Magnetische Poly(N-isopropylacrylamid)-Nanokomposite:Einfluss des Herstellungsverfahrens auf die antibakteriellen Eigenschaften

Hintergrund

Magnetische thermoresponsive Polymer-Nanokomposite wurden für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet, einschließlich Wasseraufbereitung und Nanomedizin [1,2,3,4]. Jedes Nanokomposit wurde speziell entwickelt, um von der Kombination der Eigenschaften zu profitieren, die beiden Komponenten innewohnen, d. h. magnetische Partikel und temperaturempfindliche Polymere, wodurch ein Nanokomposit entsteht, das spezifischer und kontrollierbarer ist. Magnetit (Fe₃ O₄ ) Nanopartikel verleihen magnetische Eigenschaften, die eine schnelle und einfache Trennung nach Anlegen eines externen Magnetfelds ermöglichen [5]. Poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAAm) bildet ein dreidimensionales Hydrogel, das beim Erhitzen einen reversiblen Phasenübergang der unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST) von einer einzelnen Spule mit einem gequollenen hydratisierten Zustand zu einem kollabierten und geschrumpften dehydratisierten Zustand durchläuft [6] Wasser über 32 °C. Das Abdecken der magnetischen Nanopartikel mit einer PNIPAAm-Schicht sorgt nicht nur für kolloidale Stabilität in Wasser, sondern ermöglicht auch die Oberflächenfunktionalität durch Bindung mit anderen Molekülen wie Medikamenten, Proteinen oder Enzymen [7]. Der Aufbau von dual responsiven Nanokompositen wird durch die Kombination zweier Eigenschaften erreicht, die gleichzeitig auf eine Kombination von Temperatur und Magnetismus reagieren. Die gebräuchlichsten Methoden zur Synthese von Fe₃ O₄ -PNIPAAm-Nanokomposite sind physikalische Addition, In-situ-Fällung und Emulsionspolymerisation. Die physikalische Addition, die einfachste Methode, erfordert das physikalische Mischen von zuvor synthetisierten magnetischen Nanopartikeln und PNIPAAm-Partikeln. Die zweite Methode, die In-situ-Präzipitation, beinhaltet die Präzipitation magnetischer Nanopartikel in Gegenwart des PNIPAAm-Nanopolymers [8]. Der dritte (und häufigste) Weg, die Emulsionspolymerisation, erfordert die Polymerisation des (N-Isopropylacrylamid)-Monomers in Gegenwart magnetischer Nanopartikel [9,10,11]. Fe₃ O₄ -PNIPAAm-Nanokomposite haben eine breite Anwendung in biomedizinischen und biotechnologischen Anwendungen gefunden. Um die Eignung solcher Nanokomposite für zukünftige Anwendungen zu erhöhen, werden hochstabile, kontrollierte und gut dispergierte magnetische Nanopartikel benötigt. Eine neuere Innovation betrifft ein externes Magnetfeld, das eine lokale Wärmequelle für sich selbst erwärmende Partikel erzeugt, wodurch das PNIPAAm schrumpft und wiederum die Freisetzung von verkapselten Arzneimitteln ermöglicht [12]. Dieses Phänomen, gepaart mit magnetischen Beads, die auf Tumore gerichtet sind, eröffnet andere potenzielle Krebstherapien wie die Hyperthermie. Hyperthermie kann durch oszillierende Nanopartikel in einem oszillierenden Magnetfeld bei Frequenzen im Bereich von Kilohertz bis Megahertz ausgelöst werden. Sonstiges Fe₃ O₄ -PNIPAAm-Nanokomposite wurden kürzlich synthetisiert, um die Freisetzung bioaktiver Moleküle wie Myoglobin oder Vitamin B12 zu kontrollieren und für die Wirkstoffabgabe [13]. Eine aktuelle Studie mit PNIPAAm-beschichtetem superparamagnetischem Fe₃ O₄ nanoparticles konnte zeigen, dass die thermisch induzierte Aggregation von Eisenoxid-Nanopartikeln den T2-Kontrast während der Magnetresonanztomographie stark erhöht [14]. Offensichtlich Fe₃ O₄ -PNIPAAm ist vielversprechend für zukünftige Entwicklungen sowohl in biomedizinischen als auch biotechnologischen Anwendungen. Daher ist es wichtig, dass weitere Studien zur Biokompatibilität dieses Materials und seiner antibakteriellen Wirkung durchgeführt werden.

In dieser Studie haben wir den Einfluss von drei Herstellungsmethoden auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Fe₃ . untersucht O₄ -PNIPAAm-Nanokomposite. Dabei wollen wir die geeignetste Herstellungsmethode für die Herstellung von Nanokompositen mit verbesserten Eigenschaften für biologische Anwendungen ermitteln. Erstmals beschreiben wir auch die antibakterielle Wirkung der drei Fe₃ O₄ -PNIPAAm-Nanokomposite mit einem Multi-Endpunkt-Ansatz, Bakterienwachstumsrate, Lebensfähigkeit, Zellmorphologie und DNA-Schädigungsgrad.

Methoden

Chemikalien

Eisen(III)-chlorid-Hexahydrat (FeCl₃ .) .6H₂ O, ≥ 98%), Eisen(II)chlorid-Tetrahydrat (FeCl₂ .) .4H₂ O, ≥ 99%), Ammoniumhydroxid (26% NH₃ in H₂ O), N-Isopropylacrylamid (NiPAM, ≥ 99%), N,N-Methylenbis(acrylamid) (BIS, ≥ 99%), Natriumdodecylsulfat (SDS, ≥ 99%) und Ammoniumpersulfat (APS, ≥ 98,5 .) %) wurden alle frisch von Sigma-Aldrich, Deutschland bezogen.

Herstellung von PNIPAAm durch Emulsionspolymerisation

NiPAM (4 g), BIS (0,2 g) und SDS (0,3 g) wurden in 350 ml entionisiertem Wasser (DI) bei 70 °C unter atmosphärischem Stickstoff gelöst. APS (0,0035 g) wurde in 1 ml DI gelöst und in das Reaktionsgefäß gegeben, um die Reaktion zu starten. Nach 4 h wurde die Reaktion gestoppt und die präparierten Partikel mit DI-Wasser gewaschen. Schließlich wurden die PNIPAAm-Nanopartikel durch Zentrifugation (12 000 U/min für 30 Minuten) abgetrennt und in weiteren Reaktionen verwendet.

Herstellung von Magnetit (Fe₃ O₄ ) Nanopartikel

FeCl₂ ·4H₂ O (1,9 g) und FeCl₃ ·6H₂ O (5,4 g) (Molverhältnis 1:2) wurden in DI (100 ml) gelöst und auf 70 °C erhitzt. Ammoniumhydroxid (NH₄ .) OH; 6 ml) wurde der Lösung schnell zugesetzt, was sofort einen tiefschwarzen magnetischen Niederschlag erzeugte. Schließlich das Fe₃ O₄ Nanopartikelsuspension wurde 30 min bei 70 °C gerührt. Das Produkt wurde mehrmals mit DI gewaschen, wonach das Fe₃ O₄ Nanopartikel wurden im Rotationsverdampfer (25 mbar bei 40 °C) getrocknet, bis ein feines Pulver entstand. Dies wurde in allen weiteren Reaktionen verwendet.

Herstellung von magnetischem PNIPAAm-Nanokomposit durch Emulsionspolymerisation (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1)

NiPAM (0,4 g), frisch zubereitetes Fe₃ O₄ Nanopartikel (0,2 g), BIS (0,2 g) und SDS (0,3 g) wurden in 350 ml DI gelöst und unter Stickstoffatmosphäre auf 70 °C erhitzt. APS (0,0035 g) wurde dann in 1 ml DI gelöst und in das Reaktionsgefäß gegeben, um die Reaktion zu starten. Nach 4 h wurde die Reaktion gestoppt und das hergestellte Nanokomposit mit DI gewaschen. Schließlich Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 wurde durch Zentrifugation (12 000 U/min für 30 min) abgetrennt und anschließend am Rotationsverdampfer (25 mbar bei 40 °C) getrocknet. Das pulverisierte Material wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert.

Herstellung von magnetischem PNIPAAm-Nanokomposit durch in-situ-Fällung (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2)

FeCl₂ (0,148 g), FeCl₃ (0,4 g) und 10 ml DI wurden gut gemischt und zu 1 g PNIPAAm gegeben. NH₄ Dann wurde der Lösung schnell OH (3 ml) zugesetzt, was sofort einen tiefschwarzen magnetischen Niederschlag erzeugte. Die Suspension wurde dann 30 min bei 70 °C gerührt. Das hergestellte Nanokomposit wurde mit DI gewaschen, woraufhin das Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 wurde durch Zentrifugation (12 000 U/min für 30 min) abgetrennt und mit einem Rotationsverdampfer (25 mbar bei 40 °C) getrocknet. Das resultierende Pulver wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert.

Herstellung von magnetischem PNIPAAm-Nanokomposit durch physikalische Zugabe (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3)

Frisch zubereitetes PNIPAAm (1 g), frisch zubereitetes Fe₃ O₄ Nanopartikel (0,5 g) und DI (5 ml) wurden gut gemischt und die resultierende Suspension 30 Minuten bei 70 °C gerührt. Das so hergestellte Nanokomposit wurde mit DI gewaschen, woraufhin das Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 wurde durch Zentrifugation (12 000 U/min für 30 min) abgetrennt und mit einem Rotationsverdampfer (25 mbar bei 40 °C) getrocknet. Das pulverisierte Material wurde im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert.

Nanokomposit-Charakterisierung

Die Größe und das Zetapotential des Fe₃ O₄ -PNIPAAm-Nanokomposite wurden nach vollständiger Auflösung der Nanopartikel in DI gemessen (Dispersion in DI, gefolgt von einer Beschallung für 2 Minuten bei Raumtemperatur). Zeta-Potentialmessungen wurden mit einem Zetasizer Nano-Analysator (Malvern Instruments, USA) bei pH 7 durchgeführt. Eine dynamische Lichtstreuung (DLS) von Zetasizer Nano wurde verwendet, um den hydrodynamischen Durchmesser von Partikelaggregaten in DI zu messen. Zur Quantifizierung der Beschichtungsmenge und zur Bestimmung der thermischen Stabilität des Nanokomposits wurde eine thermogravimetrische Analyse (TGA) durchgeführt. Thermische Studien wurden an 3–4 mg trockener Probe bei Temperaturen im Bereich von 25 bis 900 °C mit einem TGA Q500 (TA Instruments, USA) unter Stickstoffatmosphäre (Aufheizrate 10 °C/min) durchgeführt. Die magnetischen Eigenschaften des Materials wurden unter Verwendung eines MicroMag™ 2900 Vibrationsproben-Magnetometers (Princeton Measurements Corporation, USA) gemessen. Mikroskopische Bilder wurden unter Verwendung eines Rasterelektronenmikroskops (REM) erhalten, wobei die Partikel zunächst gründlich in DI gelöst und ein Tropfen der Lösung auf das Kupfergitter eines Zeiss ULTRA Plus Feldemissions-REM mit Schottky-Kathode gegeben wurde. Alle Bilder wurden mit der Smart SEM-Software v 5.05 (Zeiss, Deutschland) für die Bildgebung bei 1,5 kV analysiert.

Bakterienstämme und -medien

Gram-negative Escherichia coli CCM3954 und Gram-positiver Staphylococcus aureus CCM 3953 (Brno, Tschechien) wurde für alle Experimente verwendet. Detaillierte Informationen zu den Stämmen finden Sie auf der Webseite der „Czech Collection of Microorganisms“ (http://www.sci.muni.cz/ccm/). Jede Bakterienkultur wurde frisch zubereitet und über Nacht in einer Soja-Nährlösung (Sigma-Aldrich) gehalten, bevor die biologischen Experimente durchgeführt wurden.

DNA-Schaden

Comet-Assays wurden gemäß der Methodik von Singh et al. [15] und Solanky et al. [16]. Alle Chemikalien wurden von PENTA (Tschechische Republik) bezogen, sofern nicht anders angegeben. Eine frische Bakterienkultur (angepasst auf 10 ⁷ Zellen/ml) wurde über Nacht gezüchtet und dann mit zwei Konzentrationen (0,1 und 1 g/l) PNIPAAm und jedem der Fe₃ . inkubiert O₄ -PNIPAAm-Nanokomposite für 30 Minuten bei 37 °C.

Ein Mikrogel wurde hergestellt, indem 100 ml Agarose auf die mattierte Oberfläche eines Objektträgers aufgetragen und mit einem 24 × 50 mm-Deckglas (ThermoFisher Scientific, USA) bedeckt wurde. Die Objektträger wurden 5 Minuten bei Raumtemperatur belassen, dann wurden die Deckgläser entfernt und die Objektträger trocknen gelassen. Diese getrocknete Agaroseschicht (erste Schicht) lieferte eine feste Basis für nachfolgende Schichten. Nachdem die Bakterien dem PNIPAAm und Fe₃ . ausgesetzt wurden O₄ -PNIPAAm-Nanocomposites für 30 min, 2 μl (mit etwa 10.000 exponierten Zellen) wurden entnommen und mit 100 μl frisch zubereiteter 0,5 %iger Agarose vermischt. Diese Mischung wurde auf mattierte Objektträger pipettiert und sofort mit einem Deckglas (zweite Schicht) abgedeckt. Die Objektträger wurden dann in einer Stahlschale über Eis gekühlt. Nach 1 min wurden die Deckgläser entfernt und eine dritte Schicht mit 100 μl Lyse-Agarose (einschließlich 0,5 % Agarose mit 5 μg/ml RNAse A [Ameresco, USA], 0,25 % Natrium-N-Lauroylsarcosin und 0,5 mg/ml Lysozym) aufgetragen. hergestellt wurde, wiederum unter Verwendung eines Deckglases. Die Objektträger wurden dann für 10 Minuten auf Eis belassen und dann für 30 Minuten bei 37 °C in eine feuchte Kammer gelegt. Nach dem Entfernen des Deckglases wurden die Objektträger in eine Lyselösung getaucht, die 2,5 M NaCl, 100 mM EDTA-Tetranatriumsalz, 10 mM Tris-Puffer mit pH 10, 1 % Natriumlauroylsarcosin und 1 % Triton X-100 enthielt. Nach 1 h Lyse bei Raumtemperatur wurden die Objektträger in eine Enzymverdaulösung mit 2,5 M NaCl, 10 mM EDTA und 10 mM Tris pH 7 überführt. Vier Puffer mit 1 mg/ml Proteinase K. Die Objektträger wurden dann inkubiert bei 37 °C für 2 h, danach wurden sie auf die horizontale Platte einer Elektrophoreseeinheit (Scie-plas, UK) gelegt und mit 300 mM Natriumacetat und 100 mM pH 9-Tris-Puffer für 20 min äquilibriert, dann bei . elektrophoresiert 12 V (0,4 V/cm, ca. 100 mA) für 30 Minuten. Nach der Elektrophorese wurden die Objektträger 20 min in 1 M Ammoniumacetat in Ethanol (5 ml 10 M Ammoniumacetat und 45 ml absolutes Ethanol) eingetaucht, 0,5 h in absolutes Ethanol und 10 min in 70 % Ethanol. Danach wurden die Objektträger wurden bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Um eine gleichmäßige Färbung zu erzielen, wurden die Objektträger mit 50 ml einer frisch zubereiteten Lösung aus 5 % TE-Puffer und 10 mM NaH₂ . vorbehandelt PO₄ . Die Objektträger wurden dann mit 50 μl einer frisch zubereiteten 1 mM-Lösung von SYBR-Färbung (Sigma-Aldrich, USA) in TE-Puffer für 30 Minuten gefärbt. Die Migration von DNA-Strangbrüchen (Kometen) wurde unter Verwendung eines AxioImager-Fluoreszenzmikroskops bei × 400-Vergrößerung und der Software AxioVision v 4 (Zeiss, Deutschland) visualisiert. Normalerweise wurde eine Schweiflänge von 50 Kometen für jede Probe einzeln gemessen.

Bakterienwachstumsrate, Zelllebensfähigkeit und Morphologie

Das experimentelle Protokoll folgte dem von Darwish et al. [17]. Kurz gesagt, ein Fe₃ O₄ -PNIPAAm-Nanokomposit-Stammsuspension (10 g/l) wurde zu frischer Bakterienkultur hinzugefügt, um Endkonzentrationen von 0,01, 0,05, 0,5 und 1 g/l zu erhalten. Jede Konzentration wurde dreifach in einer 24-Well-Platte hergestellt. Negativkontrollen, bestehend aus Bakterienzellen nur in Nährmedien und Fe₃ O₄ -PNIPAAm-Nanokomposit nur in Wachstumsmedien, wurden parallel betrieben. Die Platte wurde dann bei 37 °C inkubiert, wonach die optische Dichte der Probe bei 600 nm (OD600) alle 2 h für 6 h mit einem Synergy™ HTX-Plattenleser (Biotek, USA) gemessen wurde. Die Bakterienwachstumsrate wurde als lineare R-Regression der OD600-Messung (Absorptionseinheiten, AU) gegen die Inkubationszeit in Stunden definiert. Vorläufige Messungen von Nanokompositproben ohne Zellen (6 h bei 600 nm) zeigten konstante Absorptionswerte, die die mit Bakterienzellen gemessenen Absorptionswerte von Nanocomposites nicht beeinträchtigten.

Die effektive Konzentration von Nanokomposit bei 10 % Hemmung (EC10) auf die Bakterienwachstumsrate (µ ) wurde für jede Form von Fe₃ . berechnet O₄ -PNIPAAm basiert auf der Gleichung:I (%) =(µ _C −µ _T )/µ _C ×100, wobei ich ist Hemmung, µ _C ist der mittlere Kontrollwachstumsratenwert und µ _T ist die Wachstumsrate der Kultur, die vom Nanokomposit beeinflusst wird [18].

Nach 24-stündiger Inkubation wurden 100 μl-Aliquote jeder Probe mit dem L7007 Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, Invitrogen, USA) im Dunkeln für 15 Minuten gefärbt. Die Bestimmung des Anteils von lebenden (Ex/Em 485/528 nm) und toten Zellen (Ex/Em 485/645 nm) wurde mit einem Synergy™ HTX-Plattenleser (Biotek, USA) durchgeführt. Der Prozentsatz an toten Zellen wurde als das Verhältnis von toten zu lebenden Zellen berechnet. Gleichzeitig werden Bilder von E. coli und S. aureus wurden mit einem AxioImager-Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Deutschland) mit Ex/Em 470/490–700 nm erhalten. Die Länge von E. coli Zellen und Fläche von S. aureus Zellcluster wurden bei einer Vergrößerung von × 600 mit der Software AxioVision v4 (Zeiss, Deutschland) bestimmt.

Statistische Analyse

Unterschiede zwischen in PNIPAAm inkubierten Bakterienstämmen, unterschiedlichem Fe₃ O₄ -PNIPAAm-Nanokomposite und Kontrollproben ohne Nanokomposite wurden mit ANOVA und Dunnett-Test (GraphPad PRISM, USA) getestet.

Ergebnisse

In dieser Studie haben wir Fe₃ . synthetisiert O₄ -PNIPAAm-Nanokomposit mit drei verschiedenen Protokollen:Emulsionspolymerisation (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1), in-situ-Fällung (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2) und physikalische Addition (Fe₃ .) O₄ -PNIPAAm-3). Die REM-Bildgebung zeigte, dass die Art des verwendeten Protokolls einen klaren Einfluss auf die Probenmorphologie und Partikelgröße hatte, mit Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 und Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 mit breiter Größenverteilung, Agglomeration aufgrund hoher Oberflächenenergie zwischen Nanopartikeln und Vorhandensein magnetischer dipolarer Wechselwirkungen ( Abb. 1 ) .

Rasterelektronenmikroskopische Bilder und Histogramme von PNIPAAm (a ), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 (b ), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 (c ) und Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (d ). Maßstabsbalken = 200 nm

TGA gab an, dass das Fe₃ O₄ -PNIPAAm-Proben wurden bei Temperaturen über 400 °C relativ stabil (Abb. 2). Insgesamt zeigten PNIPAAm-Nanopartikel einen geringeren Restgehalt als das Fe₃ O₄ -PNIPAAm-Nanokomposite. Die Zeta-Potentialwerte für die Oberflächenladung betrugen − 1,58 mV für PNIPAAm, − 15,6 mV für Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, − 16,4 mV für Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 und − 1,8 mV für Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3. Die Magnetometerwerte der vibrierenden Probe für die Magnetisierungssättigung betrugen 50,4 emu/g für Fe₃ . O₄ -PNIPAAm-1, 53,7 emu/g für Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 und 21,0 emu/g für Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3. Dynamische Lichtstreuung oberhalb (45 °C) und unterhalb (25 °C) LCST zeigte eine hydrodynamische Größe für PNIPAAm von 50 nm bei 25 °C und 27 nm bei 45 °C an; 412 nm bei 25 °C und 197 nm bei 45 °C für Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1; 212 nm bei 25 °C und 130 nm bei 45 °C für Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 und 122 nm bei 25 °C und 60 nm bei 45 °C für Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (Abb. 3).

Thermogravimetrische Analyse von PNIPAAm (a), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 (b), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 (c) und Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (d)

Dynamische Lichtstreuung unterhalb (25 °C) und oberhalb (45 °C) des Phasenübergangs der unteren kritischen Lösungstemperatur für PNIPAAm (a ), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 (b ), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 (c ) und Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (d )

Fe₃ O₄ -PNIPAAm-Nanokomposit-Wirkung auf die bakterielle DNA

Nach einer kurzen Exposition von 30 Minuten wurden DNA-Strangbrüche für beide E. coli und S. aureus in Zellen, die mit Fe₃ . behandelt wurden O₄ -PNIPAAm-Nanokomposite, 40% EtOH (Positivkontrolle) und unbehandelte Zellen (Negativkontrolle). Alle Fe₃ O₄ -PNIPAAm-Nanokomposite zeigten einen ähnlich signifikanten Effekt (P < 0,001) auf Mittelwert E. coli und S. aureus Kometenschweiflänge bei allen Konzentrationen (Abb. 4), verglichen mit Kontrollzellen, die ohne Nanokomposite inkubiert wurden.

Ein Beispiel für eine Escherichia coli Kometenschweif, nach Behandlung mit Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (a ). Ergebnisse von DNA-Strangbrüchen (Länge des Kometenschweifs) für Escherichia coli (b ) und Staphylococcus aureus (c ) inkubiert für 30 Minuten mit 40 % EtOH (Positivkontrolle), ohne Nanokomposite (Negativkontrolle), PNIPAAm (0,1 und 1 g/l) und (1) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, (2) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 und (3) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (Fehlerbalken repräsentieren SD für Kometenlänge von 50 Zellen). Signifikanzniveau ***P < 0,001

Fe₃ O₄ -PNIPAAm Nanokomposit antibakterielle Wirkung

Wachstumsraten zeigten, dass Gram-positive S. aureus war weniger resistent als Gram-negative E. coli auf alle Nanokomposite nach 6 h Exposition. Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 und Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 hemmte beide stark das Bakterienwachstum, verglichen mit PNIPAAm und Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3, mit E. coli Wachstumsrate signifikant von 0,08 auf 0,028 reduziert (P < 0,001) mit Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 und 0,005 (P < 0,001) mit Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 (1 g/l). Auf E wurde keine Wirkung beobachtet. coli Wachstumsrate entweder durch PNIPAAm oder Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (Abb. 5a). Im Vergleich dazu ist die Wachstumsrate von S. aureus war von allen Fe₃ . betroffen O₄ -PNIPAAm-Nanokomposite und durch die PNIPAAm-Nanopartikel. Bei niedrigeren Konzentrationen (0,01 g/l und 0,05 g/l) war die Wachstumsrate nur geringfügig von 0,07 auf 0,06 (P < 0,05). Bei höheren Konzentrationen (0,5 und 1 g/l) gab es jedoch eine signifikante Reduzierung von 0,07 auf 0,001 mit PNIPAAm, 0,0 mit Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, 0,01 mit Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 und 0.009 mit Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (alle P < 0,001; Abb. 5b). Außerdem die EC10 für alle Fe₃ O₄ -PNIPAAm-Nanokomposite und die PNIPAAm-Nanopartikelkontrolle war für S niedriger. aureus als das für E. coli (Tabelle 1).

Relative Wachstumsrate von Escherichia coli (a ) und Staphylococcus aureus (b ) nach 6-stündiger Inkubation in verschiedenen Konzentrationen (0,01, 0,05, 0,5 und 1 g/l) von PNIPAAm (rote Kreise), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 (orange Rauten [1]), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 (grüne Dreiecke [2]) und Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (blaue Dreiecke [3]). Die Fehlerbalken zeigen SD berechnet aus n = 3. Signifikanzniveau ***P < 0,001

Der Prozentsatz der toten E. coli Zellen nahmen mit steigender Konzentration von Fe₃ . zu O₄ -PNIPAAm-Nanokomposit nach 24 h. PNIPAAm (0,5 und 1 g/l) beispielsweise verursachte einen signifikanten Anstieg von E. coli tote Zellen (20 %) im Vergleich zu Kulturen ohne Fe₃ O₄ -PNIPAAm-Nanokomposit (12%). Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 (0,5 g/l) führte zu bis zu 28 % der toten E. coli Zellen und 32 % bei 1 g/l (P < 0,001). Die Wirkung von Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 war niedriger als das von Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 und Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3, wobei der Prozentsatz toter Zellen von 13 auf 25 % ansteigt, wenn er Konzentrationen von 0,01 bzw. 1 g/l ausgesetzt wird (P < 0,001). Sowohl bei 0,5 als auch bei 1 g/l Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 führte zu etwa 25 % toten Zellen (P < 0,001; Abb. 6a). Der Prozentsatz der toten S. aureus Zellen wurden nur durch 1 g/l Fe₃ . signifikant beeinflusst O₄ -PNIPAAm-1 und Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3, wobei tote Zellen bis zu 50 bzw. 48 % erreichen (P < 0,001). Die Kontrolle ohne Nanokomposite enthielt ungefähr 18 % tote Zellen, während sie in niedrigeren Konzentrationen von PNIPAAm, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 und Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 war der Anteil toter Zellen noch geringer. PNIPAAm in Konzentrationen von 0,5 und 1 g/l führte zu 25 und 30 % (P < 0,005) bzw. tote Zellen. Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 hatte keine Wirkung auf S. aureus Kulturen (Abb. 6b).

Prozentsatz der toten Escherichia coli (a ) und Staphylococcus aureus (b ) Zellen nach 24-stündiger Exposition gegenüber PNIPAAm und (1) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, (2) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 und (3) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3. Fehlerbalken zeigen SD von n = 3. Signifikanzniveaus *P < 0.05, **P < 0,005, ***P < 0,001

Es gab keinen Unterschied im durchschnittlichen E. coli Zelllänge (5 μm) und durchschnittlicher S. aureus Zellclusterfläche (200 μm ² ) für jedes Nanokomposit oder die PNIPAAm-Kontrolle bei niedrigsten Konzentrationen (0,1 g/l; Abb. 7). Bei höheren Konzentrationen E. coli Länge hat sich in Gegenwart von Fe₃ . nicht geändert O₄ -PNIPAAm-2, noch S. aureus Zellgruppenfläche in Gegenwart von Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1. E. coli Länge wurde in Gegenwart von 1 g/l PNIPAAm (5,4 μm, P .) signifikant erhöht < 0,005), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 (6 μm, P < 0,001) und Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (10 μm, P < 0,001) (Abb. 7a), während S. aureus bildeten bei Exposition gegenüber PNIPAAm (1937 μm ² .) größere Cluster , P < 0,001), Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 (924 μm ² , P < 0,001) und Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (1722 μm ² , P < 0,001) (Abb. 7b).

Länge von Escherichia coli Zellen (a ) und Fläche des Clusters von Staphylococcus aureus Zellen (b ) nach 24-stündiger Inkubation mit PNIPAAm und (1) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, (2) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 und (3) Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3. Die Fehlerbalken zeigen SD bestimmt von n = 50. Signifikanzstufen **P < 0,05 und ***P < 0,001

Diskussion

Sowohl die Synthesemethode als auch die Art und Weise, wie magnetische Nanopartikel in die Polymermatrix eingebracht wurden, hatten einen deutlichen Einfluss auf die intrinsischen physikalisch-chemischen Eigenschaften des magnetischen Fe₃ O₄ -PNIPAAm-Nanokomposite. Die schrittweise Synthese hatte einen starken Einfluss auf die Eigenschaften von Nanokompositen, was zu Veränderungen der Partikelform, Größenverteilung, Größe und Oberflächenchemie führte, zusammen mit nachfolgenden Änderungen der magnetischen Eigenschaften [19, 20]. Emulsionspolymerisation (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1), eine einfache und präzise Methode, erzeugte die stabilen Nanokomposite mit enger Partikelgrößenverteilung und geringster Aggregationsneigung, Eigenschaften, die für biomedizinische Anwendungen besonders wichtig sind [17]. Durch sterische und coulombische Abstoßung erzeugt, waren die Partikelabmessungen so klein, dass eine Ausfällung vermieden wurde [21]. Die am wenigsten wirksame Methode war die physikalische Addition (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3). Es wurde nicht nur in drei verschiedenen Schritten hergestellt und dauerte daher länger in der Herstellung, das resultierende Nanokomposit zeigte auch eine höhere Aggregation als jede der beiden anderen Herstellungsmethoden. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3, das auf diese Weise hergestellt wurde, kann unerwünschtes PNIPAAm und Fe₃ . enthalten haben O₄ Nanopartikelrückstände.

Polymere können entweder durch physikalische (nichtkovalente) oder kovalente Bindungen an magnetische Nanopartikel gebunden werden, wobei das resultierende Hybridmaterial je nach gewähltem Syntheseweg spezifische Eigenschaften aufweist. Eine signifikante Resuspension von magnetischen Nanopartikeln findet statt, wenn die Herstellung in dem Lösungsmittel fortschreitet, in dem die Bildung von Hybrid-Nanopartikeln stattfindet, woraufhin Aggregation und Segregation zu einem Problem werden können. In diesem Fall kann die In-situ-Bildung magnetischer Nanopartikel in vielen Fällen die bessere Alternative sein. Darüber hinaus verändert die Koaleszenz bei zu geringer Tensidkonzentration die Tröpfchengröße, während sich bei zu hoher Konzentration Micellen bilden können, die zu einer micellaren Nukleation führen. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, dass die Tensidkonzentration sorgfältig auf der Grundlage einer genauen Charakterisierung der Oberflächeneigenschaften und des Ausmaßes der Partikelmodifikation ausgewählt wird, um sicherzustellen, dass die anorganische Partikeloberfläche mit der Polymermatrix kompatibel ist.

Um die magnetischen Eigenschaften von Fe₃ . zu bewerten O₄ -PNIPAAm-Nanokomposite ist es wichtig, den Gehalt an MNPs im Nanokomposit zu kennen. TGA wurde verwendet, um die Menge an MNP zu quantifizieren und die thermische Stabilität von Fe₃ . zu untersuchen O₄ -PNIPAAm-Nanokomposite im Vergleich zu PNIPAAm-Nanopartikeln allein. Alle drei Fe₃ O₄ -PNIPAAm-Nanokomposite zeigten eine höhere thermische Stabilität als PNIPAAm-Nanopartikel, vermutlich aufgrund der Anwesenheit von Fe₃ O₄ Partikel in der Matrix (Abb. 2). Höhere Rückstände in magnetischen Nanokompositen könnten auf das Vorhandensein von anorganischem Fe₃ . zurückgeführt werden O₄ Verbindungen in den Proben, die auch bei höheren Temperaturen aufrechterhalten wurden.

Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 zeigte die höchste thermische Nanokomposit-Stabilität zusammen mit dem niedrigsten Gewichtsverlust. Bis 200 °C war die Hauptursache für den Gewichtsverlust der Wasserverlust und die physikalische Adsorption der Polymerschicht [22]; oberhalb von 200 °C waren die Verluste jedoch hauptsächlich auf die Zersetzung der chemischen Schicht zurückzuführen, die das PNIPAAm bindet. Der Probenrückstand, der über 400 °C stabil wurde, machte 87 % des ursprünglichen Gewichts aus, was der Menge an magnetischen Nanopartikeln im Nanokomposit entspricht. Ein Ziel dieses Herstellungsverfahrens war es, ein Nanokomposit mit magnetischen Eigenschaften herzustellen, das eine Aggregation verhindert und eine schnelle Redispergierung ermöglicht, sobald das Magnetfeld abgeschaltet wird. Such properties would allow its use in a range of different fields, including hyperthermic treatment of tumours, as contrasting agents in magnetic resonance imaging, in tissue repair, biomedical device coating, immunoassay, cell separation and biomagnetic separation of biomolecules [18, 23,24,25,26]. We tested our nanomaterials through magnetisation saturation, which assesses the maximum possible magnetisation of the substance beyond which no further change takes place despite an increase in the magnetic field. Our results showed Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 to have the highest magnetisation saturation level of the three nanocomposites tested. Our values were lower (53.7 emu/g) than those previously reported for uncoated Fe₃ O₄ nanoparticles (92 emu/g) [27], however, presumably due to surface order/disorder interactions in the magnetic spin moment and an increase in nanocomposite weight and volume due to the presence of the PNIPAAm polymer layer.

Of special interest as regards biomedical application is the behaviour of polymer-water solutions stable below a LCST [28]. After heating the prepared Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanomaterials above the transition temperature, a coil-to-globule transition occurred, followed by inter-molecular association. All three Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanomaterials displayed very similar behaviour, with all shrinking as temperature increased. PNIPAAm is widely used as a thermoresponsive polymer due to the proximity of its LCST (~ 30–32 °C) to physiological temperature. Furthermore, the thermo-responsibility of PNIPAAm has proved useful for drug release in vivo [28]. Nanoscale magnetic hydrogels based on PNIPAAm have now been developed for theranostic application, with those embedded with low concentrations of Fe₃ O₄ magnetic nanostructures resulting in an LCST of ~ 40 °C, making Fe₃ O₄ -PNIPAAm of especial interest for controlled drug release application [29].

SEM nanoparticle histograms displayed a broader size distribution than those using DLS (Fig. 1). Interpretation of DLS data involves the interplay of multiple parameters, however, including the size, concentration, shape, polydispersity and surface properties of the particles. Measurement of the hydrodynamic size of thermoresponsive samples in relation to temperature is a common method of characterising LCST behaviour, with nanoparticles shrinking as temperatures increase, soluble polymers precipitating and particle size increasing. As expected, PNIPAAm had a lower hydrodynamic size than the Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposites. Of the nanocomposites, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 displayed the lowest hydrodynamic size and a narrow size distribution. Variability in hydrodynamic size is likely to be due to the presence of Fe₃ O₄ nanoparticles in the PNIPAM matrix, which increases both the particle dimension and aggregation in water (Fig. 3) [8].

All Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposites displayed antimicrobial properties (Table 2), with both Gram-negative and Gram-positive bacteria negatively affecting E. coli growth rate in the order Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 = PNIPAAm and S. aureus growth rate as Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 > PNIPAAm. Similarly, the antibacterial properties desired for medical applications such as biomedical device coatings and wound dressing materials have been confirmed for a number of new PNIPAAm composites, including ZnO-PNIPAAm, Ag-PNIPAAm and chitosan-PNIPAAm [23,24,25,26].

In comparison with the modified Fe₃ O₄ nanomaterials described in our earlier studies, the PNIPAAm-1, PNIPAAm-2 and PNIPAAm-3 nanocomposites all showed a stronger effect on both E. coli und S. aureus , with S. aureus EC10 growth inhibition ranging from 0.04 to 0.06 g/l for the three nanomaterials, while modified APTS-, PEG- and TEOS-MNPs ranged between 0.1 and 0.25 g/l [17], and polymer-coated Fe₃ O₄ (PEI-mC-, PEI- and OA-MNPs) had a value of 0.15 g/l [18]. Inhibition of bacterial growth could have been caused by several factors, including cell membrane damage, oxidative stress and cell elongation, resulting in the production of lethal cells. The cells could, on the other hand, survive such unfavourable conditions by employing repair enzymes, antioxidants and/or transient growth arrest. This could partly explain the phenomenon that in lower concentrations (0.01 and 0.05 g/l) of PNIPAAm, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 and Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3, the proportion of dead cells of S. aureus was lower after 24-h incubation than in control where no such factor inducing mobilisation of the defence/repair system was present. Higher concentrations of PNIPAAm and nanocomposites caused indeed significant increase in dead cells of E. coli und S. aureus corresponding well with significant decrease in growth rate of the cell cultures.

Exposure to 1 g/l of the nanocomposite resulted in changes to bacterial cell morphology, with greatest change to E. coli cell length caused by Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 > PNIPAAm > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2, and Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 > PNIPAAm > Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 for S. aureus clustering. This effect was also observed previously when the same bacteria were exposed to different functional magnetic nanoparticles [17]. Elongation of E. coli cells in the presence of nanocomposites is indicative of transient growth arrest and is evidence of an adaptive response to oxidative stress or DNA damage [30]. In the case of S. aureus , which is a biofilm formation species, the cells became embedded over a larger area than the nanocomposite-free control when exposed to PNIPAAm, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 and Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 (Fig. 8). No S. aureus biofilm was produced when in contact with Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, possibly due to its stronger antibacterial properties. S. aureus usually produces a biofilm in harsh environments to protect the cells [31]; however, this could also have an adverse effect on the bacteria as nanocomposites can integrate through the biofilm and harm the cells, as has already been described for Pseudomonas sp. [32].

S. aureus cell culture without nanocomposites (a ) and the cells embedded in biofilm after incubation with nanocomposites for 24 h (b ). The scale bar is 10 μm

Iron could lead to DNA damage in bacterial cells as described in previous reviews [33, 34]; hence, we attempted to test whether our MNPs caused DNA damage to bacteria. The presence of Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations (0.01 or 1 g/l) caused significant damage to E. coli und S. aureus DNA, even after short exposures (30 min). To the best of our knowledge, this is the first acute genotoxicity study of magnetic composites on bacteria; as a result, we cannot compare our results with those of other authors directly. Previous studies have shown no genotoxicity attributable to PNIPAAm nanoparticles, however, and no decrease in cell viability when tested against two kinds of mammalian cell at nanoparticle concentrations of up to 800 mg/l [30]. On the other hand, previous genotoxicity studies on MNPs (γ-Fe₃ O₄ ) have shown a negative effect on human fibroblast cells at 100 mg/l [35]. Studies performed with mammalian cell lines, however, cannot be directly compared to studies done with bacterial cells, due to significant differences in eukaryotic and prokaryotic cells.

Conclusions

Magnetic poly(N-isopropyl-acrylamide) nanocomposites were prepared through emulsion polymerisation (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1), in situ precipitation (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2) and physical addition (Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3). Both Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1 and Fe₃ O₄ -PNIPAAm-2 showed higher values for surface charge and thermal stability, indicating a stable colloidal system. At room temperature, Fe₃ O₄ -PNIPAAm-3 displayed highest magnetisation saturation. Presence of Fe₃ O₄ -PNIPAAm nanocomposites at both low and high concentrations caused significant damage to both E. coli und S. aureus DNA, even after short exposure, and led to a decrease in cell viability. Overall, we suggest that Fe₃ O₄ -PNIPAAm-1, prepared through emulsion polymerisation, is the most appropriate method for producing a magnetic nanocomposite with high antimicrobial activity towards Gram-negative E. coli and Gram-positive S. aureus .

Abkürzungen

Fe₃ O₄ -PNIPAAm:

Magnetic poly(N-isopropylacrylamide)

MNPs:

Magnetite nanoparticles