Förderung des SH-SY5Y-Zellwachstums durch Goldnanopartikel, die mit 6-Mercaptopurin und einem Neuronen-penetrierenden Peptid modifiziert sind

Hintergrund

Die Förderung der neuronalen Zellproliferation und des Neuritenwachstums ist wichtig für die Nervenregeneration [1, 2], für die viele Anstrengungen unternommen wurden, um neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimer-Krankheit (AD), die Parkinson-Krankheit (PD) und Schlaganfälle zu behandeln [3 , 4]. In einer Reihe von Studien wurde gezeigt, dass Oberflächeneigenschaften von Materialien die Zellmorphologie beeinflussen, sogar die Zellreplikation und -differenzierung stören/fördern können, was in der regenerativen Medizin und der Entwicklung einer neuen Strategie von Nanomaterialien mit aktiver biologischer Funktionalität als neurophische Wirkstoffe viel versprechend ist [5 , 6].

Unter den existierenden Biomaterialien werden Gold-Nanomaterialien aufgrund ihrer einfachen Synthese, praktischen Oberflächenfunktionalisierung, geringen Toxizität, guten Stabilisierung und Biokompatibilität in einer Vielzahl von biologischen Anwendungen verwendet, einschließlich Sensorik, Markierung, Wirkstoffabgabe und Bildgebung [7, 8]. Eine frühere Studie berichtete beispielsweise, dass Goldnanostäbchen in Verbindung mit einer Laserbelichtung mit geringer Leistung die Zunahme der Neuritenlänge auf bis zu 25 μm von neuronalen NG108-15-Zellen im Vergleich zur Kontrolle stimulierten [9].

6-Mercaptopurin (6MP; Abb. 1a), ein entzündungshemmendes Medikament, wurde verwendet, um die Oberfläche von Goldnanopartikeln (AuNPs) zu funktionalisieren, um 6MP-modifizierte AuNPs (6MP-AuNPs) über eine Au-Schwefel-Bindung zu bilden [10] . Es wurde berichtet, dass 6MP-AuNPs verwendet wurden, um die 6MP-Konzentration im Lösungsmittel durch einen Ein- und Ausschaltmechanismus quantitativ zu analysieren [11]. Allerdings zeigen keine Daten die Wirkung von 6MP-AuNPs auf Zellen.

Schema des experimentellen Verfahrens. a 6-Mercaptopurin-Struktur. b Versuchsdurchführung. Die Partikel wurden bei pH 9,0 synthetisiert und erschienen bei pH 7,4 aggregiert. Wenn die Partikel in das SH-SY5Y-Zellmedium gegeben wurden, wurden sie in die Zellen aufgenommen und stimulierten das Zellwachstum

Hier haben wir neuronale Zelllinien verwendet, um die Interaktion von 6MP-AuNPs und Zellen zu untersuchen, da bekannt ist, dass neuronale Zellen stark von der Eigenschaft von Kultursubstraten beeinflusst werden. Unter den neuronalen Zelllinien gilt die humane Neuroblastomzelle (SH-SY5Y) aufgrund ihrer hohen Empfindlichkeit gegenüber Umweltstimulation und ihrer Bedeutung für funktionelle Biomaterialien in der neuronalen Forschung als weit verbreitetes Modellsystem. Um die Aufnahmeeffizienz von 6MP-AuNPs in neuronale Zellen zu erhöhen, wurde ein Neuron-Targeting-Peptid (RDP) mit der Partikeloberfläche verbunden, um ein 6MP-AuNPs-RDP-Konjugat zu bilden. Die Ergebnisse legten nahe, dass das Konjugat eine offensichtliche neurophische Aktivität, jedoch keine antiproliferative Wirkung von 6MP zeigte, was zu einer signifikanten Zunahme der Zellproliferation und des Neuritenwachstums führte.

Methoden/Experimental

Synthese von 6MP-AuNPs-RDP-Konjugat

Citrat-beschichtete AuNPs mit einer Größe von 20 nm wurden durch Reduktionsmethode synthetisiert. Kurz gesagt, eine wässrige Lösung von HAuCl₄ ·3H₂ O (100 ml, 0,01 %) wurde unter kräftigem Rühren 30 Minuten lang erhitzt, dann wurde eine Natriumcitratlösung (10 ml, 38,8 mM) schnell in das HAuCl₄ . gegeben Lösung. Die Mischung wurde weitere 30 Minuten unter Rückfluss erhitzt, bis eine tiefrote Lösung erhalten wurde, und auf natürliche Weise auf Raumtemperatur abgekühlt.

6MP-AuNPs wurden durch Mischen von AuNPs (0,33 mM) und 6MP-Lösung (Endkonzentration 0,046 nM) für 5 h bei Raumtemperatur gemäß einem früheren Bericht hergestellt [12]. Dann wurde die Mischung bei 17.000g . zentrifugiert 30 Minuten lang Anschließend wurde der Überstand verworfen und das Pellet (6MP-AuNPs) wurde resuspendiert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen.

Um RDP-modifizierte 6MP-AuNPs zu erhalten, wurden RDP (FAM w/ CKSVRTWNEI IPSKGCLRVG GRCHPHVNGG GRRRRRRRRC; synthetisiert von Shanghai Ji'er Biotech. Co., China) und 6MP mit einer jeweiligen Endkonzentration von 0,023 nM gleichzeitig zu der AuNP-Lösung gegeben (0,33 mM) 5 h lang und dann bei 17.000g . zentrifugiert 30 Minuten lang Als Kontrolle wurde ein FAM-markiertes Scramble-Peptid (FAM-SP; GRNECRIPRV GCVSRWRIGR KGRCHRLRPG GRVNRSHT GC) synthetisiert (Shanghai Ji’er Biotech. Co., China) und parallel dazu 6MP-AuNPs-SP-FAM hergestellt. Danach wurde der Überstand der Partikel verworfen und die Partikel wurden jeweils mit entionisiertem Wasser gewaschen. Die Partikellösungen wurden jeweils mit 0,1 M NaOH auf pH 9,0 eingestellt und dann durch 0,22-μm-Spritzenfilter geleitet und zur Verwendung bei 4 °C gelagert.

Eigenschaften der Partikel

Absorptionsspektren wurden bei Raumtemperatur mit einem UV/Vis-Spektrophotometer (UV-2450, Shimadzu Corp, Kyoto, Japan) gemessen, um die optische Absorption der Partikel nachzuweisen. Die Partikelgröße und das Zeta-Potential der Partikel wurden jeweils unter Verwendung eines dynamischen Lichtstreugeräts (DLS) (Zetasizer Nano ZS; Malvern) nach Verdünnung mit entionisiertem Wasser gemessen. Zur Beobachtung der Partikelstruktur wurde Transmissionselektronenmikroskopie (TEM; Shimadzu) verwendet.

Zellkultur

SH-SY5Y-Zellen wurden in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) und F-12-Medium im Verhältnis 1:1 kultiviert. Die Medien wurden jeweils mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS), 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin ergänzt. Die Zellen wurden bei 37 °C mit 5 % CO₂ . gehalten in einem befeuchteten Inkubator (Thermo Fisher Scientific, USA). Alle Reagenzien für die Zellkultur wurden von HyClone (USA) bezogen.

Zellenaufnahme

SH-SY5Y-Zellen wurden in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen/Well. Als die Zellkonfluenz 60 % erreichte, wurden den Zellmedien jeweils FAM-markierte 6MP-AuNPs-RDP und 6MP-AuNPs-SP mit einer Endkonzentration von 0,25 μg/ml für eine 2-stündige Inkubation zugesetzt. Dann wurden die Zellmedien verworfen und durch frische Medien ersetzt. Die Zellen wurden unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Olympus, Japan) beobachtet und fotografiert.

Auswirkungen von 6MP-AuNPs-RDP auf das neuronale Wachstum

SH-SY5Y-Zellen wurden in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen/Well über Nacht. Anschließend wurden RDP-6MP-AuNPs mit unterschiedlichen Konzentrationen (0, 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 μg/ml) jeweils für eine 24-stündige Inkubation in das Medium gegeben. Die Zellzahlen wurden unter Verwendung eines automatischen Zellzählers (Bio-Rad, USA) gezählt.

Außerdem wurde die metabolische Aktivität der Zellen durch den 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay gemäß dem vorherigen Bericht gemessen [13]. Kurz gesagt, SH-SY5Y-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen/Vertiefung und über Nacht in einem Medium inkubiert, das 10 % FBS enthält. Dann wurden die Partikel jeweils 24 h in das Medium gegeben. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen, dann wurden 100 μl frisches Medium und 10 μl MTT (5 mg/ml in PBS-Puffer) in jede Vertiefung gegeben. Nach einer 4-stündigen Inkubation wurden die Medien entfernt und 200 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) zugegeben, um das produzierte Formazan aufzulösen. Die Absorption des Überstands wurde bei 490 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (Bio-Rad, USA) gemessen. Zellen ohne Zusätze werden als Leerwert verwendet, und die Zellen mit nur Lösungsmittel (0,1 M NaOH (pH 9,0) wurden mit 0,1 M HCl auf pH 7,4 eingestellt) als Kontrolle. Die relative metabolische Aktivität der Zellen wurde als metabolische Aktivität (%) =OD₄₉₀ . berechnet (Muster-Leerzeichen)/OD₄₉₀ (Kontrolle-Leerzeichen). Jeder Wert wurde aus vier unabhängigen Experimenten gemittelt.

Um die Wirkung von 6MP-AuNPs-RDP auf das Neuritenwachstum zu bestimmen, wurden SH-SY5Y-Zellen in 6-Well-Platten transplantiert und bis zu einer Konfluenz von 30% gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen 3 Tage lang einmal täglich mit 6MP-AuNPs-RDP (0,25 μg/ml) behandelt. Die Neuritenlängen wurden unter einem optischen Mikroskop (Olympus, Japan) beobachtet und unter Verwendung einer ImageJ-Software berechnet [14].

Zellproliferation auf der mit 6MP-AuNPs-RDP beschichteten Oberfläche

6MP-AuNPs-RDP wurden homogen auf den Boden von Kulturschalen mit 3,5 cm Durchmesser ausplattiert, dann wurden die Zellen auf die partikelbeschichteten Schalen transplantiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen unter dem optischen Mikroskop beobachtet und die Neuritenlänge wurde gezählt. Die Zellen mit nur Lösungsmittel wurden als Kontrolle verwendet. Jedes Experiment wurde viermal unabhängig wiederholt und 200 Neuriten wurden zur Berechnung der Neuritenlänge gemittelt.

Statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Die Daten wurden mit einem Computerprogramm durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) analysiert, gefolgt von Dunnetts Mehrfachbereichstest mit der Software SPSS 13.0. Unterschiede zu p < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Aussehen und Eigenschaften der Nanopartikel

Die wässrige Lösung von AuNPs zeigte unter sichtbarem Licht eine scharlachrote Farbe (Abb. 2a, 0 s). Nach der Zugabe von 6MP wurde die Farbe allmählich dunkel, wenn 6MP an AuNPs konjugiert wurde, und schließlich trat nach 5 h Reaktionszeit ein blauschwarzer Niederschlag von 6MP-AuNPs auf. Der Niederschlag konnte durch Einstellen des pH-Werts auf 9.0 aufgelöst werden, und zu diesem Zeitpunkt zeigte die wässrige Lösung von 6MP-AuNPs eine rosa Farbe. Der Niederschlag würde sich neu bilden, wenn der pH auf 7,4 eingestellt wurde.

Reaktionsablauf und Eigenschaften der Nanopartikel. a Reaktionsprozess zur Herstellung von 6MP-AuNPs. Nach Zugabe von 6 MP zu AuNP-Lösung änderte sich die Farbe der Lösung und es bildete sich allmählich innerhalb von 5 h ein Niederschlag. b Die 6MP-AuNPs-RDP-Präzipitation wurde gelöst, als der pH-Wert mit 0,1 M NaOH auf 9,0 eingestellt wurde. c DLS-Messung der Größenverteilung der Partikel. d Zetapotential von AuNPs, 6MP-AuNPs und 6MP-AuNPs-RDP. e Partikelstrukturen unter TEM

6MP-AuNPs-RDP wurde durch Konjugieren der AuNPs mit Thiolgruppen von 6MP oder RDP bei pH 9,0 hergestellt. Die wässrige Lösung von 6MP-AuNPs-RDP zeigte dieselbe rosa Farbe wie die 6MP-AuNP-Lösung (Abb. 2b). Wenn der pH-Wert der 6MP-AuNPs-RDP-Lösung auf 7,4 eingestellt wurde, fielen die Partikel am Boden der Lösung aus.

Größe und Zetapotential von 6MP-AuNPs und 6MP-AuNPs-RDP-Lösung (pH 9,0) wurden jeweils durch DLS untersucht (Abb. 2c). Die Daten zeigten, dass die durchschnittliche Größe von 6MP-AuNPs-RDP etwas größer war als die von 6MP-AuNPs (24,6 vs. 20,5 nm), während das Zetapotential der ersteren signifikant höher war als die der letzteren (− 25,8 gegenüber − 37,2 mV). was darauf hindeutet, dass das kationische RDP das Oberflächenpotential des Partikels erhöht. Die TEM-Bilder zeigten, dass diese beiden Nanopartikel kugelförmig waren (Abb. 2d).

Zellaufnahme der Nanopartikel

Als die Partikellösungen auf pH 7,4 eingestellt und in das Zellmedium gegeben wurden, begannen die Partikel zu aggregieren und sanken allmählich auf den Boden der Vertiefungen. 30 Minuten später erschien jedoch eine offensichtlich leere Plaque um die Zellen herum, und die Lücke von 6MP-AuNPs-RDP-behandelten Zellen wies eine geringere Partikelaggregation auf als die von 6MP-AuNPs (Abb. 3a). Außerdem wurden mehr Nanopartikel in den mit 6MP-AuNPs-RDP behandelten Zellen im Vergleich zu den mit 6MP-AuNPs behandelten Zellen beobachtet.

Zellaufnahme der Nanopartikel. a 6MP-AuNPs- und 6MP-AuNPs-RDP-Lösungen von 0,25 μg/ml wurden jeweils auf pH 7,4 eingestellt und für eine 30-minütige Inkubation in das Zellmedium gegeben. Die Partikel wurden in SH-SY5Y-Zellen internalisiert oder auf dem Boden der Vertiefungen präzipitiert. b Schematische Darstellung von 6MP- und fluoreszenzmarkiertem Peptid-modifiziertem AuNP. Nachdem die SH-SY5Y-Zellen mit den Partikeln 2 h lang inkubiert worden waren, wurden Bilder aufgenommen (c ) und Fluoreszenzintensität (d ) wurde gemessen. Die Daten werden als Mittelwert  ± SEM dargestellt. Die Werte wurden für vier unabhängige Experimente gemittelt. ^** p < 0,01 im Vergleich zu den 6MP-AuNPs-SP-behandelten Zellen

Um weiter zu identifizieren, dass die Partikel in die neuronalen Zellen eindringen könnten, wurden fluoreszenzmarkierte Peptide mit den Partikeln konjugiert (Abb. 3b). Nach 2 h Inkubation der Zellen mit diesen Nanopartikeln wurde bei den 6MP-AuNPs-RDP-behandelten Zellen eine starke Fluoreszenz beobachtet, während bei den 6MP-AuNPs-SP-behandelten Zellen eine relativ schwache grüne Fluoreszenz sichtbar war. (Abb. 3c). Das Ergebnis der Fluoreszenzintensitätsmessung mit dem Fluoreszenzspektrometer (Hitachi Ltd. Co. Tokyo, Japan) zeigte, dass mit 6MP-AuNPs-RDP behandelte Zellen eine signifikant höhere Fluoreszenzintensität aufwiesen als die mit 6MP-AuNPs-SP behandelten Zellen (Abb. 3d .). ), was darauf hindeutet, dass RDP, eine Art von zelldurchdringenden Peptiden (CPPs), die zelluläre Aufnahmeeffizienz des Partikels erhöhen könnte.

Auswirkungen der Nanopartikel auf das neuronale Wachstum

Um zu untersuchen, ob die Partikel Auswirkungen auf das neuronale Wachstum hatten, wurden sowohl der MTT-Test als auch die Zellzählung verwendet, um die metabolische Aktivität und Anzahl der Zellen nach der Inkubation der Zellen mit den Partikeln für 24 Stunden zu messen. Die Ergebnisse zeigten, dass RDP allein das Zellwachstum nicht beeinflusste, während 6MP-AuNPs-RDP und 6MP-AuNPs in der jeweiligen Konzentration über 0,125 bzw. 4a, b). Außerdem zeigten 6MP-AuNPs-RDP-behandelte Zellen eine höhere metabolische Aktivität als 6MP-AuNPs-behandelte Zellen, was wahrscheinlich mit der höheren Zellpenetrationseffizienz von 6MP-AuNPs-RDP als 6MP-AuNPs zusammenhängt.

Die Partikel erhöhten die Stoffwechselaktivität der Zellen (a ) und Zahlen (b ) und die Konzentration von 6MP-AuNPs und 6MP-AuNPs-RDP variierte von 0 bis 1,0 μg/ml. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Zellen mit nur Lösungsmittel {0,1 M NaOH (pH 9,0) wird durch 0,1 M HCl auf pH 7,4 eingestellt} wurden als Kontrolle verwendet. Die Werte wurden für vier unabhängige Experimente gemittelt. ^* p < 0,05, ^** p < 0,01 im Vergleich zu RDP-behandelten Zellen, ^# p < 0,05 und ^## p < 0,01 im Vergleich zu den mit 6MP-AuNPs behandelten Zellen

Auswirkungen der Nanopartikel auf die Neuritenlänge

Abgesehen davon, dass die Partikel die metabolische Aktivität der Zellen erhöhen konnten, wurde auch ein Einfluss der Partikel auf die Neuritenlänge bei hoher Konzentration (1 μg/ml) der Partikel beobachtet. Die Bilder (Abb. 5a) zeigten, dass sich die aggregierten Nanopartikel am Boden der Vertiefungen absetzten und ein größerer leerer Plaquebereich um die 6MP-AuNPs-RDP-behandelten Zellen herum erschien.

Die Nanopartikel förderten das Neuritenwachstum. Bilder (a ) und Neuritenlänge (b ) nachdem die Zellen 24 h lang mit RDP, 6MP-AuNPs bzw. 6MP-AuNPs-RDP behandelt wurden. Die Zellen mit nur Lösungsmittel wurden als Kontrolle verwendet. Die Werte wurden für 200 Neuriten gemittelt. ^* p < 0,05 und ^** p < 0.01 im Vergleich zur Kontrolle

Nach der 24-stündigen Inkubation zeigten die Ergebnisse, dass die mit den Partikeln behandelten Zellen längere Neuriten aufwiesen als die Kontrollzellen, während es keinen signifikanten Unterschied zwischen RDP-behandelten Zellen und der Kontrolle gab. Darüber hinaus war die Neuritis von 6MP-AuNPs-RDP-behandelten Zellen bemerkenswert länger als die von 6MP-AuNPs-behandelten Zellen (Abb. 5b).

Aus dem Ergebnis von Fig. 5 tötete 6MP aufgrund seiner Zytotoxizität alle SH-SY5Y-Zellen ab; Daher haben wir keine 6MP zum Beschichten der Platte verwendet. Wie in den Fign. 3, 4 und 5 traten relativ kleine Mengen an 6MP-AuNPs in die Zellen ein, und sowohl die Neuritenlänge als auch die Zellzahl waren offensichtlich niedriger als die von 6MP-AuNPs-RDP. Daher wurde 6MP-AuNPs-RDP für die weitere Studie ausgewählt, um die Wirkung auf das Zellwachstum zu untersuchen.

Zellproliferation und Neuritenwachstum nach wiederholter Verabreichung von 6MP-AuNPs-RDP

Um die Ergebnisse von 6MP-AuNPs-RDP auf die Zellproliferation und das Neuritenwachstum weiter zu identifizieren, wurden 6MP-AuNPs-RDP dreimal an den Tagen 1, 2 und 3 nach Kultivierung der Zellen in 6-Well-Platten (Tag 0). Die Ergebnisse zeigten, dass die Neuritenlänge der mit Partikeln behandelten Zellen offensichtlich länger wurde als die der Kontrolle (Abb. 6a, b) und die metabolische Aktivität der Zellen zunahm, wenn die Zellen mit den Partikeln behandelt wurden (Abb. 6c).

Das Nanopartikel induzierte Zellproliferation und Neuritenwachstum. a Zellenbilder an den Tagen 1, 2, 3 und 4. b Neuritenlängen von 6MP-AuNPs-RDP-behandelten Zellen und der Kontrolle. Die Werte wurden für 200 Neuriten gemittelt. ^** p <0,01 verglichen mit der Kontrolle. c Metabolische Aktivität von 6MP-AuNPs-RDP-behandelten Zellen. Die Zellen wurden 3 Tage lang dreimal täglich behandelt. Zum ersten Mal wurde 6MP-AuNPs-RDP in das Zellmedium gegeben, nachdem die Zellen 24 h nach der Zelltransplantation kultiviert wurden. Jede Konzentration der Partikel betrug 0,25 μg/ml. d Bilder des Neuritenwachstums der Zellen auf Oberflächenbeschichtung mit 6MP-AuNPs-RDP. 6MP-AuNPs-RDP wurde auf den Boden von Kulturschalen mit 3,5 cm Durchmesser plattiert und dann wurden die Zellen auf die Schalen transplantiert. e Die Neuritenlänge wurde mit 0 ~ 3 Tagen gemessen. Die Zellen mit nur Lösungsmittel wurden als Kontrolle verwendet. Die Werte wurden für 200 Neuriten gemittelt. ^** p < 0,01 im Vergleich zur Kontrolle, ^* p < 0,05, ^** p < 0.01 im Vergleich zu den Zellen von Tag 1. Der blaue Pfeil zeigt auf die repräsentativen Neuriten

Um die Wirkung von 6MP-AuNPs-RDP auf das Neuritenwachstum bei Verwendung des Partikels als Oberflächenbeschichtungsmaterial zu untersuchen, wurde der Boden der Kulturschalen mit 6MP-AuNPs-RDP beschichtet und dann wurden die Zellen auf die Beschichtungen transplattiert. Die Bilder zeigten, dass die Partikel schnell an der Zellmembran hafteten (Abb. 6d), dann wurden die Partikel internalisiert und in den ganzen Zellen, einschließlich Zytoplasma, Zellkernmembran und Zellkern, verteilt. Die Ergebnisse zeigten auch, dass die mit Partikeln behandelten Zellen signifikant längere Neuriten aufwiesen als die Kontrolle (Abb. 6e).

Auswirkungen des Nanopartikels auf das Zellwachstum nach gefrorener Lagerung

Um die Zelltoleranz für die Partikel zu untersuchen und festzustellen, ob die Zellen nach dem abgelösten Wachstumszustand die proliferative Kapazität beibehielten, wurden 6MP-AuNPs-RDP-behandelte Zellen eingefroren und mehrere Tage gelagert, wenn sie die exponentielle Wachstumsphase erreichten. Dann wurden die Zellen gewonnen und auf 24-Well-Platten kultiviert (Abb. 7a). Die Ergebnisse zeigten, dass die Anzahl der partikelbehandelten Zellen signifikant zunahm und die Neuriten länger wurden als die der Kontrolle (Abb. 7b, c), was darauf hindeutet, dass das Wachstum der partikelbehandelten Zellen durch einen Gefrier- und Erholungsprozess nicht beeinflusst werden konnte .

Das Nanopartikel erhöhte die Neuritenlänge und die Zellzahl nach gefrorener Lagerung. (a ) Die Zellen wurden vor der Lagerung mit 6MP-AuNPs-RDP (1,0 μg/ml) behandelt, und die Zellen wurden gewonnen und weitere 3 Tage kultiviert. Neuritenlänge (b ) und Zellennummern (c ) von 6MP-AuNPs-RDP-behandelten Zellen waren nach Lagerung signifikant erhöht. Die Zellen mit nur Lösungsmittel wurden als Kontrolle verwendet. Die Daten werden als Mittelwert  ± SEM dargestellt. ^** p <0,01 verglichen mit der Kontrolle. Der blaue Pfeil zeigt auf die repräsentativen Neuriten

Diskussion

AuNPs haben ein großes Anwendungspotenzial in verschiedenen Bereichen der Chemie, Physik, Materialien, Biologie, Medizin und verwandten interdisziplinären Gebieten gezeigt. Um die Struktur von AuNPs zu stabilisieren, wurden am häufigsten Thiol-modifizierte Liganden als Stabilisierungsmittel verwendet, die durch Bildung von Au-S-Bindungen an die Oberfläche von AuNPs binden konnten. In der Studie wurden Thiolgruppen von 6MP und RDP mit der Oberfläche von AuNPs konjugiert, und die Partikelstruktur war stabil und konnte für weitere Studien verwendet werden.

Wie aus den Ergebnissen hervorgeht, besaßen die Partikel eine offensichtliche Säure-Base-Eigenschaft, die mit der Dissoziation der N(9)-H-Gruppe des 6MP-Moleküls zusammenhängt, die in einem pH-Bereich von 10,4 ~ 11,2 in Lösung stattfand. und Aggregation trat auf, wenn der pH-Wert der 6MP-AuNP-Lösung unter 6 lag. Die Protonierung von N9 des 6MP-Moleküls neutralisierte 6MP-AuNPs mit einem pH-Wert unter 6, und dann wurden intermolekulare Wechselwirkungen (Basenstapelungswechselwirkungen) sehr stark und kompensiert die elektrostatische Abstoßung. Nach der RDP-Modifikation zeigten die Partikel ein komplexeres Säure-Base-Verhalten, da der pI von Thiol-RDP neben der Säure-Base-Eigenschaft von 6MP-AuNPs etwa 11,5 betrug. Nach der Titration betrug der pI-Wert von 6MP-AuNPs-RDP 7,8, nahe dem physiologischen Zustand (pH 7,4). Somit könnten 6MP-AuNPs-RDP und 6MP-AuNPs aus Zellmedien präzipitieren.

In dieser Studie haben wir festgestellt, dass RDP die Zellaufnahme von 6MP-AuNPs verbessert, was mit den vorherigen Studien übereinstimmt. Es ist allgemein bekannt, dass RDP ein langes Peptid ist, das aus 39 Aminosäuren besteht, das vom Glykoprotein des Tollwutvirus abgeleitet ist und die Fähigkeit besitzt, fremde Makromoleküle in neuronale Zellen zu transportieren [15, 16]. In unserer vorherigen Studie wurde die Zellaufnahmeeffizienz von Gold-Nanoclustern signifikant verbessert, wenn die Nanocluster mit RDP konjugiert wurden [17]. Der Mechanismus der Penetration von RDP in Zellen kann mit einer durch den -Aminobuttersäure-(GABA-)Rezeptor oder durch den Nikotin-Acetylcholin-Rezeptor vermittelten Endozytose der neuralen Zellmembran in Verbindung gebracht werden [18, 19].

Die Studie deutete auch auf einen gegenteiligen Effekt von 6MP-AuNPs-RDP im Vergleich zu 6MP hin, dass 6MP-AuNPs-RDP die Zellproliferation und das Neuritenwachstum förderte, was eine offensichtliche neurophische Aktivität zeigte. Der Mechanismus dieses markanten Unterschieds von 6MP-AuNPs-RDP und 6MP könnte mit der chemischen Struktur von 6MP (einem Purinderivat der C6-Thiolgruppe) in Verbindung gebracht werden [20]. Auf der Oberfläche von 6MP-AuNPs-RDP war die Thiolgruppe von 6MP an einer Bindung mit AuNPs beteiligt und wurde somit blockiert. Daher wurde die Puringruppe auf der Partikeloberfläche freigelegt. Es ist allgemein anerkannt, dass Purin eine entscheidende Rolle bei der Förderung des neuronalen Wachstums (wie Zelldifferenzierung, Neuritenbildung und -verlängerung, Synaptogenese) über intrazelluläre purinerge Signalwege spielt [21, 22], einschließlich mitogenaktivierter Proteinkinase/extrazelluläres signalreguliertes Protein Kinase (MAPK/ERK) und Phosphatidylinositol-3-Kinase/Serin-Threonin-Kinase Akt (PI3K/Akt) Pfade (die gleichen Pfade, die durch Neurotrophine und Zytokine induziert werden) [23]. Daher könnte das Purin von 6MP-AuNPs-RDP zu den Auswirkungen der Zellproliferation und des Neuritenwachstums beitragen.

Es sollte darauf hingewiesen werden, dass SH-SY5Y-Zellen eine gute ausgezeichnete Toleranz gegenüber dem 6MP-AuNPs-RDP zeigten. Wenn die mit Partikeln behandelten Zellen eine wiederholte Verabreichung der Partikel oder eine Gewinnung aus der Gefrierlagerung erhielten, behalten sie selbst dann, wenn die Zellen auf der mit den Partikeln beschichteten Oberfläche wuchsen, ihre proliferative Aktivität bei, was darauf hindeutet, dass das 6MP-AuNPs-RDP das Potenzial für . haben sollte Anwendung.

Schlussfolgerungen

Hier schlugen wir vor, dass mit 6MP und RDP modifizierte AuNPs die Zellproliferation und das Neuritenwachstum effektiv fördern könnten. Aufgrund der hervorragenden Biokompatibilität und Biosicherheit der Nanopartikel sind sie ein vielversprechendes Biomaterial, das als neurophisches Nanomaterial für das neuronale Wachstum verwendet werden kann.

Abkürzungen

6MP:

6-Mercaptopurin

AD:

Alzheimer-Krankheit

AuNPs:

Goldnanopartikel

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

DMEM:

Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium

DMSO:

Dimethylsulfoxid

FCS:

Fötales Kälberserum

MTT:

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid

PD:

Parkinson-Krankheit

RDP:

Von Tollwutvirus abgeleitetes Peptid

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie