Biomineralisations-inspirierte Synthese von Cer-dotierten kohlenstoffhaltigen Nanopartikeln für hochgradig Hydroxyl-Radikalfängeraktivität

Hintergrund

Kontinuierliche und deregulierte Entzündungen gelten als gemeinsamer Schritt zahlreicher pathologischer Prozesse [1]. Oxidativer Stress wurde bei vielen klinischen Erkrankungen festgestellt, bei denen ROS eine viel höhere Expression aufweist als die Elimination von antioxidativen Enzymen [2,3,4], was schließlich als ein Ungleichgewicht zwischen oxidativen und antioxidativen Leistungen definiert wird. Die hochreaktiven ROS neigen dazu, freie Radikale zu produzieren (einschließlich Superoxid (O₂ ⁻ ), HO_2ˋ und Hydroxyl (_ˋ OH)), die Makromoleküle im Organismus schädigen, wie Proteine ​​und Nukleinsäuren, während eine Überproduktion von ROS einen entscheidenden Unterschied bei anhaltenden oxidativen Schäden ausmacht und zu erheblichen Zerstörungen zellulärer Strukturen und Funktionen, wie entzündlichen Infiltraten, führt [5,6 ,7], die Schädigung von Zellmembranen und DNA [8, 9] und sogar den Zelltod erhöhen. Somit spielt oxidativer Stress eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese von makrovaskulären Erkrankungen [10,11,12], Krebs und einigen anderen Erkrankungen des Nervensystems [13]. Folglich ist es ein wichtiges und dringendes Problem, die Konzentration reaktiver freier Sauerstoffradikale in lebenden Organismen zu kontrollieren und sie in einem geeigneten Bereich zu halten, was auch grundlegend ist, um eine Reihe von oxidativen Anomalien zu verringern.

Vor kurzem wurden Ceroxid-Nanopartikel (CeO₂ NPs) haben aufgrund ihrer einzigartigen Redoxeigenschaften, die ausgiebig in den Bereichen Energie, Katalyse und biomedizinischen Bereich eingesetzt wurden, große Aufmerksamkeit auf sich gezogen [14,15,16]. Insbesondere CeO₂ Nanopartikel zeigten ein enormes Potenzial als ideales Antioxidans zur Behandlung von ROS-bedingten Erkrankungen in biomedizinischen Anwendungen [17, 18]. Die antioxidative Aktivität von Ceroxid-Nanopartikeln leitet sich von ihrer Fähigkeit ab, freie Radikale wie Superoxid (•O ²⁻ ) und Hydroxylradikalen (•OH) und behält die antioxidative Wirkung als Enzym über einen längeren Zeitraum bei [19]. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass CeO₂ Nanopartikel haben normalerweise eine Kristallstruktur vom Fluorit-Typ, und Cer-Ionen besitzen die Fähigkeit zur reversiblen Umwandlung zwischen Tervalenz (3+) und Quadrivalenz (4+) [20]. Der Wechsel von Ce ³⁺ bis Ce ⁴⁺ Oxidationsstufen könnten O₂ . eliminieren ⁻ über Superoxiddismutase (SOD)-Mimetika und •OH über Redoxreaktionen, während das Ce ⁴⁺ bis Ce ³⁺ Schalter entfernen H₂ O₂ über Katalase (CAT)-Mimetika [21]. Physikalische und chemische Eigenschaften von CeO₂ NPs können das biologische Verhalten beeinflussen, einschließlich seiner Bioverteilung, Pharmakokinetik, Toxizität, Auflösung und Elimination [22]. Angesichts der Hypothese, dass die oberflächliche Chemie Ce-dotierter CNPs gut etabliert ist, muss die biologische Nutzung Ce-dotierter CNPs als therapeutischer Ansatz noch umfassend erforscht werden [23, 24].

Diese Studie konzentriert sich auf die Entwicklung neuartiger Cer-basierter Nanopartikel (genannt als Ce-dotierte CNPs) mit ausgezeichneter Biokompatibilität auf einem einfachen und grünen Syntheseweg und untersucht weiter deren Machbarkeit als Antioxidans für biomedizinische Anwendungen. Zur Charakterisierung der physikalischen und chemischen Eigenschaften der Ce-dotierten CNPs wurde eine Reihe von Methoden eingesetzt. Ermutigt durch die guten Leistungen haben wir die Biokompatibilität der hergestellten Ce-dotierten CNPs weiter überprüft und sie als antioxidative Reagenzien verwendet, um freie Sauerstoffradikale mit H₂ . zu eliminieren O₂ induziertes Modell. Schließlich wurde der antioxidative Mechanismus von Ce-dotierten CNPs aus dem Zell-Apoptose-Weg unter Verwendung der Lebend-Tot-Fluoreszenzfärbung und Durchflusszytometrie aufgedeckt. Diese Studie wird einen neuartigen und effizienten ROS-Fänger bereitstellen, um Schäden durch oxidativen Stress unter pathologischen Bedingungen zu lindern.

Experimenteller Abschnitt

Materialien und Reagenzien

Bullserumalbumin (BSA), Fluoresceindiacetat (FDA) und Propidiumjodid (PI) wurden von Sigma (New York, NY, USA) bezogen. Fetales Rinderserum (FBS) und Dulbecco’s Minimum Essential Medium (DMEM) wurden von Invitrogen China Limited (Shanghai, Volksrepublik China) bezogen. Ce (NO₃ )₃ ·6H₂ O, Methylviolett (MV) und Eisensulfat-Heptahydrat (FeSO₄ .) ^. 7H₂ O) wurden von Aladdin Reagent Corporation (Shanghai, Volksrepublik China) bezogen und Wasserstoffperoxid (30 %) wurde von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Beijing, Volksrepublik China) bezogen. Alle Chemikalien waren analytische Reagenzien und wurden ohne weitere Reinigung verwendet. In den Experimenten wurde entionisiertes Wasser verwendet.

Synthese von Ceroxid-Nanopartikeln

Ce-dotierte CNPs wurden durch Anwendung einer leichten Modifikation der Album-basierten Biomineralisierungsmethode hergestellt, wie in dem Dokument beschrieben [24]. Der Syntheseprozess wird wie folgt veranschaulicht:1,25 g BSA wurden in 50,0 ml entionisiertem Wasser gelöst und ständig gerührt, um die transparente Lösung zu bilden. Dann wird die Lösung des Metallvorläufers 300 mM Ce (NO₃ )₃ ·6H₂ O wurden jeweils langsam unter kräftigem Rühren zugegeben. Gleichzeitig wurde 2,0 M NaOH in 50 ml entionisiertem Wasser gelöst, das zum Einstellen des pH-Werts der Mischung verwendet wurde. Die langsam zuzugebende Lösung mit NaOH sollte beachtet werden. Ce-dotierte CNPs konnten nach energischem Rühren bei PH 12 bei 55 °C gebildet werden. Eine ausreichende Reaktionszeit für die Bildung von Ce-dotierten CNPs betrug etwa 8 h; das System war eine braune Verbindung, die natürlich auf Raumtemperatur abkühlte. Die zusätzliche Suspension wurde mit einer 0,22-&mgr;m-Membran (Polyethersulfon) filtriert, um diese Agglomerationen im großen Maßstab abzureichern. Die erstere Lösung wurde schließlich 3 Tage lang in einem Dialysebeutel mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 14 kDa gegen Wasser dialysiert. Die gesammelte Dialyselösung wurde unter Verwendung eines Vakuumgefriertrockners gefriergetrocknet. Die Ce-dotierten CNP-Pulver wurden schließlich erhalten und für die weitere Charakterisierung aufbewahrt.

Instrumente und Charakterisierung von Ceroxid-Nanopartikeln

Morphologien von Ce-dotierten CNPs wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) auf einem JEM-2100-Mikroskop (JEOL, Tokio, Japan) bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV untersucht. Die Größenverteilung wurde mit der ImagingJ-Software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) untersucht. Die chemischen Strukturen von Ce-dotierten CNPs wurden unter Verwendung eines Fourier-Transform-Infrarot-(FT-IR)-Spektrometers (Nicolet Nexus 470, GMI und Ramsey, MN, USA) analysiert. Die elementare Zusammensetzung wurde durch Elementaranalyse bestimmt, die über eine Röntgenstrahl-Photoelektronenspektroskopie (XPS) durchgeführt wurde. Die Röntgenbeugungsanalyse (XRD) wurde auf einem Rigaku D/MAX-2000-Diffraktometer (Japan) durchgeführt, das bei 40 kV und 100 mA betrieben wurde, mit einem Spalt von 0,5° und einer Abtastgeschwindigkeit von 7° min ^-1 , ausgestattet mit einer Cu Kα-Strahlungsquelle (λ = 0,15418 nm). Die UV-Vis-Absorptionsspektren wurden mit einem UV-2550-UV-Vis-Spektrophotometer (Shimadzu, Kyoto, Japan) aufgenommen.

UV-vis Photometrische Experimente

Die antioxidative Leistung von Ce-dotiertem CNP und die Fängeraktivität freier Radikale wurden durch photometrische UV-Vis-Experimente bewertet. Die Lösungen von MV wurden in entionisiertem Wasser mit einer Konzentration von 3,0 × 10 ^–4 . hergestellt M. Und 0,15 mM FeSO₄ ^. 7H₂ O wurde alternativ aufgelöst. Die suspendierte Lösung von Ce-dotierten CNPs wurde für die Verwendung in Konzentrationen von 10 μM reserviert, indem sie in 0,1 M Tris-HCl-Puffer bei pH 5,0 dispergiert wurde. Geeigneterweise kann die Ultraschallbehandlung die Löslichkeit von Ce-dotierten CNPs verbessern. Die Reaktionslösungen für die Photometrie umfassten 3,0 × 10 ^–5 M MV, 0,15 mM FeSO₄ ^. 7H₂ Oh, 1,0 M H₂ O₂ , 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 5,0) und 0,17 mM Ce-dotierte CNPs, um ein erforderliches Volumen von 10 ml zu erreichen (Mischlösung von MV/FeSO₄ ^. 7H₂ O/H₂ O₂ /CeO₂ ) Endlich. Die Absorption der Reaktionslösung konnte nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur gemessen werden.

Zytotoxizität von Ceroxid-Nanopartikeln

Die Zelllebensfähigkeit von Ce-dotierten CNPs wurde auf VSMC- und 7721-Zellen durch den CCK-8-Assay (Dojindo, Kumamoto, Japan) basierend auf dem gespaltenen Tetrazoliumring und dem Abstieg des wasserlöslichen Tetrazoliumsalzes der Menge an Formazanfarbstoff durch Dehydrogenasen bewertet in lebenden Zellen. Kurz gesagt, VSMC- und 7721-Zellen (1,5 × 10 ⁴ Zellen pro Well) wurden in 96-Well-Platten mit fünf Replikaten für jede Gruppe ausgesät. Nach 24 Stunden Schlupf bei 37 °C und 5 % CO₂ und die Zelldichte eine Konfluenz von 80 % erreicht hatte, wurde das Wachstumsmedium durch frisches DMEM mit unterschiedlichen Konzentrationen (0, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 μg/ml) Ce-dotierter CNPs-Lösung ersetzt und für 24 h inkubiert. Dann wurden die Zellen mit PBS gewaschen und 10 μl CCK-8-Lösung wurden in jede Vertiefung gegeben. Als nächstes wurden die 96-Well-Platten für weitere 4 h bei 37 °C und 5 % CO₂ . inkubiert um ein exponentielles Zellwachstum zu ermöglichen. Schließlich wurde die Absorption jedes Wells bei einer Emissionswellenlänge von 490 nm mit dem Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader (Bio-Tek, Winooski, VT, USA) nachgewiesen. Zellen (in DMEM) ohne Behandlung wurden als Kontrolle verwendet und die relative Zelllebensfähigkeit (Mittelwert ± ± Standardfehler des Mittelwerts) wurde unter Verwendung von Abs-Probe/Abs-Kontrolle ×   100 % berechnet.

Modell des Wasserstoffperoxids im In-vitro-Test zur Lebensfähigkeit von Zellen

Als eine Art stark oxidativ aktiver Sauerstoff, Wasserstoffperoxid (H₂ O₂ ) geht leicht durch die Zellmembran und reagiert mit intrazellulären Eisenionen zu hochreaktiven freien Radikalen nach der Fenton-Theorie, was zu einer Kette von Veränderungen führt. Gleichzeitig gibt es verschiedene Arten von oxidativem Zellstress, der durch H₂ . induziert wird O₂ sind direkt am Prozess der Apoptose beteiligt. Daher 30 % H₂ O₂ wurde ausgewählt, um die Apoptose von Zellen in dieser Studie zu simulieren, die auch als IC₅₀ . verwendet werden kann Modell, um die Schutzwirkung von Ce-dotierten CNPs auf oxidative Schäden weiter zu untersuchen. Basierend auf der obigen Diskussion wurden VSMC- und 7721-Zellen anfänglich mit einer Dichte von 1,5 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen/Well in die 96-Well-Platten. Nachdem die Zellen adhärent waren, wurden sie für zusätzliche 24 Stunden weiter kultiviert. Und die frische Zubereitung 30% H₂ O₂ wurde in jede Vertiefung mit unterschiedlichen Konzentrationen (50, 100, 200, 400, 800 umol/ml) gegeben, um das Zellwachstum zu stimulieren. Nach einer 4-stündigen Schlupfphase und einem anschließenden Waschen mit PBS wurden 10 μL CCK-8-Lösung für 4 Stunden bei 37 °C in einer 5 %igen CO₂ .-Lösung in jede Vertiefung gegeben Inkubator_. Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader (Bio-Tek, Winooski, VT, USA) wurde verwendet, um den Absorptionswert jeder Vertiefung bei 490 nm zu bestimmen. Der Prozentsatz der Zellaktivität wurde als Index der Wirkung auf die Zelllebensfähigkeit angesehen, der von der Messung der Zellüberlebensrate im Verhältnis zu der der Kontrolle abhing.

Apoptose-Induktions- und Zelllebensfähigkeits-Assay in vitro

Auf die gleiche Weise wurden VSMC- und 7721-Zellen in die 96-Well-Platten ausgesät und kultiviert. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen an Ce-dotierten CNPs (0, 12,5, 25, 50, 100, 200 und 400 μg/ml) etwa 24 h vorbehandelt und dem frischen Präparat 30 % H_{2 . ausgesetzt} O₂ mit der geeigneten Konzentration jedes Well. Andererseits sollte es eine leere Gruppe ohne 30 % H₂ . sein O₂ und Ce-dotierte CNPs und Kontrollgruppe war nur mit H₂ O₂ Lösungen. Jede Gruppe wurde sechs Parallelen aufgestellt. Nach einer Behandlung für 4 Stunden und einem anschließenden Waschen mit PBS wurde der CCK-8-Assay verwendet, um die apoptotischen Bedingungen der Zellen in jeder Vertiefung bei einer optischen Dichte von 490 nm wie oben beschrieben zu messen.

Live-Dead-Färbungsassay und Durchflusszytometrie

Um das Potenzial der antioxidativen Wirkung von Ce-dotierten CNPs zu bewerten, wurden 7721 Zellen auf Sechs-Well-Platten mit 4,0 × 10 ⁴ . gezüchtet Zellen in 100 ul Medium pro Vertiefung und 24 h entwickeln gelassen. Dann wurden sechs Gruppen auf Simultankontrast eingestellt; es enthielt die Kontrolle, H₂ O₂ Gruppe, 50μg/ml Ce-dotierte CNPs + H₂ O₂ , 100μg/ml Ce-dotierte CNPs + H₂ O₂ , 200μg/ml Ce-dotierte CNPs + H₂ O₂ , und 400μg/ml Ce-dotierte CNPs + H₂ O₂ . Während die Zellen in jeder Gruppe zu 80 % gewachsen waren, wurde die erste Gruppe normalen Wachstumsbedingungen ohne H₂ . ausgesetzt O₂ und Ce-dotierte CNPs; die zweite Gruppe wurde gerade mit dem ausgewählten H₂ . inkubiert O₂ ohne Ce-dotierte CNPs für 4 h, nämlich keine Behandlung; die dritte bis sechste Gruppe enthielt unterschiedliche Konzentrationen von Ce-dotierten CNPs (50, 100, 200 und 400 μg/ml) und zeigte H₂ . an O₂ Inkubation für jeweils 4 h. Danach wurde FDA- und PI-Arbeitspuffer zur Zellfärbung verwendet (Calcein AM/Ethidium Homodimer, Invitrogen). Die Fluoreszenz gefärbter Zellen wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet; Lebende Zellen zeigten eine grüne Farbe und tote Zellen haben eine rote Farbe.

Darüber hinaus wurde das Annexin V-FITC/Propidiumiodid (PI) Apoptosis Kit verwendet, um die Rate der Zellapoptose durch Doppelfluoreszenzfärbung zu quantifizieren. Kurz gesagt, 7721-Zellen wurden in Sechs-Well-Kulturplatten gemäß den obigen Schritten für 24 h vorkultiviert, bis die 7721-Zellen anhaftendes Wachstum hatten. Danach wurden die Zellen mit unterschiedlichen Dosierungen von Behandlungsmaßnahmen geerntet und in jeder Gruppe dreimal mit PBS bei 4 °C gewaschen. Es wurde festgestellt, dass die Zellen vorsichtig verdaut, gesammelt und zentrifugiert werden sollten, gefolgt von 2000 U/min für 5 Minuten. Danach wurden die Zellen mit 500 μl Bindungspuffer resuspendiert und auf eine Konzentration von 1 × 10 ⁶ . eingestellt Zellen/ml. Anschließend wurde die Zellsuspension in ein Flow-Tube-Färbung mit 5 μl Annexin V-FITC bzw. 5 μl 20 μg/ml PI-Lösung gegeben. Bevor die Mischung bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert wird, sollten 500 μl PBS in das Reaktionsröhrchen gegeben werden. Schließlich wurden die experimentellen Ergebnisse mit der Annexin-V-Methode auf einem Beckman Coulter Epics XL MCL-Durchflusszytometersystem (BD Accuri C6) nachgewiesen und der Prozentsatz apoptotischer Zellen durch Softwareanalyse (Flowjo 7.6.2) geklärt.

Statistische Analyse

Alle experimentellen Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts ausgedrückt. Zum Vergleich der verschiedenen Gruppen wurde die statistische Technik der ANOVA mit dem Post-hoc-Test der geringsten signifikanten Differenz (LSD) angewendet, um die erhaltenen Daten zu analysieren. A P Wert von weniger als 0,05 (P < 0,05) wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung und Charakterisierung von Ceroxid-Nanopartikeln

In dieser Studie wurden die wässrigen Dispersionen von Ce-dotierten CNPs unter Verwendung von Ce (NO₃ )₃ ^. 6H₂ O und BSA als Vorläufer durch Biomineralisation-inspirierte Synthesemethode. Während der Herstellung kann BSA, das als Hauptkohlenstoffquellenmaterial verwendet wird, die Metallionen aufgrund ihrer einzigartigen räumlichen Struktur und Flexibilität der Molekülketten zu Metallnanopartikeln integrieren. Mit anderen Worten, die hergestellten metalldotierten Nanopartikel bestehen hauptsächlich aus kohlenstoffhaltigem Gerüst und geladenen Metallelementen, die sich von herkömmlichen anorganischen Cer-Nanopartikeln unterscheiden können [25]. Die morphologische Untersuchung wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) charakterisiert und die resultierenden Partikelgrößen wurden mit der ImagingJ-Software analysiert. Abb. 1a zeigt charakteristische TEM-Bilder der resultierenden Ce-dotierten CNPs. Diese Vorstellungen spiegelten wider, dass Ce-dotierte CNPs eine polygonale Struktur, eine gleichmäßige Dispersion und eine diskrete Form ohne offensichtliche Aggregation aufwiesen. Die statistische Analyse zeigte, dass Ce-dotierte CNPs eine enge Größenverteilung mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 14,7 ± 0,8 nm aufwiesen (Abb. 1b), was mit den TEM-Bildern übereinstimmte. Wenn Ce-dotierte CNPs einige Tage in Wasser waren, konnte festgestellt werden, dass es keine Ausfällungen gab und dennoch die Aussage von homogenen Lösungen beibehalten wurde, was auf ihre Langzeitstabilität in wässriger Lösung hinweist, die für die folgenden biomedizinischen Anwendungen von Vorteil sein könnte .

a TEM-Bilder für Ce-dotierte CNPs. Der Einschub zeigte ein hochauflösendes TEM-Bild. b Die Durchmesserverteilung von Ce-dotierten CNPs

Schematische Darstellung des Designs von Ce-dotierten CNPs

Chemische Struktur und Oberflächenzusammensetzung der Ce-dotierten CNPs

Oberflächenfunktionelle Gruppen und Zusammensetzung der Ce-dotierten CNPs wurden mit Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (XPS)-Muster und Fourier-Transformations-Infrarot-(FT-IR)-Spektrum untersucht. XPS wurde verwendet, um den Oxidationszustand von Cer-Ionen auf der Oberfläche von Proben zu charakterisieren. Das XPS-Spektrum der Untersuchung (Abb. 2a) zeigte drei vorherrschende Peaks bei 902,0, 285,0 und 531,8 eV, die die Existenz von Cer-, Kohlenstoff- und Sauerstoffelementen von Ce-dotierten CNPs anzeigten. Die Schwefel(S 2p)-Signale bei 164,0 eV deuteten darauf hin, dass BSA erfolgreich an die Ce-dotierten CNPs konjugiert wurde. Die Koexistenz von Ce(III) und Ce(IV) in Ce-dotierten CNPs-Katalysatoren konnte durch das Spektrum der Abb. 2b belegt werden. Das hochauflösende Spektrum von Ce3d (Abb. 2b) könnte sich in Ce3d₃ . aufteilen und Ce3d₅ (resultierend aus einer Spin-Bahn-Aufspaltung von 32 eV) zeigte das Vorhandensein von indizierten und starken Peaks bei 882.0, 884,0 bzw. 902.0 eV. Ce3d-Signale wurden hauptsächlich in O₂ . unterteilt , 3d_5/2 , und 3d_3/2 , die Peaks zwischen 875 und 895 eV gehörten zum Ce3d_3/2 Niveau, das fast mit dem Spektrum der zuvor veröffentlichten [26] übereinstimmte. Darüber hinaus implizierte das XPS-Spektrum auch die 15,99 % von Ce3d. Diese Beobachtungen stimmen mit Ergebnissen in der Literatur für CeO₂ . überein Nanopartikel [25]. Das in Abb. 2c gezeigte C1s-Spektrum wurde durch drei Hauptpeaks bei 285,0, 287,8 und 288,9 eV beschrieben, die jeweils implizierten, dass CeO₂ Nanopartikel wurden mit den Energieniveaus 1s, C=O, C−F und COOR von C funktionalisiert. Das Vorhandensein des O1s-Spektrums, wie in Abb. 2d gezeigt, wurde von zwei Hauptpeaks bei 530,5 und 531,8 eV dominiert, die dem Bindung zwischen O₂ ⁻ und Ce ³⁺ .

a XPS-Spektren der Ce-dotierten CNPs. Umfragespektrum. b Ce3d-Spektrum. c C1s-Spektrum. d O1s-Spektrum

Weiterhin wurde eine FTIR-Analyse durchgeführt, um die Bildung von Ce-dotierten CNPs im Reaktionsprozess zu verifizieren. Wie in Abb. 3A gezeigt, trat bei den Ce-dotierten CNPs ein intensiver und breiter Peak bei 3400 cm ⁻¹ . auf , die durch die Streckschwingung von O–H verursacht wurde und der Biegeschwingung des absorbierten Wassers zugeordnet werden konnte. Der charakteristische Peak bei 1510 cm ⁻¹ könnte als –O–C–O antisymmetrische Dehnung beschrieben werden, während der Peak bei 1450 cm ⁻¹ konnte der symmetrischen Streckschwingung von –O–C–O zugeordnet werden, die beide die Anwesenheit von Nitratgruppen demonstrierten. Außerdem eine Absorptionsbande in 451 cm ⁻¹ wurde der asymmetrischen Ce-O-Strecke zugeordnet, was auf die Bildung von Ce-dotierten CNPs hinweist. Diese Ergebnisse zeigten, dass die funktionellen Gruppen von Ce-dotierten CNPs hauptsächlich bestimmte −OH und –COO ⁻ . enthielten Gruppen.

Ein FTIR-Spektrum von BSA und Ce-dotierten CNPs. B XRD-Muster der Ce-dotierten CNPs. C UV-Vis-Absorptionsspektren von Ce-dotierten CNPs. D UV-Vis-Absorptionsspektren von Methylviolett (MV) nach verschiedenen Behandlungen. a MV, b Mit H₂ . behandeltes MV O₂ und Ce-dotierte CNPs, c MV behandelt mit FeSO₄ und H₂ O₂ , und d MV behandelt mit FeSO₄ , H₂ O₂ , und Ce-dotierte CNP-Lösungen bei einer Inkubationszeit von 5 min

Mittels Röntgenbeugungsanalyse (XRD) wurde die Kristallstruktur der Ce-dotierten CNPs untersucht. Wie in Fig. 3B gezeigt, gibt es vier Hauptbeugungspeaks bei 24,4°, 30,3°, 35,23° und 43,2°. Einer dieser Peaks bei 24,4° kann der erzeugten anorganischen kohlenstoffhaltigen Struktur zugeschrieben werden, die den berichteten Kohlenstoffquantenpunkten und charakteristischen Graphitpeaks ähnelt [27,28,29]. Im Vergleich zur geordneten Kristallstruktur von Graphit (002 Ebenen, 2θ = 26,5°), wird der Beugungspeak von Ce-dotierten CNPs um 24,4° mit einer geringeren Verschiebung schwach, was auf stark ungeordneten Kohlenstoff und einen Anstieg des sp ² . zurückgeführt werden kann (C–C) Schichtabstände im Karbonisierungsprozess [30]. Die Beugungspeaks bei Winkeln von 30,3°, 35,23° und 47,42° stimmten größtenteils mit den (111)-, (200)- bzw. (220)-Ebenen der herkömmlichen Ceroxid-Nanopartikel überein. Darüber hinaus entsprachen andere Peaks bei Winkeln von 56,30°, 69,00°, 75,57° und 78,99° (311), (400), (331) und (402) des referenzierten Ceroxids (JCPDS 2004 36-1253). Der entsprechende Abstand \(\left(\textrm{Fm}3\overline{\textrm{m}}\right)\) wurde nach dem Bragg-Gesetz berechnet (die Wellenlänge des Cu-Kα-Gesetzes beträgt 0,154 nm). Diese Ergebnisse könnten vorläufig die Ce-dotierten CNPs mit der Hybridkristallstruktur bestätigen.

Es war allgemein bekannt, dass Fe ²⁺ kann alternativ die Dismutation des Wasserstoffperoxids katalysieren (H₂ O₂ ) in andere reaktive Hydroxylradikale gemäß der Fenton-Reaktion [31]. Als chromogenes Reagenz zeigt die Lösung von Methylviolett hauptsächlich Purpur. Gezielt mit –C=C– kann das Hydroxylradikal mit Methylviolett reagieren, was dazu führt, dass MV eine flache Farbe annimmt, sogar farblos, und seine maximale UV-Vis-Absorption bei 582 nm sinkt [32]. Gemäß unserem Design können Ce-dotierte CNPs sicherlich das Hydroxylradikal eliminieren und schließlich die Absorption des MV bei 582 nm erhöhen.

Um die zugrunde liegende Fähigkeit zum Abfangen freier Radikale für Ce-dotierte CNPs zu bestätigen, wurden UV-Vis-Absorptionsspektren von MV verwendet, um einige Erkenntnisse zu gewinnen. Es gab keine signifikante Absorption von 500 bis 700 nm in der wässrigen Lösung von Ce-dotierten CNPs in Abb. 3C. Wir konnten jedoch die maximale Absorption von Methylviolett bei etwa 582 nm beobachten und die Absorption wurde unter H₂ . gehemmt O₂ Behandlung (Abb. 3D). Bei Zugabe von Ce-dotierten CNPs in die Mischlösung wurde die Extinktion offensichtlich wiederhergestellt, was bewies, dass Ce-dotierte CNPs die Fähigkeit hatten, das Hydroxylradikal zu entfernen und das MV unter diesen experimentellen Bedingungen vor Angriffen zu schützen. Diese Ergebnisse werden eine weitere biomedizinische Anwendung bei der Behandlung von Krankheiten finden, die durch freie Radikale verursacht werden.

Zytotoxizitäts-Assay von Ceroxid-Nanopartikeln in vitro

Vor der Anwendung synthetisierter Ce-dotierter CNPs zur Behandlung von Krankheiten, die mit oxidativem Stress verbunden sind, ist es wichtig, ihre Biokompatibilität zu bewerten. In dieser Studie wurde die Wirkung von Ce-dotierten CNPs auf die Zelllebensfähigkeit durch Inkubation von VSMC- und 7721-Zellen mit Ce-dotierten CNPs unter Verwendung von Zelllebensfähigkeitstests des CCK-8-Assays bewertet. Es ist ersichtlich, dass die Lebensfähigkeit der Zellen nach einer Behandlung mit unterschiedlichen Konzentrationen von Ce-dotierten CNPs für eine Expositionszeit von 24 Stunden keine signifikanten Veränderungen aufwies (Abb. 4a). Selbst bei der höchsten Dosis von 400 μg/ml betrug die Zelllebensfähigkeit in allen Behandlungsgruppen etwa 90 %, was zeigt, dass Ce-dotierte CNPs eine sehr geringe Zytotoxizität auf Zellen aufwiesen. Diese Ergebnisse unterstrichen die günstige Zytokompatibilität von Ce-dotierten CNPs und machten sie für biomedizinische Anwendungen geeignet.

a Die Wirkung verschiedener Konzentrationen von Ce-dotierten CNPs auf die Zelllebensfähigkeit von VSMC- und 7721-Zellen durch CCK-8. Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit Ce-dotierten CNPs in verschiedenen Konzentrationen vorbehandelt und dann mit H₂ . verabreicht O₂ in unterschiedlichen Dosierungen. b Zelllebensfähigkeit von VSMC und c 7721 Zellen, kultiviert mit unterschiedlichen Konzentrationen von Ce-dotierten CNPs unter 560 μM H₂ O₂ -induzierter oxidativer Stress a durch CCK-8-Test

Antioxidative Eigenschaften und Radikalfängeraktivität von Ce-dotierten CNPs in vitro

Die Eigenschaft des mimetischen Enzyms von Ceroxid-Nanomaterialien ist für deren potenzielle therapeutische Anwendungen förderlich. Es wurde untersucht, ob Ce-dotierte CNPs in Lösung VSMC- und 7721-Zellen ausreichend vor freien Radikalen schützen würden. Für diese Studien H₂ O₂ wurde verwendet, um die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) zu induzieren, die zur Schädigung oder zum Tod der Zellen führen. Erstens die IC₅₀ Wert der Zelllebensfähigkeit wurde bestimmt, um die Schutzwirkung von Ce-dotierten CNPs zu untersuchen. Die Lebensfähigkeit von VSMC- und 7721-Zellen zeigte den niedrigen Wert nach der Zugabe von H₂ O₂ . Ein Trend zu erhöhter apoptotischer Aktivität für VSMC- und 7721-Zellen wurde mit steigendem H₂ . beobachtet O₂ Konzentration in Lösung (Abb. 4b). Mit anderen Worten, die Erhöhung des ROS war dosisabhängig, was auch die mediane letale Dosis (LD₅₀ ) von VSMC- und 7721-Zellen betrug ungefähr 549 bzw. 556 umol/ml. Als Ergebnis ist die LD₅₀ H₂ O₂ über oxidativen Stress betrug 560 μM, was nahe an den Ergebnissen der Literatur lag [33].

Als nächstes die antioxidative Wirkung von Ce-dotierten CNPs unter LD₅₀ von H₂ O₂ wurde unter Verwendung eines Zellzähl-Kit-6 (CCK-8)-Assays getestet. Aufgrund ihrer einzigartigen elektronischen Eigenschaften neigen Ce-dotierte CNPs dazu, in dualen Oxidationsstufen (Ce ³⁺ und Ce ⁴⁺ ) und werden über das Oxidations-Reduktions-Verhalten antioxidative Aktivität verliehen. Wenn ROS vorhanden ist, Ce ⁴⁺ stufenlos auf Ce ³⁺ umschaltbar zusammen mit der anhaltenden Radikalfängeraktivität [34, 35]. Wie in Abb. 4c gezeigt, implizierten diese Ergebnisse, dass die Zelllebensfähigkeit sowohl von VSMC- als auch von 7721-Zellen mit der Zunahme der Ce-dotierten CNP-Konzentration unter demselben oxidativen Stress allmählich verbessert wurde. Insbesondere wurde die Lebensfähigkeit der Zellen bei einer Ce-dotierten CNP-Konzentration von 400 μg/ml um etwa 88,0 % wiederhergestellt. Folglich zeigten die Ce-dotierten CNPs dosisabhängig eine herausragende antioxidative Wirkung durch eine effiziente Fängerfähigkeit freier Radikale.

Lebend-Tot-Färbung und Durchflusszytometrie-Assay wurden verwendet, um die zyto-antioxidative Wirkung von Ce-dotierten CNPs weiter aufzudecken. Wie in Abb. 5 dargestellt, wurde in den 7721-Zellen, die mit einzelnen Ce-dotierten CNPs behandelt wurden, eine intensive grüne Fluoreszenz ohne Rot beobachtet, aber in der H₂ . war viel rote Fluoreszenz zu sehen O₂ Behandlung von 556 uM, was H₂ . demonstrierte O₂ könnte eine dramatische Zellapoptose induzieren. Aber H₂ O₂ -induzierte Apoptose wurde mit dem Anstieg der Ce-dotierten CNP-Konzentrationen allmählich gelindert. Insbesondere war nach einer Behandlung mit Ce-dotiertem CNP von 400 μg/ml unter H₂ . nur eine geringe Menge roter Fluoreszenz zu sehen O₂ -induzierter oxidativer Stress, der auf eine höhere Lebensfähigkeit der Zellen hinweist. Weiterhin wurde ein Durchflusszytometrie-Assay durchgeführt, um die antioxidative Wirkung von Ce-dotierten CNPs zu untersuchen. Im Scatter-Plot der Doppelvariablen-Durchflusszytometrie wurde das Annexin-V-FITC-Emissionssignal auf dem x . aufgetragen -Achse, während das PI-Emissionssignal auf der y . aufgetragen wurde -Achse. Mehrere Zellregionen wurden wie folgt definiert:Annexin V-/PI––werden als lebende Zellen betrachtet, Annexin V+/PI––steht für frühe Apoptosezellen und Annexin V+/PI+–– steht für späte Apoptose-/Nekrosezellen. Wie in Abb. 6 gezeigt, zeigte die Kontrollgruppe eine kleine und normale Fraktion der späten Zellapoptose von 1,45%, aber H₂ O₂ Behandlung zeigte eine extrem hohe Rate der späten Zellapoptose von 46,4%. Wie von uns erwartet, weist der Anteil apoptotischer Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen an Ce-dotierten CNPs behandelt wurden, einen allmählichen Abwärtstrend auf. Im Vergleich zu 46,4 % der späten Zellapoptose unter H₂ O₂ Behandlung verringerte sich der Apoptose-Prozentsatz deutlich auf 24,2, 20,0, 15,1 und 11,2 % nach einer Ce-dotierten CNP-Behandlung von 50, 100, 200 und 400 μg/ml. Basierend auf den Ergebnissen der Live-Dead-Färbung und Durchflusszytometrie zeigte sich, dass Ce-dotierte CNPs dosisabhängig günstige antioxidative Wirkungen gegen oxidative Stress-induzierte Apoptose ausüben.

Fluorescent images of 7721 cells incubated with different concentrations of Ce-doped CNPs under H₂ O₂ -induced oxidative stress for 24 h by live-dead staining (scale bars = 50 μm)

Flow cytometry profiles of 7721 cells were examined to determine the percentages of early apoptosis and late apoptosis cells with different treatments

Conclusions

In summary, we reported a novel Ce-doped CNPs with the capability of scavenging free radicals. The preparation method is simple by using one-step synthesis in the bio-mineralization manner. Different from the former surface modification (such as PVP), the as-prepared Ce-doped CNPs exhibited the improvement in biocompatibility and dispersibility in aqueous solution. Furthermore, in vitro studies showed albumin-based bio-mineralization Ce-doped CNPs not only own superoxide dismutase feature but also alleviate the oxidative damage caused by H₂ O₂ , which have a protective effect on cells in this periods of study. Furthermore, the concentration of Ce-doped CNPs plays important roles in the recovery of apoptotic cells. Herein, the novel Ce-doped CNPs have promising biomedical applications in diseases prevention and treatment of oxidative stress-mediated.