Toxizitätsbewertung von PEG-PCCL-Nanopartikeln und vorläufige Untersuchung ihrer Antitumorwirkung der Paclitaxel-Beladung

Methoden

Materialien, Zellen und Tiere

ε-Caprolacton (ε-CL, Alfa Aesar, USA), Poly(ethylenglycol) (PEG, Mn = 1000, Fluka, USA), Hexamethylendiisocyanat (HMDI, Aldrich, USA), Palladium sur charbon (pd/c, Sigma , USA), Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM, Hyclone, USA), 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT, Sigma, USA), Rinderserumalbumin (BSA , BR, BoAo Co. Ltd., China) wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Alle Materialien waren von analytischer Reagensqualität.

Männliche Balb/C-Mäuse (7–8 Wochen alt, 20–25 g Gewicht) und neuseeländische Kaninchen (2,5–3,0 kg Gewicht) wurden von den Chengdu DaShuo Biotech Companies (Sichuan, China) mit dem Qualitätszertifikat Nr. SCXK2013– gekauft. 24. Die Tiere wurden in einer standardspezifischen, pathogenfreien Umgebung mit ausreichend Futter und Leitungswasser gehalten. Die Experimente wurden gemäß dem Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Ministry of Science and Technology of China, 2006) durchgeführt. Alle tierexperimentellen Verfahren wurden von der Ethikkommission für Labortiere des West China Medical Center der Sichuan University genehmigt.

Maus-H22-Hepatokarzinomzellen (H22), menschliche embryonale Nierenzellen (HEK293T) und Hepatomkarzinomzellen (Hep G2) wurden vom Department of Immunology, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University erhalten. HEK293T und Hep G2 wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Hyclone, UT, USA), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) (Hyclone, UT, USA) und Antibiotika (Penicillin 100 E/ml und Streptomycin .) kultiviert 100 U/ml) bei 37 °C in 5 % CO2.

Vorbereitung von PEG-PCCL- und PTX-beladenen PEG-PCCL-Mizellen

PEG-PCCL und PTX-NPs wurden von unserem Kooperationspartner Professor Liu von der School of Microelectronics and Solid-State Electronics, University of Electronic Science and Technology of China geliefert. Die PEG-PCCL-Diblockcopolymere wurden durch die Ringöffnungspolymerisation von ɛ-CL in Gegenwart von PEG-Homopolymer mit den Katalysatoren von Palladium sur charbon synthetisiert, wie das Flussdiagramm unten zeigt (Abb. 1). Die erhaltenen PEG-PCCL-Copolymere wurden gereinigt und bis zur Verwendung in luftdichten Beuteln aufbewahrt.

Das Flussdiagramm der Synthese des PEG-PCCL-Dipolymers

Um PTX in PEG-PCCL-Nanopartikel zu beladen, wurde eine feste Dispersion, eine einfache und wertvolle Technik ohne giftige organische Lösungsmittel [19] durchgeführt, nachdem PEG-PCCL hergestellt wurde. Dann wurde die Lösung bei 60 °C unter reduziertem Druck eingedampft. Nach dem Verdampfen des Alkohols wurden homogene Copolymere erhalten. PTX wurde in amorpher Form von polymeren Trägern eingekapselt. Die Coevaporation wurde in Wasser bei 65 °C gelöst, um eine PTX-NPs-Lösung herzustellen, die mit einem 0,22 nm-Filter filtriert wurde, um eine geklärte und sterile Lösung zu erhalten. PTX-NPs-Pulver wurde aus der lyophilisierten Lösung aus einem Gefriertrocknungssystem gewonnen. Die Einschlusseffizienz (EE) von PTX wurde mit der Minisäulen-Zentrifugationsmethode bestimmt [20]. Die Konzentrationen von PTX in PEG-PCCL (C_I ) oder das Gesamtarzneimittel in PEG-PCCL-Dispersionen (C_T ) wurden durch HPLC analysiert. EE (%) = (C_I / C_T ) × 100 %.

Charakterisierung

Die Partikelgröße und das Zetapotential von PEG-PCCL wurden mit einem Laser-Partikelgrößenanalysator (Malvern Nano-ZS 90) gemessen. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, H-6009IV, Hitachi, Japan) wurde verwendet, um die Morphologie von PEG-PCCL zu beurteilen. Insbesondere wurde die Lösung der Nanopartikel auf ein mit Nitrozellulose bedecktes Kupfergitter gelegt, und dann wurden die Proben mit Phosphorwolframsäure gefärbt und bei Raumtemperatur getrocknet.

Zytotoxizitätstests

Die Zytotoxizität wurde durch MTT- und LDH-Leakage-Assay in Hep-G2 und HEK293T bestimmt. Die MTS-Metabolisierung wurde in intakten Zellen nach dem Verfahren von MTT [21] quantifiziert. Zellsuspensionen wurden durch Trypsin/EDTA (HyClone, UT, USA) hergestellt. Insgesamt 0,4 × 10 ⁴ Zellen wurden in 96-Well-Platten (Corning, MA, USA) ausgesät. Die Platten wurden 12 h inkubiert, damit sich die Zellen an der Kunststoffoberfläche der Kulturplatten anheften konnten. Dann wurde das Medium entfernt und 200 μl frisches Kulturmedium oder Medium mit unterschiedlichen Konzentrationen von PEG-PCCL (von 0 bis 1 mg/ml) in die Vertiefungen gegeben. Während der 24-stündigen Expositionszeit wurde dem Medium kein FCS zugesetzt. Die Überlebensrate wurde durch Zytotoxizitätsparameter bestimmt und wurde durch die Gleichung dargestellt:Überlebensrate (%) = (OD_T /OD_C ) × 100. Hier, OD_T und OD_C beziehen sich auf den Absorptionswert (gemessen mit dem Spektralfotometer-Lesegerät bei 570 nm) von mit PEG-PCCL oder PEI-Nanopartikeln behandelten Zellen bzw. von unbehandelten Zellen.

Die LDH-Leckage im Kulturmedium wurde unter Verwendung des LDH-Assay-Kits (Biotech, China) untersucht. Alle spektrometrischen Messungen der mit Nanopartikeln behandelten Gruppen wurden durch eine zellfreie Kontrolle korrigiert. Für die morphologische Studie wurden HepG2-Zellen ausgesät und auf die gleiche Weise wie in den Zytotoxizitätsassays exponiert. Die Zellen wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert und unter dem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) beobachtet.

Apoptose-Assays

Die Apoptose wurde durch Annexin V-FITC und PI-Doppelfärbung bestimmt [22]. Kurz gesagt, HepG2-Zellen wurden in 12-Well-Platten mit einer Dichte von 4 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen/Vertiefung und behandelt mit PEG-PCCL (0,5 mg/ml) und PEI (0,5 mg/ml) für 48 Stunden. Dann wurden die Zellen dreimal mit kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, gefolgt von einer 15-minütigen Annexin-V-FITC-Inkubation und einer weiteren 15-minütigen PI-Färbung bei 4 °C im Dunkeln. Die gefärbten Zellen wurden innerhalb von 30 Minuten unter einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus Co. Ltd., Tokio, Japan) beobachtet.

Hämokompatibilitätstest

Die Hämokompatibilität von PEG/PCCL wurde anhand eines zuvor berichteten In-vitro-Hämolysetests für rote Blutkörperchen (RBC) bewertet [23]. Die Blutproben der Mäuse wurden gesammelt und die Erythrozyten wurden in PBS (2% RBC-Lösung) gelöst. Physiologische Kochsalzlösung, PEI oder PEG-PCCL von 0,5 mg/ml wurden mit der 2%igen RBC-Lösung gemischt. Eine positive Hämolysekontrolle wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens an Erythrozytensuspension und destilliertem Wasser hergestellt. Nachdem die Mischung 1 und 3 h bei 37 °C gehalten und dann 5 min bei 2000 U/min zentrifugiert wurde, wurden die Überstände mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Bio-Rad, CA, USA) bei 570 nm nachgewiesen. Der Prozentsatz der Hämolyse wurde nach folgender Gleichung berechnet:Hämolyse % = (OD_T –OD_NC )/(OD_PC –OD_NC ) × 100. Hier, OD_T , OD_NC , und OD_PC beziehen sich auf die Extinktionswerte der Probe, Negativkontrolle bzw. Positivkontrolle. Darüber hinaus wurde die In-vivo-Hämolyse durch Zählen der RBC-Zahl aus der Blutprobe, die durch die Schwanzvene der mit normaler Kochsalzlösung, PEI (20 mg/kg) oder PEG-PCCL (20 mg/kg) behandelten Mäuse für 3 h behandelt wurde, gemessen.

Kaninchen-Phlebitis

Venen in beiden Ohren von Kaninchen wurden verwendet, um die Entzündungszellinfiltration und die epidermale Degeneration zu vergleichen [24, 25]. Die Kaninchen wurden zufällig in zwei Gruppen eingeteilt; jeder erhielt entweder 1 ml physiologische Kochsalzlösung oder 0,5 mg/ml PEG-PCCL über die Ohrvene. Kaninchen wurden 24 h nach der Infusion der Nanopartikel durch eine Überdosis Chloralhydrat (4 %, Sigma, USA) getötet. Es wurden zwei Ohrvenenproben entnommen, einschließlich des Bereichs 10–15 mm von der Katheterspitze sowohl proximal als auch distal. Diese Venen wurden in 4% Paraformaldehydlösung fixiert. Dann wurden Paraffinquerschnitte hergestellt und mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt. Die histopathologische Untersuchung wurde blind durchgeführt. Die Befunde wurden nach den in der Tabelle aufgeführten Kriterien bewertet, die sich an denen von Kuwahara [17] unter Hinzufügung der epidermalen Degeneration orientierten.

Hepatorenale Funktionstests

Nach 7 Tagen der Verabreichung von PEG-PCCL (0,5 ml, 20 mg/kg) an Mäuse wurden die Blutproben aus dem orbitalen Venenplexus (2 ml) extrahiert und sofort bei 1300 g, 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde abgezogen. Dann wurden die biochemischen Parameter des Serums [26], einschließlich Aspartataminotransferase (AST), Alaninaminotransferase (ALT), alkalische Phosphatase (ALP), Bilirubi, Kreatinin, Harnsäure und Albumin, mit einem biochemischen automatischen Tieranalysator (Dri-Chem 3000 .) bewertet , Fuji Photo, Tokio, Japan), die indirekte Indikatoren für die Leber- und Nierenfunktion sind.

Histopathologische Untersuchung

Die histopathologischen Veränderungen von Lunge, Leber und Niere wurden mit H&E-Färbung 24 h, 48 h und 7 Tage nach Injektion von PEG-PCCL, PEI-Lösung oder normaler Kochsalzlösung (0,5 ml, 20 mg/kg) an Mäusen untersucht Schwanzvene. Diese Organe wurden nach Tieropferung gewonnen. Der histopathologische Schnitt und die H&E-Färbung wurden wie an anderer Stelle beschrieben durchgeführt [26]. Die histopathologischen Veränderungen wurden unter dem Lichtmikroskop beobachtet und mit einer sortierten Kamera (Leica, Co. Ltd., Deutschland) aufgezeichnet.

Blutkonzentration

Die Blutkonzentration von PTX wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers (LAMBDA 950, PerkinElmer, China) berechnet. Blutproben wurden 0,08, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 6, 12, 24 h nach der Behandlung aus dem Orbit der Mäuse entnommen. Der Überstand (100 μl) wurde gesammelt, nachdem er 10 Minuten lang bei 1300 g zentrifugiert wurde. Die PTX-Konzentration in jeder Blutprobe wurde mit einem Spektrophotometer bei 760 nm bestimmt.

Maus-Tumormodelle und -Behandlung

H22-Zellsuspension (0,25 ml, 4 × 10 ⁶ Zellen/Maus) wurde Balb/C-Mäusen am Tag 0 intraperitoneal injiziert. Als sich Aszites bildete (an Tag 3 bis 5), wurden tumortragende Mäuse zufällig in drei Gruppen (n = 5) und die Behandlung wurde eingeleitet. Den Mäusen wurde an den Tagen 3 und 10 normale Kochsalzlösung, PEG-PCCL/PTX (20 mg/kg) oder PTX (10 mg/kg) intraperitoneal in einem Volumen von 0,5 ml injiziert, um die Antitumorwirksamkeit zu bewerten. Der Bauchumfang (AP) wurde jeden Tag gemessen, um den erhöhten Prozentsatz von AP (IPAP) wie folgt zu berechnen:IPAP = (P _n − P ₀ )/P _n . Am Tag 10 wurden die überlebenden Mäuse durch zervikale Dislokation getötet und der Aszites wurde gesammelt und gewogen. Die Überlebenszeit der Mäuse wurde bis zum 20. Tag beobachtet. Tumortragende Mäuse wurden am Endpunkt mit Leidenszeichen, einschließlich hoher Atemfrequenz, Kräuseln des Fells, gebeugter Haltung, reduzierter Aktivität und fortschreitender Aszitesbildung, hingerichtet [27]. Die Antitumoraktivität wurde umfassend anhand der Überlebenstage, des Bauchumfangs und des Aszitesvolumens bewertet. Die Mäuse wurden unter Standardlaborbedingungen gefüttert.

Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit SPSS 19.0 (IBM, NY, USA) durchgeführt. Jede experimentelle Behandlung wurde unabhängig mindestens dreimal wiederholt. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Die Varianzanalyse (ANOVA) wurde für die statistische Analyse verwendet. Der Grad jedes Phlebitis-Befundes wurde durch den Wilcoxon-Rangsummentest analysiert. Der Dunnett-Test wurde verwendet, um die einzelnen Interventionen zu vergleichen. Statistische Signifikanz wurde bei P . angegeben < 0.05.

Ergebnisse

Morphologie, Durchmesser und Zeta-Potenzial von PEG-PCCL

Die Ergebnisse des Laser-Partikelgrößenanalysators zeigten, dass der durchschnittliche Durchmesser von PEG-PCCL 97 ± 2,6 nm betrug. Die TEM-Ergebnisse von PEG-PCCL (Abb. 2) zeigten, dass PEG-PCCL kugelförmige Formen aufwies und in der Lösung einheitlich war. Das durchschnittliche Zetapotential von PEG-PCCL betrug − 18,4 mV. Die Minisäulen-Zentrifugationsmethode zeigte, dass der EE% 55,98% betrug.

Das Merkmal von PEG-PCCL:TEM-Bild. Maßstabsbalken waren 100 nm

Zytotoxizität

Die Zytotoxizität von PEG-PCCL wurde durch Vergleich mit PEI, einem typischen nanoskaligen Vehikel, in HEK293T- und Hep-G2-Zelllinien bewertet. Innerhalb des Konzentrationsbereichs (von 0 bis 1 mg/ml) von PEG-PCCL oder PEI war die Lebensfähigkeit sowohl von HEK293T-Zellen (Abb. 3a) als auch von Tumorzellen (Hep-G2) (Abb. 3b) konzentrationsabhängig . gesunken Benehmen. Die embryonalen Zellen erschienen bei einer Konzentration von 0,25 mg/ml empfindlicher, während Tumorzellen über 1 mg/ml schienen. Im Vergleich zu PEI zeigte PEG-PCCL eine geringere Zytotoxizität, insbesondere bei höheren Konzentrationen, d. h. 0,75 und 1 mg/ml (P = 0,023). Der LDH-Assay zeigte, dass die Todesrate sowohl in embryonalen Zellen als auch in Tumorzellen mit der Expositionszeit zunahm; (i) es war 19 bzw. 42 % nach 24 bzw. 48 h bei 0,5 mg/ml PEG-PCCL (Abb. 3c) weniger als bei PEI. (ii) Tumorzellen zeigten eine etwas niedrigere Todesrate (32 %) zum Zeitpunkt von 48 Stunden, wenn Zellen PEG-PCCL im Vergleich zu PEI ausgesetzt waren (P = 0,037) (Abb. 3d).

Die Zytotoxizität von PEG-PCCL im Vergleich zu PEI. a , b Der MTT-Assay zeigte die Überlebensrate von 293 T und die HepG2-Konzentration abhängig von der negativ kontrollierten Gruppe (PEI). c , d LDH-Leakage-Assay von 293 T und HepG2 bei Exposition gegenüber PEG-PCCL und PEI nach 48 h. *P < 0,05 im Vergleich zur PEI-Gruppe

SEM

Die elektronenmikroskopischen Bilder von intakten Hep-G2-Zellen und Zellen, die mit PEG-PCCL-Nanopartikeln behandelt wurden, sind in Abb. 4 gezeigt. In intakten Hep-G2-Zellen gab es reichlich Mikrovilli (Mv) auf jeder Oberfläche, und der Kern (N) war mehr zu den Basen als zum apikalen Teil gelegen. Zahlreiche Mitochondrien (Mt), Golgi-Komplex (Go) und raues endoplasmatisches Retikulum (RER) waren im Zytoplasma verteilt. In PEG-PCCL-behandelten Zellen waren die pinocytotischen Vesikel definitiv erhöht. Es wurden keine signifikanten histopathologischen Veränderungen beobachtet und runde N- und zytoplasmatische Organellen einschließlich Mt, RER und Go waren intakt.

Elektronenmikroskopische Aufnahmen. a , b Normale HepG2-Zellen. c , d Zellen, die mit PEG-PCCL-Nanopartikeln durch SEM (Rasterelektronenmikroskop) behandelt wurden. Der dunkle Pfeil zeigt auf die pinocytotischen Vesikel

Apoptose

Eine signifikante Abnahme der Lebensfähigkeit von Zellen kann mit den Eigenschaften der Partikelgröße, Oberflächenchemie und Konzentration korreliert werden [28], was unser Interesse an den Mechanismen weckte, die dem beobachteten Zelltod in HepG2-Zellen zugrunde liegen. Um zu bestimmen, ob der Zelltod auf Apoptose oder Nekrose zurückgeführt wurde, wurden HepG2-Zellen mit PEI oder PEG-PCCL für Annexin V- und PI-Co-Färbung behandelt. Wie unter dem Fluoreszenzmikroskop (Abb. 5) beobachtet, zeigten die entweder mit PEI oder PEG-PCCL behandelten Zellen eine frühere Apoptose im Vergleich zur leeren Kontrollgruppe, was durch eine grüne Fluoreszenz, die durch Annexin V gefärbt wurde, angezeigt wurde. PEI-behandelte Zellen zeigten eine stärkere Apoptose als diese von PEG-PCCL, was dem vorherigen Ergebnis des MTT-Assays entsprach.

Die FITC-Annexin-V-Färbung repräsentierte die Zellapoptose. HepG2-Zellen, die 48 h lang mit Nanopartikeln in einer Konzentration von 0,5 mg/ml inkubiert und dann mit Propidiumiodid (rot) und Annexin V (grün) angefärbt wurden, wurden bei × 40

Biokompatibilität

Hämolyse

Da biokompatible Nanopartikel für endovaskuläre Anwendungen konzipiert sind, sind Untersuchungen zur Hämokompatibilität und endothelialen Zytotoxizität erforderlich. In-vitro-Tests zeigten, dass die Hämolyse während der 3-stündigen Beobachtung mit der Zeit zunahm, wobei PEG-PCCL ein niedrigeres Hämolyseverhältnis aufwies als normale Kochsalzlösung (Abb. 6a). Der in-vivo-Test zeigte eine ähnliche Tendenz. Im Gegensatz dazu verursachte PEI sowohl in vitro als auch in vivo eine schwere Hämolyse (Abb. 6b).

Hämolyseverhältnis und Zellzahl (× 10 ⁹ /l) Blutprobe in 3 h. In vitro (a ) in vivo (b ) *P < 0,05 versus negative Kontrollgruppe

Kaninchen-Phlebitis

Die histopathologische Untersuchung (Abb. 7) zeigte ein intaktes Gefäßendothel ohne Chrondrozytennekrose im Ohrknorpel. Es wurde ein geringes Ödem des proximalen Teils der Vene beobachtet. In Bezug auf den Verlust venöser Endothelzellen und die Infiltration von Entzündungszellen war die Koinfusion (Tabelle 1) von Gruppen, die nach 12 und 24 h mit PEG-PCCL behandelt wurden, tendenziell erhöht, aber die Verbesserung war statistisch nicht signifikant ( P> 0,05).

Mikrophotographien der Ohrvene nach 24-stündiger Infusion, gefärbt mit H&E. a , b Infusionsgruppe mit normaler Kochsalzlösung. c , d Infusionsgruppe mit PEG-PCCL. Die Nadeln stellen den Ohrknorpel dar. (Linkes Bild × 10, rechtes Bild × 40)

Organtoxizität

Um die akute Toxizität von PEG-PCCL in wichtigen Organen zu bewerten, wurden nach intravenöser Verabreichung von 0,5 mg/ml PEG-PCCL über 3 Tage bei Mäusen (n = 5). Als Kontrollen wurden normale Kochsalzlösung und PEI verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass PEI eine leichte Entzündung und Dicke des lobulären Interstitiums sowie eine Karyopyknose der Hepatozyten verursachte (Abb. 8). Obwohl im Vergleich zur Gruppe mit normaler Kochsalzlösung keine offensichtlichen histopathologischen Veränderungen in allen untersuchten Organen in der mit PEG-PCCL behandelten Gruppe beobachtet wurden (Fig. 7); Die hepatorenale Funktion wurde auf weitere Bestätigung ihrer Nichttoxizität untersucht (Tabelle 2).

Das H&E färbt lichtmikroskopische Bilder von Lunge, Leber und Niere. Die Bilder werden von Mäusen gesammelt, denen NS, PEI und PEG-PCCL intravenös verabreicht wurden. Die Nadeln repräsentieren die Karyopyknose der Hepatozyten. (Bilder der linken Spalte, × 10; Bilder der rechten Spalte × 40)

Pharmakokinetische Studie

Eine pharmakokinetische Studie wurde nach intravenöser Injektion von 10 mg/kg PTX von Taxol® oder 20 mg/kg PEG-PCCL/PTX (PP + PTX) (50 % Beladungsverhältnis) durchgeführt. Der Spitzenwert der Plasmakonzentration (Cmax) betrug 312 ± 2,59 µg/ml (PTX) und 283 ± 2,79 µg/ml (PP  +   PTX). Die Zeit der maximalen Konzentration (Tmax) und die Fläche unter der Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve betrugen 0,54 ± ± 0,20 h, 52,00 ± 4,30 µg h/ml und 4 ± 1,22 h, 282,21 ± 21,08 µg h/ml für PTX und PTX-NPs , bzw. Die Blutkonzentration-Zeit-Kurve ist in Abb. 9 dargestellt.

Die Blutkonzentration-Zeit-Kurve. Bei Mäusen nach intravenöser Verabreichung mit PTX oder PP + PTX. (n = 6)

Wirkung von PEG-PCCL/PTX auf tumortragende Mäuse

Um die Antitumorwirkung von PEG-PCCL/PTX in vivo zu untersuchen, wurde (i) der erhöhte Prozentsatz des abdominalen Perimeters (IPAP) von H22-Tumor-tragenden Mäusen täglich berechnet (Abb. 10a). An Tag 3 begann sich der Aszites zu bilden und der IPAP jeder Gruppe war dramatisch erhöht, wobei die PP/PTX-Gruppe und die PTX-Gruppe im Vergleich zur NS-Gruppe mit der Zeit einen langsameren Anstieg zeigten. (ii) Aszites wurde am Tag 10 gesammelt und das Volumen wurde gemessen (Abb. 10b). Im Vergleich zur NS-Gruppe war das Aszitesvolumen sowohl der PTX-Gruppe als auch der PP/PTX-Gruppe signifikant reduziert (P = 0,0005 und P = 0,0052), wobei die PP/PTX-Gruppe ein geringeres Volumen aufwies als die PTX-Gruppe (P =0,0138). (iii) das Überleben jeder Gruppe wurde für 20 Tage ab Tag 0 beobachtet. Die PP/PTX-Gruppe und die PTX-Gruppe hatten eine längere Lebensdauer und eine höhere Überlebensrate als die NS-Gruppe.

Die Anti-Tumor-Wirkung von PP/PTX bei H22-Tumor-tragenden Mäusen. a Balb/C-Mäuse (n = 5) wurden am Tag 3 intraperitoneal mit PP/PTX oder PTX injiziert. b Aszites jeder Gruppe (n = 5) wurden am Tag 10 gesammelt. c Das Überleben jeder Gruppe (n = 10) wurde täglich beobachtet. *P < 0,05, **P < 0.01, ***P <0,001

Diskussion

Viele Polymere, einschließlich PEI, wurden als Träger chemischer und biopharmazeutischer Arzneimittel für eine geeignete Konjugation vorgeschlagen. PEI ist ein umfassend untersuchtes kationisches Polymer und gilt als Goldstandard in Assays zur Transfektionseffizienz [29]. Die Nebenwirkungen (z. B. Zytotoxizität) verhindern jedoch die Anwendung von PEI in der medizinischen Anwendung. Um nach einem sichereren und wirksameren nanobasierten Material zu suchen, haben wir erfolgreich einen neuen Kandidaten für die Wirkstofffreisetzung hergestellt; PEG-PCCL zeichnet sich durch hohe Hydrophilie und günstige Stabilität aufgrund der Wirkung der Wasserstoffbrücke aus. Der Hauptzweck der Studie war die Bewertung der In-vivo- und In-vitro-Toxizität von PEG-PCCL, die ein potenziell therapeutisches Fenster für die Behandlung von Krebs eröffnet.

Da eine erhöhte Permeabilität und ein Retentionseffekt als tumorselektive Abgabemechanismen angesehen werden, wurde den Nanoarzneimitteln große Aufmerksamkeit geschenkt [30, 31]. Die Nanopartikel mit kleinerem Durchmesser haben eine bessere Immunkompatibilität [32] und eine geringere Aufnahme durch die Leber, eine längere Blutzirkulationszeit und eine höhere Bioverfügbarkeit [33].Unsere Dipolymere haben geeignete Größen (97 ± 2,6 nm) (Abb. 2), um in und aus dem Tumorblutgefäß austreten sowie dem Immunsystem des Wirts entgehen, während die kationischen Polymere mit dem positiven Zetapotential als toxisch beschrieben wurden [34]. Diese Toxizität von PEG-PCCL mit negativem Zetapotential sollte idealerweise vermieden werden. Tatsächlich gab es bei den Toxizitätsbewertungen in der vorliegenden Studie nur wenige Bedenken hinsichtlich der Toxizität von PEG-PCCL. Ähnliche Ergebnisse wurden auch von anderen Labors berichtet [35,36,37].

Die in vitro-Experimente zeigten eine toxizitätsfreie Eigenschaft für PEG-PCCL. Wie im SEM beobachtet (Abb. 4), (i) wiesen pinozytotische Vesikel, die durch einen dunklen Pfeil erkannt wurden, auf eine anfällige Endozytose hin [38]. (ii) Vollständiger Zellkern und intakte Organellen (Mt, RER und Go) zeigten eine geringe Zytotoxizität und eine gute Biokompatibilität von PEG-PCCL auf zellulärer Ebene. Im MTT-Assay und LDH-Leakage-Assay (Abb. 3) führten PEI und PEG-PCCL dosis- und zeitabhängig zu einem ähnlichen Trend der Zelllebensfähigkeit sowohl bei 293 T-Zellen als auch bei HepG2-Zellen, PEG-PCCL zeigte jedoch niedrigere Zytotoxizität insbesondere bei höheren Konzentrationen (P < 0,05). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die kovalente Bindung von Carboxyl die zusätzliche Toxizität nicht erhöht. Die In-vitro-Hämolyse wird allgemein als nützliche und zuverlässige Methode zur Bewertung der NP-Blutverträglichkeit akzeptiert. Im In-vitro-Hämolysetest zeigte PEG-PCCL ein niedrigeres Hämolyseverhältnis als normale Kochsalzlösung (Abb. 6a). Dies kann auf das negative Potenzial von PEG-PCCL zurückzuführen sein, das die Blutzellen schützt. Der in vivo Hämolysetest zeigte eine ähnliche Tendenz. Im Gegensatz dazu zeigte PEI eine schwere Hämolyse. Collectively, PEG-PCCL nanoparticles are hemocompatible as they did not exhibit any hemolytic effect neither in vitro nor in vivo model (Fig. 6b).

The innoxious nature of PEG-PCCL was further proved by in vivo experiments. Since phlebitis induced by intravenously administered antineoplastic agents [24] is frequently seen in clinical practice, we tested the inflammatory reaction after PEG-PCCL injection. In the rabbit phlebitis study (Fig. 7), little inflammatory infiltration or tissue edema was observed, indicating that the new formulation of chemotherapeutic drugs captured by PEG-PCCL is biocompatible, and that co-infusion of PEG-PCCL could be a favorable candidate as intravenous drug deliverer. Meanwhile, in the H&E staining assay (Fig. 8), no obvious histopathological changes of organs were observed in PEG-PCCL nanoparticles treatment group compared to normal group. Further hepatorenal function was investigated for safety evaluation (Table 2), in which no significant differences were shown between normal saline group and PEG-PCCL group. Consequently, it is evident that PEG-PCCL is a kind of safe and non-toxic nanoparticles with potentiality to be applied in targeting intervention.

Furthermore, preliminary evaluation of drug-loaded effect in regard of pharmacokinetics and anti-tumor was carried out in H22 tumor-bearing mice. In the pharmacokinetic study (Fig. 9), Tmax of PP + PTX was 4 ± 1.22 h, which exhibited better persistence than that of PTX (0.54 ± 0.20 h). PP + PTX also performed larger area under the plasma concentration-time curve than PTX. These results showed that PEG-PCCL/PTX lasted longer than PTX alone in blood, which indicated higher stability and more delayed release of PEG-PCCL/PTX. However, the EE% of PEG-PCCL was dissatisfactory (55.98%) and sustained drug release was less than ideal (4 ± 1.22 h). Therefore, more research is needed to modify the nanoparticle to achieve a higher EE and longer drug release. For example, adjusting the proportion of PEG and PCCL can be considered [39]. Although no metastasis was seen in abdominal organs in our model, tissue distribution and concentration of PTX-NPs should be investigated in further study to find out the possible side effects. Moreover, the combination of PEG-PCCL and PTX made an improvement in life expectancy and a reduction in tumor ascites formation (Fig. 10). Notably, the anti-tumor effect was enhanced when PTX was loaded with PEG-PCCL, suggesting a possibility of a promising drug carrier. Besides, nanoparticles may be beneficial to confront anti-tumor drug resistance. Modification with folate [40] has been reported to overcome TLR4 driven chemotherapy resistance, and its co-encapsulation of anti-tumor agents [41] could be a promising option. Nanoparticle modified by additional Fe₃ O₄ [42] may be more easily guided to its targets under the applied magnetic field, which would lower chemotherapeutic drugs-induced systemic toxicity [43].

Conclusions

PEG-PCCL nanospheres showed less cytotoxicity and better biocompatibility than mature medical nanoparticles (PEI) at the therapeutical concentration. PEG-PCCL-loaded PTX revealed higher stability and slower release in tumor mice. These results suggest that PEG-PCCL is a potential candidate of biocompatible drug vehicle for hydrophobic drugs.