Vergleichende Toxizität von PEG-beschichteten Cobaltferrit-Nanopartikeln und Nanosphären

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine vergleichende Studie der Toxizität von Polyethylenglykol (PEG)-beschichteten Cobaltferrit-Nanopartikeln und Nanosphären. Nanopartikel wurden durch hydrothermale Methode hergestellt, während Nanosphären durch solvothermale Technik synthetisiert wurden. Die Oberfläche der Nanomaterialien wurde erfolgreich mit Polyethylenglykol modifiziert. Zur Untersuchung der Morphologie der hergestellten Proben wurden Röntgendiffraktion (XRD), Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR), Raman-Spektroskopie, Thermogravimetrische Analyse (TGA) und Elektronenmikroskopie-Techniken eingesetzt. Strukturanalysen bestätigten die Bildung von polykristallinen Cobaltferrit-Nanopartikeln mit Durchmessern im Bereich 20–25 nm und Nanosphären im Bereich 80–100 nm. Kunming SPF-Mäuse (weiblich, 6–8 Wochen alt) wurden verwendet, um die durch Cobaltferrit-Nanopartikel und Nanosphären induzierte Toxizität in verschiedenen Organen der Mäuse zu untersuchen. Biodistributionsstudien, biochemische Indizes, histopathologische Bewertungen, Entzündungsfaktoren, Oxidations- und Antioxidationslevel sowie Zytotoxizitätstests wurden durchgeführt, um die Toxizität von Cobaltferrit-Nanopartikeln und Nanosphären in Mäusen zu bewerten. Cobaltferrit-Nanosphären erwiesen sich als toxischer als die Nanopartikel, und Curcumin erwies sich als guter Heilungsfaktor für die durch PEG-beschichtete Cobaltferrit-Nanomaterialien induzierte Toxizität in Mäusen.

Einleitung

In den letzten Jahren haben magnetische Nanomaterialien sowohl in der Grundlagenforschung als auch in technologischen Anwendungen enormes Interesse geweckt. Diese Anwendungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Drug-Delivery-Fahrzeuge [1–3], Magnetresonanztomographie (MRT) [4–6], Hyperthermie [7–9], Biosensoren [10], Zellseparation [11], Proteinseparation [11, 12], Gen-Magnetofektion [13–15] und Umweltverschmutzung und Sanierung [16, 17]. Cobaltferrit, als hartmagnetisches Material, wird als Kontrastmittel für MRT, gezielte Drug-Delivery und Heizmediator in Hyperthermie eingesetzt [18–23]. Obwohl Cobaltferrit in biomedizinischen Anwendungen verwendet wird, hat es bestimmte Einschränkungen wie seine hohe Toxizität aufgrund der bemerkenswerten Menge an Cobalt, das in Lösung freigesetzt wird, Aggregation in Lösung und schlechte Zugänglichkeit der Oberfläche bei Verwendung von Tensiden. Daher wurde dieses Problem durch Oberflächenmodifikation mit bestimmten biokompatiblen, ungiftigen, wasserstabilen und dispergierenden Materialien überwunden [24–28]. Zudem ist die Herstellung von Cobaltferrit einfach und kosteneffektiv mit maßgeschneiderten Zusammensetzungen, Formen und Größen für jede bestimmte Anwendung. Es gibt eine Vielzahl von Techniken zur Synthese von nanoskaligem Cobaltferrit, einschließlich mechanochemischer [29], sonochemischer [30], Ko-Fällung [31, 32], Mikroemulsion [33] und anderer [34–38]. Ebenso wurden andere Techniken einschließlich eines einstufigen umweltfreundlichen Verfahrens für die Herstellung maßgeschneiderter fluoreszierender Kupfer-Nanocluster unter Verwendung von Curcumin als Template eingesetzt [39]. Ein Hauptnachteil der meisten dieser Techniken ist die geringe Kristallinität des hergestellten Materials, was wiederum zu einer signifikanten Verschlechterung der magnetischen Eigenschaften führt. In dieser Hinsicht sind hydrothermale [40] und solvothermale [41] Techniken die effektivsten und effizientesten Methoden, um Cobaltferrit mit kontrollierten Morphologien und Kristallinitäten zu synthetisieren.

In der Literatur wurden verschiedene Nanomaterialien wie Silber-Nanopartikel (Ag NPs) für antimikrobielle Behandlung und assoziierte Infektionskrankheiten sowie als Nanofahrzeuge für Drug-Delivery und Behandlung verschiedener Krankheiten berichtet [42]. In einem Übersichtsartikel wurde berichtet, dass Ferrate zur Eliminierung einer Vielzahl chemischer und biologischer Spezies aus Abwasser eingesetzt werden [43]. Bei biomedizinischen Anwendungen von Cobaltferrit-Nanomaterialien ist das Hauptproblem die Anreicherung von Cobaltferrit in Organen, was zu Toxizität im Körper führt, die eine dringende Entfernung der angesammelten Nanomaterialien aus den Organen und Heilung der durch Cobaltferrit induzierten Schäden erfordert. Mehrere Forscher haben entzündungshemmende Medikamente untersucht und festgestellt, dass diese die durch Nanomaterialien induzierte Toxizität reduzieren können [44, 45]. Curcumin mit antioxidativen, antimutagenen, anti-tumorigen und karzinogenen Eigenschaften kann als Heilungsfaktor für die durch Cobaltferrit-Nanomaterialien induzierte Toxizität verwendet werden [46–48]. Es hat die Fähigkeit, als TNF-Blocker in vitro und in vivo zu wirken, indem es direkt an TNF bindet [49].

Das Ziel dieser Arbeit war es, Polyethylenglykol (PEG)-beschichtete Cobaltferrit-Nanopartikel und Nanosphären im Labor mit kontrollierten Morphologien herzustellen. Verschiedene Dosen der Nanomaterialien wurden intravenös in Mäuse injiziert und Bluttanalysen, Biodistribution, HE-Färbung und Zelllebensfähigkeitsstudien durchgeführt, um die Toxizität dieser Nanomaterialien zu bewerten. Ein Vergleich der Toxizität von Cobaltferrit-Nanopartikeln und Nanosphären wurde durchgeführt und Curcumin als Heilungsfaktor für die durch Cobaltferrit-Nanosphären induzierte Toxizität in Mäusen eingesetzt. Es wurde gezeigt, dass Cobaltferrit-Nanosphären toxischer sind als Nanopartikel aufgrund ihrer vergrößerten Oberflächen, die sie toxischer und reaktiver machen als Nanopartikel. Soweit uns bekannt, ist dies die erste detaillierte Studie dieser Art, die bisher nicht durchgeführt wurde.

Materialien und Methoden

Herstellung der Nanomaterialien

Für die Herstellung von PEG-beschichteten Cobaltferrit-Nanopartikeln wurde die hydrothermale Technik [40, 47] angewendet. Zu diesem Zweck wurden Lösungen von Cobaltchlorid (0,2 M) und Eisen(III)-nitrat (0,4 M) getrennt in jeweils 25 ml deionisiertem (DI) Wasser hergestellt und dann mit 25 ml wässrigen Lösungen von Polyethylenglykol (2,5 mM) und Natriumhydroxid (3 M) vermischt. Das Gemisch wurde 20 Minuten gerührt und in einen Edelstahl (SS) Autoklaven gegossen, der 6 Stunden bei 180 °C erhitzt wurde. Nach Abschluss des Prozesses wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt und die Lösung 2–3 Mal mit DI-Wasser und Ethanol gewaschen, um unerwünschte Verunreinigungen zu entfernen. Das Gemisch wurde über Nacht bei ca. 80 °C im Ofen getrocknet und dann zu feinen Pulvern vermahlen, um die gewünschten Cobaltferrit-Nanopartikel zu erhalten.

Für die Herstellung von PEG-beschichteten Cobaltferrit-Nanosphären wurde die solvothermale Technik verwendet. Hierzu wurde Cobaltchlorid-Hexahydrat in 40 ml Ethylenglykol (2,5 mM) gelöst, woraufhin 1,35 g Eisenchlorid-Hexahydrat und 1 g Polyethylenglykol (PEG) hinzugefügt wurden. Das Gemisch wurde etwa 30 Minuten gerührt und dann in einen mit Teflon ausgekleideten SS-Autoklaven versiegelt. Der Autoklav wurde dann 8 Stunden bei 200 °C erhitzt und nach Abschluss der Reaktion auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Gemisch wurde mit deionisiertem Wasser und Ethanol gewaschen und über Nacht bei 80 °C im Ofen getrocknet. Schließlich wurde das Gemisch zu feinen Pulvern vermahlen, um PEG-beschichtete Cobaltferrit-Nanosphären mit Durchmessern im Bereich 80–100 nm zu erhalten. Die Morphologie der hergestellten Nanomaterialien wurde durch Röntgendiffraktion (XRD) gemäß der in Ref. [50] verwendeten Methode, Raster- und Transmissions-Elektronenmikroskopie (REM und TEM) wie in Ref. [50, 51] verwendet, Raumtemperatur-Fourier-Transform-Infrarot (FTIR)-Spektroskopie zur Bestimmung funktioneller Gruppen in Cobaltferrit ähnlich wie in Ref. [51], Raman-Spektroskopie und Thermogravimetrische (TGA) Analyse wie in Ref. [52] verwendet, untersucht.

Radioaktive Markierung der Nanomaterialien

Die Radiomarkierung von PEG-beschichteten Cobaltferrit-Nanopartikeln und Nanosphären wurde mit ^99mTc unter Verwendung von Zinn(II)-chlorid als Reduktionsmittel durchgeführt [53–55]. Zu diesem Zweck wurde frisches ^99mTcO₄-Generator-Eluat (50 μl mit einer Aktivität von ~4 mCi) hergestellt, indem es zu 30 μl SnCl₂-Suspension (1 mg/ml in 0,5 N HCl) gegeben wurde. Mit Hilfe von NaHCO₃-Lösung (1 M) wurde der pH-Wert der Suspension in den Bereich 8–10 eingestellt. Lösungen von Nanopartikeln und Nanosphären (je 40 μl) mit ~0,4 Gew.-% Cobaltferrit wurden mit Suspensionen von Zinn(II)-chlorid (50 μg), Ascorbinsäure (10 mg/ml) und ^99mTcO₄ vermischt. Das Gemisch wurde dann bei 10.000 U/min für 25 Minuten bei 80 °C gerührt. Für genaue Messungen wurden die radioaktiven Zählimpulse innerhalb von 24 Stunden aufgrund der kurzen Lebensdauer von ^99mTc (~6 h) aufgezeichnet. Der Überstand wurde nach Zentrifugation abdekaniert und das verbleibende Material als ^99mTc-PEG-Cobaltferrit-Nanopartikel und Nanosphären identifiziert. Papierchromatographie wurde verwendet, um die radioaktiven Ausbeuten der markierten Verbindungen zu messen, die über 65 % betrugen und die tatsächliche Biodistribution der Nanomaterialien in Mäusen in vivo widerspiegelten.

Biodistribution der Nanomaterialien

Wie in Abb. 1 angegeben, wurden Kunming SPF-Mäuse (weiblich, 6–8 Wochen alt, Gewicht 18–20 g) vom Laborzentrum für Medizinische Wissenschaften, Lanzhou Universität, China, bezogen. Alle Mäuse wurden in Käfigen unter temperaturkontrolliertem System bei 21–22 °C gehalten; das Licht war von 08:00 bis 20:00 Uhr eingeschaltet. Freier Zugang zu Futter und Leitungswasser wurde den Mäusen gewährt, und sie wurden gemäß den Protokollen der Laboratory Animal Care Formulated by the National Society of Medical Research und den Richtlinien der US National Institutes of Health behandelt. Die Mäuse wurden zufällig in mehrere Gruppen mit jeweils 5 Mäusen aufgeteilt und dann intravenös mit ^99mTc-PEG-Cobaltferrit-Lösungen von Nanopartikeln und Nanosphären injiziert und nach 1 h, 6 h, 16 h und 24 h getötet. Gewebe von Herz, Lunge, Leber, Milz und Niere wurden sofort dissectiert, in Folie gewickelt, gewogen und die Radioaktivität von ^99mTc in jedem Gewebe mit einem Gammazählerdetektor gemessen. Die Biodistribution der Nanomaterialien in verschiedenen Organen der Mäuse wurde in Prozent injizierter Dosis pro Gramm Nassgewebe (d.h. % ID/g) dargestellt.

Hämatoxylin-Eosin-Färbung

Für die Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung wurde das Paraffinwachs in Xylol zum Entwachsen geschnitten und der Vorgang zweimal für jeweils ca. 10 Minuten wiederholt. Die Hydratation des Probenmaterials erfolgte durch Übertragung der Objektträger durch verschiedene Ethanol-Lösungen mit Konzentrationen von 100 % Ethanol, 95 % Ethanol und 70 % Ethanol für jeweils 2 Minuten. Die Objektträger wurden 2 Minuten bei Raumtemperatur unter fließendem Leitungswasser gespült. Nach Abschluss wurden die Zellkerne 10 Sekunden bei 60 °C in Hämatoxylin-Färbelösung und dann 1 Minute bei Raumtemperatur gefärbt, und die Objektträger wurden dann etwa 5 Minuten unter fließendem Leitungswasser bei Raumtemperatur platziert. Die Proben wurden 2 Minuten in arbeitender Eosin-Y-Lösung gefärbt und dann zuerst durch Eintauchen in 95 % Ethanol und dann in 100 % Ethanol für jeweils 2 Minuten dehydriert. Das Zytoplasma wurde 7 Sekunden durch Eintauchen in Eosin-Färbelösung für 15 Sekunden gefärbt. Nach Entfernung wurde das Zytoplasma gewaschen und zweimal mit absolutem Ethanol für jeweils 1 Minute dehydriert. Das Gewebe wurde dann 15 Sekunden mit Xylol transparent gemacht und das Zytoplasma untersucht und anschließend mit neutralem Gummiversiegelungsmittel fotografiert. Die mikroskopische Untersuchung der Gewebe erfolgte mit einem Olympus Microphot-CX41 Mikroskop, gekoppelt mit Digitalkamera.

Biochemische Indizes und Entzündungsfaktoren

250 Mikrogramm PEG-beschichteter Cobaltferrit-Nanopartikel und Nanosphären wurden intravenös in die Mäuse der Expositionsgruppe injiziert, während die Kontrollgruppe mit 0,9 % physiologischer Kochsalzlösung behandelt wurde, und alle Mäuse wurden nach 24 Stunden getötet. Blut wurde von den Mäusen entnommen und etwa 10 Minuten zentrifugiert, um das Blutserum zu erhalten. Die Serumgehalte von TB, ALT, AST, BUN, CREA und Cys-C wurden mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) und Western Blot gemessen. Enzyme, die mit der Leber assoziiert sind, IL-6, IL-8 und TNF-α, spielen eine Schlüsselrolle in der durch Nekrose induzierten Entzündungsantwort. Normalerweise treten hohe Level dieser Expressionen auf, wenn ein Organ auf Entzündung reagiert.

MTT-Zelllebensfähigkeitsassay

Die zytotoxischen Potenziale von PEG-beschichteten Cobaltferrit-Nanopartikeln und Nanosphären wurden mittels MTT, einem colorimetrischen Assay zur Bewertung zellulärer Stoffwechselaktivitäten, bestimmt. Humane Epithelzellen L-132 und humane Monozyten THP-1, bezogen aus Shanghai, China, wurden unterschiedlichen Konzentrationen von Nanopartikeln im Bereich 30–125 μg/ml und Nanosphären im Bereich 50–250 μg/ml ausgesetzt, und die optische Dichte wurde bei 590 nm für verschiedene Assays mit einem Mikroplattenspektrophotometer-System (UNICO WFZ UV-2000, Shanghai, China) gemessen. L-132-Zellen wurden ausgewählt, da Inhalation eine Haupt Expositionsroute für Nanomaterialien ist, und THP-1-Zellen wurden aufgrund ihrer Rolle bei der Beseitigung fremder Materialien verwendet. In jedem Assay wurden unbehandelte Zellen als negative Kontrolle bewertet. Die Hemmung der Enzymaktivität wurde in den Zellen beobachtet, was mit unbehandelten (negativen Kontroll-) Zellen verglichen wurde, und die Werte wurden als Verhältnis der negativen Kontrolle abgeleitet und gegen die Konzentration von Nanopartikeln und Nanosphären aufgetragen.

Statistische Analyse

Jeder Datenpunkt wurde als Mittelwert (±sem) der in Triplicate durchgeführten Experimente angegeben. Die Signifikanz von Unterschieden wurde mittels Varianzanalyse bewertet, und statistische Diagramme wurden mit Hilfe von Origin und Microsoft Excel Software erstellt.

Ergebnisse und Diskussion

Strukturanalyse

Strukturanalysen (XRD, FTIR, Raman und TGA) der hergestellten Nanomaterialien sind in Abb. 2 dargestellt. Die XRD-Ergebnisse in Abb. 2a zeigen das beschichtete und unbeschichtete Cobaltferrit im Nanomaßstab, was bestätigt, dass Cobaltferrit erfolgreich hergestellt wurde. Die Positionen und relativen Intensitäten aller beobachteten Peaks in den XRD-Daten bestätigen die kristalline Natur von Cobaltferrit. Es wurden keine zusätzlichen Peaks beobachtet, was die Reinheit des hergestellten Cobaltferrits anzeigt. Die mittlere Kristallitgröße von Cobaltferrit wurde mittels Scherrer-Gleichung [56] bestimmt und betrug ~24 nm. Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) wurde durchgeführt, um die Kationenverteilung (von Nickel, Cobalt und Eisen) in Cobaltferrit zu untersuchen. Abb. 2b zeigt die bei Raumtemperatur gesammelten FTIR-Daten. Theoretisch hat Cobaltferrit zwei starke Absorptionsbänder (ν₁ und ν₂) zusammen mit einigen weiteren im Bereich 400–600 cm⁻¹. All diese Peaks sind in unseren Daten in Abb. 2b deutlich angegeben. In den FTIR-Daten entspricht ν₁ den intrinsischen Streckschwingungen des Metalls an tetraedrischen Positionen, während ν₂ den Streckschwingungen der Metallionen an oktaedrischen Positionen entspricht [57–59]. Der bei 3421 cm⁻¹ auftretende Peak in den FTIR-Daten entspricht Polyethylenglykol (PEG), was seine erfolgreiche Bindung an die Oberfläche von Cobaltferrit anzeigt. Die Raman-Analyse von Cobaltferrit bei Raumtemperatur ist in Abb. 2c dargestellt, die 5 verschiedene Peaks in den Daten zeigt. Der bei unter 700 cm⁻¹ auftretende Peak ist der Hauptcharakteristik-Peak (A_1g-Mode) von Cobaltferrit, der der Streckung von Sauerstoffionen entlang der Fe–O-Bindungen an tetraedrischen Positionen entspricht [60], während die anderen in den Daten auftretenden Peaks ebenfalls zu Cobaltferrit gehören. Dies bestätigt die erfolgreiche Herstellung von PEG-Cobaltferrit in unserem Experiment. Abb. 2d zeigt die TGA-Ergebnisse der Proben im Temperaturbereich 50–380 °C, die anzeigen, dass Cobaltferrit bei unterschiedlichen Temperaturen an Gewicht verliert. Es ist auch in der TGA-Analyse ersichtlich, dass die thermische Stabilität von PEG relativ gering ist, während die von PEG-Cobaltferrit hoch ist.

Elektronenmikroskopische Analysen der Proben sind in Abb. 3 dargestellt. Abb. 3(a) und (b) zeigen REM-Bilder von PEG-beschichteten Cobaltferrit-Nanopartikeln und Nanosphären, während Abb. 3(c) und (d) TEM-Analysen von Nanosphären und Nanopartikeln zeigen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die durchschnittliche Größe der Nanopartikel etwa 25 nm und die der Nanosphären 80–100 nm beträgt. Aus den TEM-Bildern der Nanosphären ist offensichtlich, dass Nanosphären aus einer großen Anzahl kleinerer Nanopartikel mit großen Oberflächen bestehen, wodurch sie mesoporös sind, was für medizinische Anwendungen von Nanomaterialien als Drug-Carrier-Fahrzeuge hoch erwünscht ist. Alle diese Strukturanalysen bestätigen die erfolgreiche Bildung von reinen Phasen PEG-beschichteten Cobaltferrit-Nanopartikeln und Nanosphären.

Biodistributionsstudien

Quantitativ ist die Biodistribution von PE-beschichteten Cobaltferrit-Nanopartikeln und Nanosphären in Blut, Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere nach verschiedenen Zeitintervallen (1, 6, 16 und 24 h) in Abb. 4 dargestellt. Das Vorhandensein von Cobaltferrit in Blut und anderen Organen wurde innerhalb von 24 h nach intravenöser Injektion von ^99mTc-PEG-Cobaltferrit-Lösung (Nanopartikel und Nanosphären) bewertet. Im Fall von Nanosphären (Abb. 4a) betrug die Blutretention von Cobaltferrit 6,5 ± 0,33 % ID/g nach 1 h Exposition und nahm dann allmählich über die nächsten Zeitintervalle (6, 16 und 24 h) ab. Es zeigte sich, dass Nanosphären hauptsächlich in Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere verteilt waren; jedoch akkumulierten die meisten von ihnen primär in der Milz. Zudem war die Biodistribution von Nanosphären in verschiedenen Organen nach der ersten Stunde am höchsten und nahm dann allmählich ab und blieb nach 6 h unter 30 %. Im Fall von Cobaltferrit-Nanopartikeln betrug die Blutretention der Nanopartikel etwa 2,8 ± 0,14 % ID/g nach 1 h Exposition, was auf eine relativ schnelle Clearance des radioaktiven Materials aus dem Blutpool des Körpers hinweist, und nahm dann mit der Zeit ab, wie in Abb. 4b gezeigt. Die Nanopartikel waren in Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere verteilt, mit maximalen Konzentrationen in Milz und Leber. Aus der Abbildung geht hervor, dass die Biodistribution von Nanopartikeln in Blut und anderen Organen nach der ersten Stunde am höchsten war und dann allmählich nach 6 abnahm und schließlich nach 24 h die niedrigsten Werte erreichte. Vergleicht man die Biodistributionsergebnisse von Nanosphären und Nanopartikeln, so zeigt sich, dass die Anreicherung/Präsenz von PEG-beschichteten Cobaltferrit-Nanosphären in Blut und anderen Organen der Mäuse höher war als bei Nanopartikeln. Dies könnte mit der großen Oberfläche und hohen Porosität von Nanosphären im Vergleich zu Nanopartikeln zusammenhängen, was einer der kritischen Faktoren für die Bestimmung der Reaktivität von Nanomaterial-Wechselwirkungen mit biologischen Systemen ist. Im Fall von Nanopartikeln machte ihre nicht-mesoporöse Natur mit geringer spezifischer Oberfläche sie weniger reaktiv als Nanosphären unter gleichen Bedingungen. Diese Merkmale könnten den verlängerten Widerstand von PEG-beschichteten Cobaltferrit-Nanopartikeln in Blut und anderen Organen von Mäusen reduziert haben. Zusätzlich verursachen Nanosphären Komplexbildung mit Biomolekülen, was zu erhöhtem Radikalspezies-Level, erhöhtem oxidativem Stress, Schädigung der zellulären DNA und oxidativem Stress durch Lipidperoxidation führt.

Biochemische Indizes

Um den Toxizitätseffekt von PEG-Cobaltferrit-Nanopartikeln und Nanosphären in Mäusen zu untersuchen, wurden biochemische Indizes gemessen und die Ergebnisse in Abb. 5 dargestellt. Verschiedene Parameter einschließlich ALT, AST, BUN, CREA, TB und Cys-C wurden für Kontroll- und Expositionsgruppenmäuse gemessen. SPSS-Software wurde für Datenextraktion mit *P < 0,05 verwendet, was signifikante Änderungen während der Messungen repräsentiert. Sowohl bei Nanosphären als auch bei Nanopartikeln zeigen alle biochemischen Indizes signifikante Änderungen im Vergleich zu Kontrollgruppenmäusen (*P < 0,05). Im Fall der Cobaltferrit-Nanosphären-Expositionsgruppe zeigen die Level von ALT, AST und BUN signifikante Unterschiede (*P < 0,05) im Vergleich zu Kontrollgruppenmäusen, während im Fall der Nanopartikel-Expositionsgruppe nur Cys-C signifikante Unterschiede im Vergleich zu Kontrollgruppenmäusen aufweist (*P < 0,05). Es ist zu sehen, dass TB und Cys-C, die hauptsächlich für den Biomarker der Nierenfunktion verantwortlich sind, im Fall von Nanosphären signifikant abnahmen. Dies deutet darauf hin, dass die Niere durch die Exposition gegenüber PEG-Cobaltferrit-Nanosphären stärker betroffen ist als durch Nanopartikel. AST, als Biomarker für die Leber, wurde durch die Exposition sowohl von Nanopartikeln als auch von Nanosphären stärker beeinflusst. Dies deutet darauf hin, dass die Exposition gegenüber Cobaltferrit die Leberfunktion nachteilig beeinflussen kann. Aus all diesen Ergebnissen ist klar, dass PEG-Cobaltferrit-Nanosphären in Mäusen in vivo mehr Schäden verursachen als Cobaltferrit-Nanopartikel.

Histopathologische Studie

Wir haben die Histopathologie-Analyse der Kontroll-, Nanopartikel-, Nanosphären- und Behandlungsgruppen-Mäuse wie in Abb. 6 dargestellt vorgestellt. Vergleicht man die Ergebnisse der Nanosphären- und Nanopartikel-Expositionsgruppen mit Kontrollgruppen-Mäusen, so zeigt sich, dass PEG-Cobaltferrit-Nanosphären in verschiedenen Organen (Leber, Milz, Niere und Lunge) von Mäusen mehr Schäden verursachen als die Nanopartikel-Expositionsgruppe. In der Niere traten glomeruläre Kongestion zusammen mit milder Ödem und interstitiellen Entzündungszellen bei Nanosphären-Aufnahme im Vergleich zu Nanopartikel-Exposition und Kontrollgruppen-Mäusen auf. Es ist auch zu sehen, dass Nanopartikel weniger Entzündung zeigen als Nanosphären. Im Fall von Nanopartikel-Exposition war die Lunge relativ weniger betroffen, während bei Nanosphären die Alveolarwand verdickt war und milde Fibrose beobachtet wurde. Zusätzlich zeigte die Hepatozyten bei der Nanosphären-Expositionsgruppe Schwellung und Ödem, während bei der Nanopartikel-Expositionsgruppe relativ weniger Entzündung gefunden wurde.

Entzündungsfaktoren und Oxidations-/Antioxidationslevel

Die Expressionslevel von IL-6, IL-8, TNF-α, MDA und T-AOC wurden gemessen und die Ergebnisse in Abb. 7 gezeigt. Abb. 7a zeigt die Western-Blot-Bänder von IL-6, IL-8 und β-Actin für die Kontroll-, Nanopartikel- und Nanosphären-Expositionsgruppen. Die relativen Proteinlevel von IL-6 und IL-8 für die Kontroll-, Nanopartikel- und Nanosphären-Expositionsgruppen sind in Abb. 7b dargestellt, während die Gehalte von TNF-α, MDA und T-AOC in Abb. 7c–e mit *P < 0,05 für Expositionsgruppe versus Kontrollgruppe ± sem gezeigt sind. Die Ergebnisse zeigten, dass die Level von IL-6, IL-8, TNF-α und MDA für die Cobaltferrit-Nanosphären-Expositionsgruppen-Mäuse höher sind als die der Nanopartikel-Gruppe und beide Level höher als die der Kontrollgruppen-Mäuse. Im Fall von T-AOC war der Level von Nanosphären niedriger als der der Nanopartikel-Expositions- und Kontrollgruppen-Mäuse. All diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Nanopartikel und Nanosphären Entzündungen in Mäusen verursachen, insbesondere in der Leber. Allerdings beeinflussen Nanosphären die Organe stärker als Nanopartikel. Es ist gut verstanden, dass Nanomaterialien im Körper Sauerstofffreiradikale (ROS) erzeugen, die eine Reihe qualitativer Reduktionen der Antioxidantien verursachen, was zu Oxidationsschäden biologischer Gewebe führt, die zelluläre Organismen nachteilig beeinflussen [61, 62]. Zudem wurde festgestellt, dass Cobaltferrit-Nanosphären mehr Entzündungen verursachen als die Nanopartikel-Expositionsgruppen-Mäuse, als die Level von IL-6, IL-8, TNF-α, MDA und T-AOC für Mäuse, die Nanopartikeln ausgesetzt waren, mit denen verglichen wurden, die Nanosphären ausgesetzt waren.

Zytotoxizitätsbewertung

Die Zytotoxizitätsstudien für verschiedene Konzentrationen von PEG-beschichteten Cobaltferrit-Nanosphären und Nanopartikeln wurden durchgeführt und die Ergebnisse in Abb. 8 dargestellt. Der prozentuale Überlebensanteil von L-132-Zellen ist in Abb. 8(a) gezeigt, während Abb. 8(b) den prozentualen Überlebensanteil von THP-1-Zellen darstellt. Es ist zu sehen, dass für Konzentrationen über 100 μg/ml signifikante Änderungen in der Zelllebensfähigkeit für beide Zelltypen beobachtet werden, und die Ergebnisse sind im Fall von PEG-Nanosphären ausgeprägter. Dies bestätigt, dass Cobaltferrit-Nanosphären mehr Schäden verursachen als Nanopartikel. Zudem nimmt die Zelllebensfähigkeit mit zunehmender Konzentration sowohl von Nanopartikeln als auch von Nanosphären ab, was darauf hindeutet, dass PEG-beschichtetes Cobaltferrit in beiden Formen bei steigender Konzentration mehr Toxizität in Mäusen erzeugt. Aufgrund der zwei unterschiedlichen zellulären Ziele (L-132 und THP-1) kann man erwarten, dass die zelluläre Antwort nicht identisch ist, abhängig vom Zelltodmechanismus [63]. Ein möglicher Grund für die zelltypspezifische Empfindlichkeit sogar bei ähnlichen Partikelgrößen könnte der Funktion der Phagozytose zugeschrieben werden, die Monozyten (THP-1-Zellen) charakterisiert, aber nicht Lungenepithelzellen [64]. Es ist gut verstanden, dass ein einzelnes Nanosphäre aus einer großen Anzahl kleiner Nanopartikel besteht. Daher besitzt es eine große Oberfläche im Vergleich zu Nanopartikeln und hat daher mehr Reaktivität und mehr Chancen zur Interaktion mit biologischen Systemen (Geweben) im Vergleich zu Nanopartikeln. Zudem können Nanosphären aufgrund ihrer größeren Größe nicht leicht über Blut- oder Urin-Kreislauf ausgeschieden werden, sobald sie in das Organ eingedrungen sind. Daher verbleiben sie im Körper (Organen) für relativ längere Zeit im Vergleich zu Nanopartikeln, was sich nachteilig auf die Gewebe auswirkt. Außerdem verursachen Nanosphären reduzierte Funktion von Makrophagen, reduzierte Phagozytose der Nanosphären selbst und reduzierte Makrophagen-Mobilität und Zytoskelett-Dysfunktion.

Curcumin-Effekt auf Toxizität

Biochemische Indizes im Blutserum wurden für Nanosphären-Expositionsgruppe und Curcumin-behandelte Gruppe untersucht und die Ergebnisse mit Kontrollgruppen-Mäusen verglichen, die in Abb. 9 gezeigt sind. Es wurde festgestellt, dass all diese Indizes in der Behandlungsgruppen-Mäusen nach Verabreichung von Curcumin signifikante Verbesserungen zeigten, als ihre Werte mit Nanosphären-Expositions- und Kontrollgruppen-Mäusen verglichen wurden. In der Abbildung ist zu sehen, dass die Expressionslevel von ALT, AST, BUN, CREA, CYS-C und TB sich nach Verabreichung von Curcumin den Normalwerten annäherten. Dies kann darauf zurückgeführt werden, dass Curcumin starke antioxidative Eigenschaften besitzt, die den oxidativen Stress reduzieren, der als Folge der durch Cobaltferrit induzierten Toxizität entsteht [47]. Es wurde auch berichtet, dass TNF-α und IL-1 eine wichtige Rolle bei der Induktion von Lebernekrose spielen und Curcumin die Toxizitätswirkung durch Hemmung der Sekretion von TNF-α und IL-1 durch Makrophagen reduziert [48], ähnlich wie in früherer Arbeit in Ref. [65] berichtet.

Schlussfolgerung

In dieser Arbeit haben wir erfolgreich PEG-beschichtete Cobaltferrit-Nanopartikel und Nanosphären via hydrothermaler und solvothermaler Methode hergestellt. Aus Strukturanalysen ging hervor, dass die hergestellten Nanomaterialien hochrein, kristallin und biokompatibel sind, resultierend aus der erfolgreichen Anbindung von PEG. Es wurde festgestellt, dass sowohl Nanosphären als auch Nanopartikel von Cobaltferrit für biologische Systeme toxisch sind. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Nanosphären von Cobaltferrit toxischer sind als Nanopartikel aufgrund ihrer großen Oberfläche und höheren Reaktivität mit biologischen Geweben. Positive Veränderungen wurden in biochemischen Indizes nach Verabreichung von Curcumin überwacht, welches ein natürliches chemisches Mittel ohne Nebenwirkungen besitzt, was bestätigt, dass es als Heilungsfaktor für die durch Cobaltferrit-Nanosphären induzierte Toxizität verwendet werden kann.

Änderungshistorie

Abkürzungen

PEG:

Polyethylenglykol

XRD:

Röntgendiffraktion

FTIR:

Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie

TGA:

Thermogravimetrische Analyse

SPF:

Specific Pathogens Free (spezifische Erreger-frei)

MRI:

Magnetresonanztomographie

TNF:

Tumor-Nekrose-Faktor

HE:

Hämatoxylin-Eosin

SS:

Edelstahl

DI:

Deionisiert

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

TEM:

Transmissions-Elektronenmikroskopie

TB:

Gesamtbilirubin

ALT:

Alanin-Aminotransferase

AST:

Aspartat-Transferase

BUN:

Blutharnstoffstickstoff

CREA:

Kreatinin

Cys-C:

Cystatin C

DNA:

Desoxyribonukleinsäure

MDA:

Malondialdehyd-Assay

ROS:

Sauerstofffreiradikale

T-AOC:

Gesamte antioxidative Kapazität