Mit Curcumin beladene Chitosan-Rinderserumalbumin-Nanopartikel verstärken möglicherweise die Aβ-42-Phagozytose und die modulierte Makrophagen-Polarisation bei der Alzheimer-Krankheit

Einführung

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die durch einen schleichenden Beginn und ein Fortschreiten des kognitiven Verfalls gekennzeichnet ist. Histopathologisch wird Amyloid-β (Aβ) 42 als Peptid mit 42 Aminosäuren zu Amyloid-β-Peptid-Fibrillen aggregiert, die bei AD durch extrazelluläre „senile Plaques“ gekennzeichnet sind, wodurch neuronale Apoptose und der Verlust von Synapsen induziert werden [1,2,3] . Im Allgemeinen sind Aβ 42-Monomere physiologisch löslich und nicht toxisch, während seine Oligomere in vitro und in vivo toxischer sind [4, 5]. Daher wird die intervenierende Aβ 42 Aggregation durch Klärung des Aβ 42 Monomers weithin als das am besten geeignete therapeutische Ziel für AD angesehen [6,7,8,9]. Es ist allgemein bekannt, dass Aβ-Peptide durch Interaktion mit mehreren Toll-like-Rezeptoren (TLRs), einschließlich TLR4, eine mikrogliale Aktivierung auslösen können, und sie fördern auch die CD14-, TLR4- oder TLR2-abhängige Phagozytose und die Clearance von Aβ 42 [10, 11,12]. Obwohl die mikrogliale Aktivierung die Clearance von Aβ 42 fördern kann, werden Mikrogliazellen – eine Art mononuklearer Makrophagen – möglicherweise überaktiviert und zum M1-Phänotyp polarisiert (gekennzeichnet durch die Freisetzung potenziell neurotoxischer löslicher Faktoren und entzündungsfördernder Zytokine), was zu einer zum neuronalen Tod und zur Verschlimmerung der Entwicklung von AD. Umgekehrt sind einige Mikrogliazellen vom klassisch aktivierten (M2) Phänotyp, der durch die Produktion entzündungshemmender Zytokine gekennzeichnet ist; diese verbessern die kognitive Dysfunktion bei AD [13,14,15,16]. Daher kann das Verhältnis von M1/M2-Makrophagen das Fortschreiten der AD signifikant beeinflussen [17, 18]; Darüber hinaus wird die Hochregulation, die erforderlich ist, um proinflammatorische M1-Makrophagen in entzündungshemmende M2-Makrophagen umzuwandeln, ein vielversprechendes Potenzial bei der Prävention und Behandlung von AD zeigen.

Curcumin, das aus einem Bestandteil des indischen Gewürzes Kurkuma (Curcumin longa) – einer Ingwerart – stammt, ist ein starkes entzündungshemmendes Mittel, das Entzündungen reduzieren kann und sogar eine Rolle bei der Behandlung von AD spielen kann [19]. In den letzten Jahren wurde festgestellt, dass Curcumin Berichten zufolge antiamyloidogene, entzündungshemmende, antioxidative und metallchelatisierende Eigenschaften besitzt, die potenzielle neuroprotektive Wirkungen haben können [20, 21]. Curcumin moduliert die Makrophagen-Polarisation durch die Hemmung der Toll-like-Rezeptor 4-Mitogen-aktivierten Proteinkinase (TLR4-MAPK)/NF-κB-Wege [22,23,24]. Die geringe Stabilität und Bioverfügbarkeit von Curcumin schränken jedoch seine klinische Anwendung ein. Darüber hinaus verhindert das Vorhandensein der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​auch das Eindringen von Curcumin bei der Behandlung von AD [25,26,27].

Um den Wirkstofftransport vom Blut zum Gehirn zu verbessern, unterstützen Nanopartikel (NPs) mit einer mit Peptiden [28] und Antikörpern [29] funktionalisierten Oberfläche die Wirkstoffabgabe durch die BHS, und die Penetrationseffizienz der BHS von NPs könnte durch aktive Transportmechanismen erheblich gesteigert werden als einfache passive Diffusion [30]. Chitosan(CS)-NPs – ein Nanoträger für die Assoziation mit Aβ – können die BHS durchdringen und sind nicht immunogen [31]. Darüber hinaus wurde Serumalbumin im zirkulierenden Plasma des menschlichen Körpers in Konzentrationen von 50 g/L Serum gefunden und war ungiftig und vom Immunsystem gut verträglich [32, 33]. Es wurde auch berichtet, dass von Rinderserumalbumin (BSA) abgeleitete Nanopartikel Retard-Eigenschaften aufweisen, die die Halbwertszeit des Arzneimittels verlängern können, wodurch die Häufigkeit der Verabreichung verringert und die Patienten-Compliance erhöht wird [34]. Daher haben wir CS und BSA als die beiden Biomaterialien verwendet, um Curcumin-beladene CS-BSA-NPs herzustellen, um die beste BBB-Penetration zu erreichen. Die Wirkungen von Curcumin auf die Phagozytose von Aβ 42, die entzündliche Zytokinsekretion und die Regulation der TLR4-MAPK/NF-κB-Signalwege wurden untersucht, um den molekularen Mechanismus von Curcumin auf die Makrophagenpolarisation weiter zu bestätigen.

Materialien

CS mit einem Deacetylierungsgrad von 80 % und einem Molekulargewicht von ungefähr 400 kDa wurde von Haixin Biological Product Co., Ltd. (Ningbo, Volksrepublik China) bezogen. BSA wurde von Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) bezogen und Curcumin wurde von Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd. (Dalian, Volksrepublik China) bezogen. FITC-β-Amyloid (1–42) wurde von Chinese Peptide Co., Ltd. (Hangzhou, Volksrepublik China) bezogen. Die anderen gekauften Chemikalien waren von analytischer Qualität und wurden von Sigma-Aldrich Co. bezogen. Die Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7 (Maus-Leukämie-Monozyten-Makrophagen-Zelllinie) und die mikrovaskuläre Endothelzelllinie des Gehirns (hCMEC/D3), die als Modell diente der menschlichen BBB, wurden vom Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai (Volksrepublik China) etabliert. Beide Zellen wurden bei Temperaturen von 37 °C und mit einem CO₂ . von 5 % gehalten Atmosphäre, in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % (Volumen/Volumen) hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum und Antibiotika (100 E/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin). Es wurde berichtet, dass RAW 264.7-Zellen, die mit Lipopolysaccharid (LPS) behandelt wurden, Aspekte von Mikrogliazellen rekapitulieren, die bei neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet wurden, die durch AD veranschaulicht werden [35, 36]. Daher wurden Zellen der Makrophagenzelllinie RAW 264.7, die durch Lipopolysaccharid (LPS; 1 μg/ml) zum M1-Phänotyp polarisiert wurden, weiter angewendet, um Mikrogliazellen bei AD zu simulieren.

Vorbereitung von mit Curcumin beladenen CS-BSA-NPs

Gemäß unserem früheren Bericht [37] könnte positiv geladenes CS unter elektrostatischer Wechselwirkung mit negativ geladenem BSA konjugieren, um NPs zu bilden. Die Herstellungsmethode war wie folgt:0,1% Essigsäure wurde verwendet, um CS aufzulösen, um eine Lösung mit 0,5 mg/ml CS zu erhalten, und 100 μl DMSO, das 0,05 mg/ml Curcumin enthielt, wurden in die CS-Lösung zum gründlichen Mischen unter Magnet gegeben bei Raumtemperatur rühren. Als geeignete Menge an BSA-Lösung wurden 1,0 mg/ml langsam in die Mischung aus CS und Curcumin getropft; An diesem Punkt trat das Opaleszenzphänomen auf und CS-BSA-NPs wurden weiter zu festen Partikeln kondensiert. Darüber hinaus wurden Größe, Polydispersität, Zetapotential und Morphologie der NPs untersucht. Die In-vitro-Wirkstofffreisetzung aus NPs wurde anhand einer zuvor beschriebenen Methode geschätzt [37]. Die Einkapselungseffizienz (EE, %) von Curcumin in NPs wurde mit der folgenden Gleichung berechnet.

\( \mathrm{EE}\%=\frac{W_{\mathrm{gesamt}}-{W}_{\mathrm{frei}}}{W_{\mathrm{gesamt}}}\mal 100\% \ )

W _Gesamt war die Menge an ursprünglich hinzugefügtem Curcumin, W _kostenlos war die Menge an Curcumin, die im Überstand verblieb.

Zell-Apoptose-Bewertung durch MTT

Um die Sicherheit von CS-BSA-NPs bei der Zellapoptose zu bestimmen, wurde ein MTT-Assay verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten. Gemäß dem Protokoll unserer vorherigen Studie wurden unterschiedliche Mengen an leeren CS-BSA-NPs zur Behandlung von RAW 264.7-Zellen (M1-Phänotyp) und hCMEC/D3-Zellen für 24 Stunden bei 37 °C zur weiteren Analyse verwendet.

Penetrationsstudien mit einem In-vitro-BHS-Modell

Eine einschichtige Transwell-Kultur unter Verwendung der mikrovaskulären Endothelzelllinie des Gehirns, hCMEC/D3, ist ein gängiges In-vitro-BHS-Modell, das verwendet wird, um die Gehirnabgabe von NPs zu untersuchen. Die hCMEC/D3-Zellmischung (in 0,5–1,0 ml Gesamtvolumen) wurde in den Einsatz in der oberen Kammer einer 12-Well-Transwell-Platte für Monolayer-Zellkulturen mit einem transendothelialen elektrischen Widerstand> 300 Ω gegeben; PBS mit einem pH-Wert von 7,4 wurde in die untere Kammer gegeben. Freies Curcumin und die Suspension von Curcumin-beladenen CS-BSA-NPs wurden zur kontinuierlichen Inkubation für 3 h in einem auf 37 °C, 5 % CO₂ . eingestellten Inkubator in die obere Kammer gegeben . Danach wurden freies Curcumin und mit Curcumin beladene CS-BSA-NPs über die Zellen transferiert und in die untere Kammer eingetragen. Die Quantifizierung der durchdrungenen NPs wurde mit einem Mikroplatten-Reader (Synergy-2; BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) durch Überprüfung der Fluoreszenzintensität von Curcumin, das bei 425 nm angeregt und bei 530 nm emittiert wird, nachgewiesen. Das relative Fluoreszenzverhältnis (RFR, %), das die Penetrationsraten von NPs darstellt, wurde berechnet, indem das Verhältnis der Fluoreszenzintensität der eingedrungenen Curcumin-beladenen CS-BSA-NPs in der unteren Kammer zu der des anfänglich zugegebenen Curcumins bestimmt wurde. geladene CS-BSA-NPs in der oberen Kammer. Verschiedene endozytische Inhibitoren, wie Chlorpromazin (das die Clathrin-vermittelte Aufnahme hemmt) bei 10 μg/ml, Genistein (Caveolen-vermittelte Aufnahme) bei 1 μg/ml, Cytochalasin D (30 μM, Makropinozytose) und 20 μg/ml Natrium Azid (ein Energiehemmer) wurden verwendet, um verschiedene endozytische Wege zu bestimmen, die an den verschiedenen Penetrationsmechanismen beteiligt sind. Das relative Penetrationsverhältnis wurde durch Vergleich der Penetrationsraten von NPs, die mit Inhibitoren behandelt wurden, mit denen von NPs, die mit Nicht-Inhibitoren behandelt wurden, bestimmt.

Die zelluläre Aufnahme von mit Curcumin beladenen CS-BSA-NPs

Die Verteilung und Lage von Curcumin-beladenen CS-BSA-NPs in RAW 264.7-Zellen (M1-Phänotyp) wurde mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (FluoView FV10i; Olympus Corporation, Tokio, Japan) beobachtet. Der hCMEC/D3-Zellmix (in 0,5–1,0 ml Gesamtvolumen) wurde in den Einsatz in der oberen Kammer der 12-Well-Transwell-Platte für Monolayer-Zellkulturen mit einem transendothelialen elektrischen Widerstand> 300 Ω gegeben. RAW 264.7-Zellen (M1-Phänotyp) wurden in die untere Kammer ausgesät. Freies Curcumin und eine Suspension von Curcumin-beladenen CS-BSA-NPs wurden zur kontinuierlichen Inkubation in einem auf 37 °C, 5 % CO₂ . eingestellten Inkubator in die obere Kammer gegeben . In vorgegebenen Intervallen wurden die zellulären Verteilungen von freiem Curcumin und Curcumin-beladenen CS-BSA-NPs in RAW 264.7-Zellen (M1-Phänotyp) beobachtet, indem die von Curcumin emittierte grüne Fluoreszenz mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie nachgewiesen wurde.

Nachweis der Phagozytose von Aβ 42, die durch freies Curcumin und mit Curcumin beladene CS-BSA-NPs induziert wird

RAW 264.7-Zellen (M1-Phänotyp) in vollem Wachstumsmedium wurden in eine 12-Well-Platte (1 × 10 ⁵ Zellen/Well) und behandelt mit freiem Curcumin und mit Curcumin beladenen CS-BSA-NPs für 24 h bei 37 °C. Um nicht internalisiertes Curcumin und mit Curcumin beladene CS-BSA-NPs zu entfernen, wurde destilliertes Wasser verwendet, um die Zellen in kurzer Zeit zweimal zu waschen. Es wurde festgestellt, dass Curcumin und Curcumin-beladene CS-BSA-NPs vollständig aus dem Medium eliminiert wurden und es kein offensichtliches Risiko für Zellen aus destilliertem Wasser gab, die eine niedrige Osmolarität induzierten, da die Morphologie der mit destilliertem Wasser gewaschenen Zellen intakt war und keine Zellexplosion bestand wurde beobachtet. Schließlich wurde freies FITC-markiertes Aβ 42, gelöst in PBS (pH 7,4), zur kontinuierlichen Inkubation für 3 h in die Platte gegeben. Die Phagozytose von FITC-markiertem Aβ 42 in RAW 264.7-Zellen (M1-Phänotyp) wurde durch den Nachweis der von FITC emittierten grünen Fluoreszenz dargestellt. Die intrazelluläre Phagozytose und die Lokalisation von Aβ 42 innerhalb der Zellen wurden mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (FluoView FV10i; Olympus Corporation) weiter untersucht.

Western-Blot-Assay

Um den möglichen molekularen Mechanismus der Curcumin-vermittelten Makrophagen-Polarisierung zu untersuchen, untersuchten wir die Expressionsniveaus von proinflammatorischen Zytokinen, wie Tumornekrosefaktor (TNF)-α und Interleukin (IL)-6, sowie die Phosphorylierungsniveaus von ERK, JNK , p38 und NF-κB durch Western-Blotting für weitere studienspezifische Wirkungen von Curcumin auf den TLR4-MAPK/NF-κB-Signalweg.

Ergebnisse

Die Charakterisierung von mit Curcumin beladenen CS-BSA-NPs

Die Eigenschaften von NPs wurden untersucht, um ihre Partikelgröße, ihr Zetapotential und ihre Morphologie unter Verwendung eines Zetasizers (Nano ZS90; Malvern Instruments, Malvern, UK) und eines Transmissionselektronenmikroskops (TEM) (Jeol, Tokio, Japan) bei einer Beschleunigungsspannung von . zu bestimmen 200 kV. Die in Abb. 1 gezeigten Ergebnisse zeigten, dass CS-BSA-NPs eine mittlere Größe bei 143,5 nm, ein negatives Zetapotential bei – 10,8 mV bzw. eine Polydispersität bei 0,021 aufwiesen. Es wurde beobachtet, dass die mit Curcumin beladenen CS-BSA-NPs kugelförmig und monodispers waren. Die resultierende Suspension, die Curcumin-beladene CS-BSA-NPs enthielt, wurde zentrifugiert, um eine überstehende Lösung zu erhalten, um die Extinktion von Curcumin zu bestimmen und den Gehalt an freiem Curcumin in der überstehenden Lösung gemäß der Standardkurve zu berechnen. Die Verkapselungseffizienz (EE, %) von Curcumin in NPs wurde mit 95,4% bewertet. In Bezug auf den Wirkstofffreisetzungsprozess aus den NPs zeigten Curcumin-beladene CS-BSA-NPs ein zweiphasiges Freisetzungsmuster im Medium mit einem pH-Wert von 7,4. Ungefähr 11,3% aller Medikamente wurden innerhalb der ersten 3 h freigesetzt, was darauf hindeutet, dass Curcumin gut geschützt und im Kern der NPs eingekapselt war, als die NPs in den Blutkreislauf gelangten, bevor sie die BHS erreichten. Darüber hinaus traten einige Medikamente aus den NPs aus und wurden innerhalb der ersten 3 h ins Blut freigesetzt. Die Mehrheit der mit Curcumin beladenen CS-BSA-NPs könnten um die BBB transportiert werden und die Wirkstoffkonzentration im Gehirn erhöhen.

Charakterisierung von mit Curcumin beladenen CS-BSA-NPs. a TEM-Bild von mit Curcumin beladenen CS-BSA-NPs. b Dynamische Lichtstreuungsanalyse (DLS) der erhaltenen mit Curcumin beladenen CS-BSA-NPs. c Zeta-Potenzialanalyse der erhaltenen mit Curcumin beladenen CS-BSA-NPs. d Das in vitro-Freisetzungsprofil der erhaltenen Curcumin-beladenen CS-BSA-NPs in phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 bei 37 °C für 48 h

Penetrationsstudien mit einem In-vitro-BHS-Modell

Die Penetrationsraten von freiem Curcumin und den NPs wurden bewertet, indem die Fluoreszenzintensität von Curcumin in der unteren Kammer mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Synergy-2; BioTek Instruments) überprüft wurde, und sie wurden berechnet, indem das Verhältnis der Fluoreszenzintensität von penetriertem Curcumin bestimmt wurde -beladene CS-BSA-NPs in der unteren Kammer zu denen der anfänglich hinzugefügten Curcumin-beladenen CS-BSA-NPs in der oberen Kammer. Die Ergebnisse (Abb. 2) zeigten, dass der Penetrationsprozess von freiem Curcumin und mit Curcumin beladenen CS-BSA-NPs zeitabhängigen Mustern folgte und die Penetrationsrate mit der Zeit zunahm. Dies deutet darauf hin, dass die Penetrationsrate von freiem Curcumin nach 1 h 12,3 %, nach 2 h 20,3 % und nach 3 h 29,8 % betrug. Im Vergleich zu freiem Curcumin war die Penetrationseffizienz von Curcumin-beladenen CS-BSA-NPs verbessert, was durch die erhöhten Penetrationsraten dargestellt wird; die Penetrationsraten stiegen auf 37,7 % nach 1 h, 45,6 % nach 2 h und 60,2 % nach 3 h. Dies deutete darauf hin, dass freies Curcumin Schwierigkeiten beim Eindringen in die Zellen haben kann und eine schlechte Permeabilität für die BBB zeigte [38, 39]. Diese Beobachtung deutete auch darauf hin, dass mit Curcumin beladene CS-BSA-NPs die Wirkstoffpenetration durch Zellen effektiv fördern könnten, was auf die Rolle verschiedener endozytischer Wege hindeutet. Ein Endozytose-Hemmtest zeigte, dass in Übereinstimmung mit den vorherigen Berichten [40] freies Curcumin für die Penetration von der passiven Diffusion abhängig war und dass es keine offensichtlichen Schwankungen in der Penetrationseffizienz von freiem Curcumin gab, unabhängig davon, ob ein Inhibitor hinzugefügt wurde oder nicht. Umgekehrt war die Penetration von NPs energieabhängig, und das relative Penetrationsverhältnis, das mit Natriumazid behandelt wurde, betrug 55,6 %. Darüber hinaus vermittelten sowohl Caveolae als auch Makropinocytose hauptsächlich die endozytischen Wege von NPs. Im Vergleich zur Behandlung mit Nicht-Inhibitoren betrug die relative Penetrationsrate in Zellen, die mit Genistein und Cytochalasin D behandelt wurden, 67,8 % bzw. 60,3 %.

Analyse des Penetrationsmechanismus von freiem Curcumin und mit Curcumin beladenen CS-BSA-NPs durch hCMEC/D3-Zellen. a Fluoreszenzspektrumanalyse der Penetrationsraten von freiem Curcumin und Curcumin-beladenen CS-BSA-NPs. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 3). *P < 0,05, **P < 0,01 gegenüber den Penetrationsraten von freiem Curcumin nach 1 h. ^## P < 0,01 gegenüber den Penetrationsraten von mit Curcumin beladenen CS-BSA-NPs nach 1 h. b Auswirkungen von endozytischen Inhibitoren auf die Penetrationsfähigkeit von freiem Curcumin und Curcumin-beladenen CS-BSA-NPs. Die Ergebnisse werden als Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 3). ^## P < 0,01 vs. relatives Penetrationsverhältnis von Curcumin-beladenen CS-BSA-NPs, die mit Chlorpromazin behandelt wurden

Zell-Apoptose-Bewertung durch MTT

Die zytotoxischen Wirkungen von leeren CS-BSA-NPs gegen RAW 264.7-Zellen (M1) und hCMEC/D3 wurden in vitro durch einen MTT-Assay abgeschätzt. Die Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von CS-BSA-NPs im Bereich von 0 bis 2,0 mg/ml behandelt. Ein Zelllebensfähigkeitsassay in Abb. 3 zeigte, dass bei Behandlung mit leeren CS-BSA-NPs keine offensichtlichen zytotoxischen Aktivitäten in RAW 264.7-Zellen und hCMEC/D3-Zellen beobachtet wurden [37].

Lebensfähigkeit von RAW 264.7-Zellen (M1) und hCMEC/D3-Zellen nach Inkubation mit unterschiedlichen Mengen an nackten CS-BSA-NPs für 24 h (n .) = 3)

Verteilung und zelluläre Aufnahme von NP

Freies Curcumin und mit Curcumin beladene CS-BSA-NPs mit der gleichen Menge Curcumin bei 100 μg/ml wurden zur Behandlung von RAW 264.7-Zellen (M1) verwendet, und die Verteilung und zelluläre Aufnahme von Curcumin wurden durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (FluoView FV10i .) beobachtet; Olymp). In Abb. 4 ist zu sehen, dass die intrazelluläre Verteilung von freiem Curcumin und Curcumin-beladenen CS-BSA-NPs einem zeitabhängigen Muster folgte und dass sich die grüne Fluoreszenz von Curcumin in der Zelle angesammelt und über das gesamte Zytoplasma verteilt hatte. Im Laufe der Zeit wurde die grüne Fluoreszenzintensität innerhalb der Zellen verstärkt. Dies zeigte, dass die grüne Fluoreszenz, die von freiem Curcumin innerhalb der Zellen emittiert wurde, sehr schwach war, was darauf hindeutete, dass das meiste freie Curcumin nicht von der Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7 aufgenommen wurde. Da NPs ein vielversprechendes Potenzial für eine hocheffiziente intrazelluläre Wirkstoffabgabe haben könnten [41, 42], wurde beobachtet, dass Curcumin-beladene CS-BSA-NPs im Vergleich zu mit freiem Curcumin behandelten Zellen eine erhöhte Fluoreszenzintensität zeigten, was darauf hindeutet, dass sich CS-BSA-NPs verbessern könnten die zelluläre Aufnahme von Curcumin. Hier zeigte diese Beobachtung, dass CS-BSA-NPs die Arzneistoffakkumulation in den Zellen effektiv fördern könnten.

Die Aufnahme von freiem Curcumin und mit Curcumin beladenen CS-BSA-NPs in RAW 264.7-Zellen (M1) für 6 h. Curcumin zeigte eine grün fluoreszierende Farbe und zeigte die intrazelluläre Position von freiem Curcumin und mit Curcumin beladenen CS-BSA-NPs an. Der Kern wurde mit Hoechst (blau) für 15 min bei 37 °C gefärbt. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm und gilt für alle Figurenteile

Phagozytose von Aβ 42, induziert durch freies Curcumin und mit Curcumin beladene CS-BSA-NPs

Wie in Abb. 5 gezeigt, zeigte Curcumin eine rote Fluoreszenz bei einer Anregungswellenlänge von 550 nm und einer Emissionswellenlänge von 570 nm. Darüber hinaus zeigte es auch grüne Fluoreszenz bei den Anregungs- und Emissionswellenlängen von FITC. Daher zeigten, sobald Curcumin- und FITC-markiertes Aβ 42 in RAW 264.7-Zellen (M1) phagozytiert wurde, alle grüne Fluoreszenz bei den Anregungs- und Emissionswellenlängen von FITC. In dem Co-Lokalisierungsexperiment wurden rote Fluoreszenz und grüne Fluoreszenz (die Curcumin repräsentieren) verschmolzen und die gelben Punkte repräsentierten die intrazelluläre Existenz und Position von Curcumin; einige grüne Punkte waren nicht zusammen mit den roten fluoreszierenden Punkten lokalisiert, was die Existenz und Phagozytose von FITC-markiertem Aβ 42 in RAW 264.7-Zellen (M1) darstellt. Es wurde beobachtet, dass wenige Mengen von Aβ 42 von Mikroglia phagozytiert wurden [43], was durch die intrazelluläre Beobachtung grüner Fluoreszenz in den Zellen nachgewiesen wurde. Wie das überlagerte Bild in Abb. 5 zeigt, hatten sich im Vergleich zu freiem Curcumin mehr gelb fluoreszierende Punkte von Curcumin in den Zellen angesammelt, was darauf hindeutet, dass eine große Menge an Curcumin-beladenen CS-BSA-NPs, dargestellt durch gelb fluoreszierende Intensität, aufgrund der Interaktion zwischen NPs und RAW 264.7-Zellen (M1) in den Zellen akkumuliert worden war. Dies induzierte höhere intrazelluläre Konzentrationen von Curcumin, was zu einer erhöhten Phagozytose von Aβ 42 führte [44], was durch die höhere grüne Fluoreszenzintensität dargestellt wird. Es wurde angenommen, dass mit Curcumin beladene CS-BSA-NPs eine Makrophagen-Polarisierung induzierten sowie entzündungshemmende und neuroprotektive Wirkungen zur verstärkten Phagozytose beitrugen.

Phagozytose von Aβ 42, induziert durch freies Curcumin und mit Curcumin beladene CS-BSA-NPs. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm und gilt für alle Figurenteile

Western-Blot-Assay

Um die möglichen molekularen Mechanismen der Curcumin-vermittelten Makrophagen-Polarisierung zu untersuchen, haben wir die Gesamtspiegel von TNF-α, IL-6 und TLR4 sowie die Phosphorylierungsspiegel von p38, ERK, JNK und IκBα durch Western-Blotting untersucht, um die spezifische Wirkungen von Curcumin auf den TLR4-MAPK/NF-κB-Signalweg.

Abbildung 6 zeigte, dass im Vergleich zu den normalen RAW 264.7-Zellen als Kontrollgruppe RAW 264.7-Zellen (M1-Phänotyp) mehr potenziell neurotoxische lösliche Faktoren und proinflammatorische Zytokine freisetzten, die durch die höheren Expressionsspiegel von TNF-α und IL-6 gekennzeichnet sind. was zum neuronalen Tod führt und die Entwicklung von AD verschlimmert. Verglichen mit Kontroll- und freiem Curcumin schienen mit Curcumin beladene CS-BSA-NPs die M1-Makrophagen-Polarisation zu hemmen und induzierten die niedrigste Expression von TNF-α und IL-6 in RAW 264.7-Zellen (M1-Phänotyp). Darüber hinaus verringerten mit Curcumin beladene CS-BSA-NPs auch die TLR4-Expression, die die M1-Makrophagen-Polarisation regulierte, und die Phosphorylierung von ERK, JNK, p38 und NF-κB schien reduziert zu sein. Dies deutet darauf hin, dass mit Curcumin beladene CS-BSA-NPs die Akkumulation von Curcumin – und seine anschließende intrazelluläre Konzentration – in den Zellen effektiv förderten, wodurch seine blockierende Wirkung auf den TLR4-MAPK/NF-κB-Signalweg verstärkt und die M1-Makrophagen-Polarisation weiter gehemmt wurde.

Western-Blot-Analysen der Expressionsniveaus von TNF-α, IL-6, TLR4 und Phosphorylierung von ERK, JNK, p38 und Nuclear Factor (NF)-κB in RAW 264.7-Zellen (M1-Phänotyp) nach Behandlungen mit freiem Curcumin und Curcumin geladene CS-BSA-NPs

Diskussion

AD ist eine der häufigsten neurodegenerativen Erkrankungen und die Haupttodesursache in den Industrieländern. In Bezug auf die Behandlung von AD war die Fähigkeit der BHS, das Eindringen der meisten exogenen Substanzen in das Gehirn zu verhindern, das Haupthindernis, das ihre Verwendung verhinderte. Um dieses Problem anzugehen, haben wir CS-BSA-NPs entwickelt, um den Transport von Curcumin durch die BBB zu verbessern. Die Ergebnisse zeigten, dass in Übereinstimmung mit der vorherigen Studie [45] freies Curcumin die Zellen nur schwer durchdrang und die BBB überquerte, was zu einer geringeren Penetrationswirkung führte. Curcumin-beladene CS-BSA-NPs könnten die Wirkstoffpenetration durch die BBB mit der Vermittlung von Caveolae- und Mikropinocytose-vermittelten Signalwegen effektiv fördern. Eine durch Aβ-Aggregation induzierte Neuroinflammation ist einer der kritischen Faktoren, die den pathologischen Mechanismen der AD zugrunde liegen [46]. Die Aβ-Spiegel im Gehirn werden durch das dynamische Gleichgewicht zwischen der Bildung und Clearance von Aβ bestimmt; Daher ist die Entfernung von Aβ auch wichtig, um seinen Spiegel im Gehirn zu bestimmen. Die Fähigkeit der Mikroglia zur Phagozytose zeigte eine wichtige physiologische Bedeutung bei der Prävention von AD. Die Mikroglia waren hauptsächlich für die Aβ-Target-Clearance verantwortlich und neigten dazu, hauptsächlich um die Ablagerungszone von Aβ 42 herum zu aggregieren, wodurch die Akkumulation von Aβ 42 durch Phagozytose weiter verhindert wurde [47, 48]. Die Ergebnisse zeigten, dass die Phagozytose-Wirkung von mit Curcumin beladenen CS-BSA-NPs-behandelten RAW 264.7-Zellen (M1-Phänotyp) auf Aβ 42 erhöht war und dass die Akkumulation und Ablagerung von Aβ 42 reduziert wurde, was die Entwicklung von AD verbessern kann.

Die Mikroglia (M1-Phänotyp) setzt potenziell neurotoxische lösliche Faktoren und proinflammatorische Zytokine wie TNF-α und IL-6 frei, was zum neuronalen Absterben führt und die Entwicklung von AD verschlimmert [49]. Es wurde festgestellt, dass die M1-Makrophagen-Polarisation von der Aktivierung des TLR4-MAPK /NF-κB-Signalwegs abhängt und dass die Blockierung des TLR4-MAPK /NF-κB-Signalwegs die M1-Makrophagen-Polarisation hemmen und die Polarisation von Makrophagen vom M1-Typ fördern könnte zum M2-Typ [50]. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Curcumin als Bestandteil des indischen Gewürzes Kurkuma (Curcumin longa) – eine Ingwerart – ein starkes entzündungshemmendes Mittel war, das Entzündungen reduzieren und sogar eine Rolle bei der AD-Behandlung spielen könnte. CS-BSA-NPs dienten als leistungsstarke Werkzeuge für die effiziente gezielte Penetration von Curcumin auf die BHS. Im Vergleich zu freiem Curcumin induzierten mit Curcumin beladene CS-BSA-NPs Phagozytoseeffekte und eine größere Menge von Aβ 42 wurde von RAW 264.7-Zellen phagozytiert. Darüber hinaus induzierten mit Curcumin beladene CS-BSA-NPs niedrigere Proteinexpressionsspiegel von TNF-α, IL-6 und TLR4 als freies Curcumin, und die Phosphorylierung von ERK, JNK, p38 und NF-κB wurde ebenfalls gehemmt. Es zeigte, dass mit Curcumin beladene CS-BSA-NPs die Curcumin-induzierte Makrophagen-Phagozytose verstärken können, indem sie die M1-Makrophagen-Polarisation durch Blockieren des TLR4-MAPK/NF-κB-Signalwegs hemmen und so die entzündungshemmende und neuroprotektive Wirkung von Curcumin fördern.

Schlussfolgerung

Unsere Daten legten nahe, dass Curcumin als Therapeutikum bei der Behandlung von AD verwendet werden könnte. Curcumin-beladene CS-BSA-NPs lösten die RAW 264.7-Zell-induzierte Phagozytose von Aβ 42 durch die verstärkte BHS-Penetration von Curcumin und eine höhere intrazelluläre Wirkstoffkonzentration aus. Darüber hinaus induzierten mit Curcumin beladene CS-BSA-NPs entzündungshemmende und neuroprotektive Wirkungen, indem sie die M1-Makrophagen-Polarisation hemmten und den TLR4-MAPK/NF-κB-Signalweg blockierten. Zusammengenommen zeigten Curcumin-beladene CS-BSA-NPs ihr Potenzial zur Verbesserung der Behandlung von AD.

Abkürzungen

AD:

Alzheimer-Krankheit

BBB:

Blut-Hirn-Schranke

BSA:

Rinderserumalbumin

CS:

Chitosan

LPS:

Lipopolysaccharid

NPs:

Nanopartikel

TLRs:

Toll-like-Rezeptoren