Herstellung von Glycyrrhetinsäure-Liposomen unter Verwendung der Gefriertrocknungs-Monophasen-Lösungsmethode:Vorformulierung, Optimierung und In-vitro-Bewertung

Hintergrund

Glycyrrhetinsäure (GA), eine Art von Triterpensaponin, wird hauptsächlich aus den Wurzeln der Glycyrrhiza der traditionellen chinesischen Medizin gewonnen [1]. Studien haben gezeigt, dass GA offensichtliche antimikrobielle, antivirale und krebsbekämpfende Wirkungen hat und häufig zur klinischen Behandlung von chronischer Hepatitis und Leberkrebs eingesetzt wird [2,3,4]. Gemäß dem biopharmazeutischen Klassifikationssystem ist GA ein Arzneimittel vom Typ II. Aufgrund der geringen Polarität, hohen Hydrophobie und schlechten Löslichkeit von GA-Molekülen ist seine orale Bioverfügbarkeit relativ gering [5]. Darüber hinaus kann GA Natriumretention und Kaliumverlust verursachen [6], die mit Bluthochdruck verbunden sind, während die Nebenwirkungen von GA dosisabhängig zu sein scheinen. Daher wird die Verwendung geeigneter Formulierungsstrategien zur Erhöhung der Absorption und Aufrechterhaltung der effektiven Konzentration von GA seine Bioverfügbarkeit und Sicherheit erheblich verbessern.

Die Überlegenheit von Liposomen als Wirkstoffträger ist weithin anerkannt [7,8,9]. Ihre funktionellen Vorteile werden hauptsächlich durch die folgenden Aspekte demonstriert:(1) Liposomen haben eine gute Biokompatibilität und Sicherheit; (2) Liposomen verbessern die gezielte Arzneimittelabgabe an Lymphknoten und reduzieren die hemmenden Wirkungen oder Schäden, die Krebsmedikamente auf normale Zellen und Gewebe haben; (3) Arzneimittelträger-Liposomen geeigneter Größe haben eine verbesserte Permeabilität und Retentionswirkungen an Stellen von soliden Tumoren, Infektionen und Entzündungen, wo die Permeabilität von kapillaren Blutgefäßen erhöht ist, was die Fähigkeit des passiven Targetings demonstriert; (4) Liposomen können sowohl hydrophobe als auch wasserlösliche Arzneimittel tragen; und (5) die Liposomenoberfläche kann modifiziert und mit funktionellen Gruppen verknüpft werden. Aufgrund dieser vorteilhaften Eigenschaften wurden viele Liposomenarzneimittel zugelassen.

Die nach herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Liposomen erhaltenen Produkte sind wässrige Liposomensuspensionen. Wässrige Liposomensuspensionen sind jedoch relativ instabil und können während der Lagerung auslaufen, fusionieren und einer Phospholipidhydrolyse unterliegen, was zu einer begrenzten Langzeitlagerungsfähigkeit führt [10]. Derzeit besteht der wirksame Weg zur Lösung dieser Probleme darin, Proliposomen herzustellen [11]. Proliposom ist ein Pulver mit guter Fließfähigkeit, das aus dehydrierten Liposomenkomponenten und Hilfsstoffen hergestellt wird. Liposomen können rekonstruiert werden, indem das Proliposom vor der Anwendung in Wasser dispergiert wird. Sprühtrocknung und Gefriertrocknung sind die beiden gebräuchlichsten Verfahren zur Herstellung von Proliposomen [12], weisen jedoch einige Einschränkungen in der Anwendung auf. Sprühtrocknung ist beispielsweise für wärmeempfindliche Medikamente nicht geeignet und kann aufgrund der geringen thermischen Effizienz der Geräte oft zu Problemen wie Wandhaftung führen. Die strukturellen Umlagerungen der liposomalen Doppelschichten können während des Sprühtrocknungsprozesses erfolgen [13]. Die häufig verwendete Gefriertrocknungsmethode ist ein Wassersuspensionssystem, aber die Gefriertrocknung von Wasser dauert lange, daher ist diese Methode sehr kostspielig und zeitaufwendig.

In den letzten Jahren wurde ein neues Verfahren zur Herstellung von Proliposomen (Lyophilisation Monophase Solution Method) entwickelt [14, 15]. Dieses Verfahren beinhaltet das Auflösen der Lipide, Arzneistoffe und wasserlöslichen Lyoschutzmittel in einem tert-Butylalkohol (TBA)/Wasser-Co-Lösungsmittelsystem, dann Gewinnen von Proliposomen durch Gefriertrocknen nach Zugabe von Wasser, um eine homogene Liposomensuspension zu bilden. Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile:(1) Die Zugabe von TBA kann die Sublimationsrate von Eis signifikant verbessern, was zu einer schnellen und gründlichen Gefriertrocknung führt, die wirtschaftlich günstig ist. Gleichzeitig ist eine schnelle Sublimation vorteilhaft, um ein Zusammenfallen von Klumpen zu verhindern [16]. (2) Die Einphasenlösungstechnik der Gefriertrocknung ist ein einstufiges Verfahren, das ein hochwirksames Verfahren für die Liposomenherstellung im großen Maßstab ist. (3) Obwohl TBA nicht in den ICH-Richtlinien für Lösungsmittelrückstände aufgeführt ist, fällt es aufgrund seiner Ähnlichkeit mit LD₅₀ . wahrscheinlich in die Kategorie eines Lösungsmittels der Klasse 3 mit geringer Toxizität Toxizitätsdaten für andere Lösungsmittel der Klasse 3 [17]. (4) Durch dieses Verfahren kann steriles Pulver erhalten werden. (5) Es ist geeignet für Medikamente mit schlechter Wasserlöslichkeit oder schlechter Wasserstabilität [18].

Es gab einige Berichte über die Verwendung des TBA/Wasser-Lyophilisierungssystems für die Liposomenherstellung. Die Forschung zu diesem System ist jedoch unzureichend und es bleiben noch viele Fragen. Beispielsweise sind die Variation der Sublimationsrate von TBA/Wasser-Systemen mit unterschiedlichen Konzentrationen, Änderungen der Festkörpereigenschaft des spezifischen Arzneimittels nach der Lyophilisierung durch TBA/Wasser-Systeme mit unterschiedlichen Konzentrationen und der Hydratations- und Zusammenbauprozess des lyophilisierten Pulvers noch unklar. Andererseits ist die Löslichkeit eines bestimmten hydrophoben Arzneimittels in TBA/Wasser-Co-Lösungsmittel mit unterschiedlichen Anteilen und Temperaturen sehr spezifisch. Die obigen Informationen sind entscheidend für die Formulierung und das technologische Design von Wirkstoff-Träger-Liposomen. Daher haben wir in dieser vorliegenden Studie das GA als Modellarzneimittel verwendet, um die oben beschriebene Vorformulierungsuntersuchung durchzuführen. Darüber hinaus optimierten wir unter Verwendung des mittleren Durchmessers und der Einschlusseffizienz als primäre Bewertungsmaßstäbe die Formulierungs- und Verarbeitungsvariablen von GA-Liposomen, die durch die Gefriertrocknungs-Monophasen-Lösungsmethode unter Verwendung des Box-Benhnken-Designs hergestellt wurden. Die Auswirkungen der Gefrierschutzmitteltypen auf die Qualität der Liposomen wurden ebenso bewertet wie die in vitro-Freisetzung von Liposomen und ihre Aufnahme durch Hepatomzellen.

Methoden/Experimental

Materialien

Glycyrrhetinsäure (> ~98% rein) wurde von Dalian Meilun Biology Technology Co., Ltd. (Dalian, China) bezogen. Sojabohnen-Phosphatidylcholin (Lipoid S100) wurde von Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Deutschland) bezogen. Cholesterin wurde von J&K Scientific Ltd. (Beijing, China) bezogen. Die Referenzverbindung von GA wurde von den National Institutes for Food and Drug Control (Beijing, China) erworben. FITC-PEG-DSPE (Molekulargewicht 2000) wurde von Shanghai Ponsure Biotech, Inc. (Shanghai, China) bezogen. tert-Butylalkohol (> ~98%) und alle anderen Reagenzien, wenn nicht anders angegeben, wurden von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Beijing, China) bezogen. Entionisiertes Wasser wurde durch ein Milli-Q-Wasserreinigungssystem (Millipore, Bedford, MA, USA) hergestellt.

Löslichkeitsstudie von GA, SPC und Cholesterin im TBA/Wasser-Co-Lösungsmittelsystem

Die gesättigten TBA-Wasser-Lösungen (30 ml) von GA mit unterschiedlichem TBA-Volumenprozentsatz wurden durch Rühren eines Überschusses des Arzneimittels in dem entsprechenden Vehikel bei 25 °C, 30 °C, 35 °C, 40 °C und 45 °C hergestellt für 72 Stunden. Nach Zentrifugation (15 min bei 3000 U/min) wurde der Überstand durch einen mikroporösen Filter mit 0,45 μm geleitet. Die Sättigungslöslichkeit von GA wurde nach adäquater Verdünnung durch HPLC gemessen. Drei Wiederholungen wurden in jedem TBA/Wasser-Co-Lösungsmittel durchgeführt. Die HPLC-Analyse wurde auf einem LabAlliance (Modell Serie III) HPLC-System (Lab Alliance, Tianjin, China) durchgeführt, das mit einer quaternären Pumpe, einem Autosampler und einem Säulenfach, gekoppelt an einen UV-Detektor, ausgestattet war. Die Trennung erfolgte auf einer C18-Säule (4,6 mm  ×  250 mm; 5 μm; Dikma Technologies, Peking, China); Methanol und Wasser (90:10 V /V ) wurden als mobile Phase mit einer Flussrate von 1,0 ml/min verwendet. Die Analyten wurden mit einem UV-Detektor bei 250 nm nachgewiesen.

Die Löslichkeit von Sojabohnen-Phosphatidylcholin (SPC) (oder Cholesterin) in einem TBA/Wasser-Co-Lösungsmittelsystem wurde unter Verwendung einer turbidimetrischen Methode abgeschätzt [19, 20]. Kurz gesagt, 10 mg SPC (oder Cholesterin) wurden in TBA bei 25 °C, 30 °C, 35 °C, 40 °C und 45 °C gelöst, um eine klare Lösung zu erhalten; die Temperatur wurde während der gesamten Versuchsdauer aufrechterhalten. Eine zunehmende Menge gereinigtes Wasser mit derselben Temperatur wurde zu einer TBA-Lösung von SPC (oder Cholesterin) bei 25 °C zugegeben, bis die erste Trübung auftrat und der kritische Wasservolumenwert aufgezeichnet wurde. Die Trübung kann identifiziert werden, indem der Absorptionswert bei 655 nm (> 0,04) gegen die Blindlösung (gereinigtes Wasser) mit einem UV-Vis-Spektrophotometer des Modells T6 (Purkinje General Instrument Co., Ltd., Peking) gemessen wird.

Herstellung von Liposomen unter Verwendung der Gefriertrocknungs-Monophasen-Lösungsmethode

GA, SPC und Cholesterin wurden in TBA bei 45 °C gelöst, und wasserlösliches Lyoprotektor wie Mannit, Lactose, Saccharose und Trehalose wurden in 45 °C heißem Wasser gelöst. Dann wurden diese beiden Lösungen in geeigneten Verhältnissen gemischt, um eine dritte klare isotrope Einphasenlösung (Gesamtvolumen 60 ml) zu erhalten. Nachdem die einphasige Lösung durch Filtration durch 0,22 μm Poren sterilisiert wurde, wurde sie in die 10 ml Gefriertrocknungsvials mit einem Füllvolumen von 2,0 ml gefüllt. Nach 12 h Vorfrosten bei − 40 °C wurde die Gefriertrocknung bei einer Regaltemperatur von − 50 °C für 24 h bei einem Kammerdruck von 1–20 Pa in einem Lyophilisator (SJIA-10N, Ningbo Shuangjia Science Technology .) durchgeführt Development Co., Ltd., China).

Messung der Partikelgröße und Verkapselungseffizienz von Liposomen

Die Liposomensuspension wurde hergestellt durch Zugabe von 5 mg Proliposomenpulver zu 5 ml gereinigtem Wasser und anschließender Vortexbewegung für 1 min zweimal mit einem 15-minütigen Intervall zur vollständigen Hydratation. Die Größenanalyse der Liposomen wurde unter Verwendung eines Laser-Partikelgrößenanalysators (Nano ZS90 Malvern Instruments, UK) charakterisiert.

Die Einkapselungseffizienz von GA in Liposomen wurde durch die Ultrafiltrations-Zentrifugationstechnik bestimmt. Kurz gesagt, pipettieren Sie 1 ml der liposomalen Dispersion (500 μg Proliposomen in 5 ml gereinigtem Wasser) in einen 10-ml-Messkolben, gefolgt von der Zugabe von 5 ml gereinigtem Wasser, 2 ml Aceton und verdünnen Sie mit gereinigtem Wasser auf 10 ml. 0,5 ml dieser Suspension in die obere Kammer des Zentrifugenfilters (Amicon Ultra-0.5, Millipore, Cdduounty Cork, Irland) mit einem Molekulargewichts-Cut-off von 50 kDa überführen, die bei 10.000 U/min 30 min bei 15 °C unter Verwendung von zentrifugiert wurde eine Ultrazentrifuge (CP70MX, Hitachi Koki Co., Ltd., Japan). Dann wurden 20 μl Ultrafiltrat in das HPLC-System bei einer UV-Absorptionswellenlänge von 250 nm injiziert, und der Gehalt an GA wurde als Gehalt an freiem Arzneimittel bezeichnet. Die Verkapselungseffizienz (EE) wurde nach den folgenden Gleichungen berechnet

wo W _kostenlos ist die Menge an freiem Medikament und W _Gesamt ist die Gesamtmenge des Medikaments.

Bestimmung der Sublimationsrate von TBA/Wasser-Gemischen

Ein Milliliter TBA/Wasser-Mischungen mit unterschiedlichem TBA-Volumenprozentsatz (10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % und 90 %) wurden in 10 ml-Gefriertrocknungsfläschchen gefüllt , bzw. Die TBA/Wasser-Mischungen wurden bei – 40 °C für 12 h vorgefroren und dann mit einem Lyophilisator (SJIA-10N, Ningbo Shuangjia Science Technology Development Co., Ltd., China) bei – 50 °C lyophilisiert. Es wurde die Zeit aufgezeichnet, in der TBA/Wasser-Gemische vollständig aus den Gefriertrocknungsfläschchen verschwunden waren, und die Sublimationsrate wurde berechnet, indem das Volumen (μl) durch die Zeit (min) dividiert wurde.

Bestimmung des gesättigten Dampfdrucks von TBA/Wasser-Gemischen

Die Details der Versuchsapparatur und des Betriebsablaufs wurden an anderer Stelle beschrieben [21, 22]. Die Dampfdrücke des Systems TBA/Wasser (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% und 90%) wurden nach einem statischen Verfahren gemessen. Die Apparatur bestand aus einem mit TBA/Wasser-Gemisch gefüllten Arbeitsebulliometer, einem mit reinem Wasser gefüllten Referenzebulliometer, einem Pufferbehälter, zwei Kühlern, zwei Temperaturmessungen und einem Druckkontrollsystem. Der Gleichgewichtsdruck des Systems wurde durch die Siedetemperatur von reinem Wasser im Referenz-Ebulliometer im Sinne der Temperatur-Druck-Beziehung bestimmt, die durch die Antoine-Gleichung [23] dargestellt wird.

Bestimmung der GA-Löslichkeit

Die Wasserlöslichkeit von freiem GA wurde durch Zugabe von überschüssigem GA (10 mg) zu 10 ml reinem Wasser unter magnetischem Rühren (300 U/min) in einem thermostatisch kontrollierten Wasserbad (DF-101S, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd., China) bei 25 °C, bis ein Gleichgewicht erreicht war (48 h). Die Proben wurden durch einen 0,45-μm-Membranfilter filtriert, entsprechend mit Methanol verdünnt und mittels HPLC analysiert [24]. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.

Beobachtung der Oberflächenmorphologie von vorgefrorenen TBA/Wasser-Gemischen

Fünf Milliliter Wasser/tert-Butanol-Mischungen wurden in eine 90-mm-Petrischale gegossen, dann in der Kühlfalle ausgefroren (– 40 °C); die gefrorenen Proben wurden unter Verwendung eines optischen Mikroskops XSP-4C (Shanghai Changfang Optical Instrument Co. Ltd., Shanghai, China) beobachtet.

Transmissionselektronenmikroskopie

Das Aussehen der Liposomen wurde durch Hitachi HT7700-Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (Hitachi, Japan) bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV beobachtet. Die Liposomensuspension wurde durch Zugabe von 5 mg Proliposomenpulver zu 5 ml gereinigtem Wasser bei Raumtemperatur erhalten, durch Vortexen 10 s lang gemischt und dann 30 s lang stehen gelassen. Ein Tropfen wurde mit einer Mikropipette entnommen und dann auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter gelegt. Der Überschuss der Suspension wurde durch Abtupfen des Gitters mit einem Filterpapier entfernt. Negativfärbung mit einer 1%igen Phosphorwolframsäurelösung (w /w , pH 7,1) wurde direkt auf die Ablagerung aufgetragen. Der Überschuss wurde mit einem Filterpapier entfernt und die Ablagerung wurde vor der Analyse trocknen gelassen.

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

Die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR)-Spektren von Proben wurden auf einem Nicolet 6700 FTIR-Spektrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) erhalten. Jede Probe und Kaliumbromid wurden mit einem Achatmörser gemischt und zu einer dünnen Scheibe gepresst. Der Scanbereich betrug 4000–400 cm ⁻¹ und die Auflösung war 4 cm ⁻¹ .

Differential-Scanning-Kalorimetrie

Messungen der Differentialscanningkalorimetrie (DSC) wurden auf einem HSC-1-DSC-Scanningkalorimeter (Hengjiu Instrument, Ltd., Peking, China) durchgeführt. Proben von 15 mg wurden in Aluminiumschalen gegeben und in der Probenschalenpresse versiegelt. Die Sonden wurden unter Stickstoffatmosphäre mit einer Geschwindigkeit von 10 °C/min von 25 auf 350 °C erhitzt.

Röntgenbeugung

Die strukturellen Eigenschaften der Proben wurden mit dem Röntgendiffraktometer D8 Focus (Bruker, Deutschland) mit Cu-Kα-Strahlung erhalten. Die Messungen wurden bei einer Spannung von 40 kV und 40 mA durchgeführt. Die Proben wurden von 5° bis 60° gescannt und die Scanrate betrug 5°/min.

Stabilität des GA-Proliposoms

GA-Proliposom-Pulver wurden in eine Glasflasche überführt, mit Stickstoff gefüllt, versiegelt und bei Raumtemperatur lichtgeschützt gelagert. Der Stabilitätstest wurde 6 Monate lang durchgeführt, wobei die Einschlusseffizienz und die Partikelgröße der rekonstituierten Liposomen als Indizes verwendet wurden.

In-vitro-Wirkstofffreisetzung

Die Freisetzung von GA aus Liposomen wurde mit der Dialysemethode bei 37 ± 0.5 °C beobachtet. Nach der Rekonstitution der Liposomen in PBS (pH 7,4) oder normaler Kochsalzlösung, um 0,5 mg/ml GA herzustellen, wurde ein Aliquot jeder liposomalen Dispersion (5 ml) in einen Dialysebeutel gegeben (Molekulargewichtsgrenzwert 8000–14.000 Da) und war dicht verschlossen. Dann wurde das Röhrchen in 150 ml Freisetzungsmedium, PBS (pH 7,4) oder normale Kochsalzlösung mit 0,1 % (v /v ) Tween 80, um den Sinkzustand aufrechtzuerhalten [25, 26]. Unter Rühren des Trennmediums mit dem Magnetrührer bei 300 U/min wurden in vorgegebenen Zeitintervallen Proben (1,5 ml) aus dem Trennmedium für 12 h entnommen, die mit dem gleichen Volumen frischen Mediums nachgefüllt wurden. Die Konzentration von GA wurde nach entsprechender Verdünnung mit Methanol durch HPLC bestimmt.

In-vitro-Zelluläre Aufnahme

Die Fluoreszenz-Liposomen wurden durch das Gefriertrocknungs-Monophasen-Lösungsverfahren hergestellt. Kurz gesagt wurde eine Mischung aus 30 mg GA, 254 mg SPC, 75,5 mg Cholesterin und 21,2 mg FITC-PEG-DSPE in TBA gelöst. Außerdem wurden 1016 mg Trehalose in Wasser gelöst. Dann wurden diese beiden Lösungen gemischt, um eine klare einphasige Lösung zu erhalten (Gesamtvolumen 30 ml). Nachdem die einphasige Lösung durch Filtration durch 0,22 μm Poren sterilisiert wurde, wurde sie in die 10-ml-Gefriertrocknungsfläschchen mit einem Füllvolumen von 2,0 ml gefüllt, dann für 24 h lyophilisiert und mit Wasser bis zur Verwendung rekonstituiert.

Die HepG2-Zellen (Wanleibio, Co., Ltd., Shenyang, China) wurden in DMEM mit 10 % FBS (fetales Rinderserum) kultiviert. Die Zellen wurden ausplattiert, bis eine Konfluenz von 90 % in 6-Well-Platten erreicht wurde, und die Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator bei 37,0 °C mit 5,0 % CO₂ . kultiviert . Nach 24-stündiger Inkubation wurden 200 μl FITC-GA-Liposomensuspension zu 1 ml der HepG2-Zellsuspension (1 × 10 ⁴ .) gegeben Zellen pro Vertiefung). Nach der Inkubation für 0,5 h, 1 h, 2 h und 4 h wurden die Zellen dreimal mit PBS mit einem pH-Wert von 7,4 gewaschen und die extrazelluläre Fluoreszenz wurde mit 0,4 % (w /v ) Trypanblau-Lösung. Zellen wurden mit 1% (w /v ) Triton X100. Die Fluoreszenzintensität des Zelllysats bei 495 nm Anregung und 520 nm Emission wurde mit einem RF5301-Fluoreszenzspektrophotometer (Shimadzu, Tokio, Japan) gemessen. Die relativen Fluoreszenzwerte wurden in Phospholipidkonzentrationen umgewandelt, basierend auf einer Standardkurve der Phospholipidkonzentration gegen die FITC-Fluoreszenzintensität, gemessen im Zelllysepuffer. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des BCA-Proteinassay-Kits (Pierce, Rockford, IL, USA) bestimmt. Die Aufnahme wurde als Menge an Phospholipiden im Vergleich zu pro Milligramm zellulärem Protein ausgedrückt [27].

Ergebnisse und Diskussion

Vorformulierungsstudie

Löslichkeitsstudie

Da Liposomen unter Verwendung der Gefriertrocknungs-Monophasen-Lösungsmethode hergestellt werden, wurde eine Löslichkeitsstudie durchgeführt, um sicherzustellen, dass sich das Arzneimittel und das Trägermaterial vor der Gefriertrocknung in der TBA/Wasser-Lösung auflösen können.

Abbildung 1 zeigt die Änderungen der gesättigten Löslichkeit von GA in einem TBA/Wasser-Co-Lösungsmittelsystem mit unterschiedlichen Volumenprozentsätzen. Innerhalb von 25 °C bis 45 °C nahm die gesättigte Löslichkeit von GA mit steigendem TBA-Volumenprozentsatz von 10 auf 60 % kontinuierlich zu, und die gesättigte Löslichkeit von GA betrug> 0,5 mg/ml, wenn der TBA-Volumenprozentsatz> 40 % betrug. Andererseits nahm die gesättigte Löslichkeit von GA mit steigender Temperatur der TBA/Wasser-Lösung zu, wenn sie auf dem gleichen Volumenprozentsatz gehalten wurde. Der Unterschied in der Löslichkeit bei unterschiedlichen Temperaturen wurde immer deutlicher, als der Volumenprozentsatz von TBA 30 % erreichte. Die Löslichkeit von Sojabohnenphospholipiden und Cholesterin im TBA/Wasser-Co-Lösungsmittelsystem ist im gestapelten Säulendiagramm dargestellt (Abb. 2). Abbildung 2a, b stellen das Volumen des TBA/Wasser-Gemischs dar, das für eine Einheit (1 mg) Phospholipide bzw. Cholesterin benötigt wird, um bei verschiedenen Temperaturen eine gesättigte Löslichkeit zu erreichen. Der graue Bereich repräsentiert das Wasservolumen und der schwarze Bereich repräsentiert das TBA-Volumen. Als die Temperatur allmählich von 25 auf 45 °C anstieg, nahmen das Gesamtvolumen des TBA/Wasser-Co-Lösungsmittels und der Volumenprozentsatz von TBA (Markierungen auf den Säulen), die zum Auflösen von 1 mg Phospholipid benötigt wurden, allmählich ab (Abb. 2a). Als die Temperatur über 35 °C anstieg, verringerte sich das benötigte Volumen an TBA deutlich und lag unter 0,15 ml. In ähnlicher Weise verringerte sich das TBA-Volumen, das zum Auflösen von 1 mg Cholesterin benötigt wurde, als die Temperatur allmählich von 25 auf 45 °C anstieg, während der TBA-Volumenprozentsatz einen Trend zu einer allmählichen Abnahme zeigte. Die obigen Ergebnisse zeigten, dass Temperatur und TBA-Volumenprozentsatz die Löslichkeit von Phospholipiden, Cholesterin und GA stark beeinflussen.

Gesättigte Löslichkeit von GA in TBA/Wasser-Co-Lösungsmittel mit unterschiedlichem Volumenprozentsatz (Mittelwert ± SD, n = 3)

Löslichkeit von SPC (a ) und Cholesterin (b ) in TBA/Wasser-Co-Solvent mit unterschiedlichem Volumenprozentsatz

Vergleich der Sublimationsrate des TBA/Wasser-Co-Lösungsmittelsystems mit unterschiedlichem Volumenprozentsatz

Die Sublimationsrate beeinflusst direkt die Produktionseffizienz von lyophilisiertem Pulver. Eine schnellere Sublimationsrate ist wirtschaftlicher und kann Materialkollaps verhindern [16]. In dieser Studie haben wir die Sublimationsraten verschiedener Konzentrationen von TBA/Wasser-Systemen untersucht. Wie in Fig. 3 gezeigt, nahm die Sublimationsrate des gemischten Lösungsmittels allmählich zu, wenn der Volumenprozentsatz von TBA von 10 auf 90 % anstieg. Darüber hinaus erreichte die Sublimationsrate über 10 μl/min, da der Volumenprozentsatz 60 % überstieg.

Sublimationsrate von TBA/Wasser-Co-Lösungsmittel mit unterschiedlichem Volumenprozentsatz (Mittelwert ± SD, n = 3)

Um den Grund für die unterschiedliche Sublimationsrate von TBA mit unterschiedlichen Volumenprozentsätzen zu identifizieren, untersuchten wir zunächst die Oberflächenmorphologie der gefrorenen Proben. Abbildung 4 enthält die lichtmikroskopischen Bilder der TBA/Wasser-Lösung mit 40 % bis 80 % Volumenprozent (TBA mit < 30 % Volumenprozent konnte nicht untersucht werden, da es unter dem Lichtmikroskop schnell schmolz). Im Vergleich zu TBA mit 40 % Volumenanteil weist TBA mit>   50 % Volumen klare und verstreute nadelförmige Strukturen auf. Wir vermuten, dass mit zunehmendem Volumenprozentsatz von TBA der Durchmesser der nadelförmigen Kristalle kleiner wird, was zu einer Erhöhung der spezifischen Oberfläche und damit zu einer Erhöhung der Sublimationsrate führt.

Oberflächenmorphologie von TBA/Wasser-Co-Lösungsmittel mit unterschiedlichem TBA-Volumenprozentsatz durch optisches Mikroskop (× 100-Vergrößerung). a 40%. b 50%. c 60%. d 70 %. e 80%

Darüber hinaus haben wir auch den Sättigungsdampfdruck des TBA/Wasser-Co-Lösungsmittelsystems mit unterschiedlichen Volumenprozentsätzen bei 25 °C gemessen. Abbildung 5 ist ein Balkendiagramm der Änderungen des Sättigungsdampfdrucks des TBA/Wasser-Co-Lösungsmittelsystems mit unterschiedlichem TBA-Volumenprozentsatz. Wie in der Figur gezeigt, neigt der Sättigungsdampfdruck des gemischten Lösungsmittels dazu, mit zunehmendem Volumenprozentsatz von TBA allmählich zuzunehmen. Da die Temperatur positiv mit dem Sättigungsdampfdruck korreliert, können wir gemäß der Antoine-Gleichung (Gl. 2) ableiten, dass der Sättigungsdampfdruck des Co-Lösungsmittelsystems unter der Lyophilisationstemperatur (− 50 °C) mit dem Volumenprozentsatz zunimmt der TBA-Anstiege, und dies kann einer der Gründe für den allmählichen Anstieg der Sublimationsrate sein.

wo p ist der Dampfdruck, T ist Temperatur, A und B sind komponentenspezifische Konstanten.

Gesättigter Dampfdruck von TBA/Wasser-Co-Lösungsmittel mit unterschiedlichem Volumenprozentsatz (Mittelwert ± SD, n = 3)

Auswirkung der Lyophilisierung auf die physikalischen und chemischen Eigenschaften von GA im TBA/Wasser-Co-Lösungsmittelsystem mit unterschiedlichem Volumenprozentsatz

Um die Wirkung der Lyophilisierung auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften von GA in einem TBA/Wasser-Co-Lösungsmittelsystem zu untersuchen, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Zehn Milligramm GA wurden in 8 ml TBA/Wasser-Co-Lösungsmittel mit unterschiedlichen TBA-Volumenprozentsätzen (40 %, 50 %, 60 %, 70 % und 80 %) gelöst. Nachdem die einphasige Lösung durch Filtration durch 0,22 μm Poren sterilisiert wurde, wurde sie in die 10 ml Gefriertrocknungsvials mit einem Füllvolumen von 2,0 ml gefüllt. Die Gefriertrocknung wurde bei − 50 °C für 24 Stunden mit einem Lyophilisator durchgeführt.

Die DSC-Spektren des lyophilisierten Pulvers nach dem Auflösen von GA in einem TBA/Wasser-Co-Lösungsmittelsystem mit unterschiedlichem TBA-Volumenprozentsatz sind in Abb. 6a gezeigt. Die DSC-Kurve des Rohwirkstoffs zeigt einen offensichtlichen endothermen Peak bei 301 °C, dem Schmelzpunkt von GA. Die Gefriertrocknung in einem TBA/Wasser-Co-Lösungsmittelsystem mit unterschiedlichem TBA-Volumenprozentsatz verursachte eine Vorwärtsverschiebung des GA-Schmelzpeaks. Die Größe der Schmelzpeakverschiebung nahm mit abnehmendem TBA-Volumenprozentsatz zu.

DSC (a ), XRD (b ) und FTIR (c ) von GA nach Lyophilisierung in TBA/Wasser-Co-Lösungsmittel mit unterschiedlichem Volumenprozentsatz; (a) GA, (b) 40 % TBA, (c ) 50 % TBA, (d) 60 % TBA, (e) 70 % TBA und (f) 80 % TBA

Frühere Forschungen haben bereits gezeigt, dass die Konzentration von TBA die Bildung einer komplexen Mischung aus kristallinen, amorphen oder metastabilen Phasen stark beeinflussen kann [28]. In einigen Fällen kann die Verwendung von TBA zu einer Verringerung der Kristallinität führen, in anderen Fällen ist das Gegenteil der Fall [29].

Die Röntgenbeugungsspektren (XRD) des lyophilisierten Pulvers nach dem Auflösen von GA in einem TBA/Wasser-Co-Lösungsmittelsystem mit unterschiedlichem TBA-Volumenprozentsatz sind in Fig. 6b gezeigt. Das XRD-Spektrum des Roharzneimittels zeigt mehrere deutliche Kristallbeugungspeaks zwischen 5° und 20°. Die Gefriertrocknung in einem TBA/Wasser-Co-Lösungsmittelsystem mit unterschiedlichem TBA-Volumenprozentsatz verursachte das Verschwinden von Beugungspeaks bei 5 bis 20 ° in den XRD-Spektren der Proben. Dies deutete darauf hin, dass der ursprüngliche Wirkstoffkristall amorph geworden war.

Die FTIR-Spektren des lyophilisierten Pulvers nach dem Auflösen von GA in einem TBA/Wasser-Co-Lösungsmittelsystem mit unterschiedlichem TBA-Volumenprozentsatz sind in 6c gezeigt. Die Form des FTIR-Spektrums des Roharzneimittels stimmt mit denen des lyophilisierten Pulvers im TBA/Wasser-Co-Lösungsmittelsystem mit unterschiedlichem TBA-Volumenprozentsatz innerhalb von 4000–400 cm ⁻¹ . überein Palette. Es traten keine charakteristischen Peaks für neue funktionelle Gruppen auf, was zeigt, dass die chemische Struktur von GA nach der Lyophilisierung in TBA mit unterschiedlichem Volumenprozentsatz gleich blieb.

Die Veränderung von einer kristallinen zu einer amorphen Form kann die Löslichkeit des Arzneimittels verändern, wodurch die Proliposomenverkapselung während der hydratisierten Rekonstruktion beeinflusst wird. In dieser Studie haben wir die Wasserlöslichkeit von lyophilisiertem GA-Pulver bei 25 °C gemessen. Wir fanden heraus, dass die gesättigte Löslichkeit des lyophilisierten GA in Wasser allmählich von 64,10 auf 19,27 μg/ml abnahm, wenn der TBA-Volumenprozentsatz von 40 auf 80 % anstieg. Sie war jedoch immer noch signifikant höher als die Wasserlöslichkeit des Roharzneimittels (6,36 μg/ml), was darauf hindeutet, dass die Änderung von einer kristallinen zu einer amorphen Struktur während der Lyophilisierung die Löslichkeit des Roharzneimittels beeinflusst (Abb. 7).

Wässrige Löslichkeit der GA-Lyophilisierung in TBA/Wasser-Co-Lösungsmittel mit unterschiedlichem Volumenprozentsatz (Mittelwert ± SD, n = 3)

Einzelfaktor-Experiment

Es gibt viele Faktoren, die die Qualität von Liposomen beeinflussen können. Es ist bekannt, dass Phospholipid/Arzneimittel-Verhältnisse einen Einfluss auf die Kapselqualität des Arzneimittels haben [30]. Moderate Mengen an Cholesterin können die geordnete Anordnung der Lipidmembran und die Stabilität erhöhen. However, high content of cholesterol in the liposome can decrease the flexibility of membrane and thereby hinder the penetration of drug into the lipid bilayer [31]. In this study, we selected three factors that impact on liposome quality and performed a single-factor study to determine the appropriate values for subsequent optimization tests, including quantity of SPC, quantity of cholesterol, and volume percentage of TBA in the co-solvent. The quality of liposomes was evaluated in terms of encapsulation efficiency and mean diameter. Each experiment was performed in triplicate with all other parameters set to constant value, GA 60 mg, pre-freeze temperature − 40 °C, pre-freeze time 12 h. In this study, we compared the results via a scoring system, giving equal weight to both encapsulation rate and mean diameter. Scoring was conducted as follows:

where EE is encapsulation efficiency, MEE is maximum encapsulation efficiency of the group, MD is mean diameter, and MMD is maximum mean diameter of the group.

The experimental design and result are shown in Table 1. As can be seen in the table, within the range tested in this experiment, the highest score can be obtained separately when the amount of SPC is 480 mg (drug-SPC ratio of 1:8, w /w ), the amount of cholesterol is120 mg (cholesterol-SPC ratio of 1:4, w /w ), and volume percentage of TBA in the co-solvent is 50%. Therefore, these parameters were chosen as the center level of response surface optimization design, respectively.

Parameter Optimization by Box-Benhnken Design

To further study the interactions between the various factors, parameter optimization was performed by Box-Benhnken design. Based on the results of single-factor experiments, we investigated and optimized the interactions between the parameters, including quantity of SPC (X ₁ ), quantity of cholesterol (X ₂ ), volume percentage of TBA (X ₃ ) by Box-Benhnken design (BBD). Encapsulation efficiency (Y ₁ ) and mean diameter (Y ₂ ) were selected as responses. Optimization process was undertaken with desirability function to optimize the two responses simultaneously. We suppose that Y ₁ und J ₂ have the same weightiness (importance). Y ₁ had to be maximized, while Y ₂ had to be minimized. The desirable ranges are from 0 to 1 (least to most desirable). Experimental design and results are shown in Table 2. To find the most important effects and interactions, analysis of variance (ANOVA) was calculated by statistical software, Design Expert trial version 8.03 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, USA). Two quadratic models were selected as suitable statistical model for optimization for two responses encapsulation efficiency and mean diameter. The results of ANOVA relating encapsulation efficiency as response were shown in Table 3, indicating that the model was significant for all factors investigated with F value of 12.81 (P < 0,05). In this case, X ₁ , X ₂ , X ₁ X ₂ , X ₁ X ₁ , X ₂ X ₂ were significant model terms (P  < 0.05), demonstrating that the influences of the factors (X ₁ and X ₂ ) on encapsulation efficiency were not simply linear. The interaction terms were notably significant, indicating good interactions between the factors. On the contrary, the ANOVA results relating mean diameter as response (Table 3) indicated that the model was not significant for all factors investigated with F value of 1.9 (P  > 0.05). In this case, X ₃ were significant model terms (P  < 0.05), demonstrating that volume percentage of TBA have significant influence on mean diameter, while quantity of SPC (X ₁ ) and quantity of cholesterol (X ₂ ) do not have a significant effect (P  > 0.05). Moreover, there were no significant interactions between the three variables.

In order to provide a better visualization of the effect of the independent variables on the two responses and desirability value, three-dimensional profiles of multiple non-linear regression models are depicted in Fig. 8. Figure 8a–f presented the interaction of X ₁ , X ₂ , and X ₃ under encapsulation efficiency and mean diameter as response respectively. The three-dimensional profiles demonstrated how three pairs of parameters affect the encapsulation efficiency and mean diameter of reconstituted liposomes. For encapsulation efficiency, all the three surfaces are upper convex (Fig. 8a–c), with a maximum point in the center of the experimental domain, which demonstrated that there are good interactions between the three variables. For mean diameter, the shape of Fig. 8d is similar to flat surface, indicating that X ₁ and X ₂ have less effect on mean diameter. The surface contours of Fig. 8e, f both showed a slope; the mean diameter was decreased by increasing the volume percentage of TBA, indicating that factor X ₃ had an obvious effect on mean diameter but there was no obvious interaction between X ₃ and the other two factors.

Three dimensional plots of the effect of X X (a ), X X (b ) and X X (c ) on encapsulation efficiency and the effect of X X (d), X X (e) and X X (f) on mean diameter

Based on the quadratic model, the optimal conditions for liposomes preparation calculated by software were as follows:508 mg phospholipid quantity, 151 mg cholesterol quantity, and 55% volume percentage of TBA. Under these conditions, the encapsulation efficiency and mean diameter were found to be 68.55% and 220 nm, respectively.

Selection of the Type and Dosage of Lyoprotectant

Competition for liquid water between the growing ice crystals and the hydrophilic substances (including the hydrophilic portion of the lipid membrane) during freezing leads to adhesion of ice crystals to the phospholipid groups. This can result in damage to the lipid membrane. Lipid membrane fusion following rehydration causes an increase in particle size and leakage of encapsulated drug. Lyoprotectant can reduce liposomal damage during the freeze-thaw process [32]. In this study, we investigated the effect of various types (lactose, sucrose, trehalose, mannitol) and dosage (lyoprotectant to SPC ratio was 1:2, 1:1, 2:1, 4:1, and 6:1 w /w ) of lyoprotectant on scores of reconstituted liposome. Single-factor experiments were performed while maintaining all other variables constant:GA amount of 60 mg, SPC amount of 508 mg, cholesterol amount of 151 mg, volume percentage of TBA in the co-solvent of 55%, pre-freeze temperature of − 40 °C, pre-freeze time of 12 h. Experimental results are shown in Fig. 9. The encapsulation efficiency increases firstly and then decreases by decreasing lyoprotectant/SPC weight ratio from 1:2 to 1:6, wherein lactose, sucrose, and mannitol are respectively used as lyoprotectant. However, the encapsulation efficiency of the trehalose group increases constantly with decreasing lyoprotectant/SPC weight ratio (Fig. 9a). In terms of the mean diameter (Fig. 9b), it was found that the mean diameter was greater than 218 nm for lactose, sucrose, and mannitol group in the range from 1:2 to1:6. Nevertheless, the mean diameter of trehalose group can be reduced to less than 190 nm when lyoprotectant/SPC weight ratio is more than 4:1; obviously, the protective effect of trehalose is better than other lyoprotectants tested. Trehalose has a good protection ability for membrane, perhaps because of the formation of hydrogen bonds with the polar head groups of lipids, and disruption of the tetrahedral hydrogen bond network of water [33]. According to scores (Fig. 9c), the highest score (0.24) was obtained when trehalose/SPC weight ratio is 4:1 and 6:1. Finally, we choose trehalose and 4:1 (trehalose/SPC weight ratio) for following experiments from the perspective of cost and increasing drug loading.

The effect of mass ratio between cryoprotectant and SPC on encapsulation efficiency (a ), mean diameter (b ) and scores (c ) of reconstituted liposomes (mean  ±  SD, n =3)

Through the above Box-Benhnken design and lyoprotectant screening experiment, the experimental conditions were determinated:GA amount of 60 mg, SPC amount of 508 mg, cholesterol amount of 151 mg, volume percentage of TBA in the co-solvent of 55%, weight ratio of trehalose to SPC was 4:1. Under these conditions, the encapsulation efficiency and mean diameter were 74.87% and 191 nm, respectively.

Transmission Electron Microscopy

In this study, TEM of liposomes suspension was taken at the same time point (same hydration time). We have observed different states in the sample, which could explain the self-assembly behavior of the liposomes. Figure 10a shows the initial state of hydration; it can be seen that a large amount of GA (black dots) is wrapped in dispersed phospholipids (translucent material), and spontaneous aggregation of the phospholipid fragments occurs. Figure 10b shows the morphology of fully assembled liposomes (average diameter of about 200 nm), which were nearly spherical with a phospholipid bilayer structure (the light-gray portion). Moreover, the drug particles (dark gray dots) were entrapped in the lipid bilayer.

Transmission electron micrographs of reconstituted liposomes, (a ) initial state of hydration of proliposomes, (b ) fully assembled liposomes

Stability of GA Proliposome

After 6 months, the proliposome powders have a good mobility and an unaltered appearance. The liposome suspension formed automatically when in contact with purified water. The entrapment efficiency and particle size of the reconstituted liposome were 72.82% and 198 nm. There is no significant difference from the data of the reconstituted liposome 6 months before. Therefore, the GA proliposome could be considered stable at 25 °C for over 6 months.

In Vitro Drug Release Studies

Evaluation of in vitro drug release from encapsulated liposome was done by dialysis method. The in vitro release profiles of GA from GA-loaded liposomes at 37 °C in PBS (pH 7.4) and physiological saline solution are shown in Fig. 11. The release profile of both group showed a fast release (the larger slope) within 1 h, then curve slope becomes smaller after 1 h, the release rate begins to slow down. The drug-release curve shapes of physiological saline solution group are similar to PBS group. The in vitro release of GA from the GA-loaded liposomes was 65.25 ± 4.82% and 69.46 ± 4.32% from PBS and physiological saline solution in 12 h. No significant difference (P  = 0.088, paired t test, SPSS software17.0) was found for the release of GA at different release medium over the entire study period, which demonstrated that the reconstituted liposomes have both sustained-release performance in two kinds of release medium.

In vitro dissolution profiles of GA from GA-loaded liposomes in a PBS and b physiological saline solution (mean ± SD, n  = 3)

In Vitro Cell Uptake

Figure 12a showed that the uptake process of GA-liposomes by Hep G2 cells is time-dependent under the experimental concentrations. After incubation for 30 min, the uptake amounts of drug-loaded liposomes (unit mass protein) by Hep G2 cells were 1480 ng. In the range from 30 to 240 min, the uptake amounts of drug-loaded liposomes (unit mass protein) were gradually increased from 1480 to 2030 ng. Figure 12b–e showed fluorescence microscopy images of Hep G2 cells at 30, 60, 120, and 240 min after ingestion of drug-loaded liposomes, and it is observed that the fluorescence intensity is also gradually increased over time. This result indicates that the reconstituted liposomes prepared by monophase solution method can be effectively uptaken by the hepatoma cells.

In vitro cellular uptake of GA-loaded liposomes by Hep G2 cells. a The uptake amount versus incubation time. b –e Fluorescence microscopy images at 30, 60, 120, and 240 min

Conclusions

In the present work, preformulation investigation, formulation design along with in vitro characterization of GA-loaded liposomes by lyophilization monophase solution method have been done. After carrying out a preformulation study, we found that solubility of GA, cholesterol, and SPC in TBA/water co-solvent was substantially increased when temperature was over 40 °C. Sublimation rate of co-solvent gradually increased with increasing TBA volume percentage, which perhaps relate to surface morphology of the frozen co-solvent and saturated vapor pressure. After lyophilization using TBA/water co-solvent system, GA became amorphous structure; moreover, water solubility increased. This may have an effect on proliposome encapsulation during hydrated reconstruction. After optimization by Box-Benhnken design and screening of lyoprotectant, the optimum conditions (508 mg SPC, 151 mg cholesterol, 55% volume percentage of TBA, 4:1 trehalose/SPC weight ratio) for lyophilization monophase solution process were achieved. Under the optimum conditions, satisfactory encapsulation efficiency (74.87%) and mean diameter (191 nm) of reconstituted liposomes were obtained. The reconstituted liposomes resulted in initial assemble and final spherical shape, as confirmed by TEM analysis. The in vitro release profile of the produced GA-loaded liposome was investigated in the two media and it both showed prolonged release during 12 h. Cellular uptake studies showed that the uptake process of reconstituted liposomes by Hep G2 cells is time-dependent.

Abkürzungen

BBD:

Box-Benhnken design

DSC:

Differenzkalorimetrie

EE:

Encapsulation efficiency

FTIR:

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

GA:

Glycyrrhetinic acid

MD:

Mean diameter

SPC:

Soybean phosphatidylcholine

TBA:

Tert-butyl alcohol

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

XRD:

Röntgenbeugung