Herstellung und Bewertung neuer Emodin-beladener Stearinsäure-g-Chitosan-Oligosaccharid-Nanomicellen

Zusammenfassung

Der Zweck dieser Studie bestand darin, mit Emodin beladenes Stearinsäure-g-Chitosan-Oligosaccharid (CSO-SA/EMO) herzustellen und zu charakterisieren und seine Antitumoraktivität in vitro zu bewerten. In dieser Studie wurde Stearinsäure-g-Chitosan-Oligosaccharid als Träger verwendet und seine physikalisch-chemischen Eigenschaften wurden mit verschiedenen Methoden bestimmt. Das Zellaufnahmeverhalten wurde unter Verwendung von FITC-markiertem Stearinsäure-g-Chitosan-Oligosaccharid untersucht. CSO-SA/EMO wurde unter Verwendung von Ultraschall und Dialyse hergestellt. Partikelgröße, Oberflächenpotential, Einschlusseffizienz und Wirkstofffreisetzungsverhalten wurden in vitro untersucht. Die Auswirkungen von CSO-SA/EMO auf Magenkrebszellen wurden mit MTT-Assay und Durchflusszytometrie untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Partikelgröße von CSO-SA/EMO größer und das Potenzial kleiner war als das von Stearinsäure-g-Chitosan-Oligosaccharid. Die mizellare Aufnahme von MGC803- und BGC823-Zellen über 12 h war ausreichend, und die Micellen konnten sich bei Mäusen reichlich an Läsionsstellen anreichern, wodurch ein gutes passives EPR-Targeting erreicht wurde. MTT- und Zellzyklus-Arrest-Assays zeigten eine durch CSO-SA/EMO verstärkte Antitumoraktivität gegenüber MGC803- und BGC823-Zellen im Vergleich zu freiem Emodin. Tumorvolumen, Hämatoxylin- und Eosin-Färbung und terminaler Desoxynukleotid-Transferase-dUTP-Nick-End-Labeling-Assay bewiesen, dass CSO-SA/EMO eine signifikante Antitumorwirkung auf Tumorgewebe in vivo hatte. Zusammenfassend stellt die Ultraschalldialyse-Methode eine einfache und effektive Methode zur Herstellung von CSO-SA/EMO dar. Die Verabreichung von Emodin unter Verwendung eines Micellensystems verbesserte seine Antitumorwirkung effektiv.

Einführung

Emodin (EMO) ist ein natürliches Anthrachinon-Derivat, das hauptsächlich aus traditionellen chinesischen Kräutern wie Rhabarber, Kuspidatum und Multiflorum gewonnen wird. Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) wird aufgrund ihrer geringen Toxizität, geringen Nebenwirkungen und geringen Kosten in der klinischen Forschung häufig eingesetzt [1].

Studien haben gezeigt, dass EMO eine breite pharmakologische Aktivität hat, einschließlich Immunsuppression, Anti-Pertussis, Anti-Hypertonie, entzündungshemmende, antibakterielle und Anti-Krebs-Aktivität. Es wurde festgestellt, dass EMO das Wachstum von Krebszellen hemmt [2,3,4] und verwandte Gene reguliert, um die Apoptose, Tumorgenese, Zellproliferation, Invasion und Metastasierung von Tumorzellen zu kontrollieren [5,6,7,8,9]. Studien haben gezeigt, dass EMO verschiedene Krebszellen hemmen kann, wie z. B. humane kolorektale Adenokarzinomzellen, Hepatokarzinomzellen, lymphoide Leukämiezellen [10] und humanes Zungenkarzinom SCC-4 [11]. EMO kann die Proliferation von Tumorzellen bei Magen-, Brust- und Prostatakrebs hemmen [7, 12]. EMO zeigt jedoch keine zytotoxischen Wirkungen auf normale Zellen wie normale humane gingivale Fibroblasten [13], humane Bronchialepithelzellen [14] und humane Brustzellen [15]. Diese zeigen, dass EMO im Vergleich zu normalen Zellen eine selektive Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen aufweist.

Chitosan, ein natürliches Polysaccharid, ist die deacetylierte Form von Chitin. Dieses natürliche Polymer hat ausgezeichnete Wasserlöslichkeit, Biofunktionalität, Blutverträglichkeit und mikrobielle Abbaubarkeit und ist für seine verschiedenen biomedizinischen Anwendungen bekannt. Wir haben Chitosan mit hohem Molekulargewicht (450 kDa) unter Verwendung von Chitosanase unter sauren Bedingungen abgebaut, um Chitosan-Oligosaccharid mit niedrigem Molekulargewicht (CSO, 18 kDa) zu erhalten. CSO kann Zellmembranen stark durchdringen [16] und Stearinsäure (SA) kann über den Glykoproteinweg in den Zellkern eindringen. CSO wurde hydrophob mit SA unter Verwendung von Carbodiimid (EDC) als Kopplungsreagenz modifiziert, um amphipathisches Stearinsäure-g-Chitosan-Oligosaccharid (CSO-SA) zu synthetisieren.

Obwohl EMO eine umfangreiche biologische Aktivität aufweist, ist seine Anthrachinonstruktur in Wasser schlecht löslich. Da therapeutische Medikamente durch den Blutkreislauf transportiert werden, beeinflusst ihre Löslichkeit direkt ihre Aufnahme und Verteilung. CSO-SA-Transplantate können sich in einer wässrigen Lösung selbst anordnen, um Nanomicellen zu bilden, die innen hydrophob und außen hydrophil sind. Wir haben die Nanomicellen aus dem gesammelten Zustand mit einer Ultraschallsonde dispergiert. Da sowohl EMO als auch CSO hydrophob waren, wurde EMO im Zentrum der Micellen eingekapselt.

Mehrere Modellarzneimittel werden auf CSO-SA angewendet, was das Molekulargewicht, die Struktur und die Hydrophobie der Modellarzneimittel erfordert. Vorhandene Studien umfassen Curcumin [17], Doxorubicin [18], Lamivudinstearat [19] und Oxaliplatin [20], die die Antitumorwirkung signifikant verbessern können. Wir haben die optimalen Ladebedingungen von CSO-SA/EMO untersucht. CSO-SA/EMO schafft neue Darreichungsformen mit höherer Löslichkeit und Verwertungseffizienz. CSO-SA/EMO kann Ideen für die Auswahl von Modellarzneimitteln oder -trägern und die klinische Anwendung von Micellen liefern.

Experimentelle Materialien und Methoden

Experimentelle Materialien

Männliche BALB/C+/nu-Nacktmäuse wurden vom Experimental Animal Center der Zhejiang University erhalten. Die Magenkrebszelllinien MGC803 und BGC823 mit geringer Differenzierung wurden von der ATCC-Zellbank gekauft. RPMI-1640-Kulturmedium und FBS wurden von Hangzhou Holly Leaf Biotechnology Company bezogen. EMO, MTT, FITC, Hoechst 33342, DiR, Trinitrobenzolsulfonsäure und Pyren wurden von Sigma Aldrich geliefert. Die Universität Zhejiang hat CSO-SA eingerichtet. Andere gekaufte Reagenzien waren von AR-Qualität.

Bestimmung der CMC und ¹ H-NMR-Spektren von CSO-SA

In diesem Bericht wurde die kritische Micellenkonzentration (CMC) von CSO-SA durch Fluoreszenzspektrophotometrie unter Verwendung von Pyren als Fluoreszenzsonde bestimmt. Verschiedene Konzentrationen von CSO-SA-Lösung wurden zu einer Pyrenacetonlösung gegeben, wonach das Aceton über Nacht verdampft wurde. Die Emissionsspektren und Peakwerte von Pyren in CSO-SA-Lösungen unterschiedlicher Konzentration wurden fluoreszenzspektrophotometrisch analysiert. Der erste Gipfel (I ₁ =374 nm) und der dritte Peak (I ₃ =385 nm) des Spektrums wurden aufgezeichnet. Wir haben die logarithmische Konzentration (Log C) als Abszisse aufgetragen und I ₁ /Ich ₃ als Ordinate und berechneten die CMC für die Polymermicellen.

CSO und CSO-SA wurden in D₂ . aufgelöst O in einer Konzentration von 10 mg/ml. ¹ H-NMR-Spektren wurden aufgenommen, verglichen und auf charakteristische CSO- und CSO-SA-Peaks analysiert.

Erkannter Aminsubstitutionsgrad

Der Aminsubstitutionsgrad (SD%) wurde mit der Trinitrobenzol-Schwefelsäure-(TNBS)-Methode bestimmt.

Es wurden verschiedene Konzentrationen von CSO- und CSO-SA-Lösungen hergestellt, wonach 4% NaHCO₃ und 0,1% TNBS wurden nacheinander zugegeben. Nach 2 h Inkubation bei 37 °C in einem Wasserbad wurden 2 mol/l Salzsäure zugegeben. Die Absorption wurde bei 344 nm durch Ultraviolett-Vis-Spektrophotometrie nach 30 min Ultraschallbehandlung gemessen. Eine Standardkurve wurde gezeichnet und der SD% der CSO-SA-Probe wurde berechnet.

CSO-SA-Partikelgröße und -potenzial

Eine 1,0 mg/ml CSO-SA-Lösung wurde hergestellt und die Mizellen wurden mit einer Ultraschallsonde zum Aufbrechen von Zellen vollständig dispergiert. Die Partikelgröße und das Potenzial von CSO-SA wurden mit einem Partikelgrößen- und Oberflächenpotenzialanalysator bestimmt.

Zellaufnahme von CSO-SA

FITC- und CSO-SA-Lösungen wurden gemischt, über Nacht gerührt und in einen Dialysebeutel überführt. Nicht umgesetztes FITC und absolutes Ethanol wurden durch Dialyse mit entionisiertem Wasser für 24 Stunden entfernt. Schließlich wurde eine FITC-markierte CSO-SA (FITC-CSO-SA)-Lösung mit einer Konzentration von 1,0 mg/ml erhalten.

Als Zielzellen wurden MGC803- und BGC823-Zellen verwendet, um die Zellaufnahme von CSO-SA zu untersuchen. Basierend auf der Zellproliferationsrate wurden die Zellen in 24-Well-Platten ausgesät und über Nacht kultiviert, bis sie vollständig adhärent waren. 80 µl FITC-CSO-SA-Lösung wurden dann zu einem festgelegten Zeitpunkt zugegeben. Die Zellen wurden mit 10 µl Hoechst 33342 (1 µg/ml) für 15 Minuten inkubiert, um den Zellkern zu färben. Die Aufnahme von CSO-SA durch FITC-CSO-SA wurde durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie nachgewiesen.

In-vivo-Verteilung von CSO-SA

Die Verteilung von CSO-SA in vivo wurde durch DiR-Fluoreszenzfarbstofffärbung bestimmt. CSO-SA/DiR-Lösung wurde durch Dialyse hergestellt.

Als Versuchsmodell dienten sechs Wochen alte männliche Nacktmäuse. Nackte Mäuse wurden subkutan mit 1 × 10⁸ . geimpft /ml MGC803-Zellen. CSO-SA/DiR wurde über die Schwanzvene mit einem Tumorzellvolumen von ungefähr 200 mm³ . verabreicht . Die Mäuse wurden dann zu festgelegten Zeitpunkten anästhesiert. Die zeitlich festgelegte Verteilung von CSO-SA/DiR in vivo wurde mit einem Kleintier-Lebendkörper-Imager aufgezeichnet (Wellenlängenbereich 580-700 nm, Expositionszeit 1000 ms).

Nachweis der EMO-Konzentration durch HPLC

Die EMO-Konzentration wurde durch HPLC bestimmt. EMO wurde auf eine Eclipse XDB-C18 gepackte Säule (4,6 × 250 mm, 5 µm) mit einer Schutzsäule (4,6 × 10 mm, 5 µm) aufgetragen. Die Säulentemperatur wurde auf 30 °C eingestellt, die Flussrate betrug 1,0 µl/min, die Detektionswellenlänge betrug 254 nm und das Injektionsvolumen betrug 20 µl. Die mobile Phase war Methanol/0,1% Phosphorsäure (85:15, v/v). Die EMO-Konzentration wurde als Abszisse und die Peakfläche als Ordinate aufgetragen. Zur Ermittlung des optimalen linearen Bereichs wurden Standardkurven von EMO gezogen. Alle HPLC-injizierten Proben wurden durch einen organischen 0,45-μm-Filter filtriert, um die Säule zu schützen.

Vorbereitung von CSO-SA/EMO

In dieser Studie wurde EMO mit einer Ultraschallsonde gekapselt. Als Ausgangspunkt wurde ein anfängliches Formulierungsverhältnis von 10 % (EMO:CSO-SA, w/w) verwendet. Die EMO-Lösung wurde in einem Eisbad langsam zu der micellaren Lösung getropft. Die Ultraschallsonde wurde dann für 20 Zyklen (400 W, Arbeit 2 s, Stopp 3 s) angewendet.

Die arzneistoffbeladenen Mizellen wurden in einen Dialysebeutel (MWCO, 3,5 kDa) überführt und 24 h gegen entionisiertes Wasser dialysiert, um Ethanol aus dem Lösungsmittel zu entfernen. Reines CSO-SA/EMO wurde durch Zentrifugieren des Dialysats erhalten, um freies EMO zu entfernen.

Eigenschaften von CSO-SA/EMO (Particle Diameter Potential, TEM, EE%)

Die Partikelgröße und das Oberflächenpotential von CSO-SA/EMO wurden mit einem Partikelgrößen- und Oberflächenpotential-Analysator gemessen.

Eine 0,1 mg/ml CSO-SA/EMO-Lösung wurde tropfenweise auf einen mit Kohlenstofffilm bedeckten Kupferdraht gegeben, mit 2% Phosphorwolframsäure gefärbt und getrocknet. Die Morphologie und Partikelgröße von CSO-SA/EMO wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie beobachtet.

Die Einschlusseffizienz (EE%) und die Wirkstoffbeladung (DL%) von CSO-SA/EMO wurden durch Extraktion mit organischem Lösungsmittel und HPLC nachgewiesen. Zu einer 200 µl-Probe einer mizellaren CSO-SA/EMO-Lösung wurden 1,8 µl Methanol gegeben, um die Mizellen zu dispergieren und das Arzneimittel zu extrahieren. Die EMO-Konzentration wurde als C_EMO . gemessen . Weitere 400 µl CSO-SA/EMO-Mizellenlösung wurden in ein Ultrafiltrationszentrifugenröhrchen gegeben und zentrifugiert (12.000 U/min, 5 min), um den Überstand zu erhalten. Die EE% und DL% wurden nach den folgenden Formeln berechnet:

$$ \mathrm{EE}\%=\left(10\times {C}_{\textrm{EMO}}-C\right)\times V/{M}_{\textrm{EMO}}\times 100 \% $$$$ \mathrm{DL}\%=\left(10\times {C}_{\mathrm{EMO}}-C\right)\times \mathrm{V}/\left[\left( 10\times {C}_{\textrm{EMO}}-C\right)\times V+{M}_{\textrm{CSO}-\textrm{SA}}\right]\times 100\% $$

wobei C _EMO ist die Konzentration von EMO in Mizellen, C ist die EMO-Konzentration der wirkstoffbeladenen Micellen nach Ultrafiltrationszentrifugation, V ist das Volumen der arzneimittelbeladenen Mizellen, die einer Dialyse unterzogen werden, M _EMO ist die Menge an EMO, die während der Medikamentenbelastung verabreicht wird, M _CSO-SA ist die Masse von CSO-SA.

Evaluation der Arzneimittelfreisetzung in vitro

Die Wirkstofffreisetzung aus CSO-SA/EMO wurde unter Verwendung von PBS (pH 7,2) als Freisetzungsmedium untersucht. Ein Milliliter der arzneimittelbeladenen Micellenlösung wurde in einen 3,5 kDa-Dialysebeutel gegeben, der an beiden Enden verschlossen war, und dann in ein geeignetes Freisetzungsmedium enthaltendes Röhrchen gegeben. Der Dialysebeutel wurde in einen horizontalen Thermostat-Schüttler von 37 °C gegeben. Zu festgelegten Zeitpunkten wurden Proben entnommen und durch das gleiche Volumen an frischem Freisetzungsmedium ersetzt. Der Gehalt an EMO in den Proben wurde durch HPLC bestimmt und die kumulierte Menge an freigesetztem EMO wurde berechnet.

Zytotoxizität von CSO-SA/EMO

Die Überlebensraten von Magenkrebszellen, die mit CSO-SA/EMO, CSO-SA und EMO behandelt wurden, wurden durch den MTT-Assay nachgewiesen. Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Konzentration von ungefähr 10⁵ . ausgesät /ml. CSO-SA/EMO, CSO-SA und EMO wurden in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben. Nach Inkubation für verschiedene Zeiträume wurden 20 µl MTT-Arbeitslösung zugegeben. Nach 4 Stunden Inkubation wurden 200 µl DMSO zugegeben und die optische Dichte (OD) der Lösung bei 570 nm wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen.

Auswirkung von CSO-SA/EMO auf den Zellzyklus

Zellen aus den beiden Zelllinien wurden in einer 6-Well-Platte mit einer Dichte von 10⁵ . ausgesät /ml. Nach 12 h Kultur wurden CSO-SA, CSO-SA/EMO und EMO zugegeben und 24 h inkubiert. Die Zellen wurden dann verdaut, gesammelt und gewaschen. Anschließend wurde jeder Zellprobe 500 µl PI-Färbelösung zugesetzt, das Zellpellet wurde langsam resuspendiert und die Zellen im Dunkeln bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert. Rote Fluoreszenz wurde mit einem Durchflusszytometer bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm nachgewiesen. Der DNA-Gehalt wurde mit der FlowJo-Software analysiert.

Antitumorwirkungen von CSO-SA/EMO, bewertet durch In-vivo- und histologische Analysen

Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien für die Tierpflege und -verwendung der Zhejiang-Universität durchgeführt. MGC803-Zellen (1 × 10⁶ ) wurden männlichen Nacktmäusen im Alter von 5 bis 6 Wochen subkutan in die rechte vordere Flanke injiziert. Die Tumoren wurden auf einen Durchmesser von ungefähr 5 mm wachsen gelassen. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Mäuse zufällig in eine Kontrollgruppe, eine EMO-Injektionsgruppe und eine CSO-SA/EMO-Injektionsgruppe mit 3 Tieren in jeder Gruppe eingeteilt. Allen Mäusen wurden 2 Wochen lang einmal täglich die relevanten Reagenzien über die Schwanzvene intravenös injiziert. Ein elektronischer Messschieber wurde verwendet, um den langen (a) und kurzen (b) Durchmesser des Tumors (b) zu messen. Das Tumorvolumen wurde nach der Formel V . berechnet =a × b² /2. Das Körpergewicht jeder Maus wurde aufgezeichnet, wonach die Tumoren für die histologische Analyse gesammelt wurden. Die Tumorhemmungsrate wurde in den Tumorgeweben nach Hämatoxylin- und Eosin (HE)-Färbung bestimmt. Terminale Desoxynukleotid-Transferase-dUTP-Nick-End-Markierung (TUNEL) wurde durchgeführt, um zelluläre Apoptose im terminalen Ileumgewebe unter Verwendung eines In-situ-Zelltod-Erkennungskits gemäß den Anweisungen des Herstellers nachzuweisen.

Ergebnisse und Diskussion

CMC und ¹ H-NMR-Spektren von CSO-SA

Die amphiphilen Polymere ordnen sich in hydrophilem Medium selbst zu Micellen an. Eine niedrigere CMC führte zu einer stärkeren Micellenbildung. Dies war vorteilhaft für die Aufrechterhaltung der Micellenstruktur nach intravenöser Verabreichung. Wenn CSO-SA Micellen bildete, konnte die Pyren-Fluoreszenzsonde leicht in den hydrophoben Kern der Micellen eindringen und die Fluoreszenzintensität des geladenen Pyrens erhöhen, was die Intensität des Emissionsspektrums erhöhte. An dieser Stelle ich ₃ deutlich schneller gestiegen als ich ₁ , also das Ich ₁ /Ich ₃ das Fluoreszenzintensitätsverhältnis nahm abrupt ab. Ein signifikanter Breakpoint konnte im I . beobachtet werden ₁ /Ich ₃ Plot und Log C-Werte (Abb. 1). Berechnungen des Wendepunkts zeigten, dass CMC 179,02 µg/ml betrug. Je kleiner die CMC, desto stärker ist die Fähigkeit zur Bildung von Mizellen und desto stärker ist die Verdünnungsbeständigkeit, die den Schutz der Micellenstruktur nach intravenöser Verabreichung verbessert.

Variation des Fluoreszenzintensitätsverhältnisses (I ₁ /Ich ₃ ) gegen die logarithmische Konzentration von CSO-SA

EDC wurde als Vernetzungskupplungsmittel verwendet, um mit der Carboxylgruppe von SA zu reagieren und das aktive Zwischenprodukt -OO-Acylisoharnstoff-Derivat zu bilden. Dieses kann mit der primären Amingruppe von CSO reagieren, um eine Amidbindung zu bilden. Die Struktur von CSO-SA wurde basierend auf dem Kernspinresonanz-Protonenspektrum bestimmt und bestätigt. ¹ H-NMR (400 MHz, D₂ O) 1,06 (m, CH2), 1,02 (m, CH3) entsprechen dem Methylenproton bzw. Methylproton von SA.

Ersatzgrad der Aminogruppe

Der SD% von CSO-SA ist der Prozentsatz von Stearinsäure-substituierten Aminogruppen auf Chitosan. TNBS reagierte mit freien Aminogruppen auf Chitosan und bildete Trinitrobenzolderivate mit einer UV-Absorption bei 344 nm. Die Standardkurve des Trinitrobenzol-Derivats von Chitosan wurde durch UV-Absorption bei 344 nm bestimmt. Der SD% von CSO-SA wurde mit 9,3 ± 8% berechnet. Dies bestätigte, dass CSO und SA basierend auf ihrem Graft-Verhältnis erfolgreich verknüpft wurden.

CSO-SA, CSO-SA/EMO Partikelgröße und Potenzial

Tabelle 1 zeigt, dass der Z-Durchschnitt von CSO-SA 139,3 ± 2,2 nm betrug. Der PDI betrug 0,179 ± 0,03, was eine relativ gleichförmige Dispersion anzeigt. Im Vergleich zu CSO-SA stiegen der Z-Durchschnitt und der PDI von CSO-SA/EMO. Nach dem Laden von EMO war die positive Oberflächenladung von CSO-SA/EMO höher als die von CSO-SA.

Zellenaufnahme

FITC hatte keinen Einfluss auf die physikalisch-chemischen Eigenschaften von CSO-SA. Wir erhielten FITC-CSO-SA durch Pfropfen von Fluorescein-FITC in CSO-SA. Nachdem die Zellen mit Hoechst 33342 gefärbt worden waren, wurde die Aufnahme von FITC-CSO-SA-Zellen unter Verwendung von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie beobachtet. Wir fanden, dass die Aufnahme von MGC803 mit zunehmender Zeit allmählich zunahm und die FITC-Fluoreszenz allmählich zunahm. Die mizellare Aufnahme von BGC823 war zeitabhängig ähnlich der von MGC803. FITC-CSO-SA hatte eine gute Zellpenetrationsfähigkeit und wurde gleichmäßig im Zytoplasma von Magenkrebszellen verteilt (Abb. 2).

In-vitro-zelluläre zeitabhängige Aufnahme von CSO-SA-Micellen in MGC803 (a ) und BGC823 (b ) Zellen für 1, 4, 8, 12 h (blau, Hoechst 33342; grün, FITC; Maßstabsbalken =50 μm)

Verteilung von CSO-SA in Vivo

Die Nahinfrarot-(NIR)-Bildgebungstechnologie ist für die Durchdringung von Biomaterialien und Geweben von Vorteil. Nachdem CSO-SA/DiR in die Schwanzvene von Nacktmäusen injiziert worden war, wurde die Verteilung von CSO-SA/DiR beobachtet und zu verschiedenen Zeiten unter Verwendung eines Kleintier-Lebendkörper-Imager aufgezeichnet. Wie in 3 gezeigt, war die Verteilung von CSO-SA/DiR 4 h nach der Schwanzveneninjektion ähnlich wie bei anderen Micellen und wurde hauptsächlich in Leber, Milz und Tumorgewebe verteilt. Die Verteilung von Nanomicellen im Tumor nahm mit zunehmender Zeit allmählich an Intensität zu. Dieses zeigte, dass das CSO-SA-Transplantat eine gute passive Targeting-Fähigkeit hatte, hauptsächlich aufgrund des EPR-Effekts von Nanomicellen (Abb. 3).

Ganzkörperbild von CSO-SA/DiR zu verschiedenen Zeiten nach i.v. Injektion

Vorbereitung von CSO-SA/EMO

Der Einfluss unterschiedlicher pH-Umgebungen auf die Wirkstoffbelastung

Wir stellten eine CSO-SA-Lösung her und stellten den pH-Wert der CSO-SA ein, um die Wirkung des pH-Werts auf die Wirkstoffbeladung zu untersuchen. Wie in 4 gezeigt, hatte CSO-SA eine gute Wirkstoffbeladungskapazität und zeigte einen parabolischen Trend im pH-Bereich von 6,4–6,8. Das höchste Niveau der Wirkstoffbeladung wurde bei pH 6,6 beobachtet, was diesen Wert zum optimalen pH-Wert für die Wirkstoffbeladung macht (Abb. 4).

Auswirkungen unterschiedlicher pH-Werte von CSO-SA-Transplantaten auf die Wirkstoffbeladung. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD (n =3)

Effizienz der Kapselung, TEM und Wirkstoffbelastung

CSO-SA organisiert sich selbst zu Schale-Kern-Nanokomposit-Micellen. Die hydrophoben Einheiten bilden spontan hydrophobe Kernstrukturen, um die hydrophilen Medien abzustoßen. Diese Struktur stellt ein wichtiges Vehikel für die Wirkstoffbeladung dar, da EMO aufgrund seiner hydrophoben Struktur leicht in den hydrophoben Kern eingekapselt werden kann. Wir untersuchten die Wirkung von CSO-SA auf die Beladungskapazität von EMO durch Variation der EMO-Dosierung. Wie in Fig. 5 gezeigt, nimmt mit steigender EMO-Dosis die Menge der Arzneimittelbeladung zu. Die Beladungsrate von CSO-SA erreichte 21,16 %, wenn das Verhältnis 30 % betrug (Abb. 5).

Der Einfluss unterschiedlicher Verhältnisse von EMO und CSO-SA (5-30%) auf die Wirkstoffbelastung. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD (n =3)

CSO-SA/EMO wurde mit einem Transmissionselektronenmikroskop 30.000-fach vergrößert. Form und Größe der Nanomicellen wurden beobachtet und aufgezeichnet.

EMO-Freigabe von CSO-SA/EMO

Die arzneimittelbeladene Micellenlösung wurde in einen 3,5 kDa-Dialysebeutel gegeben, wobei PBS (pH 7,2) als Freisetzungsmedium verwendet wurde. Jedes Mal, wenn eine Probe entnommen wurde, wurde sie durch das gleiche Volumen an frischem Freisetzungsmedium ersetzt.

Die Konzentration von EMO zu verschiedenen Zeitpunkten wurde durch HPLC bestimmt, wonach der kumulative Freisetzungsprozentsatz berechnet wurde. Wie in Abb. 6 gezeigt, zeigte CSO-SA/EMO einen signifikanten Retardeffekt im Vergleich zu freiem EMO. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Freisetzungsprozentsatz von freiem EMO 38,4 % bei 0,5 h betrug, während der Freisetzungsprozentsatz von EMO von CSO-SA/EMO ungefähr 6,6 % betrug. Um 4 Uhr betrug der Freisetzungsprozentsatz von freiem EMO 83,7% und der Freisetzungsprozentsatz von CSO-SA/EMO betrug ungefähr 32,5%. Innerhalb von 72 h erreichte die Veröffentlichung kostenloser EMO 97,2%, während die Veröffentlichung von EMO von CSO-SA/EMO 78,4% betrug. EMO wurde aus CSO-SA/EMO-Wirkstoff-beladenen Mizellen auf zwei Arten freigesetzt:durch EMO-Dissoziation aus dem Mizellenkern und durch Penetration aus dem Mizellenkern in das Freisetzungsmedium.

EMO-Freigabeprofil von CSO-SA/EMO über 72 h. Fehlerbalken im Diagramm repräsentieren die Standardabweichungen (n =3)

Toxizität von CSO-SA/EMO für Magenkrebszellen

Der MTT-Assay ist ein Standardverfahren zum Nachweis der Lebensfähigkeit von Zellen. Die Zytotoxizität von freiem EMO, CSO-SA und CSO-SA/EMO gegenüber MGC803- und BGC823-Magenkrebszellen wurde mit dem MTT-Assay gemessen. Es zeigte sich, dass EMO und CSO-SA/EMO die MGC803- und BGC823-Zellen dosis- und zeitabhängig hemmen können. Bei gleicher Konzentration hatte CSO-SA/EMO jedoch eine stärkere Hemmwirkung auf MGC803- und BGC823-Zellen im Vergleich zur freien EMO-Lösung. Der IC₅₀ Werte (Tabelle 2) von EMO und CSO-SA/EMO für Magenkrebszellen wurden berechnet. Der IC₅₀ von CSO-SA/EMO war zu jedem Zeitpunkt (24 h, 48 h, 72 h) signifikant niedriger als die von EMO. Der IC₅₀ Werte von CSO-SA zeigten, dass CSO-SA ein sicherer biologischer Träger mit geringer biologischer Toxizität war, was bestätigte, dass die Zytotoxizität von CSO-SA/EMO durch EMO verursacht wurde (Abb. 7).

Zelllebensfähigkeit von MGC803- und BGC823-Magenkrebszellen, die 24 h, 48 h und 72 h mit CSO-SA, EMO und CSO-SA/EMO behandelt wurden. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD (n =3)

Tabelle 2 und 7 zeigten, dass die Zytotoxizität des CSO-SA/EMO-Wirkstoffabgabesystems signifikant höher war als die von freiem EMO. Wenn jedoch die Freisetzung von CSO-SA/EMO und freiem EMO in einer In-vivo-Umgebung simuliert wurde, erreichte die Freisetzung von freiem EMO 38,4 % nach 0,5 h, während die Freisetzung von CSO-SA/EMO nur 6,6 % betrug. Insgesamt war die Konzentration von freiem EMO zu jedem Zeitpunkt höher als die von CSO-SA/EMO.

Dieses Phänomen ist leicht zu erklären. Obwohl CSO-SA/EMO EMO relativ langsam freisetzte, verlangsamt oder nimmt die Antitumorwirkung von CSO-SA/EMO nicht ab. Viele Studien haben gezeigt, dass Nanowirkstoffabgabesysteme die Antitumoraktivität von Chemotherapeutika verbessern können [21].

Erstens, obwohl freies EMO einen anfänglichen Aktivitätsschub zeigt, kann EMO von den Zellen nicht effizient aufgenommen werden, während CSO-SA die Zellaufnahme durch Endozytose oder Phagozytose stark beschleunigt.

Zweitens kann die Wechselwirkung zwischen Nanopartikeln und Zellmembranen, wenn sich CSO-SA/EMO an Zellmembranen schließt, die Struktur und Eigenschaften von Nanomicellen sowie die Funktion biologischer Makromoleküle wie Ionenkanäle beeinflussen. Daher führt die Anlagerung von CSO-SA/EMO an die Zellmembranen nicht zu einer einfachen physikalischen Adsorption, sondern kann das dynamische Gleichgewicht der Zelle verändern und dadurch die Zytotoxizität von CSO-SA/EMO weiter fördern.

Schließlich hat freies EMO eine hydrophobe Anthrachinonstruktur, die zu einer schlechten Verteilung im Blut führt. Das CSO-SA/EMO-Wirkstoffabgabesystem erhöht die Löslichkeit von EMO und verbessert die Auflösung, was zu einer höheren molekularen Konzentration in den umgebenden Zellen führt.

Erkennung von Zellzyklusarrest durch FCM

Die Zellzyklusanalyse ist ein wichtiger Aspekt der klinischen Behandlung von malignen Tumoren. Die Anwendung zyklusspezifischer Medikamente auf Tumorzellen während arzneimittelsensitiver Phasen hat sich als sehr wirksam erwiesen. Obwohl Ethidiumbromid-Analoga normale Zellen nicht durchdringen können, können sie Zellkerne färben, indem sie beschädigte Zellmembranen durchdringen. In PI eingebettete doppelsträngige DNA erzeugt rote Fluoreszenz und die Fluoreszenzintensität ist proportional zum Gehalt an doppelsträngiger DNA. Der DNA-Gehalt wurde durch Durchflusszytometrie (FCM) nach DNA-Färbung mit PI bestimmt. Zellzyklusverteilung und Apoptose wurden basierend auf der DNA-Gehaltsverteilung analysiert.

Studien haben gezeigt, dass EMO die Zellzyklusverteilung beeinflusst [11, 22]. Die FCM-Analyse zeigte, dass CSO-SA/EMO und EMO MGC803- und BGC823-Zellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus blockieren können.

MGC803-Zellen wurden 24 h der gleichen Konzentration (20 µM) von CSO-SA, freiem EMO und CSO-SA/EMO-Lösung ausgesetzt. Der Prozentsatz an MGC803-Zellen in der G2/M-Phase betrug 8,95 %, 15,29 % bzw. 23,12 %. Der Prozentsatz der Kontrollgruppe betrug 6,47 %. Die Prozentsätze der BGC823-Zellen in G2/M, die mit 20 µM CSO-SA, freiem EMO oder CSO-SA/EMO unter den gleichen Bedingungen behandelt wurden, betrugen 14,25 %, 16,79 % bzw. 35,71 %, was höhere Werte als in der Kontrollgruppe darstellte (13,66 %). Diese Daten zeigten, dass CSO-SA/EMO die G2/M-Phase von MGC803- und BGC823-Zellen effizienter und signifikanter blockierte als freies EMO bei der gleichen Konzentration. Die CSO-SA zeigte keinen Unterschied zu den Kontrollen (Abb. 8).

Zellzyklusverteilungen von MGC803- und BGC823-Zellen, die 24 h lang mit EMO und CSO-SA/EMO behandelt wurden. Schüler t Test berechnet und die Daten werden als Mittelwerte ± SD (n =3), (*p <0,05, ^** p <0,005, ^*** p <0,001)

Antitumorwirkung von CSO-SA/EMO in vivo

Um die Antitumorwirkung von CSO-SA/EMO weiter zu untersuchen, wurden die Tumorhemmungsrate und die zellulären Apoptosespiegel in vivo evaluiert. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl CSO-SA/EMO als auch EMO eine bemerkenswerte Hemmwirkung auf das Tumorwachstum hatten (Abb. 9a). Die Tumorhemmungsrate der CSO-SA/EMO-Gruppe war dreimal so hoch wie die der EMO-Gruppe (Abb. 9d). Das Gewicht der Mäuse in jeder Gruppe änderte sich nicht signifikant (Fig. 9b). Dies zeigte, dass sowohl CSO-SA/EMO als auch EMO relativ sicher waren. Morphologische Veränderungen und Apoptose in Tumorgeweben jeder Gruppe zeigten, dass CSO-SA/EMO signifikante Antitumorwirkungen hatte (Abb. 9e, f).

Antitumorwirkung von CSO-SA/EMO in vivo. a Tumorform in jeder Gruppe. b Körpergewicht der Maus in jeder Gruppe. c Tumorvolumen in jeder Gruppe. d Tumorhemmungsrate. e Repräsentative Bilder von TUNEL-gefärbtem Tumorgewebe jeder Gruppe (Skalenbalken =200 µm). f Repräsentative Bilder von HE-gefärbtem Tumorgewebe jeder Gruppe (Skalenbalken =200 μm)

Schlussfolgerungen

In dieser Studie haben wir Struktur, CMC, SD%, Partikelgröße und Potenzial von CSO-SA mit verschiedenen Methoden nachgewiesen. Die Ergebnisse beweisen, dass amphiphiles CSO-SA als Träger gut funktioniert. Fluorescence intensity of gastric cancer cells showed CSO-SA had been taken up rapidly within 12 h. Nude mice were used as a model to study the distribution of CSO-SA within 72 h. Over time, CSO-SA distribution in lesion became more concentrated exhibiting a good passive targeting effect.

CSO-SA/EMO was prepared with ultrasound-dialysis method. CSO-SA had strong drug-loading capacity. When environment pH was set at 6.6, the level of drug loading reached 21.6% at a 30% formulation ratio. Compared with CSO-SA, CSO-SA/EMO had bigger particle size and zeta potential. The shape of CSO-SA/EMO could be recorded directly using TEM. The release of EMO from CSO-SA/EMO was 78.4% within 72 h, it indicated a smooth and continuous process in body. Considering the antitumor effect of CSO-SA/EMO compared with free EMO, we confirmed it with various experiments.

CSO-SA toxicity to gastric cancer cells was detected by MTT assay. The results showed that CSO-SA was a safe biological carrier. Compared with that of free EMO, CSO-SA/EMO significantly enhanced the antitumor activity against gastric cancer cells. MGC803 and BGC823 cell cycle could be arrested in the G2/M phase more effectively by CSO-SA/EMO. Tumor volume, HE staining, and TUNEL assay proved more significant antitumor effect of CSO-SA/EMO than free EMO.

Based on above results, CSO-SA is both biocompatible and safe carrier. CSO-SA/EMO in this study utilizes a new and effective dosage formulation for the treatment of cancer and exhibits good passive targeting effect in vivo.