Emodin-beladene Stearinsäure-g-Chitosan-Oligosaccharid-Nanomizellen: Design, Charakterisierung und Antitumor-Aktivität

Zusammenfassung

Ziel dieser Studie war die Herstellung und Charakterisierung von Emodin-beladenen Stearinsäure-g-Chitosan-Oligosaccharid (CSO-SA/EMO) und die Evaluation seiner Antitumor-Aktivität in vitro. In dieser Studie wurde Stearinsäure-g-Chitosan-Oligosaccharid als Träger verwendet und seine physikochemischen Eigenschaften durch verschiedene Methoden bestimmt. Das Zellaufnahmeverhalten wurde mittels FITC-markiertem Stearinsäure-g-Chitosan-Oligosaccharid untersucht. CSO-SA/EMO wurde mittels Ultraschall und Dialyse hergestellt. Partikelgröße, Oberflächenpotential, Einkapselungseffizienz und Freisetzungsverhalten wurden in vitro untersucht. Die Auswirkungen von CSO-SA/EMO auf Magenkrebszellen wurden mittels MTT-Assay und Durchflusszytometrie untersucht. Ergebnisse zeigten, dass die Partikelgröße von CSO-SA/EMO größer und das Potential geringer war als das von Stearinsäure-g-Chitosan-Oligosaccharid. Die 12-stündige Mizellenaufnahme durch MGC803- und BGC823-Zellen war ausreichend, und die Mizellen konnten reichlich an Läsionsstellen in Mäusen anreichern, wodurch ein gutes passives EPR-Targeting erreicht wurde. MTT- und Zellzyklusarrest-Assays zeigten, dass CSO-SA/EMO die Antitumor-Aktivität signifikant gegenüber MGC803- und BGC823-Zellen im Vergleich zu freiem Emodin steigerte. Tumorvolumen, Hämatoxylin-Eosin-Färbung und TUNEL-Assay bewiesen, dass CSO-SA/EMO einen signifikanten Antitumor-Effekt auf Tumorgewebe in vivo hatte. Zusammenfassend bot die Ultraschall-Dialyse-Methode eine einfache und effektive Methode zur Herstellung von CSO-SA/EMO. Die Verabreichung von Emodin über ein Mizellensystem verbesserte dessen Antitumor-Effekte effektiv.

Einleitung

Emodin (EMO) ist ein natürliches Anthrachinon-Derivat, das hauptsächlich aus traditionellen chinesischen Kräutern wie Rhabarber, Knöterich und Vielblütiger Knöterich extrahiert wird. Traditionelle chinesische Medizin (TCM) wird aufgrund ihrer geringen Toxizität, wenigen Nebenwirkungen und niedrigen Kosten breit in der klinischen Forschung eingesetzt.

Studien haben gezeigt, dass EMO eine breite pharmakologische Aktivität aufweist, einschließlich Immunsuppression, Antitussivum, Antihypertensivum, entzündungshemmend, antibakteriell und antikrebs. EMO hemmt das Wachstum von Krebszellen und reguliert verwandte Gene, um Tumorzellapoptose, Tumorigenese, Zellproliferation, Invasion und Metastase zu kontrollieren. Studien zeigten, dass EMO diverse Krebszellen hemmen kann, wie humane kolorektale Adenokarzinomzellen, Hepatozellulärakzinomzellen, lymphatische Leukämiezellen und humane Zungenkrebs-SCC-4-Zellen. EMO kann die Proliferation von Tumorzellen in Magen-, Brust- und Prostatakrebs hemmen. Allerdings zeigt EMO keine zytotoxischen Effekte auf normale Zellen wie normale humane Gingivafibroblasten, humane Bronchialepithelzellen und humane Mammazellen. Dies zeigt, dass EMO eine selektive Zytotoxizität gegenüber Tumorzellen im Vergleich zu Normalzellen aufweist.

Chitosan, ein natürliches Polysaccharid, ist die deacetylierte Form von Chitin. Dieses natürliche Polymer besitzt ausgezeichnete Wasserlöslichkeit, Biofunktionalität, Blutkompatibilität und mikrobielle Abbaubarkeit und ist für seine vielfältigen biomedizinischen Anwendungen bekannt. Wir degradierten hochmolekulares Chitosan (450 kDa) mittels Chitosanase unter sauren Bedingungen zu niedermolekularem Chitosan-Oligosaccharid (CSO, 18 kDa). CSO kann Zellmembranen stark durchdringen, und Stearinsäure (SA) kann über den Glykoproteinweg in den Zellkern gelangen. CSO wurde hydrophob mit SA unter Verwendung von Carbodiimid (EDC) als Kopplungsreagenz modifiziert, um amphiphiles Stearinsäure-g-Chitosan-Oligosaccharid (CSO-SA) zu synthetisieren.

Obwohl EMO umfangreiche biologische Aktivität aufweist, ist seine Anthrachinonstruktur schlecht wasserlöslich. Da therapeutische Wirkstoffe über den Blutstrom transportiert werden, beeinflusst ihre Löslichkeit direkt ihre Absorption und Distribution. CSO-SA-Grafts können sich in wässriger Lösung zu Nanomizellen selbstassemblieren, die innen hydrophob und außen hydrophil sind. Wir dispergierten die Nanomizellen aus dem aggregierten Zustand mittels Ultraschallsonde. Da sowohl EMO als auch CSO hydrophob waren, wurde EMO im Zentrum der Mizellen eingekapselt.

Mehrere Modellarzneimittel werden auf CSO-SA angewendet, was Molekulargewicht, Struktur und Hydrophobizität der Modellarzneimittel erfordert. Bestehende Studien umfassen Curcumin, Doxorubicin, Lamivudin-Stearat und Oxaliplatin, die die Antitumor-Wirkung signifikant verbessern können. Wir erforschten optimale Beladungsbedingungen von CSO-SA/EMO. CSO-SA/EMO schafft neue Darreichungsformen mit höherer Löslichkeit und Nutzungs-effizienz. CSO-SA/EMO kann Ideen für die Auswahl von Modellarzneimitteln oder Trägern und die klinische Anwendung von Mizellen liefern.

Experimentelle Materialien und Methoden

Experimentelle Materialien

BALB/c+/nu männliche Nacktmäuse wurden vom Zhejiang University Experimental Animal Center bezogen. Niedrig differenzierte Magenkrebszelllinien MGC803 und BGC823 wurden von der ATCC-Zellbank gekauft. RPMI-1640-Kulturmedium und FBS wurden von der Hangzhou Holly Leaf Biotechnology Company bezogen. EMO, MTT, FITC, Hoechst 33342, DiR, Trinitrobenzolsulfonsäure und Pyren wurden von Sigma Aldrich geliefert. Zhejiang University stellte CSO-SA bereit. Andere Reagenzien waren analytischer Grad.

Bestimmung der CMC und ¹H-NMR-Spektren von CSO-SA

In diesem Bericht wurde die kritische Mizellkonzentration (CMC) von CSO-SA durch Fluoreszenzspektrophotometrie mit Pyren als fluoreszierender Sonde bestimmt. Verschiedene Konzentrationen von CSO-SA-Lösung wurden zu einer Pyren-Aceton-Lösung gegeben, wonach das Aceton über Nacht verdampfte. Die Emissionsspektren und Peakwerte von Pyren in CSO-SA-Lösungen verschiedener Konzentrationen wurden durch Fluoreszenzspektrophotometrie analysiert. Der erste Peak (I₁ = 374 nm) und der dritte Peak (I₃ = 385 nm) des Spektrums wurden aufgezeichnet. Wir trugen den logarithmischen Konzentration (Log C) als Abszisse und I₁/I₃ als Ordinate auf und berechneten die CMC für die Polymermizellen.

CSO und CSO-SA wurden in D₂O bei einer Konzentration von 10 mg/ml gelöst. ¹H-NMR-Spektren wurden aufgezeichnet, verglichen und auf charakteristische CSO- und CSO-SA-Peaks analysiert.

Bestimmung des Amin-Substitutionsgrades

Der Amin-Substitutionsgrad (SD%) wurde mit der Trinitrobenzolsulfonsäure-Methode (TNBS) detektiert. Verschiedene Konzentrationen von CSO- und CSO-SA-Lösungen wurden hergestellt, woraufhin 4 % NaHCO₃ und 0,1 % TNBS nacheinander hinzugefügt wurden. Nach Inkubation bei 37 °C für 2 h in einem Wasserbad wurde 2 mol/l Salzsäure hinzugefügt. Die Absorption wurde nach 30 Minuten Ultraschall bei 344 nm mittels UV-Vis-Spektrophotometrie gemessen. Eine Standardkurve wurde gezeichnet und der SD% der CSO-SA-Probe berechnet.

CSO-SA Partikelgröße und Potential

Eine 1,0 mg/ml CSO-SA-Lösung wurde hergestellt und Mizellen vollständig mit einer Ultraschallzelldisruptor-Sonde dispergiert. Die Partikelgröße und das Potential von CSO-SA wurden mit Partikelgrößen- und Oberflächenpotentialanalysator bestimmt.

Zellaufnahme von CSO-SA

FITC- und CSO-SA-Lösungen wurden gemischt, über Nacht gerührt und in einen Dialysebeutel überführt. Unreagiertes FITC und absolutes Ethanol wurden durch Dialyse mit deionisiertem Wasser für 24 h entfernt. Schließlich wurde eine FITC-markierte CSO-SA (FITC-CSO-SA) Lösung mit einer Konzentration von 1,0 mg/ml erhalten.

MGC803- und BGC823-Zellen wurden als Zielzellen verwendet, um die Zellaufnahme von CSO-SA zu untersuchen. Basierend auf der Zellproliferationsrate wurden Zellen in 24-Well-Platten ausgesät und über Nacht kultiviert, bis sie vollständig adhärieren. 80 μl FITC-CSO-SA-Lösung wurden zu einem festgelegten Zeitpunkt hinzugefügt. Zellen wurden mit 10 μl Hoechst 33342 (1 mg/ml) für 15 Minuten inkubiert, um Zellkerne zu färben. Die Aufnahme von CSO-SA durch FITC-CSO-SA wurde mittels Laserscanning-Konfokalmikroskopie detektiert.

In-vivo-Verteilung von CSO-SA

Die Verteilung von CSO-SA in vivo wurde durch DiR-Fluoreszenzfarbstofffärbung bestimmt. CSO-SA/DiR-Lösung wurde durch Dialyse hergestellt. Sechs Wochen alte männliche Nacktmäuse wurden als Experimentmodell verwendet. Nacktmäuse wurden subkutan mit 1 × 10⁸/ml MGC803-Zellen injiziert. CSO-SA/DiR wurde über die Schwanzvene bei einem Tumorzellvolumen von ca. 200 mm³ verabreicht. Die Mäuse wurden dann zu festgelegten Zeitpunkten narkotisiert. Die zeitabhängige Verteilung von CSO-SA/DiR in vivo wurde mittels Klein-Tier-Lebendkörper-Imager (Wellenlängenbereich 580–700 nm, Belichtungszeit 1000 ms) aufgezeichnet.

Detektion der EMO-Konzentration durch HPLC

Die EMO-Konzentration wurde durch HPLC bestimmt. EMO wurde auf eine Eclipse XDB-C18-gefüllte Säule (4,6 × 250 mm, 5 μm) mit einer Schutzsäule (4,6 × 10 mm, 5 μm) angewendet. Säulentemperatur wurde auf 30 °C eingestellt, Flussrate 1,0 ml/min, Detektionswellenlänge 254 nm, Injektionsvolumen 20 μl. Die mobile Phase war Methanol/0,1 % Phosphorsäure (85:15, v/v). Die EMO-Konzentration wurde als Abszisse und die Peakfläche als Ordinate aufgetragen. Standardkurven von EMO wurden gezeichnet, um den optimalen linearen Bereich zu bestimmen. Alle HPLC-injizierten Proben wurden durch einen 0,45-μm-organischen Filter filtriert, um die Säule zu schützen.

Herstellung von CSO-SA/EMO

In dieser Studie wurde EMO mit einer Ultraschallsonde eingekapselt. Ein initiales Formulierungsverhältnis von 10 % (EMO: CSO-SA, w/w) wurde als Ausgangspunkt verwendet. Die EMO-Lösung wurde tropfenweise in die Mizellenlösung in einem Eisbad gegeben. Die Ultraschallsonde wurde dann für 20 Zyklen (400 W, Arbeit 2 s, Pause 3 s) angewendet. Die wirkstoffbeladenen Mizellen wurden in einen Dialysebeutel (MWCO, 3,5 kDa) überführt und 24 h gegen deionisiertes Wasser dialysiert, um Ethanol aus dem Lösungsmittel zu entfernen. Reines CSO-SA/EMO wurde durch Zentrifugation des Dialysats zur Entfernung von freiem EMO erhalten.

Eigenschaften von CSO-SA/EMO (Partikeldurchmesser, Potential, TEM, EE%)

Die Partikelgröße und das Oberflächenpotential von CSO-SA/EMO wurden mit Partikelgrößen- und Oberflächenpotentialanalysator gemessen. Eine 0,1 mg/ml CSO-SA/EMO-Lösung wurde tropfenweise auf einen mit Kohlenstofffilm bedeckten Kupferdraht gegeben, mit 2 % Phosphotungstensäure gefärbt und getrocknet. Die Morphologie und Partikelgröße von CSO-SA/EMO wurden durch Transmissionelektronenmikroskopie beobachtet. Einkapselungseffizienz (EE%) und Wirkstoffbeladung (DL%) von CSO-SA/EMO wurden durch organische Lösungsmittelextraktion und HPLC detektiert. Einer 200-μl-Probe CSO-SA/EMO-Mizellenlösung wurden 1,8 ml Methanol zugesetzt, um die Mizellen zu dispergieren und den Wirkstoff zu extrahieren. Die EMO-Konzentration wurde als C_EMO gemessen. Weitere 400 μl CSO-SA/EMO-Mizellenlösung wurden in ein Ultrafiltrationszentrifugenröhrchen gegeben und zentrifugiert (12.000 rpm, 5 min), um den Überstand zu erhalten. EE% und DL% wurden nach folgenden Formeln berechnet: EE% = (10 × C_EMO − C) × V / M_EMO × 100 %; DL% = (10 × C_EMO − C) × V / [(10 × C_EMO − C) × V + M_CSO-SA] × 100 %, wobei C_EMO die EMO-Konzentration in Mizellen, C die EMO-Konzentration der wirkstoffbeladenen Mizellen nach Ultrafiltrationszentrifugation, V das Volumen der wirkstoffbeladenen Mizelle, die der Dialyse unterzogen wurde, M_EMO die Menge an EMO während der Beladung und M_CSO-SA die Masse von CSO-SA ist.

Evaluation der Wirkstofffreisetzung In Vitro

Die Wirkstofffreisetzung aus CSO-SA/EMO wurde mit PBS (pH 7,2) als Freisetzungsmedium untersucht. Ein Milliliter wirkstoffbeladener Mizellenlösung wurde in einen 3,5 kDa Dialysebeutel gegeben, der an beiden Enden versiegelt war, und in ein geeignetes Freisetzungsmedium enthaltendes Röhrchen gelegt. Der Dialysebeutel wurde in einen 37 °C horizontalen Thermostat-Schüttler gelegt. Proben wurden zu festgelegten Zeitpunkten entnommen und durch das gleiche Volumen frischen Freisetzungsmediums ersetzt. Der EMO-Gehalt in den Proben wurde durch HPLC bestimmt und die kumulative Menge an freigesetztem EMO berechnet.

Zytotoxizität von CSO-SA/EMO

Die Überlebensraten von Magenkrebszellen, behandelt mit CSO-SA/EMO, CSO-SA und EMO, wurden durch MTT-Assay detektiert. Zellen wurden in 96-Well-Platten bei einer Konzentration von ca. 10⁵/ml ausgesät. CSO-SA/EMO, CSO-SA und EMO wurden bei verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt. Nach Inkubation für verschiedene Zeitperioden wurden 20 μl MTT-Arbeitslösung hinzugefügt. Nach 4-stündiger Inkubation wurden 200 μl DMSO hinzugefügt und die optische Dichte (OD) der Lösung bei 570 nm mittels Mikroplattenreader gemessen.

Auswirkung von CSO-SA/EMO auf den Zellzyklus

Zellen der beiden Zelllinien wurden in 6-Well-Platten bei einer Dichte von 10⁵/ml ausgesät. Nach 12-stündiger Kultur wurden CSO-SA, CSO-SA/EMO und EMO hinzugefügt und 24 h inkubiert. Die Zellen wurden dann verdaut, gesammelt und gewaschen. 500 μl PI-Färbelösung wurden jeder Zellprobe hinzugefügt, der Zellpellet langsam resuspendiert und die Zellen 30 Minuten im Dunkeln bei 37 °C inkubiert. Rote Fluoreszenz wurde durch Durchflusszytometer bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm detektiert. DNA-Gehalt wurde durch FlowJo-Software analysiert.

Antitumor-Effekte von CSO-SA/EMO evaluiert durch In-vivo- und histologische Analysen

Tiierversuche wurden gemäß den Richtlinien für Tierpflege und -nutzungskomitee, Zhejiang University, durchgeführt. MGC803-Zellen (1 × 10⁶) wurden subkutan in die rechte vordere Flanke männlicher Nacktmäuse im Alter von 5 bis 6 Wochen injiziert. Tumoren durften auf einen Durchmesser von ca. 5 mm wachsen. An diesem Punkt wurden die Mäuse zufällig in eine Kontrollgruppe, eine EMO-Injektionsgruppe und eine CSO-SA/EMO-Injektionsgruppe mit jeweils 3 Tieren aufgeteilt. Alle Mäuse wurden 2 Wochen lang einmal täglich intravenös mit den relevanten Reagenzien über die Schwanzvene injiziert. Ein elektronischer Schieblehre wurde verwendet, um die langen (a) und kurzen (b) Durchmesser des Tumors zu messen. Das Tumorvolumen wurde gemäß der Formel V = a × b²/2 berechnet. Das Körpergewicht jeder Maus wurde aufgezeichnet, wonach die Tumoren für histologische Analysen entnommen wurden. Die Tumoringhibitionsrate wurde in den Tumorgeweben nach Hämatoxylin-Eosin-(HE)-Färbung bestimmt. Terminal-Deoxynucleotidyl-Transferase-dUTP-Nick-End-Labeling (TUNEL) wurde durchgeführt, um zelluläre Apoptose in terminalem Ileumgewebe mittels In-situ-Zelltod-Detektionskit gemäß Herstelleranweisungen zu detektieren.

Ergebnisse und Diskussion

CMC und ¹H-NMR-Spektren von CSO-SA

Amphiphile Polymere selbstassemblieren in hydrophilem Medium zu Mizellen. Niedrigere CMC führte zu stärkerer Mizellbildung, was für den Erhalt der Mizellstruktur nach intravenöser Verabreichung vorteilhaft war. Wenn CSO-SA Mizellen bildete, konnte die Pyren-Fluoreszenzsonde leicht in den hydrophoben Kern der Mizellen eindringen, was die Fluoreszenzintensität des geladenen Pyren erhöhte und die Intensität des Emissionsspektrums steigerte. An diesem Punkt stieg I₃ signifikant schneller als I₁, sodass das I₁/I₃-Fluoreszenzintensitätsverhältnis abrupt abfiel. Ein signifikanter Knickpunkt konnte im I₁/I₃-Plot und Log-C-Werten beobachtet werden (Abb. 1). Wendepunktberechnungen zeigten, dass die CMC 179,02 μg/ml betrug. Je kleiner die CMC, desto stärker die Fähigkeit zur Mizellbildung und desto stärker der Widerstand gegen Verdünnung, was den Mizellstrukturschutz nach intravenöser Verabreichung verbesserte.

EDC wurde als Vernetzungs-Kupplungsmittel verwendet, um mit der Carboxylgruppe von SA zu reagieren und das aktive Intermediat -OO-Acyl-Isourea-Derivat zu bilden. Dies kann mit der primären Aminogruppe von CSO reagieren, um eine Amidbindung zu bilden. Die Struktur von CSO-SA wurde basierend auf dem Kernspinresonanz-Protonenspektrum bestimmt und bestätigt. ¹H-NMR (400 MHz, D₂O) δ 1,06 (m, CH₂), 1,02 (m, CH₃) entsprechen den Methylenprotonen bzw. Methylprotonen von SA.

Substitutionsgrade der Aminogruppe

Der SD% von CSO-SA ist der Prozentsatz der Stearinsäure-substituierten Aminogruppen auf Chitosan. TNBS reagierte mit freien Aminogruppen auf Chitosan und bildete Trinitrobenzolderivate mit UV-Absorption bei 344 nm. Die Standardkurve des Trinitrobenzolderivats von Chitosan wurde durch UV-Absorption bei 344 nm bestimmt. Der SD% von CSO-SA wurde auf 9,3 ± 8 % berechnet. Dies bestätigte, dass CSO und SA erfolgreich basierend auf ihrem Graft-Verhältnis verknüpft worden waren.

CSO-SA, CSO-SA/EMO Partikelgröße und Potential

Tabelle 1 zeigt, dass der Z-Durchschnitt von CSO-SA 139,3 ± 2,2 nm betrug. PDI war 0,179 ± 0,03, was eine relativ uniforme Dispergierung anzeigte. Im Vergleich zu CSO-SA nahmen der Z-Durchschnitt und PDI von CSO-SA/EMO zu. Nach Beladung von EMO war die oberflächenpositive Ladung von CSO-SA/EMO höher als die von CSO-SA.

Zellaufnahme

FITC beeinflusste die physikochemischen Eigenschaften von CSO-SA nicht. Wir erhielten FITC-CSO-SA durch Einpfropfen von Fluorescein FITC in CSO-SA. Nach Färbung der Zellen mit Hoechst 33342 wurde die Aufnahme von FITC-CSO-SA-Zellen mittels konfokaler Laserscanningmikroskopie beobachtet. Wir fanden, dass die Aufnahme von MGC803 mit zunehmender Zeit allmählich zunahm und die FITC-Fluoreszenz allmählich zunahm. Die Mizellenaufnahme von BGC823 war ähnlich wie MGC803 in zeitabhängiger Weise. FITC-CSO-SA zeigte gute Zellpenetrationsfähigkeit und war gleichmäßig im Zytoplasma von Magenkrebszellen verteilt (Abb. 2).

Verteilung von CSO-SA In Vivo

Nahinfrarot (NIR) Imaging-Technologie ist vorteilhaft für die Penetration von Biomaterialien und Geweben. Nach Injektion von CSO-SA/DiR in die Schwanzvene von Nacktmäusen wurde die Verteilung von CSO-SA/DiR zu verschiedenen Zeiten mittels Klein-Tier-Lebendkörper-Imager beobachtet und aufgezeichnet. Wie in Abb. 3 gezeigt, war die Verteilung von CSO-SA/DiR 4 h nach Schwanzveneninjektion ähnlich wie bei anderen Mizellen und hauptsächlich in Leber, Milz und Tumorgeweben verteilt. Die Verteilung von Nanomizellen im Tumor nahm mit der Zeit allmählich an Intensität zu. Dies zeigte, dass CSO-SA-Graft eine gute passive Targeting-Fähigkeit besaß, hauptsächlich aufgrund des EPR-Effekts der Nanomizellen (Abb. 3).

Herstellung von CSO-SA/EMO

Einfluss verschiedener pH-Umgebungen auf die Wirkstoffbeladung

Wir bereiteten eine CSO-SA-Lösung vor und justierten den pH-Wert der CSO-SA, um den Effekt des pH auf die Wirkstoffbeladung zu untersuchen. Wie in Abb. 4 gezeigt, hatte CSO-SA gute Wirkstoffbeladungskapazität und zeigte einen parabolischen Trend im pH-Bereich 6,4–6,8. Die höchste Wirkstoffbeladung wurde bei pH 6,6 beobachtet, was diesen Wert zum optimalen pH für die Wirkstoffbeladung machte (Abb. 4).

Einkapselungseffizienz, TEM und Wirkstoffbeladung

CSO-SA selbstassembliert zu Schalen-Kern-Nanokompositmizellen. Die hydrophoben Moieties bilden spontan hydrophobe Kernstrukturen, um das hydrophile Medium abzuweisen. Diese Struktur bietet ein Schlüsselvehikel für die Wirkstoffbeladung, da EMO aufgrund seiner hydrophoben Struktur leicht in den hydrophoben Kern eingekapselt werden kann. Wir untersuchten den Effekt von CSO-SA auf die Beladungskapazität von EMO durch Variation der EMO-Dosierung. Wie in Abb. 5 gezeigt, nahm mit zunehmender EMO-Dosierung die Menge der Wirkstoffbeladung zu. Die Beladungsrate von CSO-SA erreichte bis zu 21,16 %, wenn das Verhältnis 30 % betrug (Abb. 5).

CSO-SA/EMO wurde 30.000-fach mit einem Transmissionelektronenmikroskop vergrößert. Nanomizellenform und -größe wurden beobachtet und aufgezeichnet.

EMO-Freisetzung aus CSO-SA/EMO

Die wirkstoffbeladene Mizellenlösung wurde in einen 3,5 kDa Dialysebeutel gegeben, wobei PBS (pH 7,2) als Freisetzungsmedium diente. Jedes Mal, wenn eine Probe entnommen wurde, wurde sie durch das gleiche Volumen frischen Freisetzungsmediums ersetzt. Die EMO-Konzentration zu verschiedenen Zeitpunkten wurde durch HPLC bestimmt, wonach der kumulative Freisetzungsprozentsatz berechnet wurde. Wie in Abb. 6 gezeigt, wies CSO-SA/EMO einen signifikanten nachhaltigen Freisetzungseffekt im Vergleich zu freiem EMO auf. Diese Ergebnisse zeigen, dass der Freisetzungsprozentsatz von freiem EMO bei 0,5 h 38,4 % betrug, während der Freisetzungsprozentsatz von EMO aus CSO-SA/EMO ca. 6,6 % betrug. Bei 4 h betrug der Freisetzungsprozentsatz von freiem EMO 83,7 % und der von CSO-SA/EMO ca. 32,5 %. Innerhalb von 72 h erreichte die Freisetzung von freiem EMO 97,2 %, während die Freisetzung von EMO aus CSO-SA/EMO 78,4 % betrug. EMO wurde aus CSO-SA/EMO-wirkstoffbeladenen Mizellen auf zwei Hauptwegen freigesetzt: durch Dissociation von EMO aus dem Mizellenkern und durch Penetration aus dem Mizellenkern in das Freisetzungsmedium.

Toxizität von CSO-SA/EMO für Magenkrebszellen

Der MTT-Assay ist eine Standardmethode zur Detektion der Zellviabilität. Die Zytotoxizität von freiem EMO, CSO-SA und CSO-SA/EMO auf MGC803- und BGC823-Magenkrebszellen wurde mittels MTT-Assay gemessen. Es zeigte sich, dass EMO und CSO-SA/EMO MGC803- und BGC823-Zellen in dosis- und zeitabhängiger Weise hemmen konnten. Allerdings hatte CSO-SA/EMO bei gleicher Konzentration einen höheren hemmenden Effekt auf MGC803- und BGC823-Zellen im Vergleich zur freien EMO-Lösung. Die IC₅₀-Werte (Tabelle 2) von EMO und CSO-SA/EMO für Magenkrebszellen wurden berechnet. Die IC₅₀ von CSO-SA/EMO war zu jedem Zeitpunkt (24 h, 48 h, 72 h) signifikant niedriger als die von EMO. Die IC₅₀-Werte von CSO-SA zeigten, dass CSO-SA ein sicherer biologischer Träger mit geringer biologischer Toxizität war, was bestätigte, dass die Zytotoxizität von CSO-SA/EMO durch EMO verursacht wurde (Abb. 7).

Tabelle 2 und Abb. 7 zeigten, dass die Zytotoxizität des CSO-SA/EMO-Wirkstofffreisetzungssystems signifikant höher war als die von freiem EMO. Wenn jedoch die Freisetzung von CSO-SA/EMO und freiem EMO in einer in-vivo-Umgebung simuliert wurde, erreichte die Freisetzung von freiem EMO 38,4 % bei 0,5 h, während die Freisetzung von CSO-SA/EMO nur 6,6 % betrug. Insgesamt war die Konzentration von freiem EMO zu jedem Zeitpunkt höher als die von CSO-SA/EMO.

Dieses Phänomen lässt sich leicht erklären. Obwohl CSO-SA/EMO EMO relativ langsam freisetzte, verlangsamte oder verschlechterte sich der Antitumor-Effekt von CSO-SA/EMO nicht. Viele Studien haben gezeigt, dass Nanowirkstofffreisetzungssysteme die Antitumor-Aktivität von Chemotherapeutika verbessern können. Erstens: Obwohl freies EMO einen initialen Aktivitätsschub aufweist, kann EMO nicht effizient von Zellen aufgenommen werden, während CSO-SA die Zellaufnahme durch Endozytose oder Phagozytose stark beschleunigt. Zweitens: Wenn CSO-SA/EMO sich Zellmembranen nähert, kann die Wechselwirkung zwischen Nanopartikeln und Zellmembranen die Struktur und Eigenschaften der Nanomizellen sowie die Funktion biologischer Makromoleküle wie Ionenkanäle beeinflussen. Daher resultiert die Anlagerung von CSO-SA/EMO an Zellmembranen nicht in einer einfachen physikalischen Adsorption, sondern kann das dynamische Gleichgewicht der Zelle verändern und dadurch die Zytotoxizität von CSO-SA/EMO weiter fördern. Schließlich hat freies EMO eine hydrophobe Anthrachinonstruktur, was zu schlechter Distribution im Blut führt. Das CSO-SA/EMO-Wirkstofffreisetzungssystem erhöht die Löslichkeit von EMO und verbessert die Auflösung, was zu einer höheren Molekülkonzentration in umliegenden Zellen führt.

Detektion von Zellzyklusarrest durch FCM

Zellzyklusanalyse ist ein wichtiger Aspekt der klinischen Behandlung maligner Tumoren. Anwendung zyklusspezifischer Arzneimittel auf Tumorzellen während arzneimittelsensitiver Perioden hat sich als hochwirksam erwiesen. Obwohl Ethidiumbromid-Analoga normale Zellen nicht penetrieren können, können sie Zellkerne durch Penetration beschädigter Zellmembranen färben. PI-eingebettete doppelsträngige DNA produziert rote Fluoreszenz, und die Fluoreszenzintensität ist proportional zum Niveau der doppelsträngigen DNA. DNA-Gehalt wurde durch Durchflusszytometrie (FCM) nach DNA-Färbung mit PI bestimmt. Zellzyklusverteilung und Apoptose wurden basierend auf DNA-Gehaltverteilung analysiert.

Studien haben gezeigt, dass EMO die Zellzyklusverteilung beeinflusst. FCM-Analyse zeigte, dass CSO-SA/EMO und EMO MGC803- und BGC823-Zellen in der G2/M-Phase des Zellzyklus blockieren konnten. MGC803-Zellen wurden derselben Konzentration (20 μM) von CSO-SA, freiem EMO und CSO-SA/EMO-Lösung für 24 h ausgesetzt. Der Prozentsatz der MGC803-Zellen in der G2/M-Phase betrug 8,95 %, 15,29 % und 23,12 %. Kontrollgruppenprozentsatz war 6,47 %. Die Prozentsätze der BGC823-Zellen in G2/M, behandelt mit 20 μM CSO-SA, freiem EMO oder CSO-SA/EMO unter gleichen Bedingungen, betrugen 14,25 %, 16,79 % und 35,71 %, was höhere Werte als in der Kontrollgruppe (13,66 %) waren. Diese Daten zeigten, dass CSO-SA/EMO die G2/M-Phase von MGC803- und BGC823-Zellen effizienter und signifikanter blockierte als freies EMO bei gleicher Konzentration. CSO-SA zeigte keinen Unterschied zu den Kontrollen (Abb. 8).

Antitumor-Effekt von CSO-SA/EMO In Vivo

Um den Antitumor-Effekt von CSO-SA/EMO weiter zu untersuchen, wurden die Tumoringhibitionsrate und zelluläre Apoptoseniveaus in vivo evaluiert. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl CSO-SA/EMO als auch EMO einen bemerkenswerten hemmenden Effekt auf das Tumorwachstum hatten (Abb. 9a). Die Tumoringhibitionsrate der CSO-SA/EMO-Gruppe war dreimal so hoch wie die der EMO-Gruppe (Abb. 9d). Das Gewicht der Mäuse in jeder Gruppe änderte sich nicht signifikant (Abb. 9b). Dies zeigte, dass sowohl CSO-SA/EMO als auch EMO relativ sicher waren. Morphologische Veränderungen und Apoptose in Tumorgeweben jeder Gruppe zeigten, dass CSO-SA/EMO signifikante Antitumor-Effekte hatte (Abb. 9e, f).

Schlussfolgerungen

In dieser Studie detektierten wir Struktur, CMC, SD%, Partikelgröße und Potential von CSO-SA mit verschiedenen Methoden. Ergebnisse beweisen, dass amphiphiles CSO-SA gut als Träger funktionierte. Fluoreszenzintensität von Magenkrebszellen zeigte, dass CSO-SA innerhalb von 12 h schnell aufgenommen worden war. Nacktmäuse wurden als Modell verwendet, um die Verteilung von CSO-SA innerhalb von 72 h zu untersuchen. Über die Zeit wurde die CSO-SA-Verteilung in der Läsion stärker konzentriert und zeigte einen guten passiven Targeting-Effekt in vivo.

CSO-SA/EMO wurde mit Ultraschall-Dialyse-Methode hergestellt. CSO-SA hatte starke Wirkstoffbeladungskapazität. Bei Umgebungs-pH von 6,6 erreichte die Wirkstoffbeladung 21,6 % bei einem 30-%igen Formulierungsverhältnis. Im Vergleich zu CSO-SA hatte CSO-SA/EMO größere Partikelgröße und Zeta-Potential. Die Form von CSO-SA/EMO konnte direkt mittels TEM aufgezeichnet werden. Die Freisetzung von EMO aus CSO-SA/EMO betrug 78,4 % innerhalb von 72 h, was auf einen glatten und kontinuierlichen Prozess im Körper hinwies. In Anbetracht des Antitumor-Effekts von CSO-SA/EMO im Vergleich zu freiem EMO bestätigten wir dies mit verschiedenen Experimenten.

CSO-SA-Toxizität für Magenkrebszellen wurde durch MTT-Assay detektiert. Die Ergebnisse zeigten, dass CSO-SA ein sicherer biologischer Träger war. Im Vergleich zu freiem EMO steigerte CSO-SA/EMO die Antitumor-Aktivität gegen Magenkrebszellen signifikant. MGC803- und BGC823-Zellzyklus konnte durch CSO-SA/EMO effektiver in der G2/M-Phase arrestiert werden. Tumorvolumen, HE-Färbung und TUNEL-Assay bewiesen einen signifikant stärkeren Antitumor-Effekt von CSO-SA/EMO als freies EMO.

Basierend auf den obigen Ergebnissen ist CSO-SA sowohl biokompatibler als auch sicherer Träger. CSO-SA/EMO in dieser Studie nutzt eine neue und effektive Darreichungsform für die Krebsbehandlung und zeigt guten passiven Targeting-Effekt in vivo.