Dekoration von Nanovesikeln mit Insertionspeptid (pHLIP) mit pH (niedrig) für eine gezielte Abgabe

Einführung

Vor etwa einem Jahrhundert brachte Paul Ehrlich die Idee auf, „Wunderkugeln“ für eine spezifische und effektivere Verabreichung von Medikamenten zu realisieren [1]. Die „Wunderwaffe“ sollte in der Lage sein, das verabreichte Medikament vor einer rauen Umgebung zu schützen, die Nebenwirkungen zu verringern, indem das Medikament gezielt auf erkranktes Gewebe gerichtet wird, die Pharmakokinetik und Pharmakodynamik des Medikaments verbessert und die Medikamentenfreisetzung moduliert [2].

1965 beobachtete Bangham zum ersten Mal auf Phospholipid basierende Vesikel [3] und in den folgenden Jahren etablierte Gregory Gregoriadis das Konzept, dass Liposomen Wirkstoffe verkapseln und dann als Wirkstofftransportsysteme verwendet werden können. Sie bestehen insbesondere aus geschlossenen Phospholipid-Doppelschichten (Lamellen), wobei die hydrophoben Lipidketten zwischen zwei hydrophilen Kopfgruppenschichten geschlossen sind. Die geschlossene Doppelschicht umgibt einen wässrigen Kern und ermöglicht so die Lokalisierung von lipophilen bzw. hydrophilen Wirkstoffen [4, 5].

Die Liposomengröße ist ein kritischer Parameter bei der Beeinflussung des Trägerschicksals nach der Verabreichung in Bezug auf die Absorption von Plasmaproteinen, die Erkennung durch das retikuloendotheliale System (RES), die Halbwertszeit des Kreislaufs und den Zelltransport. Träger in Nanogröße können die Internalisierung von Zellen und das Targeting von Tumoren begünstigen, daher haben sich viele Forscher auf die „Nanoisierung“ konzentriert [6,7,8,9].

Um vielseitigere und wirtschaftlichere Nanoträger zu erhalten, wurden synthetische Tenside verwendet, um liposomartige Wirkstoffabgabesysteme zu erhalten. Nichtionische Tenside werden zu diesem Zweck häufig verwendet und können sich selbst zu unilamellaren oder multilamellaren Vesikeln anordnen (nicht -ionische Liposomen , Niosomen oder nichtionischen Tensidvesikeln). Sorbitanester-Tenside (Spans®) sind lipophile Substanzen, die bei der Herstellung von Niosomen weit verbreitet sind. Um die Zirkulationszeit der Vesikel zu verlängern und „Stealth“-Nanocarrier zu erhalten, ist der Einbau von Polyethylenglycol (PEG) ein Goldstandard:Durch diese Konjugation werden ethoxyethylierte Sorbitanester-Tenside (Tweens®) erhalten. Sowohl Span als auch Tween zeichnen sich durch einen unterschiedlichen HLB-Wert (Hydrophilic/Lipophilic Balance) aus und die Wahl des Tensids ermöglicht die Herstellung von Niosomen mit den gewünschten Eigenschaften [10]. Darüber hinaus wird die Zugabe von Cholesterin zur Erhöhung der Doppelschichtstabilität verwendet, indem die Tensidschwänze gestreckt werden, was die Übergangstemperatur des Tensids in die flüssige Phase beeinflusst und der lipophilen Doppelschicht Steifigkeit verleiht [11, 12].Der „optimierte“ Nanoträger wurde entwickelt um die Formulierung zu verbessern und/oder das Targeting zu verbessern [10].

Krebs ist heute eine der Haupttodesursachen weltweit. Gegenwärtige therapeutische Ansätze weisen eine Reihe von Einschränkungen auf, einschließlich einer nicht effizienten Wirkstoffabgabe an Tumore und fehlender gezielter Tumorausrichtung in Verbindung mit unerwünschten und gefährlichen Nebenwirkungen, die durch nanotechnologische Ansätze überwunden werden könnten [13].

Derzeit werden verschiedene Targeting-Ansätze entwickelt. Die meisten von ihnen basieren auf dem Targeting bestimmter Biomarker, die auf der Oberfläche von Krebszellen überexprimiert werden. Da menschliche Tumoren jedoch sehr heterogen sind, sind allgemeinere Ansätze des Tumor-Targetings viel vorteilhafter. Die Säure an der Oberfläche von Krebszellen ist ein Kennzeichen der Tumormikroumgebung und hängt nicht von der Tumorperfusion ab, daher kann sie als allgemeiner Biomarker für das Targeting von Tumorzellen dienen [14]. Die pH-(Low-)Insertion-Peptid-(pHLIP-)Technologie entwickelt sich schnell, um bildgebende Verfahren und therapeutische kleine Moleküle sowie Nanomaterialien für Tumore gezielt einzusetzen. pHLIP misst den pH-Wert an der Oberfläche von Krebszellen und fügt sich in die Membran der Zielzellen ein [15, 16]. Der Insertionsmechanismus von pHLIP wird durch die Protonierung negativ geladener Reste des Peptids bei niedrigem pH (pH < 7,0) ausgelöst. Dies führt zu einer Erhöhung der Hydrophobie des Peptids, wodurch das Gleichgewicht in Richtung einer Aufteilung des Peptids in die Doppelschicht verschoben wird [17]. Mit pHLIPs dekorierte Nanocarrier sind biokompatibel, können auf Tumore abzielen und zeigen eine verbesserte zelluläre Aufnahme durch Krebszellen. Zu den untersuchten pHLIP-beschichteten Nanopartikeln gehören Lipid-, Polymer- und Metall-basierte Nanomaterialien [18,19,20,21].

Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die vollständige Charakterisierung neuartiger vesikulärer Nanoträger, die durch pHLIP dekoriert wurden, um ein grundlegendes Verständnis der Eigenschaften von Nanoträgern zu erhalten und das rationale Design von säureempfindlichen Nanovektoren zu erleichtern.

Materialien und Methoden

Materialien

Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (Tween 20), Sorbitanmonolaurat (Span 20), Cholesterin (Chol), Hepessalz {N -(2-Idroxyethyl)piperazin-N ′ -(2-Ethansulfonsäure)}, Humanserum, Sephadex G-75, Calcein und Diphenylhexatrien (DPH) wurden von Sigma-Aldrich bezogen. 1,2-Dimyristoyl-sn -Glycero-3-phosphocholin (DMPC) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N -[4-(p-Maleimidophenyl)butyramid]-Natriumsalz (DSPE-Maleimid) wurden von Avanti Polar Lipids bezogen und Pyren wurde von Fluka bezogen. pHLIP-Peptid (ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT) wurde synthetisiert und von CS Bio gereinigt. Alle anderen Produkte und Reagenzien waren von analytischer Qualität.

Synthese von DSPE-pHLIP

pHLIP wurde mit DSPE-Lipiden in Methanol durch kovalente Konjugation von DSPE-Maleimid mit dem einzelnen Cysteinrest am N-Terminus von pHLIP konjugiert, wie zuvor beschrieben [18, 21, 22]. Kurz gesagt, 5 mg Peptid, gelöst in 250 &mgr;l Methanol (geblasen mit Argon) und DSPE-Maleimid (aus 9,9 mM Stammlösung), gelöst in Chloroform, wurden in einem Molverhältnis von 1:1 gemischt. Die Reaktionsmischung wurde etwa 2–6 h bei Raumtemperatur gehalten, bis die Konjugation abgeschlossen war. Der Reaktionsfortschritt bei der Konjugation von DSPE-Malemid mit pHLIP wurde durch RP-HPLC unter Verwendung eines Gradienten von 25 bis 80 % Acetonitril in Wasser, das 0,05 % TFA enthielt, überwacht, indem eine Abnahme des Peaks entsprechend dem unmarkierten pHLIP in der Reaktionsmischung überwacht wurde. Das synthetisierte Konstrukt wurde durch SELDI-TOF-Massenspektrometrie charakterisiert. Die Konzentration des DSPE-pHLIP-Konjugats wurde durch Absorption unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten für pHLIP bestimmt:ε ₂₈₀ = 13.940 M ⁻¹ cm ⁻¹ .

Vorbereitung und Reinigung von Vesikel

Das Dünnschichtverdampfungsverfahren wurde verwendet, um nichtionische Tensid- (von Tween 20 oder Span 20) und Phospholipid- (von DMPC) Vesikeln mit und ohne pHLIP herzustellen. In jeder Vesikelformulierung wurde Cholesterin in unterschiedlichen Molverhältnissen zugegeben (Tabelle 1) [23].

Die Probenzusammensetzung wurde optimiert, indem zuvor gut charakterisierte Strukturen [24, 25] ausgewählt wurden, bei denen die gleiche Menge an pHLIP hinzugefügt wurde.

Die lipophilen Komponenten wurden zunächst in CHCl₃ . gelöst :CH₃ OH-Gemisch (3:1); das organische Lösungsmittel wurde dann je nach Probe bei unterschiedlichen Temperaturen im Vakuum entfernt. Der erhaltene Film wurde mit 5 ml Hepes-Puffer (0,01 M pH 7,4) oder Natrium-Calcein-Lösung 10 ^-2 . hydratisiert M. Die Suspension wurde etwa 5 min vortexgemischt, gefolgt von einer Ultraschallbehandlung (siehe zusätzliche Datei 1:Tabelle S1, unterstützende Informationen) unter Verwendung einer Mikrosonde, die bei 20 kHz arbeitete (VibraCell-VCX 400-Sonics, Taunton, MA, USA). Die LipoDMPC-Beschallung wurde unter einer inerten Atmosphäre durchgeführt, um eine Oxidation zu verhindern.

Die Vesikelsuspension wurde dann durch Gelpermeationschromatographie unter Verwendung von Sephadex G-75 (Glassäule von 50 × 1,2 cm) und Hepes-Puffer als Elutionsmittel gereinigt. Anschließend wurde die gereinigte Vesikelsuspension mittels Cellulosefilter mit entsprechendem Porendurchmesser filtriert.

Das gleiche Herstellungsverfahren wurde verwendet, um pHLIP-beschichtete Niosomen und Liposomen herzustellen.

Dynamische Lichtstreuungsmessungen

Die durchschnittliche Größe und Größenverteilung der Vesikel wurde bei T . gemessen = 25 °C durch dynamische Lichtstreuung (DLS), unter Verwendung eines Malvern NanoZetaSizer ZS90, ausgestattet mit einem 5 mW HeNe-Laser (Wellenlänge λ = 632,8 nm) und einem digitalen Korrelator. Die normalisierten Autokorrelationsfunktionen der gestreuten Intensität bei einem Winkel von 90° wurden mit dem Contin-Algorithmus analysiert, um die Verteilung des Partikeldiffusionskoeffizienten D . zu erhalten , daher die Verteilung des effektiven hydrodynamischen Radius R _H der Vesikel über die Stokes-Einstein-Beziehung R _H =K _B T /6πηD , wobei K _B T die thermische Energie und η die Lösungsmittelviskosität ist. Die Breite der Größenverteilung von Niosomen/Liposomen ist eher gering, aber nicht zu vernachlässigen. Die in Tabelle 2 angegebenen Werte entsprechen dem intensitätsgewichteten durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser der Partikel [26].

ζ-Potenzialmessungen

Die elektrophoretischen Mobilitätsmessungen wurden durch die Laser-Doppler-Elektrophorese-Technik unter Verwendung des Malvern NanoZetaSizer ZS90-Geräts durchgeführt. Die Mobilität u wurde in das ζ . umgewandelt -Potential unter Verwendung der Smoluchowski-Beziehung ζ = uη/є, wobei η und є die Viskosität bzw. die Permittivität der Lösungsmittelphase sind [27].

Kleinwinkel-Röntgenstreuung

Kleinwinkel-Röntgenstreuungsexperimente (SAXS) wurden an der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF, Grenoble, Frankreich) durchgeführt. Die Verwendung der hochbrillanten Strahllinie ID02 ermöglichte Messungen an verdünnten Lösungen im Bereich der Impulsübertragung 0,1 nm ⁻¹ ≤ q ≤ 6 nm ⁻¹ , q = (4π/λ)sin(θ/2), wobei der Streuwinkel und λ = 0,1 nm die Röntgenwellenlänge ist. Die entsprechend untersuchte Längenskala liegt zwischen 1 und 60 nm und eignet sich für den Zugang zur inneren Struktur niosomaler und liposomaler Vesikel. Alle Experimente wurden bei T . durchgeführt = 25 °C mit kurzer Bestrahlungszeit, 0,1 s, um Strahlenschäden zu vermeiden. Für jede Probe wurde die Streuintensität bei unterschiedlichen Streuwinkeln auf einem 2D-Detektor erfasst, dann winkelmäßig neu gruppiert, der Hintergrund und die Lösungsmittelbeiträge abgezogen und analysiert, um Informationen über die Form und innere Struktur der Vesikel in Lösung zu erhalten.

Im Fall unilamellarer Vesikel wurde die geschlossene Doppelschicht mit drei konzentrischen Schalen modelliert, die den äußeren Kopfgruppen, den hydrophoben Ketten und den inneren Kopfgruppen entsprechen. Für die Vesikelgröße wurde eine Schulz-Verteilung angenommen.

Kryo-TEM

Vesikellösung (5 &mgr;l Tröpfchen) wurde auf einem Lacey-Formar/Kohlenstoff-Elektronenmikroskopiegitter verteilt und in einem gefrorenen, hydratisierten Zustand durch schnelles Einfrieren in flüssigem Ethan konserviert. Der Vitrifikationsprozess wurde mit dem FEI Vitrobot-System mit der Einstellung eines Einzelblots von 3 s, einem Offset von 1 und einer Abtropf- und Wartezeit von 1 s durchgeführt. Zur Abbildung der Vesikel wurde Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (JEOL 2100) mit einer Beschleunigungsspannung von 200 kV bei Vergrößerungen im Bereich von × 10.000 bis × 150.000 verwendet.

Stabilitätsstudien

Studien zur physikalischen Stabilität von Niosomen und Liposomen, hergestellt mit und ohne pHLIP, wurden bei zwei verschiedenen Lagertemperaturen (25 °C und 4 °C) durchgeführt. Ziel war es zu evaluieren, ob über einen Zeitraum von 90 Tagen signifikante Veränderungen der Größe und des ζ-Potentials der Vesikeldispersion auftreten. Proben aus jeder Charge wurden in bestimmten Zeitintervallen (1, 30, 60 und 90 Tage) entnommen und die Vesikelgröße und das ζ-Potential wurden wie zuvor beschrieben bestimmt.

In ähnlicher Weise wurde die Vesikelstabilität auch in Gegenwart von biologischen Flüssigkeiten wie Humanserum untersucht. Die Suspensionen wurden bei 37 °C mit 45 % Humanserum in Kontakt gebracht. In bestimmten Zeitintervallen (0, 30 min, 1 h, 2 h und 3 h) wurden Variationen der Vesikelgröße und des ζ-Potentials wie beschrieben bestimmt.

Bilayer-Charakterisierung

Die Fluidität und Mikroviskosität-Polarität von niosomalen und liposomalen Doppelschichten wurden durch Fluoreszenzmessungen von zwei Fluoreszenzsonden, Diphenylhexatrien (DPH) bzw. Pyren, die sich im hydrophoben Bereich der Doppelschichtmembran befinden, untersucht. Sowohl DPH (2 mM) als auch Pyren (4 mM), 220 μL bzw. 2,5 mg, wurden dem Tensid oder Phospholipid/Cholesterin-Gemisch vor der Vesikelpräparation zugesetzt [28]. Danach wurden Pyren-beladene Vesikel wie zuvor beschrieben gereinigt, während DPH-beladene Vesikel durch eine zunehmend kleinere Porengröße (von 5,0 bis 0,22 µm) filtriert wurden.

Die Fluoreszenzanisotropiemessungen wurden bei Raumtemperatur mit einem LS55-Spektrofluorometer (PerkinElmer, MA, USA) bei λ_exc . durchgeführt = 400 nm und λ_em = 425 nm und die Fluoreszenzanisotropie (A ) der Proben wurde nach folgender Gleichung berechnet [29]:

wo ich _vv und ich _vh sind die Intensitäten der emittierten Fluoreszenz (willkürliche Einheiten), parallel bzw. senkrecht zur Richtung des vertikal polarisierten Anregungslichts. Der Korrekturfaktor G = I _hv /ich _hh ist das Verhältnis zwischen den vertikal und den horizontal polarisierten Emissionskomponenten, wenn das Anregungslicht horizontal polarisiert ist. Die Fluoreszenzanisotropiewerte sind umgekehrt proportional zur Membranfluidität. Daher entspricht ein hoher Fluoreszenzanisotropiewert einer hohen strukturellen Ordnung und/oder einer geringen Membranfluidität [30].

Um die Mikroviskosität und die Mikropolarität der Vesikeldoppelschicht zu bewerten, wurden Fluoreszenzexperimente mit Pyren mit einem Perkin-Elmer LS55 Spektrofluorometer bei λ_exc . durchgeführt = 330 nm, Aufnahme des Emissionsspektrums im Bereich 350 < λ_em < 550 nm [28]. Die Feinstruktur der Pyrenfluoreszenz weist fünf Peaks auf. Das Verhältnis zwischen den Intensitäten des ersten (372 nm) und des dritten (382 nm) Schwingungsbandes des Pyren-Fluoreszenzspektrums, I ₁ /Ich ₃ , hängt mit der Polarität der Pyrenumgebung zusammen [31]. Tatsächlich sind niedrige Werte des I ₁ /Ich ₃ Verhältnis einer unpolaren Umgebung entsprechen. Darüber hinaus können in die Vesikeldoppelschicht eingebaute Pyrenmoleküle intramolekulare Excimere bilden, und dieser Prozess ist empfindlich gegenüber der Viskosität der Sondenmikroumgebung [32]. Daher ist das Excimer/Monomer-Fluoreszenzintensitätsverhältnis I _E /Ich _M , hängt mit der Mikroviskosität zusammen.

Diese Studien wurden an Vesikeln durchgeführt, die sowohl mit als auch ohne pHLIP hergestellt wurden, und die erhaltenen Ergebnisse wurden dann verglichen.

Studien zur Freisetzung von Calcein

Nichtionische Tensid- oder Phospholipidvesikel wurden mit Calcein in einer Konzentration von 10 ^-2 . beladen M. Bei dieser Konzentration wird die Calcein-Fluoreszenz selbst gelöscht [33]. Dequenching-Messungen wurden dann verwendet, um die Calcein-Freisetzung aus dem wässrigen Vesikel-Kern zu bestimmen. Die fluoreszierende Sonde wurde während der Hydratation des dünnen Films durch Zugabe von 5 ml der wässrigen Calceinlösung in die Vesikel geladen. Die Vesikelsuspensionen wurden durch Gelpermeationschromatographie gereinigt, mit 45% Humanserum oder Hepes in Kontakt gebracht und dann in einen Zellulosemembran-Dialysebeutel (Cut-off-Molekulargewicht 8.000 Da von Spectra/Por®) geladen. Die Freisetzungsexperimente wurden bei 37 °C unter magnetischem Rühren in Hepes-Puffer (10 mM, pH 7,4) als externes Medium durchgeführt. Aliquots des externen Mediums wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten über 0–24 h entnommen. Von Zeit zu Zeit wurden die entnommenen Aliquots wieder in das System eingeführt [34].

Die Calceinfreisetzung wurde durch Messungen der Fluoreszenz des Mediums unter Verwendung eines Perkin-Elmer LS50B-Spektrofluorometers mit λ_ex . überwacht = 492 und λ_em = 520 nm. Der Referenzwert F _∞ (willkürliche Einheiten), korreliert mit der gesamten in den Vesikeln eingeschlossenen Calceinmenge [35], wurde nach dem Aufbrechen der Vesikel mit Isopropylalkohol (1:1 v /v ). Die Veröffentlichungsprozentsätze (F %) zu jedem Zeitpunkt wurden unter Verwendung der folgenden Gleichung erhalten:

wo F _t (willkürliche Einheiten) ist die zu einem bestimmten Zeitpunkt gemessene Fluoreszenz t .

Statistische Analyse

Für die statistische Analyse wurde eine Einweg-ANOVA verwendet. A posteriori Bonferroni t Test wurde durchgeführt, um die statistische Signifikanz des ANOVA-Tests zu bewerten. Ein p ein Wert <  0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die Ergebnisse sind der Durchschnitt von drei Experimenten ± Standardabweichung.

Ergebnisse und Diskussion

Tween20-, Span20- und DMPC-Vesikel, hergestellt mit und ohne DSPE-pHLIP, wurden hinsichtlich Größe und ζ-Potenzial charakterisiert (Tabelle 2).

Gemäß den in Tabelle 2 dargestellten Ergebnissen zeigen die analysierten Proben keine signifikanten Variationen in Größe oder -Potential, ungeachtet des Vorhandenseins von pHLIP.

Die oben angegebenen Größenbereiche wurden durch eine andere Analysetechnik bestätigt, wie beispielsweise das Kryo-TEM (Abb. 1).

Repräsentative Kryo-TEM-Bilder von Niosomen und Liposomen, die mit pHLIP beschichtet sind. Bilder von NioSpan20-pHLIP-Niosomen (a ) und LipoDMPC-pHLIP-Liposomen (b ) erhalten bei × 10.000-Vergrößerung und LipoDMPC-pHLIP-Liposomen (c ) erhalten bei × 40.000 Vergrößerung

Die interne Struktur von Niosomen/Vesikeln mit und ohne DSPE-pHLIP wurde durch SAXS-Experimente bestimmt. Die in Abb. 2 dargestellten SAXS-Intensitätsspektren sind unterschiedlich, was darauf hindeutet, dass jedes System besondere Eigenschaften hat.

SAXS-Spektren. Intensitätsspektren von Niosomen/Vesikeln ohne (schwarze offene Symbole) und mit DSPE-pHLIP (Farbsymbole)

Tween20-basierte Niosomen sind unilamellar, während DMPC-Vesikel einen gewissen Grad an Multilamellarität (als Liposomen) aufweisen, wie das Vorhandensein des charakteristischen Peaks bei q . zeigt ≅ 1 nm ⁻¹ , entsprechend einem interlamellaren Abstand von 6 nm (etwa 5 nm Lipiddoppelschicht und 1 nm Wasser). Span20-basierte Vesikel sind definitiv multilamellar, mit einem charakteristischen Peak bei q = 1.6 nm ⁻¹ entsprechend einem interlamellaren Abstand von 3,8 nm, was der doppelten Länge des Span20-Moleküls entspricht. Die Ergebnisse zeigen, dass die mehrschichtige Hülle von Span20-Vesikeln aus benachbarten Doppelschichten besteht, die fast kein interlamellares Wasser aufweisen.

Die Anwesenheit von DSPE-pHLIP (weniger als 1% Molfraktion) beeinflusst die Systeme nicht dramatisch. Die Streuintensität in allen untersuchten q -Bereich ist ziemlich ähnlich, was auf einen vergleichbaren Anteil an strukturiertem Material und eine vergleichbare Gesamtgröße der vesikulären Partikel hinweist.

Vesikeln auf DMPC-Basis zeigen einen leichten Anstieg der Anzahl der Doppelschichten innerhalb des Liposoms, was durch den Intensitätsanstieg des Bragg-Peaks bei q . ableitbar ist = 1 nm ⁻¹ . Die Insertion eines geringen Anteils von DSPE-C18-Ketten, die an jedes Peptidmolekül gebunden sind, ändert die Dicke der Lipiddoppelschicht nicht und wird hauptsächlich durch den großen Anteil an Cholesterin in Bezug auf DMPC (ca. 40–50 %) bestimmt. Bei dieser Cholesterinkonzentration sind Lipidketten in der flüssigen geordneten (Lo)-Phase organisiert und durch die Entkopplung der schwachen seitlichen Positionsordnung der Ketten in Bezug auf die hohe Orientierungsordnung entlang der Ketten gekennzeichnet und in der Lage, wenige C18- Ketten ohne Strukturänderung [36]. Auch mehrschichtige Vesikel auf Span20-Basis zeigen keine Veränderungen in ihrer inneren Struktur.

Im Tween20 + pHLIP-System ist eine geringe Menge an Cholesterinkristalliten vorhanden, wie der typische scharfe Peak bei q . zeigt = 1,84 nm ⁻¹ (charakteristischer Abstand von 3.41 nm) und die Vesikelstruktur ist unbeeinflusst. Das Vorhandensein von wenigen Mikrokristalliten wurde oft in Verbindung mit Tween-basierten Niosomen [37] in Abhängigkeit von der Zusammensetzung, dem Herstellungsverfahren und der Reinigung festgestellt. In Abb. 2 sind die beiden experimentellen Spektren von Tween20- und Tween20 + pHLIP-Vesikeln zusammen mit den Anpassungskurven gezeigt, die durch Modellieren der kugelförmig geschlossenen Doppelschicht mit drei konzentrischen Schalen erhalten wurden:den äußeren Kopfgruppen, den Ketten und den inneren Kopfgruppen. Die passende durchschnittliche Größe der Vesikel beträgt in beiden Systemen etwa 168 nm, in Übereinstimmung mit den DLS-Ergebnissen. Die Strukturparameter sind für die beiden geschlossenen Doppelschichten (siehe Zusatzdatei 1:Abbildung S1 und Tabelle S2) gleich, mit Ausnahme der äußeren Hülle:in Gegenwart von DSPE-pHLIP eine leichte Abnahme (5%) der Elektronendichte der Kopfgruppen beobachtet wird (von 0,42 bis 0,40 e/Å ³ ), zusammen mit einer Erhöhung der Rauhigkeit der Schicht. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass die Zugabe von DSPE-pHLIP hauptsächlich die äußere Hülle der Vesikel beeinflusst. Dies stimmt mit einem Bild überein, bei dem die DSPE-C18-Ketten in die Doppelschicht inserieren und das Peptid an der Vesikeloberfläche zwischen den ausgedehnten und verzweigten Polyethylenglykol-Kopfgruppen verankern. Wir stellen fest, dass die Fähigkeit des pHLIP-Peptids selbst (nicht an die Lipidmoleküle gebunden) bei hohem pH mit der äußeren Oberfläche von Vesikeln zu interagieren und bei niedrigem pH in die Doppelschicht einzufügen, wurde kürzlich von SAXS im Fall von ungesättigten Phospholipiddoppelschichten beobachtet [38 ]. In der vorliegenden Studie ist der Molenbruch des Peptids deutlich niedriger und das Peptid ist an Lipide gebunden, da das Ziel darin besteht, pHLIP-beschichtete pH-sensitive Wirkstoff-Nanovektoren zu entwickeln. Die pHLIP-Assoziation wird durch die hydrophobe Wechselwirkung der konjugierten DSPE-C18-Ketten angetrieben, die sich in die hydrophobe Region des Nanovektors einfügen. Das pHLIP-Peptid ist verankert und liegt in der externen Kopfgruppenregion, neigt dazu, bei saurem pH mit Zielmembranen zu interagieren und/oder den Nanovektorgehalt nach Doppelschichtumlagerung in einer Umgebung mit niedrigem pH freizusetzen.

Um zu untersuchen, ob die Anwesenheit von pHLIP die mikrorheologischen Eigenschaften der Doppelschicht (Fluidität, Mikroviskosität und Polarität) beeinflussen könnte, wurde eine lipophile Hüllencharakterisierung durchgeführt. Die Charakterisierungsstudien wurden unter Verwendung der fluoreszierenden Pyren-Sonde durchgeführt, die den Proben zu Beginn des Herstellungsverfahrens zugesetzt wurde. Aufgrund seiner lipophilen Natur fügt es sich in die Vesikeldoppelschicht ein und liefert Informationen über die Polarität und Mikroviskosität der Membranumgebung.

Wie in Tabelle 3 gezeigt, nehmen in allen drei Probensätzen die Polaritätswerte in Gegenwart von pHLIP im Vergleich zum Gegenstück ohne pHLIP nur geringfügig ab, während die Mikroviskositätswerte für alle Vesikel einen dreifachen Anstieg zeigen.

Die Doppelschicht wurde ferner durch Messungen der Fluoreszenzanisotropie einer anderen lipophilen Fluoreszenzsonde, DPH, die in Lipide eingebaut wurde, charakterisiert. Diese Messungen spiegeln die Sondenbewegung und ihre Orientierung innerhalb der Doppelschicht wider, was Informationen über die Fluidität der Doppelschicht liefert, die die Fähigkeit der Vesikel beeinflussen kann, ihren Inhalt freizugeben [29]. Die Werte der Fluoreszenzanisotropie sind umgekehrt proportional zur Membranfluidität. Daher entspricht ein hoher Fluoreszenzanisotropiewert einer hohen strukturellen Ordnung und/oder einer geringen Membranfluidität, wie in der flüssigkeitsgeordneten Phase [30].

Die Anisotropiewerte für jede Probe sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Daten zeigen, dass die Anwesenheit von DSPE-pHLIP in den Vesikeln die Membranfluidität erhöht, da die Fluoreszenzanisotropie abnahm. Es ist bekannt, dass die Bilayer-Fluidität nicht nur durch die Ordnung und laterale Organisation der apolaren Ketten, sondern auch durch die polaren Kopfgruppen beeinflusst wird [31]. SAXS-Ergebnisse zu den drei verschiedenen Systemen zeigen, dass DSPE-pHLIP-Moleküle hauptsächlich die Kopfgruppenregion beeinflussen, was schließlich zu einer unterschiedlichen Packung der polaren Köpfe führt. Die strukturellen Ergebnisse scheinen mit den mikrorheologischen Eigenschaften der Doppelschichten in Gegenwart von assoziiertem DSPE-pHLIP übereinzustimmen, wie durch die Insertion von zwei verschiedenen Sonden gezeigt wurde. Die Ergebnisse zeigen eine erhöhte Mikroviskosität, wie durch Pyren gezeigt, eine Sonde, die nahe der äußeren Region inserieren könnte (Pyren log P ist 4,88). Andererseits wird angenommen, dass DPH in den Kern der Doppelschichten eingebettet ist, parallel zur Achse der Lipidacylkette orientiert oder in der Mitte der Doppelschicht, parallel zur Oberfläche, eingeschränkt ist. Es ist weitgehend empfindlich gegenüber der Winkelumorientierung von amphiphilen Acylketten [39]. Die erhöhte Fluidität, die durch DPH gezeigt wurde, könnte sowohl mit dem Effekt der Insertion von DSPE-Ketten zwischen die anderen Acylketten als auch mit dem Effekt der pHLIP-Verteilung in der polaren Kopfgruppenregion zusammenhängen, wodurch die Packungseigenschaften der Tenside verändert werden. (Abb. 3).

Darstellung der pHLIP-Wechselwirkungen mit der Vesikelmembran

An den untersuchten Präparaten wurden weitere Charakterisierungsstudien durchgeführt. Alle mit und ohne pHLIP hergestellten Proben wurden 90 Tage bei 4 °C Temperatur gelagert, um die Stabilität der Vesikel im Laufe der Zeit durch Messung ihrer Größe und ζ-Potentialvariationen zu bewerten (Zusatzdatei 1:Abbildung S2). Während des Experiments wurden keine signifikanten Variationen in Größe und ζ-Potential beobachtet; daher waren alle untersuchten Präparate stabil, wenn sie bei einer Temperatur von 4 °C gelagert wurden.

Außerdem wurde die Stabilität der Proben in Gegenwart von 90 % (v /v ) Humanserum und 3 h bei 37 °C gelagert (Zusatzdatei 1:Abbildung S3).

Bei Kontakt mit Humanserum zeigten Tween20-Vesikel eine Größenzunahme, blieben jedoch unter 300 nm. Die Größe und die PDI-Werte wurden während des 3-stündigen Experiments als konstant gemessen, was darauf hindeutet, dass die Vesikel in Suspension während des gesamten Experiments intakt blieben.

Beide Span20-Proben in Kontakt mit Humanserum zeigten eine Größenzunahme, insbesondere bei der Präparation mit pHLIP, während die PDI-Werte auf eine homogene Größenverteilung hindeuten (Daten nicht gezeigt). Dieses Ereignis kann auf die Absorption von Plasmaproteinen an der Niosomenoberfläche als Ergebnis elektrostatischer Wechselwirkungen zurückzuführen sein, jedoch ohne dass es zu einer Zerstörung der Vesikel kommt. Diese Hypothese wird durch die Abnahme des ζ-Potentials nach Kontakt der Vesikel mit menschlichem Serum gestützt. Dieses Phänomen tritt auf, wenn das ζ-Potential um den Neutralitätsbereich herum leicht negative Werte erreicht, wodurch das System instabil wird und die Vesikel zu aggregieren beginnen.

Ebenso wie Tween20 zeigen DMPC-Vesikel eine Größenzunahme im Vergleich zur Vorkontaktprobe. Es stellte sich jedoch heraus, dass diese Variation nicht signifikant war und die Größenwerte unter 280 nm (DMPC) oder unter 240 nm (DMPC + pHLIP) gehalten wurden.

Die Freisetzungsfähigkeit wurde für die mit und ohne pHLIP hergestellten Proben nach der Menge an Calcein (hydrophile Sonde), die im Laufe der Zeit aus den Vesikel freigesetzt wurde, bewertet.

Die Untersuchungen wurden bei einer Temperatur von 37 °C über einen Zeitraum von 24 Stunden durchgeführt, indem die gereinigten Proben entweder mit HEPES-Puffer oder Humanserum behandelt wurden. Wie in Abb. 4 gezeigt, erweisen sich die Calcein-Freisetzungsprofile sowohl für Tween20 als auch für Tween20-pHLIP in HEPES-Puffer oder Humanserum als sehr ähnlich.

Calcein-Freisetzungsprofil. NioTween20 und NioTween20-pHLIP kontaktiert mit HEPES-Puffer (a ) oder Humanserum (b )

Die freigesetzte Menge an Calcein lag zwischen 30 und 50 %, was darauf hindeutet, dass es keine Unterschiede in der Freisetzungsfähigkeit zwischen den mit und ohne pHLIP hergestellten Proben gibt.

Dieselben Ergebnisse wurden für Span- und DMPC-Proben erhalten (Daten nicht gezeigt).

Vergleichbare Freisetzungsprofile wurden für verschiedene stimuliresponsive Nanocarrier, wie thermosensitive Cubosomen [40] oder polymere selbstorganisierte Nanocarrier (SANs) [41, 42] berichtet.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die beobachteten physikalisch-chemischen Unterschiede in Bezug auf Mikroviskosität und Fluidität für die mit und ohne pHLIP hergestellten Proben (Tabelle 3) keinen Einfluss auf ihre Freisetzungsfähigkeiten (Abb. 4) haben, entsprechend dem Nachweis, dass die Insertion von DSPE-pHLIP Moleküle beeinflussen hauptsächlich die Kopfgruppenregion. Diese Daten stimmen mit früher berichteten Ergebnissen überein, die zeigen, dass pHLIP bei neutralen und hohen pH-Werten an die Oberfläche von Liposomen gebunden wird, die von 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn . hergestellt werden -Glycero-3-phosphocholin (POPC) und induziert keine Fusion oder Membranleckage.

Schlussfolgerung

Diese Studie bestätigt die Möglichkeit, mit pHLIP dekorierte Vesikel herzustellen. Proben sind stabil, wenn sie bei einer Temperatur von 4 °C für mindestens 3 Monate und in Gegenwart von Serum gelagert werden. Darüber hinaus sind die vorgeschlagenen Nanovektoren in der Lage, eine hydrophile Sonde einzufangen und ihre Freisetzung zu modulieren.

pHLIP-Vesikel wurden vollständig charakterisiert, um ein grundlegendes Verständnis der Eigenschaften von Nanoträgern zu erhalten und das rationale Design von säureempfindlichen Nanovektoren zu erleichtern.

Die pHLIP-Assoziation wird durch die hydrophobe Wechselwirkung der konjugierten DSPE-C18-Ketten angetrieben, die sich in die hydrophobe Region des Nanovektors einfügen. The pHLIP peptide is anchored and lies in the external headgroup region, prone to interact with target membranes at acidic pH and/or to release the nanovector content after bilayer rearrangement in low pH environment.

According to these findings, proposed pHLIP decorated vesicles could be useful to obtain a prolonged (modified) release of biological active substances for targeting tumors and other acidic diseased tissues.

Abkürzungen

Chol:

Cholesterol

Cryo-TEM:

Cryo-transmission electron microscopy

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

DMPC:

1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine

DPH:

Diphenylhexatriene

pHLIP:

pH (low) insertion peptide

SAXS:

Small angle X-ray scattering

Span20:

Sorbitan monolaurate

Tween20:

Polyoxyethylenesorbitan monolaurate