Duales Integrin αvβ 3 und NRP-1-Targeting paramagnetisches Liposom zur Tumorfrüherkennung in der Magnetresonanztomographie

Einführung

Die Magnetresonanztomographie (MRT) spielt eine wichtige Rolle bei der Früherkennung solider Tumoren, da sie eine bessere räumliche Auflösung bietet als die Computertomographie (CT) und Positronen-Emissions-Tomographie (PET) [1]. Darüber hinaus verbessert die Anwendung von paramagnetischen Kontrastmitteln wie Gadolinium-Diethylentriamin-Pentaessigsäure (Gd-DTPA) das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) weiter [2, 3]. Die geringe Spezifität der MRT bei der Früherkennung von Tumoren ist jedoch immer noch ein Problem.

Liposom kann hydrophile „Fracht“ in der wässrigen Umgebung mit integrierten amphiphilen oder hydrophilen Wirkstoffen in seiner Lipiddoppelschicht transportieren. Liposom schützt seinen Inhalt vor der Interaktion mit Komponenten im Plasma und erreicht eine verlängerte biologische Halbwertszeit der hydrophilen „Fracht“; daher wird Liposom häufiger als Träger von Kontrastmitteln in der MRT verwendet [4,5,6]. Darüber hinaus könnten durch Konjugieren von Peptiden, Antikörpern, Aptameren oder kleinen Molekülen an Lipiddoppelschichten [7,8,9] die Eigenschaften der Liposomenoberfläche modifiziert werden, um ihre Aktivität bei der „Fracht“-Lieferung oder dem Targeting auf spezifische Zellen und Gewebe zu verstärken [10 , 11]. Um auf Tumore zu zielen, werden Peptide häufig verwendet, um an Proteine ​​wie ανβ3-Integrin, den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktorrezeptor (VEGF-R) und Galectin-1 zu binden, die sowohl in Endothelzellen als auch in unzähligen Tumorzellen überexprimiert werden [12,13 ,14]. Durch das Targeting und Interferieren dieser Proteine ​​wurde erwartet, dass der Prozess der Angiogenese in soliden Tumoren blockiert wird, um anschließend das Tumorzellwachstum und die Metastasierung zu hemmen [15,16,17,18]. Diese überexprimierten Proteine ​​sind auch attraktive Kandidaten für die molekulare Bildgebung, um die Tumorlokalisation im Frühstadium zu identifizieren [19,20,21].

Dennoch könnte die heterogene Expression verschiedener Rezeptoren für die Tumorangiogenese die Targeting-Fähigkeit von Single-Targeting-Sonden beeinträchtigen [22]. Um das Problem zu lösen, kann das gleichzeitige Targeting von dualen Rezeptoren die Population der erkannten Zellen erweitern und eine verstärkte Bindungsaffinität über Konjugationen von zwei verschiedenen Liganden an die Rezeptoren auf derselben Zelloberfläche bereitstellen. Theoretisch könnten Dual-Targeting-Träger für die molekulare Bildgebung effizient mehr Kontrastmittel an die Tumorstelle liefern [23,24,25,26].

In unserer vorherigen Studie konnten paramagnetische Liposomen mit konjugiertem Arg-Gly-Asp (RGD)-Lipopeptid effektiv eine ausreichende Menge Kontrastmittel in den Tumor einbringen [27]. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass durch gleichzeitiges Targeting von zwei Molekülen in der Tumorangiogenese, z. B. ανβ3-Integrin und Neuropilin-1, das Signal der paramagnetischen Liposomen-basierten MR-Bildgebung von Tumoren verstärkt werden könnte. Zwei hochaffine Liganden von RGD für ανβ3-Integrin und Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg (ATWLPPR, A7R) für Neuropilin-1 (NRP1, ein VEGF-R-Korezeptor) wurden an die Liposomen funktionalisiert durch Konjugieren mit 6-Aminohexansäure (C6)-Palmitinsäure (Pal). Diese zweifach zielgerichteten Gd-DTPA-verkapselten Liposomen wurden durch Vergleich mit reinen Gd-DTPA, nicht zielgerichteten und einzelzielgerichteten Liposomen unter Verwendung von In-vitro- und In-vivo-Assays bewertet.

Materialien und Methoden

Chemikalien

Ei-Phosphatidylcholin (C40H82NO9P, Ei-PC, MW 775 Da) und N-(Carbonyl-Methoxypolyethylenglycol-2000)-1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (mPEG2000-DSPE, MW 2788 Da) wurden von Avanti . bezogen Polare Lipide (Alabaster, AL, USA) und Cholesterin (C27H46O, MW 386 Da) wurden von Bio Basic (Ontario, Kanada) bezogen. Gadopentetsäure-Dimeglumin-Salz-Injektion (Gd-DPTA, Magnevist) wurde von Bayer Schering Pharma (Berlin, Deutschland) bezogen. Die Peptide und Konjugate wurden von Yishengyuan (Shanghai, China) synthetisiert.

Peptide und Konjugate

Drei Peptide umfassen das dual-targeted Peptid P1 (GARYCRGD CFDATWLPPR , MW 2435 Da), Einzelzielpeptid P2 (GARYCRGD CFDG, MW 1670 Da) und Single-Targeted-Peptid P3 (ATWLPR, MW 1191 Da). Peptide wurden mit 6-Aminohexansäure (C6)-Palmitinsäure (Pal) konjugiert und die Targeting-Peptide von Pal-C6-P1, Pal-C6-P2 und Pal-C6-P3 wurden alle unter Verwendung von Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC) synthetisiert. Chemie der Festphasensynthese. Die Reinheit des Peptids wurde durch HPLC mit> 90% bestätigt.

Liposomenvorbereitung

Liposomen wurden unter Verwendung des Dünnfilm-Hydratationsverfahrens hergestellt. Die Zusammensetzung der Liposomen war Ei-PC/Cholesterin/mPEG2000-DSPE in einem Molverhältnis von 1,85/1/0,15. Drei Komponenten wurden gemischt und in Chloroform gelöst, das Lösungsmittel wurde bei 37 °C verdampft und am Boden des Rundkolbens bildete sich ein dünner Film. Der dünne Film wurde über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Zur Herstellung gezielter Liposomen wurden Peptide in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und dann in Chloroform verdünnt (DMSO-Endkonzentration 1 %). Das Liposom von P1-Gd-LP, P2-Gd-LP, P3-Gd-LP und P2/P3-Gd-LP fügte Pal-C6-P1 zu einem 4,5 μg/μmol Peptid/Gesamtlipid-Verhältnis Pal-C6 . hinzu -P2 auf ein 3 μg/μmol Peptid/Gesamtlipidverhältnis, Pal-C6-P3 auf ein 2,5 μg/μmol Peptid/Gesamtlipidverhältnis, Pal-C6-P2 und Pal-C6-P3 auf 3 und 2,5 μg/μmol Peptid/Gesamtlipid-Verhältnisse. Zur Herstellung des paramagnetischen Liposoms wurde der dünne Film mit wässriger Gd-DTPA-Lösung hydratisiert, dann wurde die Suspension zehnmal nacheinander durch 0,4 μm-, 0,2 μm-, 0,1 μm-Polycarbonatmembranen mit einem Miniextruder (Avanti Polar Lipids, USA) extrudiert. Nicht eingekapseltes Gd-DTPA wurde durch Zentrifugation bei 10.000 × g . entfernt bei − 4 °C (Avanti J-E, Beckman Coulter, CA, USA) durch Ultrafiltrationszentrifugenröhrchen mit 100.000 MWCO, Amicon Ultra-15 (Millipore, MA, USA). Die endgültige Suspension enthält nicht zielgerichtete Liposomen (Gd-LP), doppelt gezielte Liposomen (P1-Gd-LP), einzelne gezielte Liposomen (P2-Gd-LP oder P3-Gd-LP) und gemischte einzelne gezielte Liposomen (P2/P3-Gd-LP) wurden bei 4 °C unter Stickstoff gelagert.

Liposomencharakterisierung

Die Größenverteilung der hergestellten Liposomen wurde unter Verwendung eines Submikron-Partikelgrößenanalysators (Zetaplus, Brookhaven Instruments, USA) bestimmt. Die Morphologie der Liposomen wurde durch ein Transmissionselektronenmikroskop (TEM, JEM-1230, JEOL, Tokio, Japan) beim Anfärben von Uranylacetat beobachtet. Die Konzentration von Gadolinium wurde mit einem optischen Emissionsspektrometer mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES, Optima 7000DV, PerkinElmer, USA) bestimmt.

Messung der T1-Relaxivität

Die T1-gewichteten Bilder der Liposomensuspension wurden unter Verwendung eines 3,0 Tesla kernmagnetischen Resonanzanalysators (Philips, GE, USA) erhalten. Reine Gd-DTPA-, Gd-LP-, P1-Gd-LP-, P2-Gd-LP- und P3-Gd-LP-Lösung wurden jeweils mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine Gadoliniumkonzentration von 1 × 10 ^{- . verdünnt 3} mM bis 1 × 10 mM Gd/L. Zur Messung der Längsrelaxation T1 (s) wurde eine Inversion Recovery Spin-Echo (STIR)-Sequenz mit zehn verschiedenen Inversionszeiten (TI) im Bereich von 200 bis 9000 ms verwendet, und andere Scanparameter waren wie folgt:Wiederholungszeit (TR) 10000 ms, Echozeit (TE) 7,6 ms, Sichtfeld (FOV) 2 × 2 cm ² , Matrixgröße 320 × 320 und eine Schichtdicke von 5,0 mm. Die T1-Relaxivität (s ⁻¹ mM ⁻¹ ) könnte durch die folgende Formel erhalten werden:r1 = (R1obs-R1m)/C. R1obs und R1m waren die Relaxationsraten R1 (s ⁻¹ ) der Präparate und der entsprechenden Matrix, und C war die Konzentration von Gadolinium (mM).

Zelllinien und -kultur

A549-Zellen (humane Adenokarzinomzellen) und HUVECs (humane Nabelvenen-Endothelzellen), die beide die ανβ3-Integrin-Rezeptorfamilie und Neuropilin-1-Rezeptoren exprimieren, wurden vom Cancer Institute der Tongji University School of Medicine (Shanghai, China) bereitgestellt. Die Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM, Invitrogen, USA) kultiviert, das mit 10 % neonatalem Rinderserum und 100 E ml ⁻¹ . ergänzt wurde Penicillin und 100 μg ml ⁻¹ Streptomycin bei 37 °C, 5 % CO2. Die Zellen wurden in 6-Well-Platten bis zu einer Konfluenz von 80–90 % in den Assays kultiviert.

Mobilfunkaufnahme und Wettbewerbsbindung

Fünf paramagnetische Liposomen, einschließlich Gd-LP, P1-Gd-LP, P2-Gd-LP, P3-Gd-LP und P2/P3-Gd-LP mit einer Gadoliniumkonzentration von 10 mM, wurden HUVECs und A549-Zellen bei 37 ° . verabreicht C für 4 h. Nach zweimaligem Spülen mit PBS wurde die Salpetersäure zugegeben und dann wurden die Zellen in den Medien über Nacht bei 65 °C nitriert. Im kompetitiven Bindungsassay wurden die entsprechenden freien Peptide gleichzeitig mit konjugierten Liposomen und Zellen inkubiert. Die endgültigen Gadoliniumkonzentrationen wurden durch ICP-OES bestimmt.

MRT-Erkennung in vivo

Alle Tierverfahren entsprechen dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Den 4 Wochen alten weiblichen BalB/C-Nacktmäusen (SLAC, Shanghai, China) wurden subkutan A549-Zellen injiziert (1 × 10 ⁻⁴ Zellen pro Maus) an der rechten Flanke. Wenn die Größe des Tumors 50–100 mm ³ . erreichte , wurden die tumortragenden Mäuse nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen eingeteilt (jeweils n = 5). Für die MR-Bildgebung wurden die Mäuse mit einer peritonealen Injektion von 10 % Urethan (m/v) anästhesiert und mit einem 1,5 Tesla kernmagnetischen Resonanzanalysator (Philips, GE, USA) gescannt. Zuerst wurden T2-gewichtete Bilder aufgenommen, um den Tumor unter Verwendung des folgenden Verfahrens zu lokalisieren:TR = 7,3 ms, TE = 2,7 ms, FOV = 12,0 × 12,0 cm ² , Schichtdicke = 2 mm, Matrixgröße = 256 × 128. Vor der intravenösen Injektion von Kontrastmitteln wurden T1-gewichtete Bilder für das einfache Scannen durch die Spin-Echo-Sequenz aufgenommen:TR = 420 ms, TE = 14,8 ms, FOV = 12,0 × 12,0 cm ² , Schichtdicke =  2,0 mm, Matrix =256 ×   128, dann wurden sechs aufeinanderfolgende Schichten beobachtet. Nach Injektion von paramagnetischen Kontrastmitteln wurden T1-gewichtete Bilder zu den Zeitpunkten 0,5, 1, 2, 4 und 6 h aufgenommen. Die Regionen von Interesse (ROIs) der Tumor- und Hintergliedmaßenmuskelbereiche in MR-Bildern wurden abgegrenzt und die mittlere Signalintensität (SI) in ROIs vor und nach Kontrastmittelinjektion wurde verwendet, um den SER zu schätzen, wie in unserer vorherigen Studie beschrieben [27 ].

Statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt, und die Mehrfachvergleiche zwischen den Mittelwerten wurden mit Einweg-ANOVA durch die Software SPSS 22.0 analysiert. Zweischwänziges P ein Wert von weniger als 0,05 wurde als signifikant angesehen.

Ergebnisse

Liposomencharakterisierung

Alle mit Wirkstoffen beladenen Liposomen mit Nicht-, Einzel- und Doppel-Targeting-Peptiden wurden in runder oder ovaler Form ähnlicher Größe unter TEM um die klare Lipoidstruktur herum gezeigt. Diese Nanopartikel hatten einen Durchmesser von weniger als 100 nm und das Zeta-Potential lag im Bereich von – 15 mv bis – 60 mv, gemessen mit dem Zeta-Potentiometer. Die mittleren Größen von Gd-LP, P1-Gd-LP, P2-Gd-LP und P3-Gd-LP betrugen 87,75 ±   0,87 nm, 103,50 ±   1,21 nm, 89,91 ±   1,46 nm bzw. 89,90 ±   1,18 nm.

T1-Relaxivität von Dual-Targeted Liposom

Reines Gd-DTPA wies in fünf Gruppen den höchsten Relaxivitätswert auf, unterschied sich aber nicht von den anderen vier Liposomentypen (P> 0,05) (Abb. 1), was darauf hinweist, dass die Zugabe von Lipid- und Peptidzusammensetzungen nur geringe Auswirkungen auf die Relaxivität von eingekapseltem Gd-DTPA hatte. Es wurde daher vorgeschlagen, dass mit Gd-DTPA verkapselte Liposomen ohne, einzelne und zweifache Zielrichtung eine ausreichende Fähigkeit für die molekulare Bildgebung aufweisen könnten.

T1-Relaxivität (s ⁻¹ mM ⁻¹ ) reiner Gd-DTPA-, Gd-LP-, P1-Gd-LP-, P2-Gd-LP- und P3-Gd-LP-Lösung gemessen in verschiedenen Gadoliniumkonzentrationen (mM). Die Daten repräsentieren die mittlere  ± Standardabweichung (n = 3), (P> 0,05)

Mobilfunkaufnahme und Wettbewerbsbindung

Die Gadoliniumkonzentration in der Gruppe mit zweifach zielgerichteten Liposomen war höher als bei anderen Formeln in der zellulären Aufnahmestudie. Im Vergleich zu Liposomen ohne Targets erhöhte sich die Gadoliniumkonzentration der Dual-Targeting-Gruppe um 50 % (Abb. 2a). Es war ein bis zu 20 %iger Anstieg der Gadoliniumkonzentration von Einzelzielgruppen mit Liposomen. Darüber hinaus war die Gadoliniumkonzentration von gemischten Single-Targeting-Liposomen (P2/P3-Gd-LP) signifikant niedriger als die von Dual-Targeting-Liposomen.

a Zelluläre Aufnahmeexperimente von Gd-LP, P1-Gd-LP, P2-Gd-LP, P3-Gd-LP und P2/P3-Gd-LP in A549-Zellen und HUVECs. b -d Zelluläre Konkurrenzstudie von P1-Gd-LP, P2-Gd-LP und P3-Gd-LP, wobei P1, P2 bzw. P3 hinzugefügt wurden, um die Rezeptoren in den Konkurrenzgruppen zu hemmen. *P < 0.05, im Vergleich zu den anderen Gruppen

Die Gadoliniumkonzentrationen in den anvisierten Liposomengruppen waren bei der kompetitiven Bindung mit den Liganden P1, P2 oder P3 an ανβ3-Integrin und/oder die Neuropilin-1-Rezeptoren signifikant verringert. Die zelluläre Aufnahme in kompetitiven Gruppen lag nahe der des nicht zielgerichteten Liposoms (Abb. 2b–d und Tabelle 1). Diese Daten zeigten, dass das Dual-Targeting-Liposom die beste Tumor-Targeting-Fähigkeit unter diesen Gruppen aufwies, was durch die Bindung von RGD/ανβ3-Integrin und A7R/NRP1 vermittelt wurde.

MR-Bildanalyse

Herkömmliche Liposomen und Liposomen mit eingekapselten Gadolinium-Kontrastmitteln wurden tumortragenden Mäusen injiziert, um die Wirkung auf die Signalverstärkung des Tumors in der MRT zu bewerten (Abb. 3). In Bezug auf SER waren die bildgebenden Effekte von reinem Gd-DTPA und nicht zielgerichteten Liposomengruppen ähnlich (Abb. 4). Der SER erreichte 1 h nach der Injektion seinen Höhepunkt und fiel in den folgenden 6 h stark ab, während das Single- und Dual-Targeting-Liposom bei den beiden obigen Gruppen unterschiedliche Verstärkungsmuster aufwies. Der SER erreichte seinen Höchststand bei 1 h, fiel aber langsam von 2 auf 6 Stunden. Unter ihnen erreichten Dual-Targeting-Liposomen den höchsten SER-Wert mit statistisch signifikanter Signifikanz zu allen Zeitpunkten. Es war etwa das Dreifache im Vergleich zu reinem Gd-DTPA und nicht zielgerichteten Liposomen und war 2 h nach der Injektion 1,5-fach im Vergleich zu einfach gezielten Liposomen. Der SER wurde allmählich gesenkt und sank in 6 h nur um 40 % des Spitzenwertes.

MR-Bilder von tumortragenden Mäusen vor und nach Injektion verschiedener Kontrastmittel zu verschiedenen Zeitpunkten. a reines Gd-DTPA. b Gd-LP. c P1-Gd-LP. d P2-Gd-LP. e P3-Gd-LP

Bestimmung von SER zu verschiedenen Zeitpunkten mit Injektion von reinem Gd-DTPA, Gd-LP, P1-Gd-LP, P2-Gd-LP und P3-Gd-LP. N = 3 und *P < 0,05 P1-Gd-LP im Vergleich zu den anderen vier Gruppen

Diskussion

Kleine Liposomenpartikel, insbesondere solche mit einem Durchmesser von weniger als 100 nm, neigen dazu, die biologische Halbwertszeit mit der erhöhten Permeabilität in den soliden Tumor zu verlängern und sich folglich im lokalen Tumorgewebe anzureichern [4]. Wir konstruierten erfolgreich Nicht-, Einzel- und Doppelpeptid-modifizierte Liposomen mit Durchmessern im Nanopartikelbereich und zeigten, dass diese Liposomen das paramagnetische MRT-Kontrastmittel Gd-DTPA effektiv einkapseln können. Die T1-Relaxivität verschiedener Liposomenformulierungen war niedriger als bei reinem Gd-DTPA, jedoch ohne statistisch signifikanten Unterschied (P> 0,05). Ein möglicher Grund könnte sein, dass die Lipiddoppelschicht die Gadoliniumionen effektiv verkapselt und ihren Austausch mit Wasser verhindert [28]. Außerdem veränderte die Peptidmodifikation auf der Liposomenoberfläche die Integrität des Liposoms nicht [29]. Ein weiterer Grund könnte die Härte des Liposoms sein, die auf seine Bestandteile Cholesterin und gesättigte Phospholipide zurückzuführen ist, die niedrige Permeabilitätskoeffizienten für Wasser haben [30]. In diesem Sinne hatten die Liposomenkomponenten lediglich einen geringen Einfluss auf die Abbildungsfähigkeit des Kontrastmittels Gd-DTPA.

Angiogenese, die Bildung neuer Gefäße aus bestehenden Blutgefäßen, ist ein Schlüsselereignis bei vielen pathologischen Fortschritten, insbesondere bei der Wachstumsinvasion und Metastasierung von Tumoren [15, 16]. Am Fortschreiten der Tumorangiogenese sind eine Vielzahl von Molekülen beteiligt, beispielsweise VEGF und andere Faktoren für die Vaskularisierung solider Tumoren, die eine Interaktion mit Membran-Rezeptoren beinhalten [17, 31]. Ein solcher Rezeptor ist Neuropilin-1 (NRP1), ein Co-Rezeptor für VEGFR-2, der die Bindung und biologische Aktivität von VEGF165 verstärkt, das eine breite Gewebeverteilung aufweist, die einige Tumorzellen und Endothelzellen umfasst [32]. Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg (ATWLPPR), ein Heptapeptid, bindet nachweislich spezifisch an NRP1 und wird erfolgreich zum Nachweis von NRP-1-positiven Tumoren eingesetzt [12, 17]. Die relativ geringe Affinität von monomerem A7R weist jedoch auf eine weitere Verbesserung hin, um eine erfolgreiche Bildgebung zu ermöglichen [33]. Integrine, einer der Zelladhäsionsrezeptoren, spielen auch eine entscheidende Rolle bei der Tumorangiogenese und -metastasierung, insbesondere das Integrin αvβ3, das auf Tumorzellen und aktivierten vaskulären Endothelzellen stark exprimiert wird [34]. Die Arg-Gly-Asp-Aminosäuresequenz (RGD), die spezifisch an Integrinαvβ3 bindet, wurde in großem Umfang für die nichtinvasive Bildgebung von Tumoren verwendet [7, 21, 27, 35].

In den letzten zehn Jahren wird im Bereich der Bildgebung zunehmend das gleichzeitige Targeting mehrerer Rezeptoren untersucht [23, 25, 26, 36]. Die TF LP- oder RGD LP-Liefersysteme, αvβ3, und Galectin-1 mit paramagnetischen Anx/RGD-Liposomen wurden für die Tumorbildgebung verwendet [37, 38]. Der synergistische Effekt von Dual-Targeting-Motiven könnte auf mehrere Arten wirken. Erstens war die Verfügbarkeit von Bindungsstellen ein Schlüsselelement der Konjugation mit Peptidliganden. Die gleichzeitige Ausrichtung auf zwei Rezeptoren könnte die Bindungsstellen auf denselben Zellen erhöhen. Zweitens könnten Dual-Targeting-Peptide an zwei verschiedene Rezeptoren binden, um die Wahrscheinlichkeit der Abgabe von Agenzien an die interessierte Region zu erhöhen. Darüber hinaus Verbindung zu zwei verschiedenen Rezeptorfamilien, was die Möglichkeit der Bindung an heterogene Tumorzellen erhöht.

In unserer vorherigen Studie wurden neuartige, in Paclitaxel eingeschlossene Liposomen mit zwei Zielen erfolgreich konstruiert, indem eine RGD-haltige Sequenz und ein ATWLPPR-Motiv mit einem Konjugat mit einem Lys-Gly-Gly (KGG)-Spacer und Palmitinsäure (Pal)-Anker verknüpft und dann konjugiert wurden an die Oberfläche der Liposomen [39]. Es zeigte sich, dass im Vergleich zu zwei Single-Targeted-Peptiden das Dual-Targeted-Peptid die höhere Bindungsaktivität aufwies. Diese Liposomen mit zwei Zielen behielten auch eine bessere Bindungseigenschaft als die Formulierungen mit nur einem Ziel bei.

In der vorliegenden Studie haben wir anstelle von Therapiemedikamenten das MRT-Kontrastmittel Gd-DTPA in Liposomen für die molekulare Bildgebung eingekapselt. Die zelluläre Aufnahme von paramagnetischen Targeting-Liposomen war erhöht, und die dual-targeted-Liposomen zeigten eine höhere Bindungsaffinität als die single-targeted und darüber hinaus die gemischten single-targeted-Liposomen. Gegenwärtig werden zwei Strategien für das Dual-Targeting häufig verwendet, eine ist eine Mischung aus zwei einzelnen Liganden [25, 38] und die andere ist die Kombination von zwei Liganden in einem Molekül [39, 40]. Im Vergleich zur Verwendung einer Mischung einzelner Peptide stellten wir die Hypothese auf, dass die Anwendung einer Konjugation gekoppelt mit zwei Zielen eine größere Anzahl von Peptiden pro Liposomoberfläche pfropfen könnte. Im kompetitiven Bindungstest lieferte er einen entscheidenden Beweis dafür, dass das effektive Targeting des Liposoms auf Tumorzellen durch die spezifische Bindung von Liganden und Rezeptoren von ανβ3-Integrin und Neuropilin-1 vermittelt wurde. Diese Daten bestätigten erneut, dass die RGD-ATWLPPR-kombinierten Dual-Targeting-Liposomen die Wirkstoffabgabe und Akkumulation im Tumor erleichterten.

Im MR-Bildgebungsexperiment wurden reines Gd-DTPA und nicht zielgerichtete Liposomen aufgrund ihrer kleinen Moleküle, ihrer Wasserlöslichkeit und ihrer verbesserten Permeabilitäts- und Retentionseffekte (EPR-Effekte) schnell metabolisiert [41, 42]. Im Gegensatz dazu hatten eine verlängerte Zirkulationszeit und eine allmähliche Akkumulation von Dual-Targeting-Liposomen im Tumorgewebe die Fähigkeit gezeigt, spezifisch an Rezeptoren auf Tumorzellen zu binden. Pspeziell , waren dual-targeted Liposomen effektiver als single-targeted Liposomen. Zweifach zielgerichtete Liposomen üben wahrscheinlich einen synergistischen Effekt und die Spezifität der Abgabe von Gd-DTPA an die Tumorstelle aus.

In den letzten Jahren wurde aufgrund ihrer verbesserten Bindungsaffinität und Spezifität eine große Anzahl von Dual-Targeting-Nanopartikeln erfolgreich für die Tumorbildgebung entwickelt und synthetisiert. Wu et al. verwendeten auch RGD- und ATWLPPR-Motive, um ein duales auf αvβ3 und NRP-1 gerichtetes heterodimeres Peptid zum Nachweis von malignen Gliomen durch Positronen-Emissions-Tomographie (PET) zu entwerfen [43]. In ihrer Studie wurde das c (RGDyK)-Peptid über einen Glutamat-Linker mit ATWLPPR verbunden und dann mit Fluor-18 (F-18) für die Radionuklid-Bildgebung markiert. Der In-vitro-Rezeptor-Bindungsassay zeigte eine verbesserte Zellaufnahme und Bindungsaffinität der dual ausgerichteten Sonde. Darüber hinaus war die in vivo-Tumoraufnahme von F-18-markiertem Dual-RGD-ATWLPPR signifikant höher als die des Single-Targeting-Moleküls, und dieses heterodimere Peptid wies auch die höchsten Tumor-zu-Organ-Verhältnisse auf. Im Vergleich zu ihrer radioaktiv markierten Peptidsonde könnten unsere nicht-radioaktiven dual-targeted paramagnetischen Liposomen aufgrund einer höheren Belastbarkeit Kontrastmittel effektiver an die Tumorstelle abgeben. In einer anderen Studie haben Zhang et al. erfolgreich 68Ga-BBN (Bombesin)-RGD konstruiert, einen heterodimeren PET-Tracer, der sowohl auf GRPR (Gastrin-Releasing-Peptid-Rezeptor) als auch auf Integrin αvβ3 abzielt [44]. Dieser duale PET-Radiotracer konnte jedoch nur für die nichtinvasive Bildgebung von Prostatakrebs verwendet werden, da GRPR ein wichtiger Biomarker für Prostatakrebs war. Anders als die BBN-RGD-Peptidsonde konnte das RGD-ATWLPPR-Peptid an die meisten Tumoren mit der Überexpression von VEGFR und/oder Integrin in der Neovaskulatur solider Tumoren binden. Daher wird erwartet, dass dieses dual-ανβ3-Integrin-NRP1-zielende paramagnetische Liposom zur Früherkennung verschiedener Tumoren verwendet wird.

Schlussfolgerungen

In unserer Studie wurden paramagnetische Liposomen mit zwei Zielen hergestellt, indem zwei Liganden für ανβ3-Integrin- und Neuropilin-1-Rezeptoren auf der Oberfläche konjugiert wurden und das MRT-Kontrastmittel Gd-DTPA in den Kern der Liposomen geladen wurde. Diese Modifikation beeinträchtigte die Eigenschaften von Gd-DTPA nicht wesentlich. Das Dual-Targeting-Liposom erleichterte die spezifische zelluläre Aufnahme in vitro, was darauf hindeutet, dass die Affinität und Bindung des Dual-Targeting-Liganden synergistisch erhöht zu sein schienen. Darüber hinaus zeigte die In-vivo-Bildgebung, dass mit zwei Peptiden modifizierte Liposomen für einen größeren Teil und einen längeren Zeitraum im Umlauf bleiben können als nicht zielgerichtete oder einfach zielgerichtete Gegenstücke und dann eine überlegene Selektivität und Spezifität aufweisen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir erfolgreich ein neuartiges auf Angiogenese gerichtetes paramagnetisches Liposom mit einem zweifach gerichteten heterodimeren Peptid konstruiert haben, das effizient an das Tumorgewebe binden könnte, und wir erwarten, dass diese zweifach gerichteten paramagnetischen Liposomen das Potenzial haben, die Wirkung von MRT-Kontrastmitteln zu verbessern für tumorspezifische Bildgebung in einem frühen Stadium.

Abkürzungen

ATWLPR:

Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg

BBN:

Bomben

C6:

6-Aminohexansäure

CT:

Computertomographie

DMEM:

Dulbeccos modifizierte Eagle-Medien

DMSO:

Dimethylsulfoxid

FMOC:

Fluorenylmethoxycarbonyl

FOV:

Sichtfeld

Gd-DTPA:

Gadolinium-diethylentriaminpentaessigsäure

HPLC:

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

HUVEC:

Endothelzelle der menschlichen Nabelvene

ICP-OES:

Optisches Emissionsspektrometer mit induktiv gekoppeltem Plasma

mPEG2000-DSPE:

N-(carbonyl-methoxypolyethylenglykol-2000)-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin

MRT:

Magnetresonanztomographie

NRP1:

Neuropilin-1

Kumpel:

Palmitinsäure

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PC:

Phosphatidylcholin

PET:

Positronenemissionstomographie

RGD:

Arg-Gly-Asp

ROI:

Interessante Regionen

S/N:

Signal-Rausch-Verhältnis

SER:

Signalverstärkungsverhältnis

SI:

Signalstärke

STIR:

Inversion Recovery Spin-Echo

TE:

Echozeit

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop

TR:

Wiederholungszeit

VEGF-R:

Rezeptor des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors