Hydrophiles HBP-modifiziertes rGO ermöglicht duales pH/NIR-getriggertes DOX-Release für synergistische Chemo-Photothermale Tumortherapie

Zusammenfassung

Wir berichten über einen einfachen Weg zur Synthese hydrophilen reduzierten Graphenoxids (NrGO) durch Reduktion von Graphenoxid (GO) mit amin-terminiertem hyperverzweigtem Polymer (NHBP). NrGO zeigt exzellente wässrige Dispergierbarkeit, starke Nahinfrarot (NIR)-Absorption, effiziente photothermale Umwandlung und chemische Stabilität. Beladung des Chemotherapeutikums Doxorubicin (DOX) auf NrGO ergibt einen dual-responsiven Drug-Carrier, der DOX schneller unter sauren tumorähnlichen Bedingungen oder bei NIR-Laserbestrahlung freisetzt. In-vitro-Studien bestätigen Biokompatibilität von NrGO, und DOX@NrGO erzielt überlegene Tumorzellinhibition im Vergleich zu freiem DOX, was effektive Chemo-Photothermale Synergie demonstriert. Diese Ergebnisse unterstreichen DOX@NrGO als vielversprechende Plattform für kombinierte Krebstherapie und andere biomedizinische Anwendungen.

Einführung

Nahinfrarot (NIR) Photothermale Therapie (PTT) hat sich als minimalinvasive Strategie für Krebsbehandlung etabliert, da NIR-Licht (700–1100 nm) Gewebe mit geringer Absorption durchdringt, gesunde Zellen schont und lokale Erwärmung ermöglicht. Für PTT muss das Therapeutikum hohe photothermale Umwandlungseffizienz, gute Biokompatibilität und kolloidale Stabilität in wässrigen Umgebungen kombinieren.

Graphenbasierte Materialien zogen als PTT-Mittel Aufmerksamkeit auf sich aufgrund ihrer zweidimensionalen Struktur, großen Oberfläche und einstellbaren optischen Eigenschaften. Konventionelles reduziertes Graphenoxid (rGO), hergestellt durch chemische oder hydrothermale Methoden, behält jedoch oft hydrophoben Charakter, was die Anwendbarkeit in biologischen Systemen limitiert.

Wir adressierten diese Limitation durch Einsatz eines wasserlöslichen, reduktiven amin-terminierten hyperverzweigten Polymers (NHBP) zur Umwandlung von GO in ein hydrophiles, stabiles rGO (NrGO). Frühere Arbeiten demonstrierten NHBPs Fähigkeit, Metallnanopartikel zu funktionalisieren, während Dispergierbarkeit erhalten blieb.

Zusätzlich kann Beladung zytotoxischer Medikamente auf photothermale Träger Chemotherapie mit PTT synergisieren, da Wärme nicht nur Tumorzellen ablatiert, sondern auch Medikamentenfreisetzung beschleunigt. Hier beschreiben wir die Synthese von NHBP-modifiziertem rGO, seine photothermale Eigenschaften, DOX-Beladung, pH/NIR-getriggerte Medikamentenfreisetzung und die resultierende Chemo-Photothermale Wirksamkeit gegen HeLa-Zellen.

Materialien und Methoden

Materialien

Graphenoxid (GO, 0,8–1,2 nm dick, 0,5–5 µm breit) wurde von XFNANO Co., Ltd. bezogen. Doxorubicin (DOX) von HuaFeng United Technology Co., Ltd. Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), fetales Kälberserum (FBS), Trypsin, Penicillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 µg/ml) von Thermo Fisher Scientific. MTT, DAPI und PI Reagenzien von Beyotime Biotechnology. Alle anderen Chemikalien waren analytischer Grad von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.

Herstellung von amin-terminiertem hyperverzweigtem Polymer (NHBP)

Das amin-terminierte hyperverzweigte Polymer (NHBP) wurde nach unserem früheren Protokoll synthetisiert. Kurz: Tetraethylenpentamin (94 ml, 0,5 mol) wurde unter Stickstoff in einem 250-ml Dreihals-Rundkolben gerührt. Eine Methanollösung von Methylacrylat (43 ml, 0,5 mol) wurde tropfenweise zugegeben, dann wurde das Gemisch abwechselnd erhitzt und gekühlt, gefolgt von 4 h Rühren bei Raumtemperatur. Das Produkt wurde durch Rotationsverdampfung bei 150 °C isoliert, ergab ein gelbliches viskoses Polymer mit einem gewichtsmittleren Molekulargewicht von ~7759.

Herstellung von NHBP-reduziertem GO (NrGO)

GO wurde in deionisiertem Wasser dispergiert und mit NHBP bei Gewichtsverhältnissen von 1:10, 1:20 und 1:30 für 10 min ultraschallbehandelt, dann 1 h bei 90 °C gerührt. Die resultierenden Suspensionen (NrGO-10, NrGO-20, NrGO-30) wurden zentrifugiert und dreimal mit Wasser gewaschen.

Herstellung von DOX-beladenem NrGO (DOX@NrGO)

NrGO-Suspension wurde mit DOX-Lösung im 1:1 Gewichtsverhältnis gemischt und 24 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Komposit wurde durch Zentrifugation gesammelt und gewaschen, um DOX@NrGO zu erhalten.

Charakterisierung und Messungen

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, JEOL JEM-2100) untersuchte Morphologie. Fourier-Transform-Infrarot (FTIR, Nicolet iS10) Spektren wurden über 400–4000 cm⁻¹ (4 cm⁻¹ Auflösung) aufgezeichnet. Zeta-Potential und hydrodynamische Größe wurden mit einem NanoBrook 90plus Zeta-Analysator gemessen. UV-Vis-NIR-Absorption (400–900 nm, 1 cm⁻¹ Auflösung) an einem Thermo Fisher Evolution 300. Photothermale Leistung wurde mit einem 808-nm Laser (SFOLT Co.) und Thermoelement-Thermometer (DT-8891E) bewertet. Die Probe (0,2 ml) in einem 0,25 cm² Spot wurde bei 1 W cm⁻² für 5 min bestrahlt, Temperaturänderungen in Echtzeit aufgezeichnet.

Medikamentenfreisetzungstest

DOX@NrGO wurde in einen Dialysebeutel (MWCO 8000) mit PBS (pH 7,4 oder 4,0) gegeben und bei 37 °C mit 100 rpm gerührt. Für die NIR-Gruppe wurde der Beutel nach jedem Probenahmezeitpunkt 5 min bestrahlt. Bei jedem Intervall wurden 10 ml PBS entnommen, mit frischem Puffer ersetzt, und DOX-Konzentration per UV-Vis-Spektrophotometrie bestimmt.

Zelluläre Zytotoxizität und Chemo-Photothermale Evaluation

HeLa-Zellen wurden mit 5×10³ Zellen pro Well in 96-Well-Platten ausgesät und bis ~80 % Konfluenz inkubiert. Zellen wurden mit NrGO (3,125–50 µg ml⁻¹) für 24 und 48 h behandelt, dann Vitalität per MTT-Assay nach Gleichung (1) gemessen. Nach 4 h Inkubation mit DOX@NrGO (3,125–50 µg ml⁻¹) wurden HeLa-Zellen mit dem 808-nm Laser (0,5 W cm⁻²) für 5 min bestrahlt und weitere 20 h kultiviert. Vitalität wurde per MTT beurteilt, Zellmorphologie per DAPI- und PI-Färbung unter Konfokalmikroskopie untersucht.

Zellvitalität (%) = (OD_Probe / OD_Kontrolle) × 100 %.

Ergebnisse und Diskussion

Physikalische und chemische Charakterisierung

Reduktion von GO mit NHBP verwandelte die braune Suspension in eine schwarze, wasserdispergierbare Lösung, was erfolgreiche Umwandlung bestätigte. TEM-Bilder (Abb. 2) zeigen, dass NrGO-30 eine Monolagen-Blattstruktur ohne Aggregation beibehält, was anzeigt, dass NHBP die Graphenmorphologie nicht stört. FTIR-Spektren (Abb. 3) zeigen Verschwinden des 1725 cm⁻¹ C=O-Peaks von GO und Erscheinen eines 1633 cm⁻¹ C-N Amid-Signals, was kovalente Anbindung von NHBP bestätigt. Zeta-Potential-Messungen (Abb. 4) demonstrieren einen Shift von negativ (GO) zu positiven Werten (NrGO), was die Oberflächenfunktionalisierung weiter stützt. UV-Vis-NIR-Spektren (Abb. 5) zeigen starke Absorption im NIR-Fenster für alle NrGO-Proben, während GO und NHBP allein vernachlässigbare NIR-Antwort zeigen. Hydrodynamische Größe (Abb. 6) bleibt über verschiedene NHBP-Verhältnisse konsistent, was Größestabilität anzeigt.

Photothermale Eigenschaften

Unter 808-nm-Bestrahlung zeigte Wasser vernachlässigbare Erwärmung, während GO <5 °C anstieg. Im Gegensatz dazu erreichten NrGO-Proben 40–45 °C bei 200 µg ml⁻¹, mit höheren NHBP-Verhältnissen erzeugten größere Temperaturerhöhungen (Abb. 7). Temperatur stieg proportional zur NrGO-Konzentration und Laserleistung, erreichte das therapeutische Fenster (~41–43 °C) ohne Schädigung normaler Zellen. Photothermale Zyklen (Abb. 7d) und Post-Bestrahlungs-UV-Vis (Abb. 8) bestätigen exzellente Stabilität und Erhalt optischer Eigenschaften.

Drug-Delivery-Verhalten

DOX-Freisetzung aus DOX@NrGO war in sauren (pH 4,0) und NIR-bestrahlten Bedingungen markant erhöht (Abb. 9). Saurer pH ionisiert NHBP-Amingruppen, verringert elektrostatische Bindung an DOX und fördert Freisetzung. NIR-Erwärmung beschleunigt Molekularbewegung, was die Drug-Diffusion weiter beschleunigt. Somit bietet DOX@NrGO duale Responsivität, geeignet für Tumormikroumgebungen.

Zytotoxizität von NrGO

MTT-Assays (Abb. 10a) zeigen >80 % Zellvitalität bei 50 µg ml⁻¹ nach 24 h, was niedrige intrinsische Toxizität und Eignung als Drug-Carrier bestätigt.

Synergistische Tumorzellinhibition

Behandlung mit DOX@NrGO allein reduzierte HeLa-Vitalität dosisabhängig (Abb. 10b). In Kombination mit NIR-Bestrahlung (0,5 W cm⁻², 5 min) sank die Zellvitalität signifikant stärker, was Chemo-Photothermale Synergie belegt. Konfokalbilder (Abb. 11) zeigen dispersierte Kerne mit DOX@NrGO, während Bestrahlung umfangreiche Zellablösung induziert. PI-Färbung (Abb. 12) offenbart erhöhte tote Zellen nach kombinierter Therapie, was den verstärkten zytotoxischen Effekt bestätigt.

Fazit

Zusammenfassend entwickelten wir einen einfachen, wasserlöslichen NHBP-modifizierten rGO mit robuster photothermaler Umwandlung und kolloidaler Stabilität. DOX-Beladung verleiht pH- und NIR-getriggerte Freisetzung, und das DOX@NrGO-System erzielt überlegene Chemo-Photothermale Tumorzellinhibition in vitro. Diese Ergebnisse demonstrieren das Versprechen von DOX@NrGO als vielseitige Plattform für Krebstherapie und andere biomedizinische Anwendungen.

Abkürzungen

CLSM

Confocal laser scanning microscopy (Konfokale Laserscanning-Mikroskopie)

DAPI

4′,6-Diamidino-2-phenylindol

DOX

Doxorubicin

DOX@NrGO

DOX-beladenes NrGO

FTIR

Fourier-Transform-Infrarot

GO

Graphenoxid

HBP

Hyperverzweigtes Polymer

MTT

Methylthiazolyltetrazolium

NHBP

Amin-terminiertes HBP

NIR

Nahinfrarot

NrGO

Amin-terminiertes hyperverzweigtes Polymer reduziertes Graphenoxid

PI

Propidiumiodid

PTT

Photothermale Therapie

rGO

Reduziertes Graphenoxid

SEM

Rasterelektronenmikroskopie

TEM

Transmissionselektronenmikroskop