Verbesserung der Magnetofektion magnetischer Polyethylenimin-Nanopartikel in MG-63-Osteoblasten mit einem neuartigen einheitlichen Magnetfeld

Hintergrund

Das Osteosarkom ist der häufigste bösartige Knochentumor, der hauptsächlich Kinder und Jugendliche betrifft. Da konventionelle Therapien nur begrenzte Verbesserungen bringen, ist eine neue Behandlungsstrategie zwingend erforderlich [1,2,3]. Das Aufkommen der Gentherapie hat Forscher dazu veranlasst, ihre Anwendungen bei Osteosarkomen zu bewerten [4,5,6]. Ein sicheres und wirksames Genliefersystem ist für die Gentherapie von entscheidender Bedeutung. Gen-Delivery-Systeme können in virale Gen-Delivery-Systeme und nicht-virale Gen-Delivery-Systeme unterteilt werden. Es wurde gezeigt, dass virale Genabgabesysteme eine hohe Transfektionseffizienz in einer Vielzahl von primären Zellen und Zelllinien aufweisen. Virale Gen-Delivery-Systeme sind stark mit Sicherheitsproblemen wie dem Auslösen von Entzündungsreaktionen und Genmutationen verbunden [7], was Forscher dazu veranlasst, ihre Studien auf nicht-virale Gen-Delivery-Systeme umzuleiten. Die meisten nicht-viralen Gentransfektionstechniken waren jedoch bei der Transfektion von Osteosarkom-Zelllinien nicht besonders effektiv [8, 9].

In den letzten zehn Jahren wurden verschiedene physikalische Methoden wie Genkanonen [10], Ultraschall [11] und Elektroporation [12] effizient zur Verbesserung der Transfektion eingesetzt. Diese physikalischen Methoden induzieren jedoch auch Zellschäden [13]. Da Magnetfelder im Allgemeinen keine Zellschäden verursachen, hat die Technologie der magnetisch unterstützten Transfektion die Aufmerksamkeit der Forscher auf sich gezogen. Mahet al. führten magnetische Nanopartikel in Gentransfektionsexperimenten ein, indem sie grün fluoreszierende Protein (GFP)-tragende rekombinante adeno-assoziierte Viren (rAAVs) mit magnetischen Nanopartikeln verbanden, um eine zielspezifische verstärkte Transfektion sowohl in vitro als auch in vivo zu erreichen. Im Vergleich zu reinen Adenoviren können magnetische Adenovirus-Nanopartikel die Dosierung der GFP-tragenden rAAVs bei gleicher Transfektionsratenbedingung auf 1 % reduzieren [14]. Schereret al. prägte den Begriff „Magnetofektion“, um die magnetvermittelte Transfektion mit magnetischen Partikeln zu bezeichnen [15]. Anschließend haben Plank et al. beschrieben die Technik der magnetischen Transfektion mit nicht-viralen Vektoren [16]. Um die Magnetofektionseffizienz von nicht-viralen Vektoren weiter zu verbessern, haben Fouriki et al. passten die Frequenz und Amplitude eines oszillierenden Magnetfelds an, um einen dynamisch-mechanischen stimulierenden Effekt auf magnetische Nanopartikel zu induzieren, wodurch die Wahrscheinlichkeit des Kontakts mit den Zielzellen erhöht wurde [17]. Oralet al. verbesserte Transfektionseffizienz und reduzierte Zytotoxizität von Genträgern durch umgekehrtes Drehen der hexagonalen Welle des Magneten, um die Geschwindigkeit und Richtung des Magnetfelds zu steuern [18]. In einer anderen Studie haben Vainauska et al. verwendeten ein dynamisches Gradienten-Magnetfeld, das durch Rotation eines zylindrischen Permanentmagneten erzeugt wurde, um die Abgabe magnetischer Genträger zu zielen [19].

Die Effizienz der Magnetofektion hat sich erheblich verbessert, da sich Magnetfelder von statisch und einzeln zu dynamisch und hochentwickelt entwickelt haben. Studien, die sich auf die Gleichmäßigkeit und den effektiven Bereich des Magnetfelds konzentrieren, sind jedoch begrenzt. Nach unserem besten Wissen können die meisten Magnetvorrichtungen keine einheitlichen Magnetfelder in einem bestimmten dreidimensionalen Raum bilden, was zu einer heterogenen Verteilung der magnetischen Nanopartikel führt, nur eine lokale Transfektionswirksamkeit des Magnetfelds erreicht und die resultierenden Zytotoxizitäten nicht anspricht. Ein ungleichmäßiges Magnetfeld behindert auch den Vergleich von magnetischen Transfektionsreagenzien und verringert die Transfektionseffizienz.

Um diese Probleme zu lösen, hat unsere Forschungsgruppe in Zusammenarbeit mit dem Electrical Engineering College der Chongqing University einen neuartigen Magnetfeldgenerator entwickelt [20, 21]. Der Magnetfeldgenerator kann in einer bestimmten Höhe ein gleichmäßiges Magnetfeld bilden und die zugegebenen magnetischen Nanopartikel werden schnell und gleichmäßig am Boden der Kulturplatte verteilt. Das gleichmäßige Magnetfeld eignet sich nicht nur für vergleichende Studien zur Beziehung zwischen Dosis und Transfektionseffizienz verschiedener Transfektionsreagenzien, sondern kann auch zur Bewertung der zellulären Aufnahme magnetischer Nanopartikel verwendet werden.

Im vorliegenden Design zielten wir darauf ab, ein zuverlässiges nicht-virales Gen-Delivery-System mit hoher Magnetofektionseffizienz in Osteosarkom-Zelllinien zu etablieren. Das lineare Polyethylenimin Mw20000 (PEI-20000) wurde für die Herstellung magnetischer Nanopartikel ausgewählt, da mehrere frühere Studien bestätigt haben, dass lineare PEI-Abgabesysteme in vivo eine bessere Transfektionseffizienz aufweisen als verzweigte PEI-Abgabesysteme [22, 23]. Die Eigenschaften von Polyethylenimin-modifizierten superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln (PEI-SPIO-NPs) wurden bewertet. Ein neuartiger Magnetfeldgenerator wurde entwickelt, um ein gleichmäßiges Magnetfeld zu erzeugen, das verwendet wurde, um PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe in MG-63-Osteosarkom-Zelllinien zu transfizieren. Die Auswirkungen verschiedener Magnetfelder auf die Magnetofektion wurden systematisch untersucht.

Methoden

Materialien und Reagenzien

Superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPIO-NPs), Polyethyleniminhydrochlorid (PEI) und Hoechst-33.324 wurden von Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) bezogen. PolyMag-200 (kommerzielles Magnetofektionsreagenz) wurde von Beijing Chief-East Tech Co., Ltd. (Qwbio) (Beijing, China) bezogen. 1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimid (EDC) und N -Hydroxysuccinimid (NHS) wurden von Chengdu Xiya Reagent Co. (Sichuan, China) bezogen. PolyMag-200 und 96-Well-Zellkultur-Magnetplatten wurden von Chemicell GmbH (Berlin, Deutschland) bezogen. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) und Penicillin-Streptomycin und fetales Rinderserum (FBS) wurden von Invitrogen-Gibco (CA, USA) bezogen. Rhodamin B-Isothiocyanat wurde von Aladdin Ind., Co. (Shanghai, China) erhalten. LysoTracker Green DND-26 wurde von Shanghai Wei Jin Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Das CCK-8-Testkit wurde von Seven Seas Biological Technology Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen, und das Endo-free Plasmid Maxi Kit-25 wurde von OMEGA (GA, USA) bezogen. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und andere Reagenzien wurden in unserem Labor hergestellt. Alle Lösungsmittel und Chemikalien waren von analytischer Qualität.

Synthese von PEI-SPIO-NPs

PEI-SPIO-NPs wurden wie zuvor beschrieben hergestellt [24]. Kurz gesagt, 0,1 g EDC und 0,5 g NHS wurden zu 15 ml carboxylmodifizierter SPIO-NPs wässriger Lösung (5 mg/ml, pH-Wert auf 5 eingestellt) gegeben, und die Lösung wurde 4–6 h bei Raumtemperatur gerührt, um die zu aktivieren Carboxyl von Eisenoxid-Nanopartikeln. Als nächstes wurde das gleiche Volumen wässriger Polyethyleniminhydrochlorid-Lösung (20 mg/ml) zugegeben, um mehrere Stunden lang zu reagieren. Die resultierende konjugierte PEI-SPIO-NPs-Lösung wurde unter Verwendung einer Dialysemembran (MWCO 20.000), eingetaucht in destilliertes Wasser für 2 Tage, dialysiert, um alle unkonjugierten PEI-Moleküle und Zwischenprodukte zu entfernen. Ein Aliquot der Nanopartikellösung wurde gefriergetrocknet und gelagert.

Synthese und Charakterisierung von PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen

Die Synthese von PEI-SPIO-NPs erfolgte wie oben beschrieben, PEI-SPIO-NPs und Plasmid-DNA (pDNA) wurden separat 10 min bei 37 °C vorgewärmt und dann bei unterschiedlichen N/P-Verhältnissen miteinander vermischt, um die herzustellen PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe. Die Morphologie der PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, CM100, Philips, Niederlande) gemessen und der hydrodynamische Durchmesser wurde durch dynamische Lichtstreuung gemessen (DLS, Nicomp 380, PSS, FL, USA) . Ihre magnetischen Eigenschaften von SPION und PEI-SPIO-NPs wurden mit einem EV-11 Vibrationsprobenmagnetometer (PPMS-9, Quantum Design, San Carlos, CA, USA) bei 300 K untersucht. Die Messungen wurden auf das Gewicht von Eisen in . normiert jede Probe, und die Messungen wurden durch ein optisches Emissionsspektrometer mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES) verifiziert.

Oberflächenladungen wurden durch Bestimmung des Zetapotentials unter Verwendung des dynamischen Lichtstreuungsinstruments (Malvern, Southborough, MA, USA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH =7,4) gemessen. Die PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe wurden in verschiedenen N/P-Molverhältnissen im Bereich von 2,5 bis 25 hergestellt, indem die PEI-SPIO-NPs-Lösung zur pDNA-Lösung zugegeben wurde, und die endgültige pDNA-Konzentration wurde auf 30 μg/ml eingestellt.

Die Komponenten der PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe wurden mit einem Rasterkraftmikroskop (IPC-208B, Chongqing University, Chongqing, China) nachgewiesen. Ein kleines, flockiges Metall, das als Träger für die Beobachtung verwendet wurde, wurde mit Aceton gewaschen und getrocknet. Dann wurden einige Tropfen der Antisense-Sondenprobe auf das Metall gegeben und luftgetrocknet. Die Oberflächenmorphologie der Probe wurde in einem großflächigen Scanbereich von 700 nm  ×  700 nm und 1000  × 1000 Pixel beobachtet. Die molekulare Struktur und Mikrostruktur der Probe wurden in einem kleinen Scanbereich von 9 nm × 9 nm und 800 × 800 Pixeln beobachtet. Die Originalbilddaten wurden an einen Computer übertragen und eine 3D-Rekonstruktion mit der G2DR-Software durchgeführt [25]. Die Messungen wurden für jede Gruppe dreimal wiederholt.

Die Mobilität von pDNA nach Bindung mit PEI-SPIO-NPs wurde durch Gelelektrophorese analysiert. Die N/P-Verhältnisse von PEI-SPIO-NPs/pDNA betrugen 1/5, 1, 5, 10, 15, 20, 25 und 30, wobei der DNA-Gehalt bei 3 μg gehalten wurde. Nach 15-minütiger Inkubation bei 37 °C wurden 10 μL der Mischungslösung durch 1 %-Agarose-Gelelektrophorese (90 V, 30 min) analysiert. Als Kontrolle wurde nackte pDNA verwendet.

Die Wirkungen von PEI-SPIO-NPs auf den Schutz von pDNA gegen DNase I wurden bewertet. PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe mit verschiedenen N/P-Verhältnissen und nackter pDNA (3 μg) wurden bei 37 °C in einem 5 %igen CO₂ . inkubiert subfeuchte Umgebung für 30 Minuten mit DNase I (4 U) in DNase/Mg ²⁺ Aufschlusspuffer bestehend aus 50 mM Tris-HCl (pH=7,6) und 10 mM MgCl₂ . Anschließend wurde DNase I durch Zugabe von EDTA-Lösung (pH =8,0) inaktiviert, bis die Endkonzentration 2,5 mM betrug. Anschließend wurde die Probe 15 min bei 65 °C inkubiert und 10 μL 1 mg/ml Natriumheparin zugegeben, um die pDNA aus PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen freizusetzen [26]. Die Integrität der pDNA wurde durch 1 %-Agarose-Gelelektrophorese (90 V, 30 Minuten) bestimmt.

Magnetfeld

Der neuartige Magnetfeldgenerator (Abb. 4) wurde von unserer Gruppe in Zusammenarbeit mit dem Electrical Engineering College der Chongqing University [20, 21] entwickelt. Wir haben das 3D-CAD-Bild verwendet, um die Magnetanordnung des gleichmäßigen Magnetfelds zu zeigen. Die XOY-Ebenenverteilung und die 3D-Verteilung des Magnetfelds in der interessierenden Region wurden angezeigt. Die Verteilung von PEI-SPION-NPs in verschiedenen Magnetfeldern wurde beobachtet, und ein ungleichmäßiges Magnetfeld (96-Well-Nd-Fe-B-Permanentplatte) wurde als Kontrolle verwendet.

Zellkultur

Die menschliche Osteosarkom-Zelllinie MG-63 (ursprünglich von der American Type Culture Collection) wurde vom Chongqing Engineering Research Center of Stem Cell Therapy (Chongqing, China) erhalten. Die Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, 100 E/ml Penicillin und 100 mg/ml Streptomycin, gehalten und bei 37 °C mit 5 % CO₂ . inkubiert und 95% relative Luftfeuchtigkeit.

In-vitro-Zytotoxizität

Die in vitro zytotoxischen Wirkungen verschiedener Nanopartikel mit oder ohne pDNA und der magnetisierten oder unmagnetisierten Nanopartikel auf die MG-63 Osteosarkomzellen wurden mit dem CCK-8 Testkit bestimmt. Die Zellen wurden in 96-Well-Kulturplatten mit einer Dichte von 4 × 10 ³ . ausgesät Zellen pro Vertiefung und verschiedene Nanopartikel wurden hinzugefügt und für 24, 48, 72 und 96 h inkubiert. CCK-8-Lösung (10 % des Kulturmediums) wurde zu voreingestellten Zeitpunkten in jede Vertiefung gegeben und die Zellen wurden weitere 2 h kultiviert. Die optische Dichte der Zellen wurde mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 450 nm bewertet, wobei der Absorptionswert die hohe Lebensfähigkeit der Zellen widerspiegelt; die Beobachtung einer hohen Lebensfähigkeit weist darauf hin, dass Nanopartikel geringe zytotoxische Wirkungen haben. Als Positivkontrolle wurden PolyMag-200/pDNA und PolyMag-200 verwendet. Um die Toxizitätswirkung verschiedener Magnetfelder auf Zellen zu untersuchen, wählten wir PEI-SPIO-NPs (ohne pDNA) als Genvektoren aus und untersuchten die optische Dichte von Zellen, die zu verschiedenen Zeitpunkten mit unterschiedlichen Magnetfeldern interveniert wurden.

Konfokale Mikroskopie-Analyse

Die Aufnahme von PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen oder Polyethylenimin-Nanopartikeln (PEI-NPs) wurde durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie beobachtet. MG-63-Osteosarkomzellen wurden in 24-mm-Glasschalen mit einer Dichte von 3 × 10 ⁵ . ausgesät pro gut. Rhodamin-B-Isothiocyanat (RBITC)-markierte PEI-SPIO-NPs/pDNA (3 μg)-Komplexe wurden zu den Zellen gegeben und 30 Minuten lang unter Einwirkung eines gleichmäßigen Magnetfelds oder eines ungleichmäßigen Magnetfelds inkubiert; RBITC-markierte PEI-NPs/pDNA-Komplexe wurden den Zellen ohne Einwirkung eines Magnetfelds zugesetzt. Die Zellen wurden dann sofort zweimal mit PBS (0,01 M) gewaschen, um alle freien RBITC-markierten PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe oder RBITC-markierten PEI-NPs/pDNA-Komplexe zu entfernen, und die behandelten Zellen wurden 6–24 h lang inkubiert . Das Medium wurde 6, 12 und 24 h nach der Transfektion entfernt und die Zellkerne wurden mit Hoechst 33342 für 5 min gefärbt. Nach Entfernung des Hoechst 33342-Restes wurden die Zellen in vorgewärmtem Medium mit 0,5 mM LysoTracker Green DND-26 für 1 h inkubiert und dann zweimal mit vorgewärmtem PBS gewaschen. Die Zellen wurden unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (LSM 700, Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland) mit einem × 40-Objektiv abgebildet, um die Fluorochrome mit den folgenden Anregungs- (Ex) und Emissionswellenlängen (Em) [GFP (Beispiel:488 nm .); Em:530 nm), Hoechst (Beispiel:350 nm; Em:460 nm), LysoTracker Green (Beispiel:443 nm; Em:505 nm) und RBITC (Beispiel:554 nm; Em:576 nm)] [27 ].

Durchflusszytometrie-Analyse

MG-63-Zellen wurden in 12-Well-Platten ausgesät (1 × 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung) für 24 h, danach wurden sie vor der Transfektion zweimal mit PBS gespült und 1 h mit 0,8 ml Opti-MEM-Medium bei 37 °C vorinkubiert. Die PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe (N/P = 10) oder PEI-NPs/pDNA-Komplexe (N/P = 10) mit 3 μg pDNA wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Zellkulturplatten wurden in die einheitliche oder ungleichmäßiges Magnetfeld für 20 Minuten. Als Positivkontrollen wurde PolyMag-200/pDNA verwendet. Nach 4 h wurden die Zellen dreimal mit 1 ml PBS (0,01 M) gespült, um alle freien PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe oder PEI-NPs/pDNA-Komplexe zu entfernen, und die Zellen wurden weitere 24 h kultiviert. Nach der Inkubation wurden die Zellen gesammelt und mittels Durchflusszytometrie (BD FACS Canto II, BD Biosciences, San Jose, CA, USA) auf Transfektionseffizienz bewertet. Dieser Teil des Experiments wurde dreimal wiederholt.

Statistische Analyse

Quantitative Daten wurden in dreifacher Ausfertigung (n = 5) und als mittlere  ± Standardabweichung ausgedrückt. Statistische Analysen wurden mit Einweg-ANOVA für Mehrfachvergleiche und dem t . des Schülers durchgeführt Test zum Intergruppenvergleich. A P Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse und Diskussion

Prinzip der Magnetofektion

Magnetofektion ist definiert als Vektoren, die mit superparamagnetischen Nanopartikeln assoziiert sind und sich durch Anlegen magnetischer Gradientenfelder auf den Zielzellen anreichern [15]. Abbildung 1 zeigt die Komponenten und Morphologie von PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen und das Hauptprinzip der Magnetofektion. Eine langsame Vektorakkumulation und folglich eine niedrige Vektorkonzentration in Zielgeweben wurden als einfache, aber starke Barrieren für eine effektive Genabgabe identifiziert [28]. Der wichtigste wirkungssteigernde Mechanismus der Magnetofektion scheint die schnelle Sedimentation der vollen Vektordosis auf den Zielzellen zu sein, so dass bis zu 100 % dieser Zellen innerhalb weniger Minuten Vektorpartikel an ihre Oberfläche gebunden haben. Somit ist die Magnetofektion ein geeignetes Werkzeug, um die starke Barriere der langsamen Vektorakkumulation und folglich der niedrigen Vektorkonzentration im Zielgewebe zu überwinden. PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe sind zufällig und können in Abwesenheit eines Magnetfelds in den Zielzellen nur begrenzt und zeitaufwändig abgelagert werden. Nichtsdestotrotz kann der PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplex die Zielzellen in relativ kurzer Zeit in Gegenwart eines Magnetfelds breit und gleichmäßig berühren, was die Wahrscheinlichkeit einer endozytischen Aufnahme in der Einheitsfläche der Zellen erhöhen kann, um verbessern die Verwertungsrate des PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexes und steigern die Transfektionseffizienz.

Überblick über die Magnetofektion mit PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplex. Ausgekleidetes Polyethylenimin (LPEI) und superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPIO-NPs) sind durch die Reaktion der Dehydratisierungskondensation verbunden. Dazu wurden SPIO-NPs mit LPEI beschichtet, d.h. das LPEI ist fest an die Oberfläche von SPIO-NPs gebunden und sie bilden zusammen PEI-SPIO-NPs. Wenn PEI-SPIO-NPs mit nackter pDNA gemischt werden, bindet negativ geladene pDNA über elektrostatische Adsorption an positiv geladene PEI-SPIO-NPs. Zellen werden mit den PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen in Gegenwart eines Magnetfelds inkubiert, das die Komplexe zu den Zellen hin anzieht. Das Ergebnis der Magnetofektion ist, dass im Wesentlichen alle Zellen mit Vektoren in Kontakt kommen und ein hoher Prozentsatz der Zellen schnell transfiziert wird

Charakterisierung von PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen

Abbildung 2a zeigt, dass die PEI-SPIO-NPs ungefähr kugelförmig sind und PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe aggregiert erscheinen, beide haben eine günstige Dispergierbarkeit, und die Anziehung zwischen positiven und negativen Ladungen macht PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe in der Lage, eine kleine Größe. Die Hystereseschleife von PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen ist in Abb. 2b gezeigt. Der Gewichtsprozentsatz von Eisenoxid in PEI-SPION-NPs, gemessen mit einem Atomabsorptionsspektrometer, beträgt 20,33(± 2,87) %. Die Sättigungsmagnetisierung der PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe betrug 21,5 (± 1,6) emu/g Eisen. Trotz der reduzierten magnetischen Eigenschaften im Vergleich zu den unmodifizierten superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln zeigten PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe eine ausgezeichnete magnetische Reaktionsfähigkeit, die für eine hocheffiziente Magnetofektion erforderlich ist.

Eigenschaften von PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen. a TEM von PEI-SPIO-NPs und PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen. b Hystereseschleifen von SPIO-NPs und PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen. c Zetapotential und hydrodynamischer Durchmesser von PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen bei verschiedenen N/P-Verhältnissen. d AFM-Graustufenbild und die molekulare Struktur der PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe. Rote Punkte stellen die Position der chemischen SPIO-Gruppe dar, die grünen Punkte zeigen Stickstoffatome an, gelbe Punkte bedeuten Kohlenstoffatome und das Phosphoratom wird durch einen weißen Kreis schwarzer Punkt dargestellt. e (a) Größenverteilung von PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen und e (b) Zeta-Potential von PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen, gemessen mit einem Malvern Zetasizer dynamisches Lichtstreugerät. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD (n = 5)

Hydrodynamischer Durchmesser und Zetapotential galten als unverzichtbare Parameter von Genträgern. Abbildung 2c zeigt, dass der hydrodynamische Durchmesser von PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen 200 (± 21,7) nm mit einem N/P-Verhältnis (NH₂ .) betrug —Gruppe in PEI / PO₄ -Gruppe in pDNA) von 2,5 und 175 (± 16,4) nm bei einem N/P-Verhältnis von 5, was darauf hinweist, dass die schnelle Größenänderung während des Übergangs des Potentials von negativ zu positiv auftrat. Danach nahmen die Abstoßungskräfte zwischen den PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen mit höheren N/P-Verhältnissen zu, was darauf hindeutet, dass die Größe der Nanopartikel zugenommen hatte.

Wir analysierten die Arten chemischer Bindungen nach der Anordnung der Atome und spekulierten weiter über die molekulare Struktur von PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen. Die Molekülstruktur von PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen wurde indirekt durch Rasterkraftmikroskopie (AFM, Abb. 2d) offenbart, die zeigte, dass die Carboxylgruppen von superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln mit dem primären Amin von PEI durch die Amidbindung kombiniert wurden. Darüber hinaus wurde die pDNA durch elektrostatische Bindung zwischen den Phosphatgruppen der Nukleotidkette und den Amingruppen von PEI in eine PEI-Molekülkette eingewickelt, wodurch PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe gebildet wurden. Im AFM-Graustufenbild repräsentiert der rote Punkt die Position der Eisenatome, der grüne Punkt zeigt Stickstoffatome an, die gelben Punkte bedeuten Kohlenstoffatome und das Phosphoratom wird durch einen weißen Kreis mit einem schwarzen Punkt dargestellt.

Wie in Abb. 2e gezeigt, wurde das Potenzial von PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen mit dem dynamischen Lichtstreuungsinstrument nachgewiesen. Bei pH =7 betrug das Potenzial der superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikel (SPIO-NPs) − 6,6 (± 1,1) mV, was auf das Vorhandensein von Carboxylgruppen an ihrer Oberfläche hinweist. Das Potenzial von PEI-SPIO-NPs betrug + 18,2 (± 1,5) mV. Das Potenzial von mit SPIO-NPs modifiziertem PEI wurde in eine positiv geladene Oberfläche umgewandelt, die als Genträger verwendet werden könnte, der sich mit negativ geladener pDNA verbindet. Wir untersuchten die Änderung der Oberflächenladungen von PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen bei verschiedenen N/P-Verhältnissen. Die PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe zeigten selbst bei einem niedrigen N/P-Verhältnis von 2,5 eine negative Oberflächenladung, die sich mit zunehmendem N/P-Verhältnis auf 5 allmählich in eine positive Oberflächenladung überführte. Dieser Anstieg der N/P-Verhältnisse in PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen führte zu einer Erhöhung der positiven Oberflächenladung von Polyplexen. Bei einem N/P-Verhältnis von 10 betrug das Potenzial der PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe (N/P = 10) + 11.9 (± 1.2) mV, und die Oberflächenladung erreichte ein Plateau. Die positiv geladenen Komplexe kamen in Kontakt mit der negativ geladenen Zellmembran und ermöglichten die zelluläre Aufnahme der komplexierten Nanopartikel [29]. PEI-SPIO-NPs können nicht nur als Genträger von negativ geladener pDNA verwendet werden, sondern tragen auch einen gewissen Magnetismus für die gezielte Wirkstoffabgabe bei und werden zum Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie (MRT) Kontrastbildgebung [30, 31] .

Eine grundlegende Anforderung an Genträger ist, dass der Transfektionsträger mit Nukleinsäuren effizient einen stabilen Komplex bilden muss. Um seine Bindungsfähigkeit zu bewerten, wurden ähnliche Volumina von PEI-SPIO-NPs-Lösung und pDNA-Lösung bei unterschiedlichen N/P-Verhältnissen gemischt und gevortext. Ein 10-μl-Aliquot der Mischung wurde dann durch Agarosegelelektrophorese analysiert (Abb. 3a). Im Gegensatz zu nackter pDNA wurde die Migration des Plasmids bei einem N/P-Verhältnis von 5 vollständig blockiert, was darauf hindeutet, dass die PEI-SPIO-NPs die pDNA vollständig konzentrierten [32].

Der pDNA-Bindungstest und der pDNA-Schutztest von PEI-SPIO-NPs. a Agarosegelelektrophorese von PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen bei verschiedenen N/P-Verhältnissen. b Elektrophoretische Mobilitätsanalyse von PEI-SPIO-NPs/pDNA nach DNase-I-Behandlung. PEI-SPIO-NPs mit verschiedenen N/P-Verhältnissen und pDNA (3 μg) wurden bei 37 °C in einem 5 %igen CO₂ . inkubiert subfeuchte Umgebung für 30 Minuten mit DNase-I (4 U) in DNase/Mg ²⁺ Aufschlusspuffer bestehend aus 50 mM Tris-HCl (pH = 7.6) und 10 mM MgCl₂ . Anschließend wurde DNase I durch Zugabe von EDTA-Lösung (pH =8) inaktiviert, bis die Endkonzentration 2,5 mM betrug. Die Probe wurde dann für 15 Minuten bei 65 °C inkubiert und 10 μL 1 mg/ml Natriumheparin wurden hinzugefügt, um pDNA aus PEI-SPIO-NPs/pDNA freizusetzen. Die Integrität der pDNA wurde durch 1 % Agarosegelelektrophorese (90 V, 30 min) bestimmt

Ein weiteres Merkmal von PEI-SPIO-NPs als potentielle Genträger besteht darin, dass sie pDNA vor dem Abbau durch Nukleasen schützen könnten und dadurch die Transfektion begünstigen. Abbildung 3b zeigt, dass nackte pDNA durch DNase-I signifikant abgebaut wird. Die PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe bei einem N/P-Molverhältnis < 5 wurden vollständig verdaut, während die aus den PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexen freigesetzte pDNA (N/P = 5:1) intakt blieb. Die Ergebnisse dieser DNase-I-Schutz-Assays zeigten, dass die PEI-SPIO-NPs pDNA effektiv vor dem DNase-I-Verdau schützten, was auf ihre potentiellen Anwendungen in der Gentherapie schließen lässt.

Wie oben gezeigt, konnten PEI-SPIO-NPs pDNAs nicht vor Nukleaseabbau schützen, wenn N/P <5 war. Die Größen der PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe nahmen zu, wenn N/P>   10 war, was für den Vektortransport ungeeignet war [33, 34]. Die Größe der PEI-SPIO-NPs/pDNA-Komplexe war am kleinsten und zeigte Stabilität bei N/P =  5. Darüber hinaus erhöhte sich das Zeta-Potential der PEI-SPIO-NPs nicht signifikant, wenn N/P> 10. Um die Stabilität von PEI-SPIO-NPs/pDNA zu gewährleisten, wurde für die nachfolgenden Experimente ein N/P-Verhältnis von 10 gewählt.

Erzeugung eines Magnetfelds

Der neuartige Halbach-Magnetfeldgenerator (Abb. 4a, b) wurde von unserer Gruppe in Zusammenarbeit mit dem Electrical Engineering College der Chongqing University [20, 21] entwickelt. Der neuartige Magnetfeldgenerator besteht aus neun identischen quaderförmigen Permanentmagnetmodulen und zwei passiven Shimmingblechen (Abb. 4c), die in der horizontalen Ebene ein sehr gleichmäßiges Magnetfeld erzeugen.

Die Magnetfeldgeneratoren und deren Magnetfeldhomogenität und PEI-SPIO-NPs verteilen sich auf die unterschiedlichen Magnetfelder. a Messung der Magnetfeldhomogenität mit Graussmeter. b Generator für gleichförmiges Magnetfeld. c 3D-Bild der Magnetanordnung eines gleichmäßigen Magnetfeldgenerators (wobei jeder Magnet eine Größe von 40 × 40 × 200 mm ³ . hat ). d 96-Well-Magnetfeldgenerator. e Gleichmäßigkeit des Magnetfelds des 96-Well-Magnetfeldgenerators. f Gleichmäßigkeit des Magnetfelds des Generators für ein gleichmäßiges Magnetfeld. g Verteilung von PEI-SPIO-NPs im 96-Well-Magnetfeld. h Verteilung von PEI-SPIO-NPs im gleichförmigen Magnetfeld. ich Die Verteilung des gleichmäßigen Magnetfelds in der XOY-Ebene (50 mm × 50 mm) und j 3D-Verteilung des gleichmäßigen Magnetfelds

Die optimierende Magnetstruktur kann ein Magnetfeld erzeugen, das sich in der horizontalen Richtung des 50 mm  ×  50 mm-Bereichs in der YOZ-Ebene flach verteilt. Die Steigung wird in vertikaler Richtung mit einer Steigung von 2 mT/mm verteilt. Das Magnetfeld ist gleichmäßig in einem XOY-Bereich von 50 mm × 50 mm mit einer Gleichmäßigkeit von 1,3 × 10 ^–3 . verteilt und einem Magnetfeld von 0,0739 T betragen die magnetischen Stärken der Koronarebene und der Sagittalebene, wo die Zellkulturplatte platziert wurde, 0,0632 T bzw. 0,07 T. Der Gleichmäßigkeitsunterschied jeder Vertiefung in der 96-Well-Zellkultur-Magnetplatte betrug ungefähr 80 % (Abb. 4d, e). Der Gleichförmigkeitsunterschied jeder Mulde im neuartigen Halbach-Magnetfeld ist jedoch kleiner als 2‰, sodass der Gleichmäßigkeitsunterschied zwischen den beiden Magnetfeldern> 100-fach ist (Abb. 4f). In diesem Fall haben wir eine 96-Well-Zellkultur-Magnetplatte als ungleichmäßiges Magnetfeld eingestellt, und das neuartige Halbach-Magnetfeld ist ein relativ gleichmäßiges Magnetfeld, das als experimentelles Werkzeug für nachfolgende Studien verwendet wurde.

Die Verteilung der PEI-SPIO-NPs wurde durch das Magnetfeld signifikant beeinflusst. PEI-SPIO-NPs sanken aufgrund der Schwerkraft allmählich und wurden in Abwesenheit des Magnetfelds zufällig verteilt. Beim Anlegen eines Magnetfelds sanken PEI-SPIO-NPs schnell auf den Boden der Platten. Darüber hinaus könnte die Verteilung auch in unterschiedlichen Magnetfeldern deutlich verändert werden. Im herkömmlichen nicht gleichförmigen Magnetfeld (96-Well-Zellkultur-Magnetplatte) wurden PEI-SPIO-NPs zu Massen oder Bändern gesammelt und entlang der magnetischen Kraftlinien verteilt (Abb. 4g). Die PEI-SPIO-NPs waren jedoch gleichmäßig in dem gleichmäßigen Magnetfeld verteilt, das durch den neuartigen Magnetfeldgenerator induziert wurde (Abb. 4h). Wie aus der XOY-Ebenenverteilung und der 3D-Verteilung des Magnetfelds (Abb. 4i, j) ersichtlich ist, ist der rote Bereich in der Abbildung ein relativ gleichmäßiges Magnetfeld mit einer Gleichmäßigkeit von etwa zwei Tausendstel (Z  = 10 mm), and it can be seen that the gradient of the magnetic field in the target region is about 1.3 t/m (130 G/cm). The magnetic field generated in the designated area could obtain a good flat property in the horizontal direction by adjusting the arrangement of the magnet module and changing the magnetization direction of the magnet module.

Assessment of In Vitro Cytotoxicity

We used CCK-8 kits to evaluate the effects of magnetization, magnetic field, and pDNA on the cytotoxicity of nanoparticles. Figure 5a shows that with the prolongation of culture time, the absorbance values increased in all the groups except for the PolyMag-200/pDNA groups. The absorbance values of PEI-SPIO-NPs/pDNA group were higher than that of PEI-NPs/pDNA group and PolyMag-200/pDNA group (P  < 0.05) and lower than that of the control group (P  > 0.05), suggesting that the cytotoxicity of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes is lower than unmagnetized PEI-NPs/pDNA complexes and PolyMag-200/pDNA complexes. Figure 5b shows the negative effects on the absorbance values caused by the uniform and non-uniform magnetic fields. The negative effect caused by the uniform magnetic field was smaller than that caused by the non-uniform magnetic field (P < 0,05). As shown in Fig. 5c, the absorbance values of nanoparticles without pDNA is significantly lower than that of nanoparticles with pDNA (P  < 0.05), which meant nanoparticles added with pDNA have low cytotoxicity effect to Mg-63 osteoblasts.

Comparison of cytotoxicity effects of the uniform magnetic field and non-uniform magnetic field, PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, PolyMag-200/pDNA complexes and PEI-NPs/pDNA complexes, and different nanoparticles with pDNA and without pDNA on MG-63 osteoblasts. Cytotoxicity is detected by the CCK-8 test kit, the absorbance was measured at a wavelength of 450 nm, which reflects the cell viability, and the high viability is indicative of the low cytotoxicity. The results are expressed as the mean ± SD (n  = 5, one-way ANOVA, *P < 0,05, **P < 0.01). a The cytotoxicity effects of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, PolyMag-200/pDNA complexes and PEI-NPs/pDNA complexes on MG-63 osteoblasts. b The cytotoxicity effects of the uniform magnetic field and non-uniform magnetic field on MG-63 osteoblasts and c the cytotoxicity effects of different nanoparticles with pDNA and without pDNA

Although PEI is an efficient transfection reagent, its cytotoxicity is strongly and positively correlated with its transfection efficiency and the mechanism of cytotoxicity caused by PEI is not very clear [35]. The present study found that during transfection, PEI increases the permeability of the cell membrane and damages the integrity of the mitochondrial and nuclear membranes [36, 37]. Sonawane et al. [38] reported that PEI25K promotes the release of mitochondrial protons and inhibits the electron transport chain in a dose- and time-dependent manner, indicating that PEI induces cell apoptosis. Another study showed that PEI induces cell autophagy, which is closely related to cytotoxicity [39]. The cytotoxicity of magnetized PEI decreased, and this might be attributable to the surface carboxyl groups of superparamagnetic iron oxide nanoparticles, which are negatively charged, thus partly neutralizing the positive charge of the PEIs and decreasing the chances of incurring irreversible damage. The non-uniform magnetic field induced PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes to gather into masses or bands, and be distributed along with the lines of magnetic force (Fig. 4b), thereby causing severe damage to parts of the cell membrane and even cell death due to the excessively high number of positive charges [40]. In contrast, PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes were uniformly distributed across the uniform magnetic field, thereby decreasing the accumulation of positive charges and reducing the cytotoxicity.

Nanoparticles added with pDNA have low cytotoxicity effect to Mg-63 osteoblasts than nanoparticles without pDNA; this may be attributed to the negatively charged pDNA partially neutralize the surface positive potential of the cationic nanoparticles at the beginning of magnetofection progress. Moghimi SM et al. concluded that PEI-induced cellular toxicity could been defined as a two-stage process, with the first stage taking place within 30 min of PEI uptake [41]. Stage-one toxicity has been defined as necrosis that is based on compromise of cell membrane integrity mediated by PEI binding to negatively charged plasma membrane proteoglycans, with highly cationic NPs being extremely cytotoxic [42]. After internalized by MG-63 osteoblast, different nanoparticles exhibits similar cytotoxic mechanisms, internalization leads to proton buffering, osmotic pressure, and eventual lysis of lysosomal membranes, releasing hydrolytic enzymes and other lysosomal constituents into the cytoplasm [43].

Cellular Uptake of PEI-SPIO-NPs/pDNA Complexes

To better understand the intracellular distribution of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes or PEI-NPs/pDNA complexes and the relationship between intracellular uptake of complexes and transfection efficiency, a laser scanning confocal microscope was used to trace the magnetized RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes and non-magnetized RBITC-PEI-NPs/pDNA complexes during transfection of MG-63 cells. LysoTracker Green D26 is a specific marker for lysosomes, and Hoechst 33342 specifically stains nuclei. Overlapping green and red fluorescence, which yields yellow fluorescence, represents colocalization and indicates entrapment of polyplexes in lysosome.

Figure 6 shows that extensive co-localization was observed at 6 h post-transfection, which indicates that most of the complexes were entrapped in endosomes. The RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group showed a higher frequency of co-localization than the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field group and the RBITC-PEI-NPs/pDNA group (arrow). At 12 h post-transfection, most of the red fluorescence had already translocated from the green fluorescence of lysosomes to the surrounding blue fluorescence of nuclei, and some green fluorescence of gene expression was visible in the cytoplasm, which indicated that most complexes escaped the endosomes via the proton sponge effect [44, 45] (arrow). The fluorescent signals of the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group were more distinct than those of the RBITC-SPIO-PEI-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field group and the RBITC-PEI-NPs/pDNA group. It was interesting that the cytoplasm emitted green fluorescence in the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group, which indicated expression of GFP, thereby illustrating the proton sponge effect that facilitates gene expression. At 12 h post-transfection, some nuclei emitted red fluorescence in the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group, indicating that complexes had been transported into nuclei, which may be attributable to the mechanical effect of magnetofection (arrow). At 24 h post-transfection, the green fluorescence in the cytoplasm showed maximal levels, the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + uniform magnetic field group showed more intense green fluorescence than the RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA + non-uniform magnetic field and the PBITC-PEI-NPs group (arrow). The affiliated magnetic field enabled the magnetic nanoparticles to attach rapidly to the cell membrane and accelerate intracellular uptake of magnetic nanoparticles. By contrast, up to 100% of these cells will have vector particles bound to their surfaces within a few minutes in the presence of the novel uniform magnetic field; more vectors adherence leads to a greater probability of cellular uptake, and transfection efficiency is positively correlated with uptake capability [46].

Intracellular tracking of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes in the presence of uniform magnetic field (uniform MF) or non-uniform magnetic field (non-uniform MF) and PEI-NPs/pDNA complexes without magnetic field (No MF) at 6, 12, and 24 h post-transfection to MG-63 osteoblasts. Confocal images were obtained from three channels and overlaid:red indicates RBITC-PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes (excitation:554 nm; emission:576 nm), green represents lysosomes stained with Lysotracker-DND26 and the homogeneous green in the cytoplasm implies GFP expression (excitation:443 nm; emission:505 nm), blue signifies the nuclei stained by the Hochest 33342. (excitation:359 nm; emission:461 nm)

In Vitro Transfection

Because PEI-SPIO-NPs are endowed with promising attributes such as pDNA condensation ability and high cell viability, we next used it as a gene carrier to determine the role of novel uniform and non-uniform magnetic fields on transfection efficiency. To evaluate the effectiveness of magnetofection, we selected the MG-63 osteosarcoma cell line as target cells and used GFP-pDNA as the reporter gene.

GFP expression was observed by inverted fluorescence microscopy at 24 h post-transfection. Figure 7a shows that the PEI-SPIO-NPs/pDNA group yielded significantly higher transfection efficiencies than the PEI-NPs/pDNA group in the presence of the uniform or non-uniform magnetic field, which is obvious in the uniform magnetic field group (P  < 0.05), the transfection efficiency of the uniform magnetic field group was 42.1%, which is roughly two times higher than that of the non-uniform magnetic field group. Although PolyMag-200/pDNA showed high transfection efficiency and has been confirmed to transfect most adherent cell lines, it is also highly cytotoxic. The cells were collected for flow cytometry at 48 h post-transfection (Fig. 7b), and the statistical analysis results were in agreement with the findings from fluorescence microscopy (Fig. 7c).

MG-63 osteoblasts transfected with PEI-SPIO-NPs/pDNA or PEI-NPs/pDNA under the condition of no magnetic field, non-uniform magnetic field, or uniform magnetic field. GFP-pDNA was used for reporter gene in combination with PEI-NPs or PEI-SPIO-NPs (N/P = 10), and the cells were exposed to the non-uniform or uniform magnetic fields for 20 min. At 24-h post-transfection, cell images were captured under an inverted fluorescent microscope. PolyMag-200 comprise commercial magnetic transfection reagents that were used as positive control, naked pDNA was used as the negative control. a At × 40 magnification in an inverted fluorescent microscope. b Transfection efficiency was calculated by flow cytometer and c statistical analysis of the transfection efficiency of PEI-SPIO-NPs/pDNA group, PolyMag-200/pDNA group and PEI-NPs/pDNA group. The results are expressed as the mean ± SD (n  = 5, one-way ANOVA, *P < 0,05, **P  < 0.01)

The mechanism underlying the increase in transfection efficiency by magnetofection is currently unclear. Previous studies have demonstrated that magnetofection does not involve magnetic nanoparticles being pulled directly into the cells by the magnetic field, magnetic nanoparticles enter cells via endocytosis and remain intact upon cellular uptake [47]. The observed significant increase in transfection efficiency may be due to the synergistic effect of accelerated sedimentation and fast internalization [48, 49]. The number of magnetic complexes that enter each cell apparently influences pDNA content. Although genes must still escape endosomes before transcription, transfection efficiency is positively correlated with uptake capability [50], branched PEIs showed a higher uptake rate. However, once inside the cell, lysosomal escape becomes the key to transfection, especially with higher N/P ratios, and linear PEIs showed higher rates of lysosomal escape [51,52,53]. Because of the magnetic force, PEI-SPIO-NPs can quickly come in close contact with cell membranes, which to some extent, increases the uptake capability of complexes. Once the complexes are inside the cell, PEIs provide a structural advantage and facilitate timely release of pDNA, which is eventually expressed by the cells.

Schlussfolgerungen

The novel magnetic field generator has been developed to induced a uniform magnetic field, in which the PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes are rapidly and uniformly distributed on the surface of MG-63 osteoblasts, thereby averting local transfection and decreasing disruption of the membrane caused by centralization of positively charged PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes, ultimately resulting in an increase in the effective coverage of the magnetic gene carriers during transfection, and improving magnetofection efficiency. This innovative uniform magnetic field could be used to determine the optimal amount of PEI-SPIO-NPs and pDNA, and screen for the optimal formulation design of a magnetic gene carrier under homogeneous conditions. Most importantly, the novel uniform magnetic field facilitates the transfection of PEI-SPIO-NPs/pDNA complexes into osteoblasts, which provides a novel approach for the targeted delivery of therapeutic genes to osteosarcoma tissues and serves as a reference for the treatment of other tumors. However, a series of comprehensive studies are warranted to establish the therapeutic potential of PEI-SPIO-NPs that are integrated into a novel uniform magnetic field in combating osteosarcoma.

Abkürzungen

AFM:

Atomic force microscopy

CLSM:

Confocal laser scanning microscopy

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

DMEM:

Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium

EDC:

1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino) propyl] carbodiimide

FBS:

Fötales Rinderserum

GFP:

Green fluorescent protein

ICP-OES:

Inductively coupled plasma optical emission spectrometer

MF:

Magnetic field

MG-63:

Human osteoblasts

MRT:

Magnetresonanztomographie

MWCO:

Molecular weight cut off

NHS:

N -hydroxy succinimide

PBS:

Phosphate-buffered saline

pDNA:

Plasmid DNA

PEI:

Polyethylenimine

PEI-NPs:

Polyethylenimine nanoparticles

PEI-SPIO-NPs:

Polyethylenimine modified superparamagnetic iron oxide nanoparticles

RBITC:

Rhodamine B isothiocyanate

SPIO-NPs:

Superparamagnetic iron oxide nanoparticles

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

VSM:

Vibrations-Probenmagnetometer