Dual Stimuli-getriggerte Nanogele als Reaktion auf Temperatur- und pH-Änderungen zur kontrollierten Wirkstofffreisetzung

Einführung

Stimuli-responsive Nanocarrier wurden allgemein als Drug-Delivery-Systeme für Therapie, Bildgebung und Diagnostik entwickelt [1, 2]. In letzter Zeit wurden verschiedene Stimuli, einschließlich pH, ​​Temperatur, Biomoleküle, Redox, Magnetfeld und ultraviolettes Licht verwendet, um eine anhaltende oder kontrollierte Wirkstofffreisetzung über eine interne oder externe Aktivierung zu induzieren [3,4,5,6]. Unter diesen Stimuli sind der pH-Wert und die Temperatur die bekanntesten Modalitäten in Arzneimittelabgabe- und Freisetzungssystemen. Poly-N -Isopropylacrylamid (PNIPAM) ist ein repräsentatives temperaturempfindliches Polymer, das in Arzneimittelreservoirs und Freisetzungssystemen verwendet wurde. Dieses wärmeempfindliche Polymer hat die Fähigkeit, sein Phasenverhalten zu ändern, zeigt einen gequollenen Zustand aufgrund von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Wasser und funktionellen Amidgruppen bei der unteren kritischen Lösungstemperatur (LCST) und zeigt umgekehrt eine Schrumpfung des Polymernetzwerks durch hydrophobe Wechselwirkungen oberhalb der LCST [7,8,9]. Darüber hinaus kann die LCST im Allgemeinen durch das Komplexierungsverhältnis von Acrylsäure (AAc) oder Acrylamid gekoppelt mit PNIPAM gesteuert werden [10, 11]. Insbesondere kann AAc zwei Phasenübergänge vollziehen, wenn die LCST zu höheren Temperaturen verschoben wird [12, 13]. PNIPAM-co-AAc-Nanogele beginnen aufgrund hydrophober Wechselwirkungen oberhalb der LCST zu schrumpfen [14, 15]. Die Deprotonierung von Carboxylgruppen in AAc verursacht jedoch eine Zunahme des Nanogeldurchmessers aufgrund der interelektronischen Abstoßung und des erhöhten osmotischen Drucks [16,17,18].

PNIPAM-vermittelte Arzneimittelabgabesysteme wurden für verschiedene Anwendungen in biomedizinischen Bereichen entwickelt. Temperatur- oder pH-empfindliche PNIPAM-Nanogele wurden verwendet, um den Prozess der Wirkstoffadsorption und -abgabe aufgrund der reversiblen Phasenübergangseigenschaft zu optimieren [19,20,21,22]. Insbesondere wurde berichtet, dass pH-Werte in verschiedenen Geweben für die orale Verabreichung in Betracht gezogen werden, obwohl es innerhalb verschiedener Gewebe subtilere Veränderungen gibt [23,24,25,26]. Bis heute haben die intelligenten Biomaterialien, die unter mehreren Stimuli, wie pH und Temperatur, eine kooperative Reaktion erzeugen können, Vorteile gegenüber solchen Systemen gezeigt, die auf einen einzelnen Stimulus empfindlich reagieren [27,28,29]. Die durch die Temperaturempfindlichkeit induzierte Änderung der Hydrophilie, die so angepasst werden kann, dass sie beim Umgebungs-pH spontan auftritt, kann zusammen mit dem LCST-Verhalten der Copolymere und Gele auch eine wichtige Rolle bei der pH-Empfindlichkeit spielen.

β-Lapachon (β-LP), ein Naturstoff, zeigte die therapeutische Wirkung bei der Krebsbehandlung [30]. In der Biomedizin wurden die funktionalisierten Träger von β-LP mit dem Ziel entwickelt, seine toxischen Wirkungen zu minimieren. Unter Verwendung von Gold, Graphenoxid und PNIPAM wurden verschiedene Träger für die β-LP-Lieferung entwickelt [31, 32]. Bis heute wurde β-LP-beladenes PNIPAM bei Chemotherapeutika bei Leber-, Brust-, Prostata- und Dickdarmkrebs angewendet [33,34,35,36]. Obwohl mehrere β-LP-Träger untersucht wurden, waren die relativ komplexen Herstellungsverfahren unkontrolliert oder die spontane β-LP-Freisetzung schränkte ihre Wirksamkeit teilweise ein. Daher bleibt die Entwicklung effizienter Träger von β-LP für biomedizinische Anwendungen eine wichtige Aufgabe.

Hier haben wir ein bidirektionales kontrolliertes Freisetzungssystem entwickelt, das die thermo- und pH-sensitiven Eigenschaften von PNIPAM nutzt. Dieses Wirkstoffabgabesystem besteht aus PNIPAM-Nanogel, das mit AAc-Gehalten copolymerisiert ist und ein PNIPAM-co-AAc-Nanogel bildet. Wir beschrieben eine schematische Darstellung der Selbstorganisationsstrategie, der Wirkstoffbeladung und der Freisetzung von PNIPAM-co-AAc-Nanogel (Schema 1). β-LP, ein Modellarzneimittel, wurde über hydrophobe Wechselwirkungen in PNIPAM-co-AAc-Nanogele geladen. Die Freisetzung von β-LP durch die beladenen PNIPAM-co-AAc-Nanogele konnte durch Temperatur und pH-Wert effektiv kontrolliert werden. PNIPAM-co-AAc-Nanogele zeigten eine wirksame antiproliferative Eigenschaft in Fibroblasten mit basischem pH-Wert bei Körpertemperatur. In Nanogele beladenes β-LP erzielte mit einer thermo- und pH-responsiven Struktur eine signifikante therapeutische Wirksamkeit, daher könnte PNIPAM-modifiziertes Nanogel ein guter Kandidat für die stimuliresponsive Wirkstoffabgabe und die Behandlung von Tumoren sein.

Schematische Darstellung der doppelt kontrollierten Wirkstofffreisetzung von PNIPAM-co-AAc-Hydrogelen über Temperatur und pH

Methoden

Materialien

NIPAM (97%, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) wurde unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. N ,N ′-Methylenbisacrylamid (MBA), AAc, destilliertes Wasser, Ethylalkohol (EtOH), Kaliumpersulfat (KPS) (98%, Dae Jung, KOREA), β-LP (Natural Products, Korea) und phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS .) ) waren alle von analytischer Qualität und wurden ohne weitere Reinigung verwendet.

Synthese des PNIPAM-co-AAc-Nanogels

PNIPAM-co-AAc-Nanogel wurde nach früheren Berichten synthetisiert [37]. In einem 500 ml-Dreihalsrundkolben wurden 2,26 g NIPAM-Monomer, 0,154 g MBA als Vernetzungsmittel und 0 g, 0,036 g, 0,077 g, 0,145 g AAc in 200 ml destilliertes Wasser gegeben und dann gelöst durch Rühren mit einem Magnetstab für 30 Minuten bei 75 °C, gefolgt von der Synthese von PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5, PNIPAM-co-AAc10 bzw. PNIPAM-co-AAc20. Sauerstoff wurde aus der Mischung durch Spülen mit Stickstoff entfernt. Um die Reaktion zu starten, wurden der Lösung 37,5 mg KPS als Initiator zugesetzt und dann gerührt. Ein Rückflusskühler wurde verwendet, um das Verdampfen der Lösung aufgrund der hohen Temperatur zu verhindern. Die Lösung wurde innerhalb von 10 Minuten nach der Zugabe von KPS trüb. Um nicht umgesetzte Monomere zu entfernen, wurde es 7 Tage lang mit einem Dialyseschlauch (12–14 kDa) dialysiert. Das für die Dialyse verwendete destillierte Wasser wurde täglich gewechselt. Die erhaltenen Materialien wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und 3 Tage lyophilisiert, um getrocknetes PNIPAM-co-AAc-Nanogel zu erhalten.

β-LP Laden in PNIPAM-co-AAc

Ein Milligramm des synthetisierten PNIPAM-co-AAc-Nanogels wurde in 1 ml Ethanol gelöst und 0,1 mg β-LP wurden zu dem gelösten PNIPAM-co-AAc gegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur im Dunkeln über Nacht kräftig gerührt. Nach dem Rühren wurde das unverkapselte β-LP mit einem Dialyseschlauch (6–8 kDa) dialysiert. Das dialysierte Nanogel wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und 3 Tage lyophilisiert. Dann wurde 1 ml PNIPAM-co-AAc-verkapseltes β-LP in den Dialyseschlauch (6–8 kDa) injiziert. Um den Verlust der Lösung zu verhindern, wurde das Ende des Röhrchens verschlossen. Nach Zugabe von 10 ml Ethanol wurden die vorbereiteten Dialyseröhrchen in PBS-Lösung getaucht.

Charakterisierung von PNIPAM-co-AAc

Die Morphologie wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (FE-SEM) bestimmt. Kurz gesagt, nachdem PNIPAM-co-AAc-Nanogele unter Verwendung von Beschallung ausreichend dispergiert wurden, werden die Dispersionen auf 300 mesh Kupfergitter (Electron Microscopy Science, PA, USA) getropft und über Nacht verdampft. Dann wurden TEM-Bilder bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV (JEM2100F, JEOL Ltd., Japan) erhalten. REM-Aufnahmen wurden bei einer Elektronenbeschleunigungsspannung von 15 kV (JSM-7100F, JEOL USA) gescannt. Die Spektren wurden von einem Fourier-Transform-Infrarotspektrometer (FT-IR, Nicolet 6700, Japan) gesammelt. Die β-LP-Beladung und die von den Nanogelen freigesetzte Menge wurden mit einem UV-Vis-Spektrometer (UV-1800, Shimadzu, Japan) berechnet. Um die LCST zu bestätigen, wurde das Nanogel in Intervallen von 1 °C präzise auf Veränderungen der Größe und Oberflächenladung der Nanogele mithilfe dynamischer Lichtstreuung (DLS) (ELS-2000ZS, Otsuka Electronics, Japan) gemessen.

Wirkstofffreisetzungseigenschaften von PNIPAM-co-AAc

Um das Freisetzungsverhalten von β-LP zu untersuchen, wurden 10 ml β-LP-beladene Nanogele in ein Dialyseröhrchen (3,5 kDa) überführt, das dann bei Raumtemperatur und 37 °C in PBS gerührt wurde. Zu einer definierten Freisetzungszeit (0–12 h) wurden 2 ml der Probe in jeder Mischlösung mit dem UV-Vis-Spektrometer analysiert. Im UV-Vis-Spektrometer wurde die Basislinie mit PBS bei pH 2, 4, 7,4 und 8 auf 200–800 nm eingestellt und 2 ml des in der PBS-Lösung enthaltenen freigesetzten β-LP in die Küvette gegeben.

Wirkstofffreisetzende Aktivität durch Temperatur- und pH-Stimuli

Die zweifache Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay bewertet. NIH3T3-Fibroblastenzellen wurden in 96-Well-Platten ausgesät (2 × 10 ⁴ Zellen/Well) und über Nacht bei 37 °C kultiviert. Das Medium wurde dann durch frisches Medium ersetzt, das freies β-LP, PNIPAM-co-AAc5 und PNIPAM-co-AAc20 einschließlich β-LP in verschiedenen Konzentrationen enthielt. Nach 3 h Inkubation wurde MTT-Lösung in jede Vertiefung gegeben und 4 h inkubiert. Dann wurde das Kulturmedium entfernt, gefolgt von einer Behandlung mit der Solubilisierungslösung. Die Absorptionswerte bei 595 nm wurden mit einem Mikroplattenlesegerät (EL800, Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) gemessen. Die Live/Tot-Fluoreszenzbilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (IX37, Olympus, Japan) aufgenommen. NIH3T3-Zellen (1,5 × 10 ⁵ Zellen/Well) wurden in µ-Slide 8-well (ibidi, München, Deutschland) ausgesät und über Nacht kultiviert. Nach dem Austausch des Kulturmediums wurden 20 μg/ml freies β-Lapachon, PNIPAM-co-AAc5 und PNIPAM-co-AAc20 einschließlich β-LP, dispergiert im Kulturmedium, in die Vertiefungen gegeben. Nach einer Inkubation von 3 h oder 6 h wurden die Zellen gewaschen und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem LIVE/DEAD® Viability/Cytotoxicity Assay (Molecular Probes, Eugene, OR) bewertet.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung von PNIPAM-co-AAc-Nanogelen

PNIPAM-co-AAc-Nanogele mit drei verschiedenen Gehalten an AAc (5, 10 und 20 %) wurden durch eine radikalische Polymerisationsmethode hergestellt. TEM und SEM wurden verwendet, um die Partikelgröße, Morphologie und Monodispersität der Nanogele zu bestätigen. Wie in den Abbildungen 1a und b gezeigt, wies das PNIPAM-co-AAc5-Nanogel eine relativ gleichmäßige Größenverteilung mit einem mittleren Partikeldurchmesser von ungefähr 250 nm auf. Darüber hinaus wurde der Sol-Gel-Übergang der PNIPAM-basierten Nanogele mit steigender Temperatur beobachtet. Obwohl wässrige Lösungen von PNIPAM-co-AAc5 bei Raumtemperatur als Solphase bestanden, ging das Nanogel beim Erhitzen in die Gelphase über, was dazu führte, dass die Lösung oberhalb der LCST trübe wurde (Abb. 1c). Die Zeta-Potentiale von PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5, PNIPAM-co-AAc10 und PNIPAM-co-AAc20 sanken auf − 13,56 mV, − 16,61 mV, − 21,87 mV und − 23,62 mV aufgrund der erhöhten Oberfläche durch den AAc-Gehalt bereitgestellte Carboxylgruppen (Abb. 1d). Es zeigte auch, dass der hydrodynamische Durchmesser von PNIPAM-co-AAc einen Bereich von 217–442 nm aufwies, wenn der Gehalt an AAc aufgrund der zunehmenden Wasserstoffbrückenbindung mit Wasser und der interelektronischen Abstoßung auf 30 °C anstieg. Aufgrund hydrophober Wechselwirkungen nahmen die Nanogeldurchmesser jedoch bei 50 °C ab (Abb. 1e). Diese Ergebnisse legten nahe, dass die Größe von PNIPAM-co-AAc in Abhängigkeit von der Menge an AAc, die mit PNIPAM verbunden ist, und der Temperatur variieren kann. Die Zusammensetzung des Nanogels wurde weiter durch FT-IR-Spektroskopie charakterisiert, wie in Abb. 2 gezeigt. Die 1100 cm ⁻¹ ~1200 cm ⁻¹ Spitze zeigte C-N-Biegung an. Die Spektren zeigten auch das -CH₂ Dehnungsvibrationsspitze bei 1300 cm ⁻¹ ~1400 cm ⁻¹ . Der zusätzliche Peak bei 1600 cm ⁻¹ ~1700 cm ⁻¹ wurde C=O zugeschrieben, das zu NIPAM gehört. Insbesondere trat bei 1700 cm ^–1 . eine Streckung der Carbonsäure (−COOH) auf ~1800 cm ⁻¹ mit Ausnahme des PNIPAM-Nanogels. Ein breiter Peak bei 3200 cm ⁻¹ ~3300 cm ⁻¹ zeigte die Absorption der N-H-Streckung. Daher haben PNIPAM-Nanogel-Derivate, die aus verschiedenen Mischungsverhältnissen von PNIPAM und AAc bestehen, aufgrund des unterschiedlichen AAc-Gehalts unterschiedliche Eigenschaften.

a TEM und b REM-Aufnahme von PNIPAM-co-AAc5-Nanogelen. c Physikalisches Aussehen von PNIPAM-co-AAc5-Nanogelen. Maßstabsbalken sind 500 nm. d Zetapotentiale und e durchschnittliche Durchmesser, gemessen bei 30 °C und 50 °C mit DLS für PNIPAM mit 0 %, 5 %, 10 % und 20 % AAc-Gehalt bei pH 7,4

FT-IR-Spektren von PNIPAM mit 0 %, 5 %, 10 % und 20 % AAc-Gehalt

Temperaturabhängige Eigenschaften

Zur Untersuchung des Temperaturverhaltens wurde die Größenverteilung von PNIPAM-co-AAc-Nanogelen mittels DLS untersucht. Zur Bestimmung der LCST wurde die Änderung des hydrodynamischen Durchmessers im Temperaturbereich von 30 bis 50 °C gemessen. PNIPAM mit 5 %, 10 % und 20 % AAc hatte zwei unterschiedliche Übergangsstufen (Abb. 3). PNIPAM-co-AAc-Derivate starteten den ersten Übergangsschritt bei 30 °C und traten dann bei etwa 40 °C in den zweiten Übergangsschritt ein. Darüber hinaus neigte die zweite Übergangstemperatur dazu, mit steigendem AAc-Gehalt des PNIPAMs anzusteigen. Daher lag die LCST von PNIPAM-co-AAc20 bei einer relativ hohen Temperatur von 45 °C, während die von PNIPAM bei 32 °C lag. Dieser Unterschied in den LCST-Werten könnte durch die erhöhte negative Ladung von PNIPAM-co-AAc-Derivaten induziert werden. Allerdings waren die LCST-Temperaturen von PNIPAM-co-AAc5 und PNIPAM-co-AAc10 mit 37 °C bzw. 39 °C nahezu identisch. Daher wurde PNIPAM-co-AAc10 nicht weiter verwendet, um die Wirkstofffreisetzungsleistung zu bewerten. Die in PNIPAM-co-AAc-Derivaten erhaltenen LCST-Werte waren denen der vorherigen Studie ähnlich [37]. Diese Ergebnisse zeigten, dass PNIPAM-co-AAc-Nanogele zwei Phasenübergänge aufweisen und die LCST von PNIPAM mit AAc aufgrund hydrophober Wechselwirkungen von den Grenzflächen-PNIPAM-Ketten und interelektronischer Abstoßung über die Carboxylgruppen von AAc zu höheren Temperaturen verschoben ist.

Temperaturabhängigkeit der hydrodynamischen Durchmesser von a PNIPAM, b PNIPAM-co-AAc5, c PNIPAM-co-AAc10 und d PNIPAM-co-AAc20-Nanogele bei pH 7,4

Doppelte kontrollierte Wirkstofffreisetzung

Um die Wirkstofffreisetzungsprofile von PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5 und PNIPAM-co-AAc20 zu vergleichen, wurde aus den PNIPAM-co-AAc-Derivaten freigesetztes β-LP über einen Zeitraum von 6 Stunden bei Raumtemperatur (24 °C) gemessen. und Körpertemperatur (37 °C). Zunächst haben wir die UV-Vis-Absorptionsspektren von PNIPAM-co-AAc20 und PNIPAM-co-AAc20 einschließlich β-LP gemessen und eine starke Absorption bei 257 nm entsprechend β-LP beobachtet (zusätzliche Datei 1:Abbildung S1). Die Wirkstoffbeladungskapazität von PNIPAM-co-AAc20-beladenem β-LP wurde mit einer Standardkonzentrations-Absorptions-Kalibrierungskurve von β-LP zu etwa 60 % ermittelt (zusätzliche Datei 2:Abbildung S2) [38, 39]. Wie in Abb. 4 gezeigt, zeigte der kumulative Prozentsatz des aus PNIPAM-co-AAc-Derivaten freigesetzten Arzneimittels, dass die Menge an β-LP, die aus PNIPAM-co-AAc20 freigesetzt wurde, relativ geringer war und seine Freisetzungswirksamkeit im Vergleich zu PNIPAM und PNIPAM . signifikant reduziert war -co-AAc5 bei beiden Temperaturen. Die gesättigten Wirkstofffreisetzungspunkte der meisten PNIPAM-co-AAc-Derivate wurden jedoch nach der Behandlung innerhalb von 2 h beobachtet. Insbesondere die Wirksamkeit der Wirkstofffreisetzung von PNIPAM-Nanogelen wurde stark von der Reaktionstemperatur beeinflusst. PNIPAM-co-AAc-Derivate zeigten eine verbesserte Wirkstofffreisetzungseffizienz bei Körpertemperatur im Vergleich zu der bei Raumtemperatur. Dieses Ergebnis wurde auch durch die deutlich höhere kumulative Wirkstofffreisetzung aller PNIPAM-Derivate bei einer Reaktionstemperatur von über 40 °C gestützt (Zusatzdatei 3:Abbildung S3).

Kumulative Freisetzung von β-LP aus PNIPAM-, PNIPAM-co-AAc5- und PNIPAM-co-AAc20-Nanogelen bei Temperaturen von a Raumtemperatur (24 °C) und b Körpertemperatur (37 °C) und pH 7,4

Wie in Abb. 4 und Tabelle 1 gezeigt, könnten PNIPAM-co-AAc-Nanogele bei der hohen Temperatur das Medikament aufgrund ihrer bemerkenswerten Schrumpfung leicht freisetzen. Darüber hinaus wurde bei PNIPAM die höchste Wirksamkeit der Wirkstofffreisetzung bei Körpertemperatur beobachtet und die zweithöchste Wirksamkeit bei PNIPAM-co-AAc5. Beide haben einen relativ niedrigen AAc-Gehalt, was zu einer verringerten LCST-Temperatur führt. Insbesondere beobachteten wir, dass β-LP in PNIPAM-co-AAc20 mit einer relativ geringeren Effizienz (61%) bei Körpertemperatur freigesetzt wurde, während in den anderen Nanogelen etwa 80% des β-LP bei derselben Temperatur freigesetzt wurden. Diese Ergebnisse zeigten, dass PNIPAM-co-AAc20 im Vergleich zu PNIPAM und anderen PNIPAM-co-AAc5 eine minimale Freisetzung des Arzneimittels bei Körpertemperatur zeigte, während es so viel wie möglich einkapselte. Darüber hinaus stimmten diese Ergebnisse auch mit temperaturabhängigen Änderungen der Größenmessung von PNIPAM-Derivaten zur Bestimmung von LCST-Werten überein.

Als nächstes untersuchten wir, ob PNIPAM-co-AAc20 die Wirkstofffreisetzung über einen anderen Faktor, auf den PNIPAM anspricht, den pH-Wert, mit maximalem Einschluss des Wirkstoffs bei Körpertemperatur kontrollieren könnte. PNIPAM-co-AAc20 zeigte eine kumulative maximale Freisetzungseffizienz von ungefähr 70 %, die bei pH 8 im Vergleich zu entweder saurem oder neutralem pH um ungefähr 10 % zunahm. In der Zwischenzeit wurde kein signifikanter Unterschied zwischen pH 7,4 und saurem pH beobachtet (Abb. 5 und Tabelle 2). Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass das Wirkstofffreisetzungsprofil von PNIPAM-co-AAc20 durch die Kontrolle des AAc-Gehalts beeinflusst werden kann, und dieses Nanogel mit doppelt kontrollierter Wirkstofffreisetzung könnte die Wirkstofffreisetzungsrate bei basischen pH-Werten, von denen bekannt ist, dass sie in Teilen des Dünndarms vorhanden [40].

Kumulative Freisetzung von β-LP aus PNIPAM-co-AAc20-Nanogelen bei verschiedenen pH-Werten

Bewertung der Wirkstofffreisetzungseigenschaften

Die In-vitro-Antiproliferation wurde evaluiert, um ein Schlüsselkriterium für Nanomaterialien zu erfüllen, die für die kontrollierte Wirkstoffabgabe und -freisetzung entwickelt wurden. Wie in Fig. 6 angegeben, zeigte freies β-LP eine geringere Zelllebensfähigkeit als mit β-LP beladene PNIPAM-co-AAc-Nanogele für äquivalente Konzentrationen von β-LP. Darüber hinaus zeigte das PNIPAM-co-AAc20-Nanogel eine relativ hohe Zelllebensfähigkeit bei einer Konzentration von 20 μg/ml, da die β-LP-Freisetzung des PNIPAM-co-AAc20-Nanogels im Vergleich zu der des PNIPAM-co-AAc5-Nanogels relativ gering war at 37 °C. Darüber hinaus stimmte dieses Ergebnis auch mit den kumulativen Wirkstofffreisetzungsprofilen überein. Dann bewerteten wir die Lebensfähigkeit der Zellen mit fluoreszenzgefärbten lebenden und toten Zellen (Abb. 7). Der Assay zur Färbung von lebenden/toten Zellen zeigte, dass β-LP und PNIPAM-co-AAc5-Nanogel, einschließlich β-LP, eine ähnliche Zellviabilität aufwiesen, während PNIPAM-co-AAc20 mit einer Dosis von 20 μg/ml . eine signifikante Steigerung der Zellviabilität aufwies nach der Behandlung für 3 h. Nach Inkubation bei pH 8,0 für 3 h wurde jedoch eine verstärkte Wirkstofffreisetzung von PNIPAM-co-AAc20 beobachtet, und eine signifikante, synergistische Anti-Tumor-Aktivität wurde bei demselben pH während der 6-stündigen Nachbehandlung beobachtet. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das auf Temperatur und pH-Wert dual reagierende PNIPAM-co-AAc20-Nanogel eine potenzielle Anwendung für die kontrollierte Wirkstoffbeladung und -freisetzung im terminalen Dünndarm hat.

Antiproliferative Aktivität von PNIPAM-co-AAc-Nanogelen, beladen mit β-LP in verschiedenen Konzentrationen in NIH3T3-Fibroblastenzellen für 3 h bei 37 °C

Fluoreszierende Bilder der Zytotoxizität in NIH3T3-Zellen mit a unbehandelt, b nur β-LP, c β-LP/PNIPAM-co-AAc5 und d β-LP/PNIPAM-co-AAc20-Behandlung für 3 h bei pH 7,4 und β-LP/PNIPAM-co-AAc20-Behandlung für 3 h (e ) und 6 h (f ) bei pH 8,0. Die lebenden und toten Zellen werden mit Calcein AM (grün) und Ethidium-Homodimer (rot) gefärbt. Maßstabsbalken sind 100 μm

Schlussfolgerungen

Wir haben β-LP-beladene PNIPAM-co-AAc-Nanogele entwickelt, deren Wirkstofffreisetzung durch Temperatur und pH-Wert ausgelöst werden kann. Diese Nanogel-Derivate wurden durch radikalische Copolymerisation entworfen und hergestellt. Die LCST wurde mit zunehmendem AAc-Gehalt der PNIPAM-co-AAc-Nanogele aufgrund der interelektronischen Abstoßung zwischen den Carboxylgruppen auf den AAc-Gehalten erhöht, was zu einer Schrumpfung der PNIPAM-Nanogele und der daraus resultierenden Wirkstofffreisetzung führte. Mit β-LP beladene PNIPAM-co-AAc-Nanogele mit hohem AAc-Gehalt zeigten ein deutlich reduziertes in vitro-Freisetzungsprofil bei Körpertemperatur. Außerdem kann die Wirkstofffreisetzung mit bemerkenswerter synergistischer Wirkung bei basischem pH erreicht werden. Schließlich zeigen wir, dass PNIPAM-co-AAc20 optimale Eigenschaften hat, da es bei Körpertemperatur eine verringerte Wirkstofffreisetzungseffizienz, aber eine verbesserte Wirkstofffreisetzung bei pH 8,0 aufweist, was durch Zelllebensfähigkeitsassays unter Verwendung von Fibroblastenzellen unterstützt wird. Daher könnte dieses temperatur- und pH-responsive Nanogel eine vielversprechende Anwendung für die doppelt kontrollierte Wirkstofffreisetzung beim physiologischen pH-Wert des Dünndarms und eine attraktive Modalität für die gezielte Wirkstoffabgabe im Darm durch orale Wirkstoffverabreichung fördern.

Abkürzungen

AAc:

Acrylsäure

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

FE-REM:

Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie

FT-IR:

Fourier-Transformations-Infrarotspektrometer

KPS:

Kaliumpersulfat

LCST:

Niedrigere kritische Lösungstemperatur

MBA:

N ,N ′-Methylenbisacrylamid

PNIPAM:

Poly-N -Isopropylacrylamid

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

β-LP:

β-Lapachon