Einfache Herstellung von rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln für magnetisch gezielte, NIR-responsive Chemo-Photothermische Krebstherapie

Zusammenfassung

Nahe-Infrarot (NIR)-responsives Graphen hat vielversprechende Effekte in der photothermischen Ablationstherapie von Krebs gezeigt. Hier berichten wir über die Herstellung von Fe₃O₄-dekorierten hohlen Graphen-Mikrokugeln (rGO@Fe₃O₄) durch ein einfaches Sprüh-Trocknungs- und Co-Fällungsverfahren für die magnetisch gezielte und NIR-responsive Chemo-Photothermische Kombinationsbehandlung. Die Mikrokugeln weisen eine sehr hohe spezifische Oberfläche (~ 120,7 m² g⁻¹) und ein großes Porenvolumen (~ 1,012 cm³ g⁻¹) auf, was deutliche Vorteile für eine hohe Beladungskapazität von DOX (~ 18,43 %) bietet. Der NIR-getriggerte photothermische Effekt der rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln reagiert in einem Ein-/Aus-Modus und induziert einen hohen photothermischen Umwandlungswirkungsgrad. Darüber hinaus zeigt das Fe₃O₄ auf den Mikrokugeln eine exzellente Zielgerichtetheit gegenüber Tumorzellen. Die Chemo-Photothermische Behandlung basierend auf rGO@Fe₃O₄/DOX zeigte eine überlegene Zytotoxizität gegenüber HeLa-Zellen in vitro. Unsere Studien deuten darauf hin, dass rGO@Fe₃O₄/DOX-Mikrokapseln großes Potenzial in der kombinierten Chemo-Photothermischen Krebsbehandlung haben.

Einleitung

Krebs ist eine der bösartigsten Erkrankungen weltweit und eine führende Todesursache beim Menschen [1, 2]. Obwohl Chemotherapie häufig in der klinischen Krebstherapie eingesetzt wird, begrenzen mehrere Schlüsselfragen wie geringe therapeutische Effizienz und umfangreiche Nebenwirkungen ihre Anwendung erheblich [3]. Drug-Delivery-Systeme (DDS) haben große Vorteile bei der Verbesserung der Arzneimittellöslichkeit, Bioverfügbarkeit und Tumoranreicherung gezeigt, was ihre antitumorale Wirksamkeit deutlich verbessern soll [4]. In jüngerer Zeit haben hohle Mikrokugeln als Drug-Delivery-Systeme aufgrund ihrer großen Oberfläche und reichhaltigen Porenstrukturen zunehmende Aufmerksamkeit erhalten [5-8], und verschiedene hohle Mikrokugel-Materialien wurden mit innovativen Technologien entwickelt [9-13].

Graphenoxid (GO), ein neuer Typ anorganischer metallfreier Materialien, wurde aufgrund seiner einzigartigen Eigenschaften wie guter Biokompatibilität, niedriger Kosten und einfacher Herstellung umfassend in der Drug Delivery untersucht [14-17]. Bemerkenswert ist, dass Graphenoxid Licht bei NIR-Bestrahlung effektiv in Wärme umwandeln kann [18-20], was eine vielversprechende Strategie zur Verbesserung der photothermischen Therapiewirkung bei Krebs darstellt. Die Chen-Gruppe berichtete, dass GO Antikrebsmedikamente durch nicht-kovalente Wechselwirkungen wie π-π-Stapelung, Wasserstoffbrückenbindungen und elektrostatische Adsorption transportieren kann [21]. Allerdings neigen 2D-Graphenoxid-Nanoschichten aufgrund ihrer großen spezifischen Oberfläche und der Van-der-Waals-Bindungen zwischen den Graphenschichten zur Agglomeration [17, 22], was zu schlechter Wasserlöslichkeit und verringerter Arzneimittelbeladung führt. Verschiedene Strategien wurden erforscht, um diese Mängel zu überwinden. Die Tsukruk-Gruppe entwickelte Graphen-Hohlkapseln mittels Layer-by-Layer-Assemblierungstechnologie [23], die im Vergleich zu anderen GO-Materialien eine extrem hohe Arzneimittelbeladung aufwiesen. Dies könnte auf die hohe spezifische Oberfläche und das große Porenvolumen der durch GO stabilisierten Hohlkapsel zurückzuführen sein. Allerdings gibt es wenige Berichte über die Untersuchung von GO mit einer dreidimensional vernetzten Porenstruktur für die Drug Delivery.

Obwohl viele berichtete Drug-Delivery-Systeme eine überlegene Arzneimittelbeladung und kontrollierte Freisetzung zeigten, sind ihre präklinische Forschung und Anwendung auch durch unzureichende Spezifität bei der Zielgerichtetheit auf Tumorengewebe begrenzt [24]. Unter den verschiedenen zielgerichteten Drug-Delivery-Systemen wird Fe₃O₄, ein magnetisches Targeting-Material, aufgrund seiner hohen magnetischen Antwort, stabilen Qualität und einfachen Herstellung häufig in der Krebstherapie eingesetzt [25-29]. Die Ni-Gruppe entwickelte Fe₃O₄@SiO₂-Kern-Schale-Nanopartikel mit superparamagnetischen Eigenschaften für das magnetische Targeting von Tumoren [30]. Darüber hinaus wurden Fe₃O₄-verankerte GO-Nanopartikel in der Kombination von magnetischem Targeting und photothermischer Therapie gut untersucht [31-34].

In der vorliegenden Studie berichten wir über eine fortschrittliche Strategie zur Entwicklung einer DDS-Plattform, bestehend aus eisenoxid-dekorierten rGO-Hohlmikrokugeln (rGO@Fe₃O₄) für magnetisch gezielte und NIR-getriggerte photothermische Therapie (PTT). Wie in Schema 1 dargestellt, wurden rGO@Fe₃O₄-Hohlmikrokugeln in drei Schritten hergestellt. Zunächst wird rGO-SiO₂ durch Sprüh-Trocknung unter Verwendung von SiO₂ als Template synthetisiert, dann werden hohle rGO-Mikrokugeln durch Entfernen von SiO₂ mit HF-Ätzung erhalten. Anschließend werden Fe₃O₄-Nanopartikel auf die hohlen rGO-Mikrokugeln aufgebracht, um rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln zu konstruieren. In diesem System dient rGO als NIR-getriggerter PTT-Agent, und Fe₃O₄ bietet die magnetische Targeting-Eigenschaft gegenüber HeLa-Zellen. Doxorubicin (DOX), in Mikrokugeln eingekapselt (rGO@Fe₃O₄/DOX), basierend auf Porenadsorption und π-π-Stapelung, wird eine ultrahohe Arzneimittelbeladungskapazität und pH-responsive Freisetzung erwarten, und kann den Antikrebs-Effekt durch die Kombination von Photothermie und Chemotherapie signifikant verstärken.

Materialien und Methoden

Materialien

Eisen(III)-chlorid-Hexahydrat (FeCl₃·H₂O), Natriumhydroxid (NaOH) und Eisen(II)-sulfat-Heptahydrat (FeSO₄·7H₂O) wurden von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. bezogen. HeLa-Zellen stammen vom Tianjin Cancer Hospital. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), Doxorubicin-Hydrochlorid (DOX·HCl), Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und Cell Counting Kit-8 (CCK-8) wurden von Solarbio Science and Technology Co., Ltd. gekauft. SiO₂ (~ 300 nm) wurde von Shanghai Yuanjiang Chemical Company bezogen. Graphenoxid-Deionwasserlösung (2 mg/ml) war ein kommerziell erhältliches Produkt von Nanjing Xianfeng Company.

Herstellung von rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln

Hohle Graphen-Mikrokugeln wurden via Sprüh-Trocknung unter Verwendung von SiO₂ (300 nm) als Template hergestellt. Kurz gesagt, 100 ml SiO₂-Suspension (50 mg ml⁻¹) wurden langsam in 300 ml GO-wässrige Lösung (2 mg ml⁻¹) unter starkem Rühren gegeben, die Mischung wurde bei 200 °C in einem Sprüh-Trockner getrocknet. Anschließend wurde das Produkt 2 Stunden bei 300 °C unter Ar-Schutz gehalten, und rGO-SiO₂ wurde erhalten. Zur Entfernung von SiO₂ wurde rGO-SiO₂ 48 Stunden bei 60 °C in HF-Lösung (10 %) platziert. Das feste Produkt wurde mehrmals gewaschen und 12 Stunden bei 60 °C im Vakuumtrockenschrank getrocknet; rGO wurde schließlich mit einer Ausbeute von 75 % erhalten.

Die rGO@Fe₃O₄-Nanopartikel wurden via Co-Fällungsmethode hergestellt. In einem typischen Prozess für die Synthese von rGO@Fe₃O₄-Nanopartikeln wurden 0,27 g FeCl₃·H₂O, 0,28 g FeSO₄·7H₂O und 0,1 g hohle rGO-Mikrokugeln in 10 ml deionisiertem Wasser gelöst und 30 Minuten bei 50 °C gerührt. Dann wurden 60 ml NaOH (0,15 mol L⁻¹) unter kontinuierlichem Rühren bei 50 °C für 12 Stunden langsam zugegeben. Die Produkte wurden schließlich magnetisch separiert und wiederholt mit deionisiertem Wasser und Ethanol gewaschen, gefolgt von Trocknung bei 60 °C unter Vakuum für 12 Stunden.

Strukturaufklärung

Größe und Morphologie der Proben wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie (FE-SEM, Hitachi, S-4800) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, JEM2100F, JEOL) analysiert. Die Zusammensetzung der Produkte wurde mittels Röntgenbeugung (XRD, D8 Focus, Cu Kα-Strahlung, Bruker, Deutschland) bei einer Scanrate von 12 °/min im Bereich von 10 bis 80° untersucht. Auch Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) wurde an einem XPS-Spektrometer (Thermo Fisher Scientific, ESCALAB 250Xi, USA) durchgeführt. FTIR-Spektren (FT-IR, AVATAR360, Nicolet) wurden von 500 bis 4000 cm⁻¹ bei einer Auflösung von 4 cm⁻¹ aufgezeichnet. Magnetische Messungen wurden mit einem Supraleitenden Quanteninterferenzgerät (SQUID, Quantum Design MPMS) Magnetometer bei Raumtemperatur (300 K) durchgeführt. Raman-Spektren wurden mit einem Raman-Spektroskop (Renishaw, inVia Reflex, England) mit einem 532 nm Wellenlängen-Laser gesammelt. Der rGO-Gehalt wurde mit einem Thermogravimetrie-Analysator (TGA, TA Instruments-water LLC, SDTQ-600) bewertet. Die spezifische Oberfläche wurde mit der Brunauer-Emmett-Teller (BET)-Technik gemessen. UV-Vis-Spektren wurden mit einem Beckman DU 800 Nukleinsäure/Protein-Analysator (Beckman Instruments, Inc., Rosemead, CA) aufgezeichnet.

DOX-Beladung und -Freisetzung

DOX, ein Modell-Chemotherapeutikum Doxorubicin, wurde in die Kerne von rGO@Fe₃O₄ eingekapselt, um das Beladungs- und Freisetzungsverhalten von Antikrebsmedikamenten in vitro zu bewerten. rGO@Fe₃O₄/DOX wurde gemäß der Literatur hergestellt. Kurz gesagt, 10 ml (0,2 mg ml⁻¹) DOX-wässrige Lösung wurden zu 10 mg rGO@Fe₃O₄-Lösung gegeben, die Mischung wurde ultraschallhomogenisiert, um keine signifikante Ausfällung sicherzustellen. Dann wurde die Mischung 24 Stunden auf einem Reziprokschüttler (SK-O180-Pro) bei 150 rpm gleichgewichtet. Nach Zentrifugation bei 6000 rpm für 10 Minuten wurde unbehandeltes DOX entfernt, der Überstand von rGO@Fe₃O₄/DOX wurde via UV-Vis-Spektrophotometer gemessen, um die Menge des beladenen DOX zu bestimmen. Die OD von DOX wurde bei 490 nm aufgezeichnet, folgende Gleichungen wurden zur Berechnung der Beladungseffizienz (LE) und Beladungskapazität (LC) von DOX verwendet:

LE = (gesamte DOX-Menge - freies DOX) / gesamte DOX-Menge

LC = (gesamte DOX-Menge - freies DOX) / Menge von rGO@Fe₃O₄/DOX

Die in vitro-Freisetzungsstudien von DOX wurden durchgeführt, indem rGO@Fe₃O₄/DOX (10 mg) in einen Dialysebeutel (MWCO = 1000) mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 30 ml) bei pH 5,4, 6,5 oder 7,4 gegeben wurde, in ein 37 °C-Wasserbad gelegt und bei 80 rpm geschüttelt. Zu vorgegebenen Zeitintervallen wurden 3 ml des Freisetzungsmediums entnommen und die Menge des freigesetzten DOX durch Messung der UV-Vis bei 480 nm berechnet.

NIR-getriggerter photothermischer Effekt von rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln

Um den Einfluss der rGO@Fe₃O₄-Dosis auf den NIR-getriggerten photothermischen Effekt zu überwachen, wurden rGO@Fe₃O₄-Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 und 1 mg ml⁻¹) mit NIR-Laser bei 2 W cm⁻² für 5 Minuten bestrahlt. Darüber hinaus wurde der Einfluss der NIR-Energie auf den photothermischen Effekt durch Bestrahlung von rGO@Fe₃O₄ (0,25 mg ml⁻¹) mit unterschiedlichen Leistungen (1 W cm⁻², 1,5 W cm⁻², 2 W cm⁻²) für 5 Minuten bewertet. Die Echtzeit-Temperatur wurde mit einer FLIR I5 Infrarot-Wärmebildkamera gemessen.

In vitro-Aufnahme

HeLa-Zellen wurden in 35 mm² Konfokal-Schälchen mit einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen/Well ausgesät. Nach 24-stündiger Inkubation in einem Inkubator (5 % CO₂, 37 °C) wurde das Medium entfernt, und frisches Medium mit rGO@Fe₃O₄/DOX-Mikrokugeln und rGO@Fe₃O₄/DOX mit Magnet wurde für weitere 5 Stunden zugegeben. Die rGO@Fe₃O₄/DOX-Konzentration betrug 0,1 mg ml⁻¹. Die Zellen wurden dann dreimal mit kalter PBS (pH = 7,4) gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd-Lösung für 20 Minuten fixiert (CLSM, TCSSP5II, Leica, Ernst-Leitz-Strasse, Deutschland).

Zelllebensfähigkeits-Assays

Die Zytotoxizität dieser Mikrokugeln wurde durch einen CCK-8-Assay nach NIR-Behandlung bewertet. HeLa-Zellen wurden auf 96-Well-Platten (5 × 10³ Zellen/Well) in 100 µl Medium ausgesät und in 5 % CO₂ bei 37 °C für 24 Stunden kultiviert. Für die Biokompatibilitätsbewertung wurde rGO@Fe₃O₄ mit Konzentrationen von 0,01 bis 0,2 mg ml⁻¹ zugegeben; für die einzelne Photothermie-Gruppe wurde rGO@Fe₃O₄ mit Konzentrationen von 0,01 bis 0,2 mg ml⁻¹ zugegeben und NIR-Lichtbestrahlung für 10 Minuten (2 W cm⁻², 808 nm) angewendet; für die kombinierte Photothermie-Chemotherapie-Gruppe wurde rGO@Fe₃O₄/DOX mit Konzentrationsbereich von 0,01 bis 0,2 mg ml⁻¹ zugegeben und NIR-Lichtbestrahlung für 10 Minuten (2 W cm⁻², 808 nm) angewendet. Die Zellen wurden weitere 24 oder 48 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in 100 µl DMEM-Medium mit 10 µl CCK-8-Lösung für weitere 40 Minuten inkubiert. Die Lebensfähigkeit wurde mit einem Mikroplattenleser bei 450 nm Wellenlänge detektiert. Alle Experimente wurden in Triplicate durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Morphologie-Charakterisierung

Die Herstellung von rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln erfolgte in drei Schritten. Zunächst wurden rGO-SiO₂-Mikrokugeln durch Sprüh-Trocknung unter Verwendung von SiO₂ als Template synthetisiert. Die Morphologie der rGO-SiO₂-Mikrokugeln wurde durch SEM und TEM charakterisiert. Wie in Abb. 1a gezeigt, wiesen die rGO-SiO₂-Mikrokugeln mit Durchmessern von 3 µm eine gleichmäßige kugelförmige Form auf und bestanden aus vielen gedrängten SiO₂-Nanopartikeln (~ 300 nm). Die TEM-Daten und der hydrodynamische Durchmesser, gemessen durch dynamische Lichtstreuung, bestätigten die Ergebnisse (Abb. 1d, g). Dann wurden hohle rGO-Mikrokugeln durch Entfernen von SiO₂ aus rGO-SiO₂ durch Erhitzen bei 300 °C und HF-Ätzung erhalten. Offensichtliche Poren mit einer Porengröße von etwa 300 nm waren aufgrund der SiO₂-Lösung sichtbar (Abb. 1b, e). Schließlich wurde Fe₃O₄ aufgrund seiner magnetischen Targeting-Fähigkeit durch Co-Fällung auf das poröse rGO aufgebracht. Die SEM- und TEM-Beobachtungen zeigten, dass eine bemerkenswerte Verringerung der Porengröße nach Fe₃O₄-Beladung erzielt wurde (Abb. 1c, f), was die Machbarkeit von Drug Delivery und kontrollierter Freisetzung belegt. Bemerkenswert ist, dass die Partikelgröße und hydrodynamische Größenverteilung von rGO-SiO₂, rGO, rGO@Fe₃O₄ während dieser Behandlungen keine sichtbaren Veränderungen aufwiesen (Abb. 1g, h, i).

Struktur- und Zusammensetzungs-Charakterisierung

Um die erfolgreiche Herstellung von rGO@Fe₃O₄ weiter zu bestätigen, wurde SEM mit EDS eingesetzt, um Struktur und Zusammensetzung der Mikrokugeln zu untersuchen. Die EDS-Bilder von rGO@Fe₃O₄ wurden durch Visualisierung der unelastisch gestreuten Elektronen in den Energieverlustfenstern für die Elemente O, Fe und C charakterisiert, und die unterschiedlich farbigen Bereiche repräsentieren O-, Fe- und C-anreichernde Bereiche in den echten Strukturen. Wie in Abb. 2a und b gezeigt, waren Fe und O weit verbreitet in den rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln mit hoher Beladungsdichte. Abb. 2d bestätigte, dass die Fe₃O₄-Nanopartikel gleichmäßig im rGO mit einem Durchmesser von etwa 18 nm dispers waren, was zu einer scharfen Verringerung der Porengröße in den rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln führte. Das Selected-Area-Elektronenbeugungsmuster (SAED) verifizierte weiterhin das Vorhandensein von Fe₃O₄ im rGO (Abb. 2e), die charakteristischen Resonanzen bei 2,98 nm, 2,53 nm, 2,09 nm, 1,62 nm und 1,49 nm Ebenenabstand wurden den 220-, 311-, 400-, 511- und 440-Ebenen des flächenzentrierten kubischen Phasen von Fe₃O₄ zugeordnet. Die Peaks bei 220, 311, 400, 511 und 440, die Fe₃O₄ entsprechen, wurden auch in den XRD-Spektren detektiert, was mit den SAED-Ergebnissen konsistent war (Abb. 2c). Allerdings wird berichtet, dass Fe₃O₄ und γ-Fe₂O₃ nicht allein durch das XRD-Muster unterschieden werden können, da die charakteristischen Peaks an gleicher Stelle liegen [35]. XPS-Ergebnisse zeigten, dass die vorherrschenden Peaks bei 725,9/724,5 eV und 714,1/711,0 eV, entsprechend Fe2p₁/₂ und Fe 2p₃/₂ des rGO@Fe₃O₄ (Abb. 2g, h), das Koexistieren von Fe³⁺ und Fe²⁺ in Fe₃O₄ anzeigen [36]. Thermogravimetrische (TGA) Analyse wurde durchgeführt, um das thermische Abbauverhalten von rGO in rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln zu überwachen, indem das Probenmaterial auf 800 °C erhitzt und in Luftatmosphäre auf 100 °C abgekühlt wurde (Abb. 2f). Die Massenverlustkurve zeigte zwei deutliche Massenverlustbereiche einschließlich des Dehydratationsbereichs (40-300 °C) und des Entflüchtigungsbereichs (300-800 °C) von rGO in rGO@Fe₃O₄, der Kohlenstoffgehalt berechnet aus der Probe betrug 25,6 Gew.-%.

Die magnetischen Eigenschaften der rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln wurden mit einem Supraleitenden Quanteninterferenzgerät untersucht. Das Magnetfeld wurde mit einem Scan-Bereich von -20.000 bis 20.000 Oe bei Raumtemperatur durchgeführt. Abb. 2i zeigt, dass der Sättigungsmagnetisierungswert (Ms) und der Koerzitivfeldwert (Hc) von Fe₃O₄ 66,6 emu g⁻¹ bzw. 9,3 Oe betragen. Nach Beladung von Fe₃O₄ auf rGO verringerten sich der Ms-Wert und Hc-Wert der rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln auf 33,9 emu g⁻¹ bzw. 7,44 Oe. Die bemerkenswerte Abnahme der magnetischen Sättigung kann auf die diamagnetischen Eigenschaften von rGO in den rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln zurückgeführt werden. Darüber hinaus wurde die selektive Agglomerationsfähigkeit der rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln intuitiv durch ein magnetisches Separationsexperiment demonstriert. Die Suspensionen von Fe₃O₄ und rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln wurden in ein Fläschchen mit einem externen Magneten für 2 Minuten gegeben; die Suspensionen konnten an die Magneten-Seite konzentriert werden und die wässrige Lösung wurde transparent. Wenn der Magnet entfernt wurde, dispersierten sich die rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln nach leichtem Schütteln wieder gleichmäßig, was zeigt, dass rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln den Vorteil einer guten Wasser-Dispersibilität besitzen. Die exzellente Wasser-Dispersibilität und magnetische Antwort-Eigenschaft ebneten den Weg für die magnetisch gezielte Anwendung von rGO@Fe₃O₄ als Drug Carrier in der Krebstherapie.

Photothermische Effekt-Analyse

In Anbetracht der tieferen Penetration in das Gewebe und geringerer Schädigung des umliegenden Gewebes durch NIR wurde NIR-responsive photothermische Therapie häufig zur Tumorbehandlung eingesetzt. Daher wurde das photothermische Transformationsverhalten von wässrigen rGO@Fe₃O₄-Lösungen bei unterschiedlichen Konzentrationen und Leistungsdichten unter NIR-Laserbestrahlung bei 808 nm für 5 Minuten aufgezeichnet. Abb. 3a, b zeigten, dass der Temperaturanstieg von rGO@Fe₃O₄ stark von der Konzentration und der Laserleistungsdichte abhing. Wenn die Konzentration der Mikrokugeln bis zu 1 mg ml⁻¹ betrug, stieg die Temperatur unter NIR-Laserbestrahlung für 5 Minuten bei 2 W cm⁻² von 27,9 auf 70,3 °C an, während die Temperatur der PBS-Gruppe nur von 31,7 auf 36,2 °C anstieg. Der hohe photothermische Umwandlungswirkungsgrad von rGO@Fe₃O₄ wird großes Potenzial für die Tumor-Photothermie haben, gemäß vorangegangenen Berichten, dass Proteindegeneration und DNA-Schädigung in Zellen bei Exposition gegenüber 50 °C für 4 bis 6 Minuten auftreten [21, 37]. Um das photothermische Transformationsverhalten von rGO@Fe₃O₄ intuitiv darzustellen, wurde IR-Thermografie durchgeführt und die Ergebnisse in Abb. 3c gezeigt. Die rGO@Fe₃O₄-Lösung mit einer Konzentration von 1 mg ml⁻¹ wurde nach NIR-Bestrahlung für 5 Minuten schnell auf 70,3 °C erhöht, während die Wassergruppe keine offensichtlichen Veränderungen zeigte, was mit den Thermometrie-Ergebnissen konsistent war. Darüber hinaus wurde die photothermische Stabilität von rGO@Fe₃O₄ durch ein Laser-Ein/Aus-Verfahren mit einem 808 nm Laser bei 2 W cm⁻² für sechs Zyklen untersucht (Abb. 3d). Ein identischer Temperaturanstieg wurde erzielt, was die perfekte NIR-Photothermische Stabilität der rGO@Fe₃O₄-Komposite anzeigt. Diese Ergebnisse demonstrierten, dass rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln großes Versprechen als photothermische Agenten für die Photothermie in der Krebsbehandlung halten.

Arzneimittelbeladung und -freisetzung

Der Oberflächenbereich und die Porengröße von rGO@Fe₃O₄ wurden durch BET- und BJH-Analysen bewertet (Abb. 4a, b). Die N₂-Adsorptions-Desorptions-Kurve war vom isothermen IV-Typ, und der Oberflächenbereich und die Porengröße betrugen 120,7 m² g⁻¹, 2-8 nm und 1,012 cm³ g⁻¹. Die Ergebnisse zeigten, dass rGO@Fe₃O₄ mesoporöse Kanäle und eine durchschnittliche Porengrößenverteilung besaß, was großes Potenzial für die Beladung von Antitumor-Medikamenten aufwies. Dann wurden die rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln mit poröser Struktur verwendet, um ein Modell-Chemotherapeutikum Doxorubicin durch einfaches Mischen und leichtes Sonizieren zu beladen. Die ATR-FTIR-Analyse verifizierte weiterhin die stabile Einbindung von DOX in rGO@Fe₃O₄ aufgrund der charakteristischen Resonanz von -COOH und Benzolgruppen von DOX bei 1726 cm⁻¹ und 1618 cm⁻¹ (Abb. 4c). Rasterelektronenmikroskopie (SEM) zeigte, dass die neuen Signale von N-Elementen, die DOX zugeordnet sind, nach DOX-Beladung gleichmäßig in der Mikrokugel verteilt waren (Abb. 4d, e). Darüber hinaus betrugen die DOX-Beladungseffizienz (LE) und Beladungskapazität (LC) von rGO@Fe₃O₄/DOX 92,15 % bzw. 18,43 %. Die bemerkenswert höheren LCs von rGO@Fe₃O₄/DOX im Vergleich zu vielen Drug-Carriern können auf die extrem hohen Oberflächenbereiche und Porengrößen zurückgeführt werden [19]. Die hohe LE von rGO@Fe₃O₄/DOX kann auf zwei Aspekte zurückgeführt werden: Erstens kann rGO@Fe₃O₄ durch starke π-π-Stapelung zwischen sp²-hybridisierten π-Bindungen von rGO@Fe₃O₄ und dem Chinon-Anteil von DOX mit DOX interagieren [21], und zweitens können sie Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Carbonsäure (-COOH), Hydroxyl (-OH) Gruppen von rGO@Fe₃O₄ und den Amin (-NH₂), Hydroxyl (-OH) Gruppen von DOX bilden. Dann überwachten wir das DOX-Freisetzungsverhalten in PBS bei pH 7,4, 6,5 und 5,4, um die extrazellulären Umgebungen von Tumor- und Normalgeweben zu simulieren. Wie in Abb. 4f angegeben, wurde die Freisetzungsrate von DOX beschleunigt, wenn der pH-Wert von 7,4 auf 5,4 eingestellt wurde, und die anhaltende DOX-Freisetzung bei pH 5,4 konnte nach 98-stündiger Behandlung bis zu 73 % betragen. Daher zeigte das kumulative Freisetzungsprofil von DOX aus rGO@Fe₃O₄ ein pH-abhängiges Verhalten. Diese beschleunigte Freisetzung unter sauren Bedingungen könnte auf die partielle Protonierung der Hydroxyl- und Aminogruppen von DOX zurückzuführen sein, was zu höherer Arzneimittellöslichkeit und Schwächung der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen DOX und Graphen führt [38]. Darüber hinaus untersuchten wir auch das NIR-responsive DOX-Freisetzungsverhalten in vitro. Wie in Abb. 4g angegeben, wurde die DOX-Freisetzung durch NIR-Bestrahlung beschleunigt und die Freisetzungsrate von DOX betrug bis zu 85 %. Dieses pH- und NIR-stimuli-responsive Verhalten spielt eine wichtige Rolle in der effektiven Drug Delivery zum Tumorstandort.

In vitro-Zellaufnahme

Um die magnetische Targeting-Fähigkeit von Fe₃O₄ in rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln zu verifizieren, wurden zelluläre Aufnahmeexperimente mit oder ohne magnetische Feldbehandlung qualitativ mittels Konfokal-Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) untersucht. HeLa-Zellen wurden 4 Stunden mit rGO@Fe₃O₄/DOX inkubiert, und die Kerne der HeLa-Zellen wurden mit DAPI gefärbt. Die Ergebnisse in Abb. 5 zeigten, dass der schwarze Fleck, der rGO@Fe₃O₄-Mikrokugeln entspricht, und offensichtliche intrazelluläre rote Fluoreszenzsignale, die DOX zugeordnet sind, in der rGO@Fe₃O₄-Gruppe mit magnetischer Feldbehandlung beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu waren weniger schwarze Flecken und schwächere DOX-Fluoreszenz zu finden, wenn die rGO@Fe₃O₄-Gruppe ohne magnetische Feldbeladung war. Die Erklärung könnte sein, dass der schwarze Fleck, der auf rGO@Fe₃O₄ zurückzuführen ist, der in die Zelle internalisiert wurde, durch den Magneten gefördert werden könnte. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Fe₃O₄ in rGO@Fe₃O₄/DOX HeLa-Zellen spezifisch und effizient gezielt ansprechen und die Zellinternalisierung der Mikrokugeln signifikant verbessern kann, was die günstige magnetische Targeting-Fähigkeit des Drug-Delivery-Systems in der Krebstherapie demonstriert.

In vitro-Zytotoxizitäts-Analysen

Die Biokompatibilität von rGO@Fe₃O₄ wurde mittels CCK-8-Assay gegenüber HeLa-Zellen bewertet. Wie in Abb. 6a gezeigt, lag die Zelllebensfähigkeit nach Inkubation mit rGO@Fe₃O₄ bei einem breiten Konzentrationsbereich auch bei hohen Konzentrationen bis zu 200 µg ml⁻¹ über 90 %, was darauf hindeutete, dass rGO@Fe₃O₄ eine hohe Biokompatibilität aufweist und als effiziente Drug-Delivery-Plattform dienen könnte. Die Photothermie-Wirksamkeit von rGO@Fe₃O₄ wurde weiter nach Inkubation mit HeLa-Zellen für 24 und 48 Stunden unter NIR-Lichtbestrahlung (808 nm NIR-Laser, 10 min) untersucht. Wie in Abb. 6b gezeigt, war die Phototoxizität bei NIR-Stimulation deutlich dosisabhängig, und die Zelllebensfähigkeit sank von 90,37 auf 35,52 % nach 24 Stunden und von 93,77 auf 31,75 % nach 48 Stunden, was implizierte, dass rGO@Fe₃O₄ eine exzellente Phototoxizität aufwies und großes Versprechen in der Photothermie hielt. Um die synergistische therapeutische Wirksamkeit der Photothermie-Chemotherapie zu schätzen, wurde die Zytotoxizität von rGO@Fe₃O₄/DOX gegenüber HeLa-Zellen mit und ohne NIR-Bestrahlung untersucht. Wie in Abb. 6c, d gezeigt, zeigte die Zelllebensfähigkeit eine konzentrationsabhängige und zeitkontrollierte Weise. Etwa 65 % und 80 % der HeLa-Zellen wurden durch rGO@Fe₃O₄/DOX ohne NIR-Bestrahlung und DOX nach 24 Stunden abgetötet; die verringerte Tumorabtötungsfähigkeit von rGO@Fe₃O₄/DOX im Vergleich zu freiem DOX könnte auf das verzögerte DOX-Freisetzungsverhalten der rGO@Fe₃O₄/DOX-Mikrokugeln zurückzuführen sein. Nach NIR-Laserbestrahlung (808 nm NIR-Laser, 10 min) tötete die rGO@Fe₃O₄/DOX mit Laser-Gruppe mehr als 86 % der Zellen bei einer äquivalenten DOX-Dosis (30 µg ml⁻¹). Ähnliche Ergebnisse konnten nach derselben Behandlung der Zellen für 48 Stunden beobachtet werden; der Rückgang der Zelllebensfähigkeit in der DOX-, rGO@Fe₃O₄/DOX-, rGO@Fe₃O₄/DOX mit NIR-Bestrahlung-Gruppe betrug 80 %, 76 % bzw. 90 %, was einen synergistischen Effekt der kombinierten Photothermie und Chemotherapie anzeigte.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend haben wir eine einfache Strategie erforscht, um eine rGO-basierte Drug-Delivery-Plattform rGO@Fe₃O₄/DOX für synergistische Photothermie-Chemotherapie zu konstruieren. rGO@Fe₃O₄/DOX-Mikrokugeln zeigten einen exzellenten NIR-getriggerten PTT-Effekt und perfekte NIR-Photothermische Stabilität. Das Fe₃O₄ auf den Mikrokugeln sicherte eine exzellente Tumorzellen-Targeting-Fähigkeit. DOX konnte in rGO@Fe₃O₄ mit einer ultrahohen Arzneimittelbeladungskapazität eingekapselt werden, und ein pH-responsives Freisetzungsverhalten konnte gleichzeitig erreicht werden. Darüber hinaus wurde eine verbesserte Antitumor-Wirksamkeit erreicht, wenn eine Kombination aus Chemotherapie und Photothermie angewendet wurde. Daher könnte diese multifunktionale Drug-Delivery-Plattform ein vielversprechender Kandidat für Tumor-Targeting und kombinatorische Krebstherapie in der Zukunft sein.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Daten und die Analyse in der aktuellen Arbeit sind auf angemessene Anfrage bei den korrespondierenden Autoren verfügbar.

Abkürzungen

DDS:

Drug delivery system

NIR:

Near-infrared

GO:

Graphene oxide

DOX:

Doxorubicin

DMEM:

Dulbecco's minimum essential medium

DAPI:

4',6-diamidino-2-phenylindole

CCK-8:

Cell counting kit-8

SEM:

Scanning electron microscopy

TEM:

Transmission electron microscope

XRD:

X-ray diffraction system

XPS:

X-ray photoelectron spectroscopy

FTIR:

Fourier transform infrared spectroscopy

TGA:

Thermogravimetric analyzer

LE:

Loading efficiency

LC:

Loading capacity