Temperatur- und pH-responsive PNIPAM-basierte Nanggele für dual-stimulierte β-Lapachon-Freisetzung

Zusammenfassung

Poly-N-isopropylacrylamid (PNIPAM)-Nanogele wurden mit Acrylsäure (AAc) copolymerisiert, um die untere kritische Lösungstemperatur (LCST) einzustellen. Die resultierenden PNIPAM-co-AAc-Nanogele zeigen zwei distinkte Volumenphasenübergänge, wobei die LCST mit zunehmendem AAc-Gehalt ansteigt. Bei Beladung mit β-Lapachon (β-LP) wird die Wirkstofffreisetzung sowohl durch Temperatur als auch pH gesteuert und stark vom AAc-Verhältnis beeinflusst. Bemerkenswert ist, dass die PNIPAM-co-AAc20-Formulierung bei saurem-neutralem pH und Körpertemperatur <10 % Wirkstofffreisetzung aufweist, während bei basischem pH >70 % freigesetzt werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass temperatur- und pH-responsive PNIPAM-Nanogele vielversprechende Träger für darm-spezifische Wirkstofffreisetzung via oraler Verabreichung sind.

Einleitung

Stimuli-responsive Nanocarrier werden zunehmend in der Wirkstofffreisetzung, Bildgebung und Diagnostik eingesetzt. Unter den verwendeten Triggern – pH, Temperatur, Redox, Magnetfeld, Licht – bleiben Temperatur und pH die am weitesten verbreiteten für kontrollierte Freisetzung. PNIPAM, ein thermoresponsives Polymer, kollabiert oberhalb seiner LCST (~32 °C) aufgrund hydrophober Wechselwirkungen, während deprotonierte Carboxylgruppen in AAc zusätzliche elektrostatische Abstoßung einführen, die die LCST nach oben verschiebt. Die Copolymerisation von PNIPAM mit AAc bietet daher eine einstellbare Plattform, die auf sowohl Temperatur als auch pH reagieren kann. β-Lapachon, ein natürliches Antikrebsmittel, hat ein begrenztes therapeutisches Fenster aufgrund seines schnellen Metabolismus und Off-Target-Toxizität; die Einkapselung in responsive Nanogele kann diese Nachteile mildern. In dieser Studie berichten wir über die Synthese von PNIPAM-co-AAc-Nangelen mit variierendem AAc-Gehalt, ihr dual-stimuli Wirkstofffreisetzungsverhalten und ihre zytotoxische Wirksamkeit in Fibroblastenzellen.

Methoden

Materialien

NIPAM (97 %, Sigma-Aldrich), N,N'-Methylenbisacrylamid (MBA), AAc, destilliertes Wasser, EtOH, Kaliumpersulfat (KPS, 98 %, Dae Jung), β-LP (Natural Products) und PBS waren analytischer Qualität und wurden unverändert verwendet.

Synthese von PNIPAM-co-AAc-Nangelen

In einem 500 mL Kolben wurden 2,26 g NIPAM, 0,154 g MBA und 0–0,145 g AAc in 200 mL Wasser bei 75 °C gelöst. Nach Stickstoffspülung wurden 37,5 mg KPS zugegeben und das Gemisch 10 min unter Reflux gehalten, wodurch eine trübe Lösung entstand. Das Polymer wurde dialysiert (12–14 kDa) für 7 Tage, in flüssigem Stickstoff gefroren und 3 Tage lyophilisiert, um trockene Nanogele zu erhalten (PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5, PNIPAM-co-AAc10, PNIPAM-co-AAc20).

β-LP-Beladung

1 mg getrocknetes Nanogel wurde in 1 mL EtOH gelöst und 0,1 mg β-LP zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht im Dunkeln gerührt, dann dialysiert (6–8 kDa), gefroren und lyophilisiert. Die resultierenden β-LP-beladenen Nanogele wurden bei 4 °C gelagert.

Charakterisierung

Morphologie wurde per TEM (200 kV) und FE-REM (15 kV) untersucht. FT-IR-Spektren wurden auf einem Nicolet 6700 Spektrometer aufgenommen. Wirkstoffbeladung und -freisetzung wurden per UV-Vis-Spektroskopie (200–800 nm) quantifiziert. Die LCST wurde durch dynamische Lichtstreuung (DLS) in 1 °C-Schritten von 30 bis 50 °C bestimmt.

Wirkstofffreisetzungsstudien

10 mL β-LP-beladener Nanogele wurden in 3,5 kDa-Dialysetuben gegeben und bei 24 °C und 37 °C in PBS bei pH 2, 4, 7,4 und 8,0 inkubiert. Zu festgelegten Zeitpunkten (0–12 h) wurden 2 mL Aliquots entnommen und per UV-Vis analysiert. Die kumulative Freisetzung wurde relativ zur gesamten beladenen β-LP-Menge berechnet.

Zellviabilitätsassays

NIH3T3-Fibroblasten (2×10⁴ Zellen/Well) wurden mit freiem β-LP, PNIPAM-co-AAc5-β-LP oder PNIPAM-co-AAc20-β-LP bei 0–20 µg/mL behandelt. Nach 3 h wurden MTT-Assay (595 nm) und LIVE/DEAD®-Färbung durchgeführt, um die Zytotoxizität zu bewerten.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung und Morphologie

TEM- und REM-Bilder (Abb. 1) zeigten monodisperse Nanogele mit mittleren Durchmessern von ~250 nm für PNIPAM-co-AAc5. Zeta-Potenziale sanken von −13,6 mV (PNIPAM) auf −23,6 mV (PNIPAM-co-AAc20), was die erhöhten Oberflächen-Carboxylgruppen widerspiegelt.

Temperatur-responsives Verhalten

DLS-Messungen (Abb. 2) zeigten zwei distinkte Schwell-Kollaps-Übergänge. Der erste Übergang begann bei ~30 °C, der zweite erschien nahe 40 °C und verschob sich auf 45 °C für PNIPAM-co-AAc20. Somit steigt die LCST mit dem AAc-Gehalt, konsistent mit früheren Berichten.

Dual-stimuli Wirkstofffreisetzung

Bei 37 °C gab PNIPAM-co-AAc20 nur ~61 % β-LP innerhalb von 6 h frei, während PNIPAM und PNIPAM-co-AAc5 ~80 % freisetzten. Bei pH 8,0 stieg die Freisetzung aus PNIPAM-co-AAc20 um ~10 % im Vergleich zu neutralem oder saurem pH (Abb. 3). Diese Ergebnisse bestätigen, dass die Wirkstofffreisetzung synergistisch durch basisches pH und erhöhte Temperatur verstärkt wird.

In-vitro Zytotoxizität

Freies β-LP reduzierte die Zellviabilität stärker als die Nanogel-Formulierungen. PNIPAM-co-AAc20 zeigte bei 20 µg/mL höhere Zellviabilität, was mit seiner geringeren Wirkstofffreisetzung bei 37 °C korreliert. Live/Dead-Färbung (Abb. 4) zeigte ausgeprägte Zytotoxizität für PNIPAM-co-AAc5-β-LP nach 3 h, während PNIPAM-co-AAc20-β-LP weitgehend ungiftig blieb bis 6 h bei pH 8,0, wo synergistischer Zelltod beobachtet wurde.

Schlussfolgerungen

Wir haben erfolgreich PNIPAM-co-AAc-Nanogele entwickelt, deren LCST durch den AAc-Gehalt eingestellt werden kann. Die High-AAc (20 %) Formulierung zeigt minimale β-LP-Freisetzung bei physiologischer Temperatur, setzt den Wirkstoff jedoch effizient bei basischem pH frei, was der Umgebung des Dünndarms entspricht. Diese dual-stimuli-responsiven Nanogele stellen daher eine überzeugende Plattform für orale, darm-zielgerichtete Freisetzung von β-Lapachon dar.

Abkürzungen

AAc

Acrylsäure (Acrylic acid)

DLS

Dynamische Lichtstreuung (Dynamic light scattering)

FE-REM

Feldemissions-Rasterelektronenmikroskopie (Field emission scanning electron microscopy)

FT-IR

Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (Fourier-transform infrared spectrometer)

KPS

Kaliumpersulfat (Potassium persulfate)

LCST

Untere kritische Lösungstemperatur (Lower critical solution temperature)

MBA

N,N'-Methylenbisacrylamid (N,N'-methylenebisacrylamide)

PNIPAM

Poly-N-isopropylacrylamid (Poly-N-isopropyl acrylamide)

TEM

Transmissionselektronenmikroskopie (Transmission electron microscopy)

β-LP

β-Lapachon

Abbildungen

Abbildung 1. TEM (a) und REM (b) Bilder von PNIPAM-co-AAc5-Nangelen. (c) Sol-Gel-Übergang bei 30 °C. (d) Zeta-Potenzial vs. AAc-Gehalt. (e) Hydrodynamischer Durchmesser bei 30 °C und 50 °C.

Abbildung 2. FT-IR-Spektren von PNIPAM mit 0–20 % AAc.

Abbildung 3. Temperaturabhängigkeit des hydrodynamischen Durchmessers für PNIPAM und PNIPAM-co-AAc-Derivate bei pH 7,4.

Abbildung 4. Kumulative β-LP-Freisetzung aus PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5 und PNIPAM-co-AAc20 bei 24 °C und 37 °C (pH 7,4).

Abbildung 5. β-LP-Freisetzung aus PNIPAM-co-AAc20 bei pH 2, 4, 7,4 und 8,0.

Abbildung 6. Antiproliferative Aktivität von β-LP und β-LP-beladenen Nangelen an NIH3T3-Zellen nach 3 h bei 37 °C.

Abbildung 7. Live/Dead-Färbung von NIH3T3-Zellen behandelt mit β-LP, PNIPAM-co-AAc5-β-LP und PNIPAM-co-AAc20-β-LP (pH 7,4 und pH 8,0).