Tumor-gezielte und biokompatible MoSe2-Nanodots@Albumin-Nanosphären als dualer Therapiewirkstoff für die synergistische photothermische Strahlentherapie

Hintergrund

Weltweit tritt Brustkrebs mit einer sehr hohen Inzidenzrate bei Frauen auf und ist berüchtigt für seine niedrige Überlebensrate und hohe Metastasierungs- und Rückfallraten [1, 2, 3]. Chirurgische Resektion, Strahlentherapie (RT) und Chemotherapie sind in der Praxis häufig verwendete Behandlungsstrategien, obwohl diese Therapien Nachteile haben [4]. RT ist eine hochwirksame Therapie, aber auch schädlich für normales Gewebe. RT wurde im Hinblick auf eine verbesserte therapeutische Wirkung untersucht, während sie ihre schädlichen Wirkungen verringert. Die RT verwendet ionisierende Strahlung (z. B. γ-Strahlung, Röntgenstrahlung), um Wassermoleküle zu reaktiven freien Radikalen zu ionisieren, die die DNA in Krebszellen lokal, sogar in tieferen Regionen, schädigen [5]. Da die Tumormikroumgebung als hypoxisch beschrieben wurde, wurde dies als eines der Haupthindernisse für die RT angesehen [6, 7]. Angesichts dieser Nachteile wurde berichtet, dass die Kombination von RT mit anderen therapeutischen Modalitäten wirksam ist, um die therapeutischen Wirkungen zu verstärken. Bis heute wurde die photothermische Therapie (PTT) aufgrund der geringeren Nebenwirkungen, der hohen Spezifität und der minimalen Nebenwirkungen auf normales Gewebe als minimal-invasive Krebsbehandlung umfassend untersucht [8,9,10,11,12,13,14,15 ]. PTT allein ist jedoch aufgrund unvollständiger Tumorsuppression, insbesondere bei unzugänglichen Tumoren, oft unzureichend, was möglicherweise zu einem Tumorrezidiv führen könnte [16,17,18]. Interessanterweise wurde berichtet, dass PTT zu einer durch Nahinfrarot (NIR) induzierten Hyperthermie führt, die die intratumorale Blutzirkulation erhöht und anschließend die Sauerstoffverfügbarkeit in der Tumormikroumgebung erhöht, was dazu führt, dass die Zellen empfindlicher auf RT reagieren [19,20,21]. Die Kombination von RT mit PTT könnte die Vorteile beider kombinieren, was für die Verbesserung der therapeutischen Ergebnisse von Krebs vorzuziehen ist.

Kürzlich wurden zweidimensional (2D) geschichtete Übergangsmetalldichalkogenide (TMDs) wie MoS₂ , WS₂ , ReS₂ , usw. wurden aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften als NIR-Adsorptionsmittel oder Radiosensibilisatoren zur Verbesserung der Wirksamkeit von PTT oder RT verwendet [7, 19, 21]. Shen und Co-Autoren haben über eine Bottom-up-Präparation von einheitlichem ultradünnem ReS₂ . berichtet Nanoblätter für bildgeführte hocheffektive PTT und RT [21]. Zusätzlich zu diesen TMDs, Molybdänselenid (MoSe₂ ) wurden als photothermischer NIR-Wandler für PTT beschrieben [22, 23]. Da PTT allein seinen Nachteil hat, gibt es noch mehr Gründe für die Nutzung von MoSe₂ Eigenschaften wie Strahlensensibilisierung für eine bessere Krebstherapie.

In dieser Arbeit haben wir zuerst das ultrakleine MoSe₂ . hergestellt Nanodots, die dann mit Rinderserumalbumin (BSA) zu Nanosphären (NSs) zusammengesetzt und schließlich über Polyethylenglykol (PEG)-„Brücken“ mit dem tumorgerichteten Molekül Folsäure (FA) konjugiert wurden. Neben dem großartigen photothermischen Effekt ist das erhaltene FA-MoSe₂ Es wurde festgestellt, dass @BSA-NSs ausgezeichnete Funksensibilisierungseigenschaften aufweisen. Die BSA-Modifikation verlieh dem MoSe₂ Nanodots (NDs) mit ausgezeichneter physiologischer Stabilität und Biokompatibilität. In-vitro- und in-vivo-Experimente zeigten, dass FA-MoSe₂ @BSA-NSs zeigten eine ausgezeichnete Tumor-Targeting-Wirkung, während sie gleichzeitig als photothermisches NIR-Mittel und Strahlensensibilisator für eine synergistische photothermische Strahlentherapie ohne Toxizität für das Gesundheitsgewebe fungierten.

Methoden

Materialien

FA-PEG₅₀₀₀ -NHS und CH₃ -PEG₅₀₀₀ -NHS wurden von Shanghai Ponsure Biotech bezogen. Co. Ltd. Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Rinderserumalbumin (BSA, gereinigt ≥ 98,0%), Bulk-MoSe₂ Pulver und Calcein-AM (CA)-Propidiumiodid (PI)-Färbung wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) wurde von Aladdin (Shanghai, China) bezogen. Die Zellkultivierungsreagenzien wurden alle von Corning Inc. bereitgestellt. Das Zellzählungskit-8 (CCK-8) wurde von Dojindo Laboratories (Japan) bereitgestellt. Der γ-H2AX-Antikörper wurde von Millipore (Temecula, CA) geliefert.

Vorbereitung von FA-MoSe₂ @BSA-NSs

Erstens, in einem typischen Verfahren 50 mg MoSe₂ Pulver wurde unter 20-minütigem Rühren in 25 ml destilliertes Wasser gegeben und dann in einem Eisbad unter Verwendung von Spitzenbeschallung (Scientz-IID, 950 W, 25 kHz) beschallt. Die Beschallung wurde für 2 s an und 3 s aus für eine Gesamtbeschallungszeit von 12 h mit einer Amplitude von 70 % gepulst. Danach wurde die Mischung mit 6000 U/min für 25 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und erneut 30 Minuten bei 12.000 U/min zentrifugiert, was zu MoSe₂ . führte Nanopunkte (MoSe₂ NDs) Lösung. Danach wurden 25 mg BSA-Pulver unter leichtem Rühren in den obigen Überstand gegeben, wodurch nach 6 h Rühren bei 25 °C und pH = 7,4 gehärtete Koazervate gebildet wurden, und wurde dann durch Vernetzung mit 0,5% Glutaraldehyd (250 μL) verarbeitet. Danach wurde das Glutaraldehyd durch Dialyse in Wasser für 1 Tag entfernt, was zu MoSe₂ . führte @BSA-Nanosphären (MoSe₂ .) @BSA-NS). Als nächstes MoSe₂ @BSA-Nanosphären wurden in zwei Teile geteilt, der eine ist mit FA-PEG₅₀₀₀ gemischt -NHS (8 mg), und das andere wurde mit CH₃ . gemischt -PEG₅₀₀₀ -NHS (8 mg)-Lösung und 2 h gerührt. Zuletzt wurde die Lösung in Wasser dialysiert, um gereinigtes FA-MoSe₂ . zu erhalten @BSA NSs und MoSe₂ @BSA NSs-Lösung. Die vorbereitete Lösung wurde bei 4 °C gelagert. Darüber hinaus wurde ein UV-VIS-Spektrometer verwendet, um die FA auf dem FA-MoSe₂ . zu quantifizieren @BSA-NSs. Im Detail, nach dem Mischen von MoSe₂ @BSA-Nanosphären mit FA-PEG₅₀₀₀ -NHS (8 mg) und 2 h reagieren, wurde die Mischung zentrifugiert, um das ungebundene FA zu entfernen. Der Überstand wurde zum Absorptionsnachweis gesammelt. Die FA-Konzentration wurde mit einem UV-Vis-Spektrometer bei der FA-Absorptionspeakwellenlänge (280 nm) nachgewiesen. Die FA-Einkapselungseffizienz (EE) wurde wie in der folgenden Gleichung beschrieben berechnet:

Charakterisierungen von FA-MoSe₂ @BSA-NSs

Die Morphologie der Proben wurde mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM, JEOL JEM2011, Tokio, Japan) und einem Rasterelektronenmikroskop (SEM, Hitachi FE-SEM S-9300, Janpan) beobachtet. Zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., UK) wurde auf das Größen- und Zetapotential hin verwendet. Die UV-Vis-Absorptionsspektren (UV-Vis) wurden auf einem UV2550-UV-Vis-Spektrophotometer (Shimadzu, Kyoto, Japan) aufgezeichnet. Die Fourier-Transformations-Infrarot-(FTIR)-Spektren wurden mit einem FTIR-Spektrometer (BRUKER VERTEX 70, Ettlingen, Deutschland) nachgewiesen. Die Röntgenpulverbeugung (XRD) der Nanokugeln wurde mit einem Röntgendiffraktometer (Seifert Jso-Debyerex-2002, Deutschland) aufgezeichnet. Der Gehalt an Mo in Zellen und Gewebe wurde durch induktiv gekoppelte Plasma-Atomemissionsspektrometrie (ICP-AES, Hitachi P4010, Japan) gemessen. Während der NIR-Bestrahlung wurde die Temperaturänderung alle 30 s mit einem Thermoelement-Thermometer (Fluke, USA) aufgezeichnet.

Zellkultur und zelluläre Aufnahme

Mammatumor-4T1-Zellen der Maus wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) erworben und in DMEM-Medien, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin, bei 37 °C mit 5 % CO₂ . kultiviert .

Für die zelluläre Aufnahme wurde FITC verwendet, um die NSs durch physikalische Absorption zu markieren. 4T1-Zellen hafteten an Glasobjektträgern in 6-Well-Platten und wurden mit freiem FITC, MoSe₂ . inkubiert @BSA NSs, FA-MoSe₂ @BSA NSs + FA und FA-MoSe₂ @BSA NSs mit derselben FITC-Konzentration (0,05 mg/ml) jeweils 3 h lang. Die Zellen wurden dann dreimal mit PBS gewaschen und mit 0,2 ml Glutaraldehyd fixiert, gefolgt von einer Färbung mit DAPI für 10 Minuten. Die Fluoreszenzbilder von Zellen wurden mit dem Laserscanningmikroskop aufgenommen. Um die zelluläre Aufnahme weiter zu beobachten, 4T1-Zellen (2 × 10 ⁵ Zellen/Well) wurden 24 h in einer 6-Well-Zellkulturplatte kultiviert und dann mit MoSe₂ . inkubiert @BSA NSs, FA-MoSe₂ @BSA NSs + FA und FA-MoSe₂ @BSA NSs für zusätzliche 3 Stunden. Danach wurden die behandelten Zellen dreimal vorsichtig mit PBS gewaschen, homogenisiert und 4 h mit 1 ml Königswasserlösung behandelt. ICP-AES wurde verwendet, um den Mo-Gehalt in den Zellen nachzuweisen. Aufnahmeverhältnis =\( \frac{\mathrm{Ma}}{\mathrm{Mb}} \)× 100%, wobei Ma die Masse des Mo in den Zellen und Mb die Masse des insgesamt hinzugefügten Mos ist.

In-vitro-Biokompatibilität

Zunächst wurde Vollblut von Gesundheitsmäusen gesammelt, um die in vitro-Hämolyse von FA-MoSe₂ . nachzuweisen @BSA-NSs. Im Detail wurden rote Blutkörperchen (RBCs) durch Zentrifugation gesammelt. Nach Verwerfen der Überstände wurden die gesammelten Erythrozyten mit FA-MoSe₂ . gemischt @BSA NSs (in PBS, 1:4) in vorbestimmten Konzentrationen (50 μg/ml, 100 μg/ml, 150 μg/ml, 200 μg/ml und 400 μg/ml). Als Positiv- oder Negativkontrolle wurden RBCs mit entionisiertem Wasser oder PBS inkubiert. Nach 1 h Stehenlassen bei 37 °C wurde der obige Satz von Suspensionen zentrifugiert (10.000 U/min, 1 min) und die Absorption der Überstände bei 541 nm wurde mit einem UV-Vis-Spektrometer überwacht. Das Hämolyseverhältnis wurde unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet.

wo A _t , A _PC , und A _nc sind die Extinktion des Überstands bei 541 nm der Testprobe, positiver bzw. negativer Kontrollen.

Darüber hinaus ist die Zytotoxizität von MoSe₂ @BSA NSs und FA-MoSe₂ @BSA-NSs wurden durch einen Standard-CCK-8-Assay nachgewiesen. 4T1-Zellen (1 × 10 ⁵ Zellen/ml, 0,5 ml) wurden in 96-Well-Platten ausgesät und für 24 h kultiviert. Nach dem Entsorgen der alten Medien frische Medien mit 0,01, 0,1, 0,15, 0,3 und 0,4 mg/ml MoSe₂ @BSA NSs und FA-MoSe₂ @BSA-NSs wurden 24 h mit 4T1-Zellen inkubiert. PBS wurde verwendet, um die Zellen dreimal mild zu waschen. Eine 100 μl CCK-8-Arbeitslösung (10 % CCK-8 + 90 % DMEM) wurde dann in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C für 1 h. Der Absorptionswert bei 450 nm wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (Labtech, Inc., Durham, North Carolina) erfasst.

Photothermische In-vitro-Strahlentherapie

Zunächst wurde die photothermische Leistung der NS in vitro untersucht. MoSe₂ @BSA NSs und FA-MoSe₂ @BSA-NSs mit denselben Mo-Konzentrationen, 3 h lang mit Zellen kultiviert und dann 5 min lang mit NIR-Bestrahlung bestrahlt (808 nm, 1 W/cm ² ). Die Temperatur der behandelten Zellen in jeder Vertiefung wurde jeweils mit einer Infrarot-Wärmekamera (Fluke TI25, USA) erfasst.

Als nächstes wurden für die photothermische In-vitro-Therapie adhärente 4T1-Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von MoSe₂ . kultiviert @BSA NSs und FA-MoSe₂ @BSA NS für 3 h. Die NSs außerhalb der Zellen wurden entfernt. Die Zellen wurden dann mit oder ohne NIR (808 nm, 1 W/cm ² .) behandelt , 5 min) und unterschiedlicher Dosis der Röntgenbestrahlung (RT, 0–5 Gy, 0,084 Gy/s). Nach einer weiteren 24-stündigen Inkubation wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch einen Standard-CCK-8-Assay nachgewiesen. Die oben behandelten Zellen wurden weiter mit Calcein-AM/PI co-gefärbt, um die lebenden und toten Zellen nachzuweisen, und dann mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop abgebildet (Calcein-AM:Ex = 488 nm, Em = 515 nm; PI:Ex =535 nm, Em = 617 nm). Darüber hinaus wurden die behandelten Zellen auch durch -H2AX-Immunfluoreszenz analysiert. Nach der obigen Behandlung wurden die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 10 Minuten fixiert und mit Methanol für 15 Minuten bei – 20 °C permeabilisiert und mit PBS gewaschen. Danach wurden die Zellen mit einem Blockierungspuffer (1% BSA in PBS-Lösung) für 1 h bei 25 °C gemischt und weiter mit anti-Phospho-Histon γ-H2AX monoklonalen Maus-Antikörper (Verdünnung 1:500) über Nacht bei 4 ° . inkubiert C. Nach dem Waschen mit PBS wurde die Fluoreszenz der Zellen mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop beobachtet.

Tiermodell

Balb/c-Nacktmäuse (5–8 Wochen alt) wurden von Charles River Laboratories (Beijing, China) bereitgestellt. Um ein tierisches 4T1-Tumormodell zu etablieren, 150 μl von 10 ⁶ Suspensionszellen wurden subkutan in den Rücken der Maus injiziert. Die Mäuse wurden im Tierraum gefüttert und alle 2 Tage beobachtet. Alle Tierschutz- und experimentellen Verfahren in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Nationalen Gesundheitsministeriums durchgeführt und von der Ethikkommission des Ersten Volkskrankenhauses der Stadt Shangqiu genehmigt. Wenn das Tumorvolumen 100 mm ³ . erreichte , wurden die Mäuse für In-vivo-Experimente verwendet.

In-vivo-Bioverteilung und Blutzirkulation

Die systemische Bioverteilung der NS wurde in 4T1-Tumor-tragenden Mäusen untersucht. 1 h, 1 Tag, 7 Tage und 24 Tage nach der intravenösen Injektion von MoSe₂ @BSA NSs und FA-MoSe₂ @BSA (10 mg/kg), der Tumor und die wichtigsten Organe (Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere) wurden gewogen und 12 h mit Königswasserlösung verdaut. Der Mo- und Se-Gehalt in diesen Geweben wurde durch ein ICP-AES analysiert. Außerdem wurde gesunden Balb/c-Mäusen FA-MoSe₂ . intravenös injiziert @BSA (10 mg/kg). Ungefähr 10 μl Blut aus dem Schwanz von Mäusen wurden gesammelt und mit einem ICP-AES auf die Blutzirkulation analysiert.

Photothermische In-vivo-Strahlentherapie

Für die photothermische In-vivo-Strahlentherapie werden tumortragende Mäuse (n = 5 pro Gruppe) wurden mit PBS + NIR, PBS + RT, MoSe₂ . behandelt @BSA NSs + NIR + RT, FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT, FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR und FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT (mit 5 mg/kg MoSe₂ ). Die Strahlentherapiedosis betrug 5 Gy. 24 Stunden nach intravenöser Injektion wurde die Tumorregion mit einer 5 Minuten langen NIR-Bestrahlung (808 nm, 1 W/cm ² .) bestrahlt ). Während der Bestrahlung wurden die Wärmebilder der Mäuse mit einer Infrarot-Wärmebildkamera aufgenommen. In den folgenden 30 Tagen wurden alle 4 Tage Länge und Breite des Tumors kontrolliert. Das relative Tumorvolumen wurde als V . berechnet /V ₀ , wobei V ₀ stellt das Tumorvolumen dar, als die Behandlung begonnen wurde. In der Zwischenzeit wurde das Körpergewicht jeder Maus alle 4 Tage überwacht.

In-vivo-Biokompatibilität

Für die In-vivo-Biokompatibilität 150 μl FA-MoSe₂ @BSA NS (15 mg/kg) wurde gesunden Balb/c-Nacktmäusen intravenös injiziert. Vor der Injektion und nach 30 Tagen wurde das Blut für ein komplettes Blutbild entnommen, einschließlich weißer Blutkörperchen (WBC), roter Blutkörperchen (RBC), Hämoglobin (HGB), mittleres Thrombozytenvolumen (MPV), mittleres korpuskulares Hämoglobin (MCH), Hämatokrit (HCT), mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration (MCHC), mittleres korpuskulares Volumen (MCV) und Thrombozyten (PLT). Gleichzeitig wurden die Mäuse getötet und Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere gesammelt. Die erhaltenen Organe wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und in 5 μm-Scheiben geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Die gefärbten Schnitte wurden mit einem Digitalmikroskop abgebildet.

Statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert  ± SD gezeigt. t . des zweischwänzigen Schülers Test wurde verwendet, um die statistische Signifikanz von zwei Gruppen zu analysieren. Die Unterschiede wurden für *P . als signifikant erachtet < 0,05 und hochsignifikant für **P < 0.01.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung und Charakterisierung von FA-MoSe₂ @BSA-NSs

Das Vorbereitungsverfahren des FA-MoSe₂ @BSA-NSs sind in Abb. 1a dargestellt. Kurz gesagt, instabiles MoSe₂ Nanopunkte wurden aus Bulk-MoSe₂ . hergestellt unter Ultraschall, dann durch BSA-Protein stabilisiert und zusammengesetzt und gleichzeitig über PEG-„Brücken“ an das Zielmolekül FA konjugiert. Das vorbereitete MoSe₂ NDs waren ultrakleine Nanopunkte, wie in TEM beobachtet (Abb. 1b). Das XRD-Muster von MoSe₂ NDs wurde in der zusätzlichen Datei 1 angezeigt:Abbildung S1. Der Beugungspeak bei 13,1° gehört zur (002)-Ebene und entspricht der Peakposition von Bulk-MoSe₂ . Der deutliche (002)-Peak weist auf die Existenz von wenigen Schichten in der c-Achse von MoSe₂ . hin NDs. Der Beugungspeak der (100)-Ebene für MoSe₂ NDs verbreitert sich signifikant im Vergleich zu Bulk-MoSe₂ , die möglicherweise auf die Größenreduktion von MoSe₂ . zurückzuführen ist NDs [23]. Nach dem Zusammenbau und der Konjugation mit BSA-Protein und FA bildeten die Nanokomposite kugelförmige Partikel (Abb. 1c). Die FTIR-Spektren zeigten die Existenz der –CONH- Bindung in FA-MoSe₂ @BSA NSs, was darauf hinweist, dass FA wahrscheinlich an MoSe₂ konjugiert war durch Esterbindung (zusätzliche Datei 1:Abbildung S2). Außerdem haben wir die FA auf dem FA-MoSe₂ . quantifiziert @BSA-Nanosphären, die 10,5 ± 0,11% betrug. Die DLS-Analyse ergab, dass die durchschnittlichen Durchmesser von MoSe₂ NDs und FA-MoSe₂ @BSA NS betrugen ungefähr 3,8 nm bzw. 139,8 nm (Abb. 1d). Nach 7 Tagen Lagerung ist die Größe von MoSe₂ NDs von 3,8 auf 63,2 nm erhöht, während FA-MoSe₂ @BSA-NSs zeigten keine offensichtliche Größenänderung (Abb. 1e), was auf eine Aggregation und die geringe Stabilität von MoSe₂ . hinweist NDs im Langzeitspeicher. Darüber hinaus wird FA-MoSe₂ . in verschiedenen Medien wie Wasser, PBS und Zellmedium dispergiert @BSA-NSs zeigten eine ähnliche Größenverteilung (Abb. 1f). Diese Ergebnisse zeigten die FA-MoSe₂ @BSA NSs sind unter physiologischen Bedingungen stabil und diese verbesserte Stabilität von MoSe₂ NDs werden wahrscheinlich der BSA-Assemblierung und der PEG-Beschichtung zugeschrieben [24, 25]. Wie in Abb. 1g gezeigt, sind die Ultraviolett-Vis-Spektren (UV-Vis) von MoSe₂ NDs und FA-MoSe₂ @BSA-NSs hatten ähnlich hohe NIR-Absorptionseigenschaften, was darauf hindeutet, dass die BSA- und FA-Modifikationen die Absorption von MoSe₂ . nicht beeinflussten .

a Ein Schema von FA-MoSe₂ @BSA NSs-Synthese. b TEM-Bild von MoSe₂ NDs. Eingefügt war das hochauflösende TEM-Bild. c Die TEM- und SEM-Bilder von FA-MoSe₂ @BSA-NSs. d Die Größenverteilung von MoSe₂ NDs und FA-MoSe₂ @BSA-NSs. e Die Größenänderung von MoSe₂ NDs und FA-MoSe₂ @BSA-NSs in Wasser über 7 Tage. f Die Größenverteilung von FA-MoSe₂ @BSA NSs in Wasser, PBS bzw. Medium. g Die Absorptionsspektren von MoSe₂ NDs und FA-MoSe₂ @BSA-NSs

Photothermische Wirkung von FA-MoSe₂ @BSA-NSs

Abbildung 2a zeigt, dass die Temperatur von FA-MoSe₂ @BSA NSs-Lösung nahm mit steigender Konzentration zu (0–200 μg/ml). Nach NIR-Bestrahlung (808 nm, 1 W/cm ² ) für 5 min die Temperaturänderung von FA-MoSe₂ @BSA NSs-Lösung mit 200 μg/ml erreichte ungefähr 41 °C, während die Temperatur von reinem Wasser unter den gleichen Bedingungen nur um ungefähr 1,5 °C anstieg. Darüber hinaus ist die Temperaturänderung von FA-MoSe₂ @BSA NS mit unterschiedlicher Leistungsintensität bestrahlt (0,5–2,0 W/cm ² ) für 5 Minuten wurde ebenfalls aufgezeichnet. Wie in Abb. 2b gezeigt, stieg die Temperatur mit zunehmender Laserleistungsintensität auf maximal 40,6 °C. Abbildung 2c zeigt die Photostabilität von FA-MoSe₂ @BSA NSs, was bedeutet, dass die FA-MoSe₂ @BSA-NSs behielten nach drei Zyklen NIR-Bestrahlung ihre hervorragenden photothermischen Effekte ohne Abschwächung der Temperaturerhöhung bei. Diese Ergebnisse zeigten, dass FA-MoSe₂ @BSA-NSs hatten eine signifikante Photostabilität und ausgezeichnete photothermische Eigenschaften. Wie in Abb. 2d gezeigt, sind die Werte der Hounsfield-Einheit (HU) von FA-MoSe₂ @BSA NSs-Bilder, die mit Computertomographie (CT) erhalten wurden, waren positiv mit ihren Konzentrationen korreliert, was darauf hindeutet, dass die NSs möglicherweise als Radiosensibilisator verwendet werden könnten.

a Photothermische Heizkurven von FA-MoSe₂ @BSA NSs-Lösung in verschiedenen Konzentrationen (0, 50, 100 und 200 μg/ml) unter 808 nm Laserstrahlung bei einer Leistungsdichte von 1 W/cm ² . b Photothermische Heizkurven von FA-MoSe₂ @BSA NSs-Lösung mit 100 μg/ml unter 808 nm Laserstrahlung bei unterschiedlicher Leistungsdichte (0,5, 1, 1,5 und 2 W/cm ² ). c Temperaturschwankungen von FA-MoSe₂ @BSA-NSs unter drei Zyklen von 808 nm Laserstrahlung bei einer Leistungsdichte von 1 W/cm ² . d CT-Bilder (Einschub) und HU-Werte von FA-MoSe₂ @BSA NSs mit unterschiedlichen Konzentrationen

Zelluläre Aufnahme und In-vitro-Biokompatibilität

Um die zelluläre Aufnahme zu bewerten, MoSe₂ @BSA NSs und FA-MoSe₂ @BSA-NSs wurden von FITC markiert. Wie in Abb. 3a dargestellt, wurde bei FA-MoSe₂ . eine viel stärkere FITC-Fluoreszenz im Zytoplasma beobachtet @BSA NSs-behandelte Zellen im Vergleich zu denen von MoSe₂ @BSA NSs- und freie FITC-behandelte Zellen. Die quantitative ICP-AES-Analyse zeigte eine höhere zelluläre Aufnahme von FA-MoSe₂ @BSA NSs als MoSe₂ @BSA-NSs (Abb. 3b). Diese Ergebnisse zeigten, dass FA die zelluläre Aufnahme von FA-MoSe₂ . verbessert @BSA-NSs. Interessanterweise wird nach einer FA-Blockierung der FA-MoSe₂ @BSA NSs-behandelte Zellen zeigten eine schwächere grüne FITC-Fluoreszenz im Zytoplasma im Vergleich zu Zellen ohne FA-Blockierung. Entsprechend ist die Zellaufnahmerate von FA-MoSe₂ @BSA NSs + FA-behandelte Zellen ist geringer als die von FA-MoSe₂ @BSA NSs-behandelte Zellen. Dies weist darauf hin, dass der FA-Rezeptor auf der Zellmembran (durch freie FA) behindert wird, was wiederum die Targeting-Fähigkeit und Zugänglichkeit von FA-MoSe₂ . verringert @BSA-NSs. Es zeigt weiter, dass der FA-Rezeptor in 4T1-Zellen überexprimiert wird und FA-MoSe2@BSA-NSs wahrscheinlich über einen rezeptorvermittelten Endocytose-Weg in die Zellen eindringen [26, 27].

a Konfokale Fluoreszenzbilder von 4T1-Zellen nach Inkubation mit freiem FITC und FITC-markiertem MoSe₂ @BSA NSs, FA-MoSe₂ @BSA NSs + FA-Blockierung und FA-MoSe₂ @BSA-NSs. Rote und blaue Farben repräsentieren FITC-Fluoreszenz bzw. DAPI-gefärbte Zellkerne. b Quantitative ICP-AES-Analyse von 4T1-Zellen in Richtung MoSe₂ @BSA NSs, FA-MoSe₂ @BSA NSs + FA-Blockierung und FA-MoSe₂ @BSA-NSs

Die In-vitro-Biokompatibilität der NS wurde durch Hämolyse- und Zytotoxizitätsanalysen bewertet. Abbildung 4a zeigte keine offensichtliche Hämolyse für FA-MoSe₂ @BSA NSs-behandelte rote Blutkörperchen (RBCs) oder PBS-behandelte RBCs. Bei Konzentrationen von bis zu 0,4 mg/ml MoSe₂ @BSA NSs und FA-MoSe₂ @BSA-NSs wurden 24 Stunden lang mit Zellen inkubiert, es gab eine Unterdrückung der Lebensfähigkeit von weniger als 10 %. Diese Ergebnisse legen nahe, dass FA-MoSe₂ @BSA-NSs haben eine hervorragende In-vitro-Biokompatibilität.

a Hämolyseverhältnis der Erythrozyten nach 1-stündiger Inkubation mit FA-MoSe₂ @BSA NSs in verschiedenen Konzentrationen. Der Einschub zeigt das Foto von Erythrozyten, die destilliertem Wasser, PBS und FA-MoSe₂ ausgesetzt waren @BSA NSs mit unterschiedlichen Konzentrationen, gefolgt von Zentrifugation. b Zelllebensfähigkeit von 4T1-Zellen nach Behandlung mit MoSe₂ @BSA NSs und FA-MoSe₂ @BSA-NSs in verschiedenen Konzentrationen für 24 Stunden

Photothermische In-vitro-Strahlentherapie

Wie in Abb. 5a, b gezeigt, mit FA-MoSe₂ . behandelte Zellen @BSA-NSs zeigten den höchsten Temperaturanstieg (ΔT = 23,6 °C) nach 5 Minuten NIR-Bestrahlung (808 nm, 1 W/cm ² ) im Vergleich zu MoSe₂ @BSA NSs- und PBS-behandelte Zellen. Abbildung 5c zeigt eine Verbesserung der RT-Wirksamkeit durch Zugabe von FA-MoSe₂ @BSA-NSs. Mit steigender Röntgendosis wird die RT-Wirksamkeit von FA-MoSe₂ @BSA NSs haben sich viel mehr verbessert als die von MoSe₂ @BSA-NSs. Es wurde gezeigt, dass FA-MoSe₂ @BSA-NSs könnten die Strahlentherapiewirkung verstärken, wahrscheinlich aufgrund ihrer Fähigkeit zur Röntgendämpfung, die die Röntgenstrahlungsenergie in Tumorzellen konzentrieren und sekundäre Auger-Elektronen erzeugen könnte, was zu DNA-Schäden und zur Unterdrückung des Zellwachstums führt [28, 29].

a Wärmebilder von PBS, MoSe₂ @BSA NSs und FA-MoSe₂ @BSA NS behandelte Zellen und b die entsprechenden Temperaturänderungskurven unter kontinuierlicher Bestrahlung mit einem 808 nm-Laser (1 W/cm ² .) ). c Zelllebensfähigkeit von 4 T1-Zellen, behandelt mit PBS, MoSe₂ @BSA NSs und FA-MoSe₂ @BSA-NSs kombiniert mit unterschiedlicher Röntgendosis (0–5 Gy). d Zelllebensfähigkeit von 4T1-Zellen, die mit verschiedenen Proben unter einem 808-nm-NIR-Laser behandelt wurden (5 min, 1 W/cm ² .) ) und Röntgenbestrahlung (5 Gy)

Zur weiteren Bewertung der kombinierten therapeutischen Wirkung von RT und PTT wurden 4T1-Zellen nur mit NIR oder RT, FA-MoSe₂ . behandelt @BSA NSs + RT, FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR oder FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT. Wie in Abb. 5d gezeigt, FA-MoSe₂ Die mit @BSA NSs + NIR + RT behandelte Gruppe zeigte den signifikantesten konzentrationsabhängigen Zelltod mit einer Suppressionsrate von 92,8%. Die hervorragende therapeutische Wirkung des FA-MoSe₂ @BSA-NSs waren wahrscheinlich auf (1) die photothermische Ablation von PTT und DNA-Schäden durch RT von FA-MoSe₂ . zurückzuführen @BSA-NSs und (2) FA-Targeting verbesserten die Zellinternalisierung von FA-MoSe₂ @BSA NSs und damit die Erzeugung von mehr Hitze und Röntgenstrahlung, um die Zellen abzutöten.

Wie in Fig. 6a gezeigt, konnten in den PBS + NIR- und PBS + RT-Kontrollgruppen wenige tote Zellen beobachtet werden. Obwohl tote Zellen in FA-MoSe₂ gefunden wurden @BSA NSs + RT oder FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR-Gruppen, aber lebende Zellen existierten noch. Umgekehrt im FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT-Gruppe, mehr als 95 % der Zellen waren geschädigt und zeigten eine rote Fluoreszenz, was darauf hindeutet, dass RT und PTT von FA-MoSe₂ . kombiniert wurden @BSA NSs könnten die therapeutische Effizienz verbessern.

a Lebendtot und b γ-H2AX-Färbung Bilder von 4T1-Zellen behandelt mit PBS + RT, PBS + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs, FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT und FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT

Seit FA-MoSe₂ @BSA-NSs haben eine hohe Röntgenabsorption, sie könnten die RT verbessern. Wie in Abb. 6b gezeigt, wurden in den mit PBS behandelten Gruppen sehr niedrige -H2AX-Signale beobachtet, FA-MoSe₂ Nur @BSA NSs und FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR-behandelte Gruppen. In der Zwischenzeit FA-MoSe₂ Die mit @BSA NSs + NIR + RT behandelte Gruppe zeigte höhere Spiegel von γ-H2AX-Signalen, was auf eine signifikantere DNA-Schädigung in den Zellkernen hinweist. Diese Ergebnisse zeigten, dass FA-MoSe₂ @BSA-NSs könnten den RT-Effekt verbessern, der auf ihre Fähigkeit zur Röntgendämpfung zurückzuführen ist, die die Röntgenstrahlungsenergie in Tumorzellen konzentrieren und Sekundär- und Auger-Elektronen erzeugen würde, um DNA-Schäden und die Unterdrückung des Zellwachstums zu verursachen [30–32].

In-vivo-Bioverteilung und Blutzirkulation

Wie in Abb. 7a, b gezeigt, reicherten sich die Mo- und Se-Elemente 24 Stunden nach der Injektion im Tumor mit Ausnahme von Leber und Niere an. Der Gehalt an Mo-Elementen in Tumorgewebe nach Injektionen von MoSe₂ @BSA NSs und FA-MoSe₂ @BSA-NSs wurden ebenfalls bewertet. Wie in Abb. 7c gezeigt, sind die Mo-Spiegel im Tumorgewebe für FA-MoSe₂ Die mit @BSA NSs behandelte Gruppe nahm mit der Zeit zu und erreichte den Höhepunkt 24 Stunden nach der Injektion, der höher war als der von MoSe₂ @BSA NSs-behandelte Gruppe. Figure 7d shows the blood circulation curve of Mo at different time point post-injection of FA-MoSe₂ @BSA NSs. The Mo t _1/2 α (blood distribution half-life) and t _1/2 β (blood terminal elimination half-life) of the FA-MoSe₂ @BSA NSs group are 0.91 ± 0.06 h and 16.96 ± 1.3 h, respectively. These results were likely due to (1) prolonged blood circulation promoted by PEG and BSA modifications [24, 33], (2) decreased macrophage clearance of nanoparticles by the reticuloendothelial system [34, 35], and (3) facilitated tumor targeting effect by the FA modification and subsequent accumulation in tumor tissues. The tumor optimum accumulation time of FA-MoSe₂ @BSA NSs could guide the in vivo photothermal radiotherapy.

Die a Mo und b Se elements content of tumor and major organs including heart, liver, spleen, lung, and kidney in MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice. c Quantitative in vivo analysis of the Mo elements content of the tumor regions in MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice as a function of injection time. d Blood circulation curve of Mo at different time points post-injection of FA-MoSe₂ @BSA NSs

In Vivo Photothermal Radiotherapy

As shown in Fig. 8a, b, the temperature of the tumor region under NIR irradiation (5 min, 1 W/cm ² ) showed about 22.1 °C increase at 24-h post-injection of FA-MoSe₂ @BSA NSs, compared with that of PBS- or MoSe₂ @BSA NSs-treated groups. This indicated that FA-MoSe₂ @BSA NSs have excellent photothermal effect in vivo. As shown in Fig. 8c, no distinct weight changes were observed in the control or any of the treated Balb/c mice during the 30-day treatment duration, demonstrating that the treatments did not affect the health of these mice. Next, 4T1-tumor-bearing mice were randomly divided into six groups. Group 1:NIR; group 2:RT; group 3:FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT; group 4:FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR; group 5:MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT; and group 6:FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT. Then, 5 mg/kg of MoSe₂ was used in all groups. The radiotherapy dose was 5 Gy, and the dose rate is 0.084 Gy/s. At 24-h intravenous post injection, tumor region was irradiated by 5 min NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm ² ). The tumor sizes were closely monitored afterward (Fig. 8d). Compared to other groups, the most remarkable tumor growth inhibition was observed in group 6 after the combined photothermal-radiotherapy with FA-MoSe₂ @BSA NSs, achieving an obvious synergistic therapeutic outcome in comparison to PTT alone or RT alone delivered by FA-MoSe₂ @BSA NSs (Fig. 8d).

a In vivo thermal images of mouse after intravenous injection of saline, MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs and durations NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm ² ). b The corresponding temperature change curves of tumor regions in mice. c The weight and d relative tumor volume profile of 4T1 xenografted tumors after intravenous injection of PBS + RT, PBS + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT, MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT, and FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT, respectively. **P  < 0.01 vs control group and other groups

In Vivo Biocompatibility

As a kind of nanoagent for in vivo biomedical applications, their potential toxic side effect is something that always requires particular attention. In addition to the body weight data of mice in different groups post various treatments in Fig. 8c, the H&E staining images of major organs and complete blood panel assays were provided to evaluate the safety of the FA-MoSe₂ @BSA NSs. As shown using H&E staining in Fig. 9a, no apparent pathological tissue damage or abnormality in major organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) was observed in FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice. Moreover, as illustrated in Fig. 9b, the parameters of WBC, RBC, HGB, MCH, HCT, MCHC, MCV, and PLT for FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice were within the normal range. These results demonstrated that FA-MoSe₂ @BSA NSs exhibited low toxicity and excellent in vivo biocompatibility.

a H&E-stained tissue sections of major organs, including the heart, liver, spleen, lung, and kidney from mice treated with FA-MoSe₂ @BSA NSs at day 0 and day 30 (scale bar = 100 μm). b Blood biochemistry of mice at days 0 and 30 post-treatment with FA-MoSe₂ @BSA NSs

Schlussfolgerungen

In summary, MoSe2 NDs was first prepared by ultrasonication, and MoSe₂ @BSA nanospheres was then successfully synthesized via a simple BSA self-assembly method. The BSA surface provided a rich modifiable functional group that readily conjugated FA molecules, enabling the synthesis of versatile FA-MoSe₂ @BSA NSs which showed outstanding physiological stability and excellent tumor targeting effect. Due to the strong radio-sensitization ability and high NIR absorption of MoSe₂ NDs, FA-MoSe₂ @BSA NSs could be used as a photothermal agent for NIR-induced tumor ablation, and act as a radio-sensitizer to enhance the efficacy of RT. In vitro and in vivo experiments verified that FA-MoSe₂ @BSA NSs exhibited high cytotoxicity under NIR and X-ray irradiation, contributing to remarkably enhanced therapeutic effect in the tumor-targeted combined photothermal-radiotherapy. Most importantly, it was demonstrated that FA-MoSe₂ @BSA NSs have great biocompability in vitro and in vivo, encouraging further biomedical or clinic applications. Therefore, considering all the above desirable characteristics, the FA-MoSe₂ @BSA NSs with highly integrated functionalities is promising for applications in cancer therapy.

Abkürzungen

BSA:

Rinderserumalbumin

FA:

Folic acid

MoSe₂ :

Molybdenum selenide

NDs:

Nanodots

NIR:

Nahes Infrarot

NSs:

Nanospheres

PEG:

Polyethylenglykol

PTT:

Photothermische Therapie

RT:

Radiotherapy