Verstärkte proapoptotische Wirkung von wasserdispergierten Komplexen von 4-Thiazolidinon-basierten Chemotherapeutika mit einem PEG-haltigen polymeren Nanoträger

Einführung

Chemotherapie ist die wichtigste Behandlungsmethode für viele Tumore, Chemotherapeutika werden als letzte Option gewählt, insbesondere wenn sich der Krebs bereits ausgebreitet hat [1]. Die schwerwiegenden negativen Nebenwirkungen verringern jedoch die klinische Wirksamkeit vieler aktueller Krebsmedikamente. Daher besteht ein ständiger und entscheidender Bedarf an der Entwicklung alternativer oder synergistischer Krebsmedikamente mit reduzierten oder minimalen Nebenwirkungen [2].

Die geringe Wasserlöslichkeit von Krebsmedikamenten ist ein weit verbreitetes und ernstes Problem, das ihre Entwicklung und klinische Anwendung behindert, und viele hochaktive und vielversprechende Chemotherapeutika wurden aufgrund ihrer geringen Wasserlöslichkeit ausgeschlossen [3]. Tenside und Hilfslösungsmittel werden in hohen Konzentrationen verwendet, um wasserunlösliche Antikrebsmittel zu solubilisieren; Diese Substanzen können jedoch auch nachteilige Nebenwirkungen haben, wodurch die Verwendung vieler Krebsmedikamente eingeschränkt wird [4].

Eine große Herausforderung für die Entwicklung von Arzneimitteln besteht darin, die negativen Nebenwirkungen hochaktiver Arzneimittel zu beseitigen oder zumindest zu reduzieren, insbesondere der Antitumormittel, die eine allgemeine Toxizität im Körper aufweisen, die ihre Anwendung erheblich einschränkt [5,6,7,8,9 ]. Ein wirksamer Weg, dieses Problem zu überwinden, besteht darin, einen multifunktionalen Nanoträger des Arzneimittels zu verwenden, der es den toxischen Antitumormitteln ermöglicht, an der Stelle ihrer Abgabe an Zielzellen in bestimmten Organen oder Geweben zu binden [8, 10, 11]. Die geringe Größe, kontrollierte spezifische Struktur, große Oberfläche und Form von Nanopartikeln bieten ihnen mehrere Vorteile gegenüber anderen Materialien [5, 8, 9]. Durch den Einsatz von Nanopartikeln ist es möglich, die Effizienz zu optimieren, negative Nebenwirkungen zu minimieren und die Krebstherapie zu verbessern [12, 13]. Somit können Medikamente, die früher aufgrund einer hohen allgemeinen Toxizität versagt haben, jetzt eine zweite Chance für den klinischen Einsatz erhalten, da sie in ein Abgabesystem mit verbesserter Bioverfügbarkeit und kontrollierter Freisetzung aufgenommen werden. Solche Wirkstoff-Träger-Komplexe dringen leichter durch natürliche Barrieren wie Blut-Hirn-Schranken oder Membranen einzelner Zellen. Die große Oberfläche von Nanopartikeln ermöglicht es ihnen, mit spezifischen Vektorbiomolekülen Komplexe zu bilden, die den Wirkstofftransport zum Zielorgan unterstützen, zu einer signifikanten Reduzierung oder sogar vollständigen Eliminierung negativer Nebenwirkungen führen, eine Erhöhung der minimalen wirksamen Dosis ermöglichen während einer einzigen Verabreichung des Arzneimittels, erhöhen die Wirksamkeit der Arzneimittelwirkung und geben neue Impulse für die Entwicklung einer personalisierten Pharmakotherapie. Darüber hinaus können Nanopartikel Moleküle einkapseln, die die Löslichkeit, Stabilität und Absorption bestimmter Medikamente verbessern [11, 13, 14, 15]. Arzneimittelabgabesysteme können eine verlängerte Zirkulation eines Arzneimittels im Blut, die Fähigkeit des Arzneimittels, sich während des pathophysiologischen Prozesses zu akkumulieren, und die Fähigkeit zur effektiven Übertragung des Moleküls des Wirkstoffs in die Zellen und Organellen der Zellen bereitstellen. Die Nanopartikel müssen stabil sein, ihre chemische Struktur über einen bestimmten Zeitraum beibehalten und gleichzeitig biologisch abbaubar sein [16, 17].

Um neue Krebsmedikamente zu evaluieren, ist es wichtig, ihre zytotoxische Aktivität und Potenz unter Verwendung verschiedener menschlicher Zielkrebszelllinien und experimenteller Tumormodelle in vivo zu messen Die Chemotherapie versagt oft aufgrund eines Mangels im Apoptoseprozess, der eine entscheidende Rolle beim arzneimittelinduzierten Zelltod als Folge oder Folge einer Veränderung der Tumorgenese spielt [18,19,20,21].

Da viele bösartige Zellen dem apoptotischen Tod entgehen können, sollte beim Design und der Entwicklung neuer Krebsmedikamente ein rationaler Ansatz verfolgt werden. Die Hauptziele bei der Entwicklung neuer Krebsmedikamente sind (1) Wege zu finden, um Mutationen einzelner Krebszellen zu überwinden, die sich auf unabhängige Mechanismen der Arzneimittelwirkung auswirken; und (2) Entwerfen von Chemotherapie-Schemata, die in der Lage sind, gleichzeitig auf unabhängige Pfade abzuzielen. Ein besseres Verständnis der Beziehung zwischen Krebsgenetik und Behandlungsempfindlichkeit ist ein Schlüsselthema bei der Entwicklung neuer wirksamer Krebsmedikamente [22].

In früheren Studien haben wir gezeigt, dass synthetische 4-Thiazolidinon-Derivate (Les-3288, Les-3833 und Les-3882) wahrscheinlich andere Wirkmechanismen als andere Antikrebsmittel verwenden, um in vitro Ratten-C6-Gliom- und menschliche U251-Glioblastom-Zellen abzutöten zu Doxorubicin (Dox). Les-3288 beeinflusste den Gehalt an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in den behandelten Zellen nicht signifikant [23, 24]. Es sollte betont werden, dass diese potenten Antitumormittel im Körper von Versuchstieren im Vergleich zu denen von Dox eine geringere allgemeine Toxizität zeigten, wie dies durch die gemessenen biochemischen Parameter ihrer toxischen Wirkung in Tumorzellen und Tieren belegt wurde [7, 8]. So kann die Bindung eines Antitumorwirkstoffs an einen polymeren Nanocarrier (PNC) und die Wirkstoffapplikation in Form eines stabilen Wasserabgabesystems die toxischen Wirkungen in Tierorganen im Vergleich zur Wirkung dieser Substanzen in freier Form reduzieren [ 7, 8].

Das Ziel dieser Arbeit war es, die Apoptose-Induktion in Ratten-Gliomzellen der C6-Linie in vitro und in vivo durch wässrige Formulierungen von Komplexen von 4-Thiazolidinon-Derivaten mit einem PEG-haltigen PNC zu untersuchen und die Apoptose-Induktion mit diesen Derivaten zu vergleichen in freier Form.

Materialien und Methoden

Antikrebsmedikamente

Die heterocyclischen 4-Thiazolidinon-Derivate (Verbindungen Les-3288 und Les-3833, Abb.1) wurden am Department of Pharmaceutical, Organic and Bioorganic Chemistry der Danylo Halytsky Lviv National Medical University, Ukraine, wie zuvor beschrieben, synthetisiert [25].

Struktur der untersuchten Verbindungen – Les-3288 und Les-3833

Vor der Verwendung in Zellkulturen wurden diese Verbindungen in Dimethylsulfoxid (DMSO, Arterium, Lviv, Ukraine) gelöst. Die Lösung wurde zusätzlich 5 min in einem siedenden Wasserbad gehalten und mit destilliertem Wasser verdünnt, um die Arbeitskonzentrationen zu erreichen. Die Endkonzentration des DMSO im Kulturmedium lag unter 0,1%. Dox wurde in einer lokalen Apotheke von einem Pfizer (Italien)-Vertreter in der Ukraine gekauft.

Polymerer Nanoträger

Der PNC für die Wirkstoffabgabe wurde am Institut für Organische Chemie der Polytechnischen Nationaluniversität Lviv, Ukraine, unter Verwendung einer zuvor beschriebenen Methode synthetisiert [26, 27]. Synthese von poly(VEP-co -GMA)-Graft-PEG wurde über nachfolgende Stufen wie folgt durchgeführt. Poly(VEP-co -GMA) wurde durch radikalische Copolymerisation von 5-tert . synthetisiert Butylperoxy-5-methyl-l-hexen-3-in (VEP, 0,41 g, 0,5 mol) (Peroxidmonomer synthetisiert nach der beschriebenen Methode [28]) und Glycidylmethacrylat (GMA, 7,72 g, 12,2 mol) (Sigma-Aldrich , USA) in Ethylacetat (7,9 ml) (Merck, Darmstadt, Deutschland) unter Verwendung von Azoisobutyronitril (AIBN, 0,129 g, 0,05 mol) (Merck, Darmstadt, Deutschland) als Radikalstarter. Die Polymerisation wurde bei 343 K durchgeführt, bis die maximale Umwandlung von 65 % erreicht war. Poly(VEP-co -GMA) wurde als Rückgrat für die Anlagerung von PEG-Seitenketten über Additionsreaktionen von Poly(ethylenglycol)methylether (mPEG) an seitliche Epoxidgruppen verwendet. Bortrifluoridetherat (0,027 ml, 0,031 mol) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) wurde zu der Lösung des Copolymers (1,0 g) in Dioxan (20 ml; Merck, Darmstadt, Deutschland) bei 313 K und zugegeben 3 h gerührt. mPEG (2,5 mg, 3,35 mmol) (Sigma-Aldrich, USA) wurde in Dioxan (15 ml) gelöst und die Lösung mit der Lösung des Rückgratpolymers vermischt und 6 h bei 313 K gerührt. Nicht umgesetztes mPEG wurde mit Dialysebeuteln entfernt mit einer Porengröße des Molekulargewichts-Cut-off (MWCO) von 6–8 kDa (Sigma-Aldrich, USA). Resultierendes kammartiges Poly(VEP-co -GMA)-Pfropf-PEG wurde bei Raumtemperatur unter Vakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Die Strukturen und einige Eigenschaften der PNC sind in Abb. 2 dargestellt und wurden zuvor beschrieben [29].

Schematischer Aufbau des PNC — poly(VEP-co- GMA)-Transplantat -PEG mit der Hauptkette auf der Basis eines Copolymers aus ungesättigtem Peroxid von 2-tert -Butylperoxy-2-methyl-5-hexen-3-in (VEP, bezeichnet mit „k“), mit Seitenketten aus Glycidylmethacrylat (GMA, bezeichnet mit „l“) und Polyethylenglykol (PEG, bezeichnet mit „m“ )

Zur Herstellung der wasserbasierten PNC-Lösungen wurden 0,09 g PNC in 0,9 ml DMSO gelöst. Diese PNC-Lösung wurde zu 8,0 ml 0,9% NaCl-Lösung gegeben. Dann wurde die Lösung 0,5 h gerührt und 10 s beschallt. Wasserdispersionen der Komplexe wurden durch Eintropfen der DMSO-Lösung von 4-Thiazolidinonen und PNC in das Wasser in der folgenden Reihenfolge erhalten:0,045 g PNC wurden in 0,15 ml DMSO (Sigma-Aldrich, USA) gelöst und 0,0015 g Les -3288 (oder Les-3833) wurde in 0,10 ml DMSO gelöst. Die Lösungen von PNC und 4-Thiazolidinonen wurden gemischt und zu 4,25 ml 1%iger wässriger NaCl-Lösung gegeben und 10 s lang beschallt.

Diese oberflächenaktive PNC enthält die hydrophilen PEG-Ketten, die auf das hydrophobe Rückgrat gepfropft sind (Abb. 2a). In wässrigen Lösungen bilden die amphiphilen PNC mizellenähnliche Strukturen, die wasserunlösliche Verbindungen (z. B. Medikamente) solubilisieren können oder diese Verbindungen können an die Oberfläche der Nanopartikel adsorbiert werden, wodurch ihre Biokompatibilität erhöht wird. Die Technik, die entwickelt wurde, um hochstabile wässrige Dispersionen der Chemotherapeutika auf 4-Thiazolidinon-Basis zu erhalten, besteht in der Nukleation von nanoskaligen Wirkstoffpartikeln, die auftritt, wenn die verdünnten Lösungen in DMSO in die Fällungssalzlösung überführt werden, die das polymere Tensid PNC enthält, das eine Polymerbeschichtung für die Nanopartikel-Oberfläche. Als Ergebnis wurde der Komplex aufgrund von Aggregation und Sedimentation stabilisiert und die Dispersion wurde verhindert. Darüber hinaus werden die nanoskaligen Komplexe der 4-Thiazolidinon-Derivate vor möglichen Wechselwirkungen mit der umgebenden biologischen Mikroumgebung geschützt. Dieser Schutz ermöglicht es ihnen, länger im Körper zu verbleiben, ohne an Stabilität zu verlieren und sich im Zielgewebe oder -organ anzureichern, ohne negative Nebenwirkungen zu verursachen. Somit bietet eine solche Modifikation eine verbesserte Aggregations- und Sedimentationsstabilität von Wasserdispersionen der Nanopartikel der Antikrebsverbindung.

Die Größen der Polymermicellen von PNC und der Komplexe von PNC mit heterocyclischen 4-Thiazolidinonen wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) unter Verwendung eines Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments GmbH, Stuttgart, Deutschland) und DynaPro NanoStar (Wyatt Technology, Santa) gemessen Barbara, CA, USA) und durch Photonenkorrelationsspektren unter Verwendung der nicht-invasiven Rückstreuungstechnologie (NIBS) bei 25°C. Die Proben für DLS-Messungen wurden wie oben beschrieben vorbereitet und ggf. mit bidestilliertem Wasser, pH 6,5–7,0, verdünnt. Für jede Probe wurden drei bis fünf Messungen durchgeführt (jede Messung bestand aus 5 Zyklen und der Bereich zwischen den Messungen betrug 5 Minuten). Abbildung 3 zeigt die Größenverteilung der mizellaren Strukturen der PNC und der Nanopartikel der Komplexe von PNC mit den heterocyclischen 4-Thiazolidinonen (Les-3833 und Les-3288), analysiert durch DLS. Die Größe und Morphologie von PNC-Mizellen sowie von PNC-beschichteten 4-Thiazolidinon-Nanopartikeln wurden mit einem Transmissionselektronenmikroskop JEM-200А (JEOL, Japan) bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV untersucht [30, 31]. Die Proben wurden wie oben beschrieben hergestellt und, falls erforderlich, mit bidestilliertem Wasser verdünnt. Proben wurden durch Aufsprühen der getesteten Lösung auf ein Substrat mit Hilfe des Ultraschall-Dispergiermittels UZDN-1A (Ukrrospribor Ltd., Ukraine) hergestellt, das eine gleichmäßige Beschichtung auf dem Substrat ermöglicht. Als Substrat wurde ein dünner amorpher Kohlenstofffilm verwendet, der auf einem Kupfergitter abgeschieden wurde. Die Größen und Morphologie der PNC-Micellen und der Komplexe mit den heterocyclischen 4-Thiazolidinonen (Les-3288 und Les-3833), die mit den Methoden von DLS und TEM untersucht wurden, sind in Abb. 3 dargestellt.

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Bilder der PNC (links) und des Komplexes von PNC + Les-3833 (rechts)

Die DLS- und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Studien zeigten, dass die Größe der PNC-Micellen 50 ± 25 nm betrug und die Nanopartikel, die durch Komplexe von PNC mit den heterocyclischen 4-Thiazolidinonen Les-3833 und Les-3288 gebildet wurden, 140 ± 25 nm und 155 betrugen ± 30 nm bzw.. Die Dispersionen von Komplexen der PNC mit 4-Thiazolidinon-Derivaten sind sehr stabil und werden durch die adsorbierte PNC-Hülle auf der Thiazolidinon-Nanopartikeloberfläche vor Aggregation und Sedimentation geschützt. Wie in Abb. 4 gezeigt, sind Größenänderungen der im Wassersystem dispergierten Nanopartikel bei mehrfacher Verdünnung mit Wasser sowie nach 6-monatiger Alterung der Wassersysteme von PNC-Komplexen mit 4-Thiazolidinonen vernachlässigbar.

DLS-Untersuchung hydrodynamischer Durchmesser von PNC und Komplexen (a ) und Abhängigkeit der durchschnittlichen Größe von PNC-Wirkstoffkomplexen von der Dispersionsverdünnung (b ):Wasserdispersionen von PNC (1), Komplexe von Les-3833+PNC (2) und Les-3288+PNC (3) sowie hydrodynamische Größen von Les-3833+PNC (1–3) und Les- 3288+PNC (4–6) Dispersionen nach Lagerung für 2 Tage (1.4), 4 Monate (2.5) und 6 Monate (3.6) (c )

Zellkultur

Rattengliomzellen der C6-Linie wurden von der Zellkultursammlung des Instituts für Molekularbiologie und Genetik der Nationalen Akademie der Wissenschaften der Ukraine (Kiew, Ukraine) erhalten. Die Zellen wurden in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Sigma, USA), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Sigma, USA), kultiviert. Die Zellen wurden in einem CO₂ . gezüchtet -Inkubator bei 37°C, 5% CO₂ , und 95 % Luftfeuchtigkeit. Die Neuaussaat der Zellen erfolgte im Verhältnis 1:5 einmal in 2-3 Tagen.

Bewertung der zytotoxischen Wirkung von untersuchten Substanzen

Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen mit einer Konzentration von 100.000 Zellen/ml in einer Vertiefung ausgesät. (Greiner Bio-One North America, Inc., Monroe, NC, USA). Die zu untersuchenden Substanzen wurden in Konzentrationen von 0,1, 0,5 und 1,0 µM nach einer 24-stündigen Anpassungsphase, die nach der Zellaussaat begann, zugegeben. Die Zellzählung wurde in regelmäßigen Abständen in der hämozytometrischen Zählkammer unter Verwendung von Trypanblau-Farbstoff (DV-T10282, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Corp., Waltham, MA, USA) bei einer Endkonzentration von 0,01 % 2 min nach Zugabe zur Zellsuspension durchgeführt . Die toten Zellen nahmen diesen Farbstoff aufgrund von Schäden an ihrer Plasmamembran auf.

Durchflusszytometrie

Zur Untersuchung des Zellzyklus und der Apoptose wurden C6-Zellen mit Les-3288, Les-3833 und ihren Komplexen mit PNC sowie mit PNC in freier Form behandelt, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) gewaschen, durch Zentrifugation pelletiert bei 1000 Upm für 5 min bei 4°C und resuspendiert in kaltem PBS (2 Millionen Zellen pro 1 ml PBS). Dann wurden die Zellen durch Zugabe von Aliquots von 4 ml absolutem Ethanol, das auf – 20 °C gekühlt wurde, unter leichtem Mischen fixiert. Die fixierten Proben wurden bis zur Verwendung (nicht länger als 1 Woche) bei – 20 °C aufbewahrt. Für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)-Analyse wurden Zellproben bei 1000 UpM für 5 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 1 ml PBS resuspendiert. Einhundert Mikroliter DNase-freie RNase (Sigma, USA) wurden dieser Suspension zugesetzt und die Proben wurden 30 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde jede Probe mit 100 µl Propidiumiodid (PI) (Sigma, USA, 1 mg/ml) ergänzt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurden die Proben in Falcon-Kunststoffröhrchen überführt und die Zellsuspension mit einem FACSCalibur-Durchflusszytometer (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA) und Summit v3.1-Software (Cytomation, Inc., Fort Collins, CO, USA) zur Messung der Parameter des Zellzyklus und der Apoptose.

Die Messung der Annexin V-positiven (apoptotischen) Zellen wurde mittels FACS-Analyse durchgeführt. Gliom-C6-Zellen der Ratte wurden mit Konzentrationen von 0,1 mg/ml, 0,5 mg/ml und 1 mg/ml von PNC, Les-3288, Les-3833 und ihren polymeren Konjugaten, wie in den Figuren angegeben, behandelt. Am Ende des Experiments wurden die Zellen mit Trypsin-EDTA-Lösung vom Boden der Schale abgelöst, zweimal mit PBS gewaschen und mit Annexin V-FITC unter Verwendung des Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) gefärbt. , nach Herstellerangaben. Gewaschene Zellen wurden 15 min in Annexin V-Bindungspuffer (BD Pharmingen) inkubiert, der 1/50 Volumen FITC-konjugierte Annexin V-Lösung enthielt. Dann wurden die Proben zweimal mit einem geeigneten Volumen des Annexin-V-Bindungspuffers verdünnt und sofort auf dem FL1/FL2-(FITC-PI)-Kanal eines Durchflusszytometers (Becton Dickinson, USA) gemessen. Die Annexin V-einzeln positiven Zellen wurden als apoptotisch klassifiziert.

DNA-Kometenassay

Der DNA-Comet-Assay wurde unter alkalischen Bedingungen durchgeführt. Zehntausend Zellen wurden in 75 &mgr;l Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (0,5%) pro Probe gemischt. Nach dem Mischen wurde die Probe auf einen Objektträger pipettiert, der zuvor mit 1,5% normaler Schmelzpunkt-Agarose bedeckt war. Die Proben wurden 18 h bei 4 °C in Lyselösung (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-Base, 10 % DMSO, 1 % Triton X-100) inkubiert. Um das Abwickeln der DNA und die Expression alkalilabiler Schäden zu ermöglichen, wurden die Objektträger in einer alkalischen Lösung bei Raumtemperatur für 20 min (durchgeführt im Dunkeln) inkubiert. Für die Elektrophorese (~74 V/cm für 30 min) wurden die Objektträger in eine horizontale Kammer überführt und 1x Elektrophoresepuffer (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA, pH> 13) wurde zugegeben. Die Objektträger wurden in eiskaltem 100 % Methanol fixiert und getrocknet. Die Objektträger wurden mit 80 μl 1 × Ethidiumbromid (EtBr) für 5 min gefärbt und dann in gekühltes destilliertes Wasser getaucht, um überschüssige Färbung zu entfernen. Die DNA-Kometen wurden mit einem Mikroskop (Carl Zeiss, Deutschland) visualisiert und die Bilder mit der Software „CASP“ (Casplab-1.2.3b2-Software, CASPlab, Wroclaw, Polen) analysiert. Einhundert Kometen pro Probe wurden gezählt. DNA-Schäden wurden je nach Kometenschweifgröße in fünf Stufen der Genotoxizität eingeteilt:0 (0–5% Schaden), 1 (5–25% Schaden), 2 (25–45 % Schaden), 3 (45–70% Schaden ) und 4 (mehr als 70 % Schaden) [32]. Der Schadensindex (DI) wurde wie zuvor beschrieben berechnet [33].

DNA-Interkalationsassay mit Methylgrün-Farbstoff

Die Verbindungen Les-3288 und Les-3833 wurden auf ihre Fähigkeit zur Interkalation in das DNA-Molekül mit Hilfe des Methylgrün-Assays untersucht [34]. Lachssperma-DNA (10 mg/ml) wurde 1 h bei 37 °C mit 15 μl Methylgrünlösung (1 mg/ml in H₂ .) inkubiert Ö). Die Verbindungen wurden mit 1 µg/ml zugegeben und 2 h bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Das Gesamtendvolumen der Proben betrug 1 ml. Die Absorption von Methylgrün wurde bei 630 nm gemessen, nach Probeninkubation für 2 h bei 37 °C, unter Verwendung eines BioTek 76 883 Mehrkanal-Mikrophotometers (BioTek, Winooski, VT, USA). EtBr wurde als Positivkontrolle verwendet.

Datenanalyse und Statistik

Alle Experimente wurden dreimal mit drei Parallelen in jeder Variante wiederholt. Die Varianzanalyse (ANOVA) wurde zum Vergleich der Gruppen verwendet. Die Daten der Verteilung von C6-Ratten-Gliomzellen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus wurden durch Einweg-ANOVA analysiert, gefolgt von Tukeys post-hoc-Mehrfachvergleichstest. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Ein p Wert von < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Zytotoxische Wirkung (Trypanblau-Ausschlusstest) von 4-Thiazolidinon-Derivaten, die in freier Form und im Komplex mit dem polymeren Nanoträger verwendet werden

Die Ergebnisse des Trypanblau-Ausschlusstests zeigten, dass die wasserbasierten Formen der Les-3288- und Les-3833-Komplexe mit den PNC eine erhöhte Toxizität gegenüber Gliom-C6-Zellen (24-Stunden- und 48-Stunden-Behandlung) im Vergleich zur Zytotoxizität bei Verwendung des freie Form dieser Verbindungen (Abb. 5 und 6). Die höchste Zytotoxizitätswirkung wurde bei 0,1 und 0,5 µM Dosen der Les-3288- und Les-3833-Verbindungen in ihren Komplexen mit den PNC beobachtet, während bei der höchsten Dosis (1,0 µM) dieser Verbindungen eine Verstärkung der Komplexierung mit den PNC festgestellt wurde nur bei Les-3288 für 24 h (Abb. 5 und 6).

Anzahl lebender Gliom C6-Zellen der Ratte, gemessen durch Trypanblau-Ausschlusstest nach Behandlung für 24 h und 48 h mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,1, 0,5 und 1,0 μM) von Les-3288 allein im Vergleich zur Wirkung seines Komplexes mit dem polymeren Nanoträger ( PNC) *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001 ( Unterschied zur Kontrolle, 100%)

Anzahl lebender Gliom-C6-Zellen der Ratte, gemessen durch Trypanblau-Ausschlusstest nach Behandlung für 24 h und 48 h mit unterschiedlichen Konzentrationen (0,1, 0,5 und 1,0 μM) von Les-3833 allein im Vergleich zur Wirkung seines Komplexes mit dem polymeren Nanoträger ( PNC) *P <0,05; **P <0,01; ***P <0,001 (Differenz zur Kontrolle, 100 %)

Komplexierung von Les-3833- und Les-3288-Verbindungen mit polymeren Nanoträgern verstärkt ihre pro-apoptotische Aktivität in vitro gegenüber Gliom-C6-Zellen der Ratte

Zwei alternative Ansätze wurden verwendet, um die modulatorische Wirkung der PNC auf das zytotoxische Potenzial der ausgewählten 4-Thiazolidinon-Derivate zu bewerten. Zunächst wurde eine Zellzyklusanalyse durchgeführt, um den Einfluss der Wirkstoff-PNC-Komplexe auf den Zellzyklus zu untersuchen. Darüber hinaus wurde die Annexin V/PI-Doppelfärbung verwendet, um die genaue Art des Zelltods zu unterscheiden, der durch diese Nanokomposite induziert wird.

Les-3288- und Les-3833-Verbindungen in niedrigen Dosen (0,1 µg/ml und 0,5 µg/ml) erzeugten keine sichtbare Wirkung auf die Zellzyklusprogression oder die Induktion der Apoptose, wie in Fig. 7 und Tabelle 1 gezeigt beide Verbindungen mit dem PNC erhöhten die Anzahl der Zellen in Prä-G₁ . signifikant Phase (4-fach für Les-3288 und 6-fach für Les-3833), was eine deutliche Steigerung ihres pro-apoptotischen Potenzials anzeigt. Es sollte betont werden, dass PNC in freier Form keinen Einfluss auf den Zellzyklus oder die Apoptose-Induktion hatte; Daher kann das beobachtete Auftreten einer großen Population von Prä-G1-Zellen unter Behandlung mit den Thiazolidinon-Nanocarrier-Komplexen nicht durch einen einfachen synergistischen Effekt der PNC und der experimentellen Medikamente erklärt werden.

Einfluss auf die Zellzyklusprogression der 4-Thiazolidinon-Derivate Les-3288 und Les-3833 in freier Form und im Komplex mit dem polymeren Nanocarrier (PNC) in C6-Ratten-Gliomzellen. Propidiumiodid (PI)-Färbung, Durchflusszytometrie. R2, vor-G1; R3, G1; R4, S; R5, G2-Phase. FL2-H, Emissionsspitzenwerte des zweiten Kanals (585/40-Filter) des Durchflusszytometers

Um zu bestätigen, dass der beobachtete Sub-G1-Peak aus den apoptotischen Zellen besteht, wurden die Ergebnisse des Annexin V/PI-Färbeassays analysiert. Wir haben keine signifikante Externalisierung von Phosphatidylserin (Hauptmarker der frühen Apoptose, nachgewiesen durch FITC-konjugiertes Annexin V) während der Behandlung mit C6-Gliom mit niedrigen (0,1 und 0,5 μg/ml) und hohen Dosen von Les-3288 (1,0 μg/ml) beobachtet. , was darauf hindeutet, dass diese Verbindung ein schwacher Apoptose-Induktor ist. Stattdessen fanden wir einen Anstieg der nekrotischen Zellpopulation (von 1,2 % in der Kontrolle auf 11,25 % für Les-3288, 1,0 µg/ml), was darauf hindeuten könnte, dass Les-3288 zumindest teilweise zum nekrotischen Zelltod führt. Die Komplexierung von Les-3288 mit dem PNC änderte jedoch die Wirkungsweise dieses Arzneimittels vollständig. Die Zahl der frühen apoptotischen (Annexin V(+)/PI(−)) und spätapoptotischen Zellen (Annexin V (+)/PI(+)) nahm massiv zu, während die Gesamtmenge der rein nekrotischen Zellen bei das Niveau der Kontrollzellen (unbehandelt) (Fig. 8a). Somit verstärkt die Bindung von Les-3288 an den PNC nicht nur stark seine pro-apoptotische Aktivität gegenüber Gliomzellen, sondern verringert auch seinen potentiellen pro-nekrotischen Zelltodmechanismus. Diese Ergebnisse können für die klinische Praxis von entscheidender Bedeutung sein, da die Anwendung der pronekrotischen Medikamente aufgrund einer massiven Entzündungsauslösung, die für die Patienten unangenehm ist, nicht empfohlen wird.

Vergleich der pro-apoptotischen Aktivität von Les-3288 (a ) und Les-3833 (b ) Verbindungen und ihre Komplexe mit dem polymeren Nanocarrier (PNC) für Gliom-C6-Zellen der Ratte. Annexin V/PI Doppelfärbung, Durchflusszytometrie. PI, Propidiumiodid

Überraschenderweise beobachteten wir nicht den gleichen Effekt für den Les-3833+PNC-Komplex. Tatsächlich war die pro-apoptotische Aktivität des Les-3833+PNC-Komplexes im Vergleich zu Les-3288 in freier Form bei allen getesteten Konzentrationen geringer ( 8b ). Ein so drastischer Unterschied zwischen beiden Verbindungen könnte durch die Spezifität ihrer chemischen Struktur erklärt werden, und wir spekulieren, dass im Fall von Les-3833 die Struktur des Polymers optimiert werden sollte, um bessere Ergebnisse zu erzielen.

Komet-Assay auf DNA-Schäden in Gliom-C6-Zellen der Ratte, verursacht durch 4-Thiazolidinon-Derivate in freier Form und komplexiert mit dem PNC

Der alkalische Comet-Assay ermöglicht den Nachweis von DNA-Einzelstrangbrüchen in alkalilabilen DNA-Stellen. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mit dem Mittelwert des Olive Tail Moments (OTM) geschätzt. Unsere Daten zeigten, dass die Behandlung von С6-Ratten-Gliomzellen mit Les-3288, Les-3833 und PNC (Konzentration 0,5 μg/ml) für 3 h (Abb. 9 und 10) keinen signifikanten DNA-Schaden verursachte (OTM =0,7299 ± ). 0,1276, OTM =1,466 ± 0,3086, OTM =0,5846 ± 0,1078), verglichen mit den unbehandelten Zellen in der Kontrolle (OTM =0,4541 ± 0,07273). Jedoch verursachte die Zellbehandlung mit dem Les-3833 + PNC-Komplex (OTM =2,3880 ± 0,2212) signifikantere DNA-Schäden als die Zellbehandlung mit der freien Form von Les-3833. Für die Wirkung des Les-3288+PNC-Komplexes wurde eine solche Zunahme des Schadens nicht beobachtet (Abb. 9 und 10).

Die DNA-Schädigung wurde unter Verwendung des Olivenschwanzmoments in Gliom-C6-Zellen der Ratte bewertet, die 3 Stunden lang mit experimentellen antineoplastischen Verbindungen behandelt wurden, die in einer Konzentration von 0,5 µg/ml verwendet wurden. *P 0,05; **P 0,01; ***P 0,001. PNC, polymerer Nanoträger; Dox, Doxorubicin (Positivkontrolle)

Vorhandensein von DNA im Kometenschweif von Rattengliom-С6-Zellen nach 3-stündiger Behandlung mit (a ) Kontrolle (unbehandelte Zellen), Les-3288 (b ), Les-3288+PNC (c ), Les-3833 (d ) Les-3833 + PNC (e ), PNC (f ) und Doxorubicin (g ), verwendet bei einer Konzentration von 0,5 μg/ml

An increase of cell incubation time to 6 h (Figs. 11 and 12) caused greater DNA damage in all experimental groups:Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, Les-3833+PNC, and Dox (positive control). However, the effects of the Les-3288+PNC and Les-3833+PNC complexes appeared to be lower than the effects of the free forms of Les-3288 and Les-3833. It should be noted that the DNA-damaging effect of the complexes of both derivatives with the PNC was less than such effect from these derivatives used in free form.

DNA damage was evaluated using the Olive tail moment in rat glioma C6 cells treated for 6 h with experimental antineoplastic compounds used at a 0.5 μg/mL concentration. *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

Presence of DNA in comet tail of rat glioma С6 cells after treatment for 6 h with (a ) control (untreated cells), Les-3288 (b ), Les-3288 + PNC (c ), Les-3833 (d ) Les-3833 + PNC (e ), PNC (f ), and doxorubicin (g ), used at a 0.5 μg/mL concentration

The results were evaluated using the mean value of the TailDNA%. The obtained data show that incubation of С6 rat glioblastoma cells with substance Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, and PNC (all at concentration of 0.5 μg/mL) during 3 h (Fig. 13) does not lead to significant DNA damage (TailDNA% of 4.157 ± 0.682; TailDNA% of 3.530 ± 1,012, 8.807 ± 0.878; 3.298 ± 0.514, respectively) compared with control (TailDNA% =3.638 ± 0.406), but cell treatment with the Les-3833+PNC complex (TailDNA% =19.53 ± 1.48) causes more significant damage of DNA than the free form of Les-3833. An increase in the incubation time up to 6 h (Fig. 14) in all cases leads to greater damage to the DNA. Again, the level of TailDNA% detected from the action of complexes of both derivatives with the PNC was less than the level of that indicator for the action of these derivatives used in free form.

DNA damage evaluated using the % of DNA in comet tail of C6 rat glioma cells treated with experimental antineoplastic compounds during 3 h at a concentration of 0.5 μg/mL. *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

DNA damage evaluated using the % of DNA in comet tail of C6 rat glioma cells treated with experimental antineoplastic compounds during 6 h at a concentration of 0.5 μg/mL. *P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001. PNC, polymeric nanocarrier; Dox, doxorubicin (positive control)

We also used an alternative, five-category classification system to classify DNA migration and calculated the DI. Table 2 summarizes the percentages of rat glioma C6 cells for each level of genotoxicity during 3 h of treatment. In the control (untreated cells), higher percentages of cells in levels 0 (81.3%) and 1 (18.6%) were detected compared to these levels in Les-3288 and PNC-treated cells. Complexation of Les-3288 with the PNC did not lead to a big change in the distribution pattern of the DNA comets. In contrast, Les-3833-treated cells showed a lower percentage of cells in 0 level (38.6%) and a higher percentage of cells in level 1 (60.0%), while Les-3833 + PNC-treated cells demonstrated a significantly lower percentage of cells in level 0 (8.0%) and much higher percentages of cells with levels 1 (76.0%), 2 (13.3%), and 3 (2.6%). The integrative indicator of DNA damage (DI) in the case of application of both Les-3288 and its complex with the PNC did not differ significantly from that for control or using free PNC, while the DI from using both Les-3833 and its complex with the PNC was even higher than the DI from using Dox.

During this time interval, Les-3833 + PNC-treated cells demonstrated a higher percentage of cells with level 4 (5.3%) DNA damage than cells treated with Les-3288 and the other experimental compounds, but the percentages of cells in levels 2 and 3 were lower (16.0% and 12.0%, respectively) than those from treatment with other compounds (Table 2). Table 3 summarizes the percentages of rat glioma C6 cells with DNA damage after 6 h of treatment. In general, a tendency for the appearance of DNA comets of higher classes was detected when complexes of Les-3833 and Les-3288 were used, compared with a spectrum of DNA comet classes induced by free forms of these agents (Table 3). However, the integrative indicator of DNA damage (DI) calculated for the action of complexes of Les-3833 and Les-3288 was found to be lower than such an indicator for the action of free forms of these agents. A possible explanation could be a very high DI level at 6 h action of studied agents that is even higher than such indicator found for the action of Dox (Table 3). Thus, we observed time dependence of DNA damage caused by complexes of Les-3833 and Les-3288:at 3 h of treatment, there was an increase of the DI in the case of action of Les-3833 complexes, compared to the action of the free form of Les-3833; however, at 6 h of treatment, there was a decrease in DNA damage for the action of complexes of both Les-3833 and Les-3288, compared to such damage observed for the action of the free forms of these agents. There was no significant time dependence for the action of the PNC, while a significant time-dependent (from 3 to 6 h) increase in the DI was observed for the action of Dox (from 41.2 + 0.40 to 185.2 + 0.23).

DNA Intercalation by 4-Thiazolidinone Derivatives—Les-3288 and Les-3833

Les-3288 and Les-3833 compounds demonstrated a certain capability for intercalating DNA molecules with approximately 15% and 10%, respectively, of replacement of methyl green dye. EtBr, a well-known DNA intercalating agent, was used as a positive control, and it was shown to replace the methyl green dye much more efficiently (70%) (Fig. 15). Thus, Les-3288 and Les-3833 are not capable of effectively intercalating in between two complementary base pairs in double-stranded DNA.

Replacement of methyl green dye intercalated into the DNA of salmon sperm by Les-3288 and Les-3833 compounds (1.0 μg/mL) and ethidium bromide (EtBr) used as a positive control

Diskussion

There are two major problems that impede increasing the efficiency of treatment for cancer patients:(1) non-addressed actions of many anticancer drugs that lead to general toxicity and severe negative side effects due to damage of normal tissues and organs; (2) rapid (6–12 months) development of resistance of tumor cells to applied anticancer drugs that leads to a loss of efficacy of drug action. In addition, there is a third, technical problem of poor water solubility of many anticancer drugs. However, binding these drugs with specific carriers of the nanoscale size can help to solve the solubility problem.

In this study, we addressed the first and third of the above-mentioned problems by (a) selecting novel synthetic substances (4-thiazolidinone derivatives:Les-3288 and Les-3833) that possess both high anticancer activity and less general toxicity in tumor-bearing animals [7, 8, 23] and (b) applying a novel drug delivery platform that provides stable water-based forms of the complexes of the water-insoluble 4-thiazolidinone derivatives with a PEGylated polymer.

The 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—are heterocyclic compounds with molecular mass of 400–600 Da. These and other related derivatives were synthesized at Lviv National Medical University (Ukraine), and most of them have been tested under the Developmental Therapeutic Program at the National Cancer Institute in Bethesda, MA, (USA) [35,36,37,38]. Based on these evaluations of their antineoplastic activity, the most promising substances were selected for further study of the mechanisms of their cytotoxic action and anticancer effects [25]. Les-3833 demonstrated high toxicity towards B16F10, WM793, and SK-Mel-28 melanoma cells, and against human lung A549, breast MCF-7, colon HCT116, and ovarian SKOV3 cancer cells and leukemia cells (L1210, Jurkat, HL-60 lines) [23, 25, 39]. Les-3288 and Les-3833 showed high toxicity against mammalian glioma cells (C6, U251, U373 lines) [23, 24].

Earlier, we found that Les-3288 and Les-3833 were the most toxic among the other studied 4-thiazolidinone derivatives towards rat glioma C6 cells and human glioblastoma U251 cells [23, 24], although their application for cell treatment was very complicated due to their absolute insolubility in water. Only using DMSO with additional heating was effective for preparing a soluble form of the derivatives (see the “Materials and Methods” section). Thus, it was reasonable to search for a way of improving the delivery of these derivatives to target cells, and we used a synthetic PNC to accomplish this task. The complexation of the studied derivatives of 4-thiazolidinone with the applied PNC also enhanced the effectiveness of their antineoplastic action. The mechanisms of the pro-apoptotic action of these compounds were demonstrated using western blot and FACS analyses [23, 24]. It should be noted that in healthy experimental animals, Les-3288 and Les-3833 produce much fewer negative side effects such as cardiotoxicity [40], hepatotoxicity [8], and nephrotoxicity [7] than the widely used anticancer chemotherapeutic agent Dox.

In a previous study, we showed that Les-3288 did not induce ROS production during its pro-apoptotic action in vitro and effects in experimental laboratory animals [23], while the action of Les-3833 led to such production; however, it was less than that of Dox. ROS are considered to be the main effectors of negative side effects of anticancer drugs, particularly Dox [41, 42]. Thus, the Les-3288 and Les-3833 compounds could be prospective anticancer drugs because they possess antitumor activity, but do not demonstrate general toxicity at the level characteristic for effective anticancer medicines such as Dox.

A great impediment to promoting Les-3288 and Les-3833 as anticancer drugs is their poor water solubility. This problem also exists for other anticancer medicines, such as taxols [2, 4]. For paclitaxel, this problem was solved by using a special oil for preparing the medicinal formulation [2, 4, 43]. However, specific delivery platforms are considered to be more promising for creating “smart” drugs that possess effective action in the organism [3, 13]. Specific functional polymer surfactants with block, comb-like, and block/branched architectures, including PEG-containing ones, as well as derived water forms have been developed and proposed for application as carriers for the delivery of Dox [26, 27] and the metal chemotherapeutic agent KP-1019 [10] at the Department of Organic Chemistry of Lviv Polytechnic National University.

Since the 4-thiazolidinone derivatives are water-insoluble compounds, DMSO was used to prepare their water-soluble forms. To avoid the negative consequences of using a toxic solvent like DMSO, we complexed these derivatives with the above-noted PNC. Highly dispersed and stable nanoscale water dispersions of these substances were obtained and applied for treatment of rat glioma C6 cells.

The use of complexes of 4-thiazolidinone derivatives with the PNC led to reduced general toxicity of these compounds in experimental animals. Earlier, we found that when experimental antitumor agents (Les-3288, Les-3833, Les-3882) were applied in a complex with a synthetic polymeric carrier, their action was accompanied by much smaller changes in the biochemical parameters in blood serum that are characteristic for cardiotoxicity [40], hepatotoxicity [8], and nephrotoxicity [7], compared to those for Dox. Thus, complexation of these antitumor agents with the PNC and their application in the form of water-soluble stable delivery systems reduces their toxic effects in experimental animals, compared with the action of these substances in a free form [44]. Several systems for paclitaxel delivery have been proposed including polymeric nanoparticles, lipid-based formulations, polymer conjugates, inorganic nanoparticles, carbon nanotubes, nanocrystals, and cyclodextrin nanoparticles [43].

Thus, complexation of Les-3288 with the PNC significantly increased the pro-apoptotic activity of this experimental drug, thereby allowing us to advance it to pre-clinical studies on animal tumor models. Complexation of Les-3833 with the same type of nanocarrier was less efficient, and thus another type of polymer should be used.

The developed water-based forms of the complexes, as well as the free derivatives, were applied for treatment of rat glioma C6 cells. It was found that these water-based forms of the complexes of the PNC with the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—enhanced the pro-apoptotic action of these compounds. In another study, we demonstrated that the induction of apoptosis by Les-3288 was not accompanied by ROS induction, opposite to the action of Dox and Les-3833 [23]. Thus, high antitumor activity of Les-3288 together with its low general toxicity when targeting the malignancy in NK/Ly lymphoma-bearing mice suggest great potential for this experimental anticancer compound. The presented data also predict the potential usefulness of Les-3288 and Les-3833 compounds complexed with the PNC for glioma treatment.

Cell division, differentiation, and death are principal physiological processes that regulate tissue homeostasis in multicellular organisms. A disruption of genomic integrity and impaired regulation of cell death may both lead to uncontrolled cell growth. A compromised cell death process can also promote genomic instability. It is becoming clear that dysregulation of the cell cycle and cell death processes plays a pivotal role in the development of major disorders such as cancer, cardiovascular disease, infection, inflammation, and neurodegenerative diseases [45].

We have found that some of the 4-thiazolidinone derivatives, namely, Les-3288 and Les-3833, were even more effective than Dox in the induction of apoptosis in rat C6 glioma and human U251 glioblastoma cells in vitro [23, 24]. It should be noted that brain tumors belong to malignancies that are the most resistant to applied chemotherapies, and survival rates in patients with these tumors are extremely low [44].

It has been shown that the complexation with this PNC enhanced the pro-apoptotic action of 4-thiazolidinone derivatives (Les-3288 and Les-3833) [44]. In another study [23], we demonstrated that the induction of apoptosis by Les-3288 was not accompanied by ROS induction, opposite to the action of Dox and partially opposite to that of Les-3833. These data could explain the lower general toxicity of Les-3288 compared with that of Dox [23, 24].

The results of FACS analysis are in agreement with the suggestion that an enhancement of the pro-apoptotic action of the studied 4-thiazolidinone derivatives is due to their complexation with a novel PNC. Such complexation of Les-3288 and Les-3833 increased the ratio of pre-G1 cells in the population of treated rat glioma C6 cells, decreased the ratio of G1 cells, and increased the action of G2/M cells. These data suggest an enhancement of both cytotoxic action (apoptosis) and cytostatic action (block in G2/M phase of cell cycle) of the studied derivatives complexed with the PNC. In general, the apoptosis mechanism of glioma cell killing by the Les-3288 + PNC complex and the Les-3833 + PNC complex was demonstrated by the results of FACS analysis of the appearance of Annexin V single-positive rat glioma C6 cells.

Involvement of the apoptosis mechanisms in the action of the studied 4-thiazolidinone derivatives was also confirmed by the results of the DNA comet assay. It was found that the complexation of Les-3833 with the PNC led to a decrease (compared to free Les-3833) in the ratio of rat glioma C6 cells in “0” DNA comets and sіmultaneous increase in the ratio of “1,” “2,” and “3” comets (3-h treatment of cells). At 6 h of treatment by the Les-3833+PNC complex, there was a large increase (compared to free Les-3833) in the ratio of “1” comets, an increase in the ratio of cells with the most expressed DNA damage (“4” comets), and a decrease in the ratios of “2” and “3” comets. It should be noted that the DNA damaging effects of Les-3288 and Les-3833 measured at 6 h was higher than such effects of complexes of these derivatives with the PNC (see Table 3). A possible explanation here could be a very high level of the DI at 6 h action of studied agents that is even higher than the level of that indicator found for the action of Dox (Table 3). There was no time dependence in the action of the PNC, while a significant time-dependent (from 3 to 6 h) increase (from 41.2 + 0.40 to 185.2 + 0.23) in the DI was detected for the action of Dox.

Thus, a complexation of 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—with a PNC enhanced the cytotoxic effect of these compounds towards rat glioma C6 cells, and that effect was achieved through the apoptosis mechanisms including DNA damage observed as DNA comets in the electrophoresed cells.

We used the DNA intercalation test to investigate the direct targeting of DNA by the 4-thiazolidinone derivatives and revealed only weak replacement of methyl green dye (15% and 10% replacement for Les-3288 and Les-3833, respectively) that intercalated into the DNA of salmon sperm, compared to the replacement by EtBr, used as a positive control (70%).

Thus, conducting the cytotoxicity experiments in vitro with the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—was more convenient due to using the water-based forms of the 4-thiazolidinone derivatives—Les-3288 and Les-3833—complexed with the novel PNC. Besides, we have demonstrated that the novel synthetic 4-thiazolidinone derivatives (Les-3833 and Les-3288) possessed treatment effects i n vivo towards NK/Ly lymphoma grafted to BALB/C mice, and those effects were comparable to such effects of Dox. At the same time, the action of these derivatives led to much fewer negative side effects measured as changes in the number of erythrocytes, neutrophils, and lymphocytes in the animals’ blood and the activity of aspartate and alanine aminotransferases in their blood serum, compared with the action of Dox.

Schlussfolgerungen

The complexation of Les-3288 and Les-3833 with the PEG-containing PNC enhanced their cytotoxic action towards rat glioma C6 cells. The cytotoxic action was realized by apoptotic mechanisms and confirmed by FACS analysis as the presence of the pre-G1 fraction in the rat glioma C6 cells and of Annexin V-single-positive cells. DNA comet analysis revealed single-strand brakes in the nuclear DNA of treated glioma C6 cells that probably was not caused by the intercalation of the studied compounds into the DNA molecule. The Les-3288 and Les-3833 stabilized by the amphiphilic PEG-containing PNC resulted in the water-based forms and provided enhancement of their antitumor effect in vitro in comparison with the free form of the drugs.

Abkürzungen

DMSO:

Dimethylsulfoxide

Dox:

Doxorubicin

EtBr:

Ethidium bromide

FACS:

Fluorescence-activated cell sorting

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PEG:

Polyethylenglykol

PI:

Propidiumjodid

PNC:

Polymeric nanocarrier

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

VEP:

2-Tret-butylperoxy-2-methyl-5-hexen-3-in