Wasser-dispergierte PEG-Polymer-Komplexe von 4-Thiazolidinon-Chemotherapeutika verstärken pro-apoptotische Aktivität gegen Ratten-Gliom-C6-Zellen

Zusammenfassung

Ziel

Untersuchung, ob die wässrige Formulierung des Komplexes von 4-Thiazolidinon-Derivaten mit einem PEG-haltigen polymeren Nanoträger ihre pro-apoptotische Wirkung auf Ratten-Gliom-C6-Zellen verstärkt.

Methoden

Mechanismen antineoplastischer Effekte von 4-Thiazolidinon-Derivaten wurden in vitro an Ratten-Gliom-C6-Zellen untersucht. Zellvitalität, Zellzyklusmuster und Annexin-V-Expression wurden evaluiert und DNA-Schäden durch DNA-Kometenanalyse geschätzt. Eine neuartige wässrige Formulierung von 4-Thiazolidinon-Derivaten, komplexiert mit einem polymeren Nanoträger, wurde zur Verstärkung der pro-apoptotischen Wirkung auf C6-Zellen genutzt.

Ergebnisse

Die untersuchten 4-Thiazolidinon-Derivate nutzen Apoptose-Mechanismen zum Abtöten von Ratten-Gliom-C6-Zellen, bestätigt durch FACS-Analyse dieser Zellen in Prä-G1-Stadium, das Auftreten von Annexin-V-positiven C6-Zellen und eine erhöhte Anzahl von DNA-Kometen höherer Klassen. Komplexierung der untersuchten Verbindungen mit einem PEG-haltigen polymeren Nanoträger steigerte die pro-apoptotischen Effekte in Ratten-Gliom-C6-Zellen signifikant, gemessen mit allen oben genannten Methoden.

Schlussfolgerung

Komplexierung von 4-Thiazolidinon-Derivaten mit einem PEG-haltigen polymeren Nanoträger verlieh ihnen Wasserlöslichkeit und verstärkte pro-apoptotische Effekte in Ratten-Gliom-C6-Zellen.

Einleitung

Chemotherapie ist die Hauptbehandlungsmodalität für viele Tumoren, und chemotherapeutische Medikamente werden als letzte Option gewählt, besonders wenn Krebs bereits metastasiert ist [1]. Allerdings reduzieren schwere negative Nebenwirkungen die klinische Wirksamkeit vieler aktueller Antikrebsmedikamente. Daher besteht ein kontinuierlicher und entscheidender Bedarf, alternative oder synergistische Antikrebsmedikamente mit reduzierten oder minimalen Nebenwirkungen zu entwickeln [2].

Die geringe Wasserlöslichkeit von Antikrebsmedikamenten war ein weit verbreitetes und ernstes Problem, das ihre Entwicklung und klinische Anwendung behindert, und viele hochaktive und vielversprechende chemotherapeutische Wirkstoffe wurden aufgrund ihrer geringen Wasserlöslichkeit ausgeschlossen [3]. Tenside und Ko-Lösungsmittel werden in hohen Konzentrationen eingesetzt, um wasserunlösliche Antikrebsmittel zu lösen; diese Substanzen können jedoch auch adverse Nebenwirkungen erzeugen, was den Einsatz vieler Antikrebsmedikamente limitiert [4].

Eine große Herausforderung bei der Entwicklung pharmazeutischer Medikamente ist die Eliminierung oder zumindest Reduktion der negativen Nebenwirkungen hochaktiver Medikamente, besonders Antitumor-Wirkstoffe, die allgemeine Toxizität im Körper zeigen und deren Einsatz erheblich einschränken [5,6,7,8,9]. Ein effektiver Weg, dieses Problem zu überwinden, ist die Verwendung eines multifunktionalen Nanoträgers des Medikaments, der es ermöglicht, die toxischen Antitumor-Wirkstoffe an der Stelle ihrer Abgabe an gezielte Zellen in spezifischen Organen oder Geweben zu binden [8, 10, 11]. Die kleine Größe, kontrolliert-spezifische Struktur, große Oberfläche und Form von Nanopartikeln verleihen ihnen mehrere Vorteile im Vergleich zu anderen Materialien [5, 8, 9]. Bei Verwendung von Nanopartikeln ist es möglich, Effizienz zu optimieren, negative Nebenwirkungen zu minimieren und Krebstherapie zu verbessern [12, 13]. Somit können Medikamente, die früher aufgrund hoher allgemeiner Toxizität scheiterten, nun eine zweite Chance für klinische Nutzung erhalten, dank ihrer Einbindung in ein Abgabesystem mit verbesserter Bioverfügbarkeit und kontrollierter Freisetzung. Solche Medikament-Träger-Komplexe durchdringen leichter natürliche Barrieren wie Blut-Hirn-Schranken oder Membranen einzelner Zellen. Die große Oberfläche von Nanopartikeln ermöglicht es ihnen, Komplexe mit spezifischen Vektor-Biomolekülen zu bilden, die bei der Medikamentenabgabe zum Zielorgan helfen, zu einer signifikanten Reduktion oder sogar vollständigen Eliminierung negativer Nebenwirkungen führen, eine Erhöhung der minimalen wirksamen Dosis bei einer Einzelverabreichung ermöglichen, die Wirksamkeit der Medikamentenwirkung steigern und einen neuen Anstoß für die Entwicklung personalisierter Pharmakotherapie geben. Zusätzlich können Nanopartikel Moleküle einkapseln, die Löslichkeit, Stabilität und Absorption bestimmter Medikamente verbessern [11, 13,14,15]. Medikamentenabgabesysteme können verlängerte Zirkulation eines Medikaments im Blut, die Fähigkeit des Medikaments, sich während des pathophysiologischen Prozesses anzureichern, und die Fähigkeit, das Molekül des aktiven Wirkstoffs effektiv in die Zellen und Organellen der Zellen zu transferieren, bereitstellen. Die Nanopartikel müssen stabil sein, ihre chemische Struktur für einen bestimmten Zeitraum beibehalten und gleichzeitig bioabbaubar sein [16, 17].

Um neue Antikrebsmedikamente zu evaluieren, ist es wichtig, ihre zytotoxische Aktivität und Potenz an verschiedenen humanen Krebszelllinien und experimentellen Tumormodellen in vivo zu messen. Chemotherapie scheitert oft wegen eines Mangels im Apoptose-Prozess, der eine entscheidende Rolle im medikamenteninduzierten Zelltod spielt, der auf eine Veränderung der Tumorgenese folgt oder daraus resultiert [18,19,20,21].

Da viele maligne Zellen apoptotischem Tod entgehen können, sollte ein rationaler Ansatz im Design und der Entwicklung neuer Antikrebsmedikamente verwendet werden. Die Hauptziele für die Schaffung neuer Antikrebsmedikamente sind: (1) Wege zu finden, Mutationen individueller Krebszellen zu überwinden, die unabhängige Mechanismen der Medikamentenwirkung beeinflussen; und (2) Chemotherapie-Regime zu entwerfen, die in der Lage sind, unabhängige Wege gleichzeitig anzugreifen. Ein besseres Verständnis der Beziehung zwischen Krebsgenetik und Behandlungsempfindlichkeit ist ein Schlüsselthema für die Entwicklung neuer wirksamer Antikrebsmedikamente [22].

In früheren Studien demonstrierten wir, dass synthetische 4-Thiazolidinon-Derivate (Les-3288, Les-3833 und Les-3882) wahrscheinlich andere Wirkmechanismen als andere Antikrebsmittel nutzen, um Ratten-C6-Gliom und menschliche U251-Glioblastom-Zellen in vitro abzutöten, im Gegensatz zu Doxorubicin (Dox). Les-3288 beeinflusste den Spiegel reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in behandelten Zellen nicht signifikant [23, 24]. Es sollte betont werden, dass diese potenten Antitumor-Wirkstoffe weniger allgemeine Toxizität im Körper von Versuchstieren zeigten, wie durch gemessene biochemische Parameter ihrer toxischen Wirkung in Tumorzellen und Tieren demonstriert, im Vergleich zu denen von Dox [7, 8]. Somit kann die Bindung eines Antitumor-Medikaments mit einem polymeren Nanoträger (PNC) und die Medikamentenanwendung in Form eines stabilen wässrigen Abgabesystems die toxischen Effekte in den Organen der Tiere reduzieren, im Vergleich zur Wirkung dieser Substanzen in freier Form [7, 8].

Das Ziel dieser Arbeit war es, Apoptose-Induktion in Ratten-Gliom-Zellen der C-Linie in vitro und in vivo durch wässrige Formulierungen von Komplexen von 4-Thiazolidinon-Derivaten mit einem PEG-haltigen PNC zu untersuchen und die Apoptose-Induktion mit diesen Derivaten in freier Form zu vergleichen.

Materialien und Methoden

Antikrebsmedikamente

Die heterocyclischen 4-Thiazolidinon-Derivate (Verbindungen Les-3288 und Les-3833, Abb. 1) wurden an der Abteilung für Pharmazeutische, Organische und Bioorganische Chemie der Danylo Halytsky Lviv Nationalen Medizinischen Universität, Ukraine, synthetisiert, wie zuvor beschrieben [25].

Vor Verwendung in Zellkultur wurden diese Verbindungen in Dimethylsulfoxid (DMSO, Arterium, Lviv, Ukraine) gelöst. Die Lösung wurde zusätzlich 5 min in einem kochenden Wasserbad gehalten und in destilliertem Wasser verdünnt, um die Arbeitskonzentrationen zu erreichen. Die finale DMSO-Konzentration im Kulturmedium lag unter 0,1 %. Dox wurde in einer lokalen Apotheke von einem Pfizer (Italien) Vertreter in der Ukraine gekauft.

Polymerer Nanoträger

Der PNC für Medikamentenabgabe wurde an der Abteilung für Organische Chemie der Lviv Polytechnischen Nationalen Universität, Ukraine, unter Verwendung einer zuvor beschriebenen Methodik [26, 27] synthetisiert. Die Synthese von Poly(VEP-co-GMA)-graft-PEG erfolgte in nachfolgenden Stufen wie folgt. Poly(VEP-co-GMA) wurde durch radikalische Copolymerisation von 5-tert-butylperoxy-5-methyl-l-hexen-3-in (VEP, 0,41 g, 0,5 mol) (Peroxid-Monomer synthetisiert nach beschriebener Methode [28]) und Glycidylmethacrylat (GMA, 7,72 g, 12,2 mol) (Sigma-Aldrich, USA) in Ethylacetat (7,9 ml) (Merck, Darmstadt, Deutschland) unter Verwendung von Azoisobutyronitril (AIBN, 0,129 g, 0,05 mol) (Merck, Darmstadt, Deutschland) als Radikalinitiator durchgeführt. Die Polymerisation wurde bei 343 K durchgeführt, bis die maximale Umwandlung von 65 % erreicht war. Poly(VEP-co-GMA) wurde als Rückgrat für die Anbindung von PEG-Seitenketten über Additionsreaktionen von Poly(ethylenglycol)methylether (mPEG) mit Seiten-Epoxidgruppen verwendet. Bortrifluorid-etherat (0,027 ml, 0,031 mol) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) wurde zur Lösung des Copolymers (1,0 g) in Dioxan (20 ml; Merck, Darmstadt, Deutschland) bei 313 K gegeben und 3 h gerührt. mPEG (2,5 mg, 3,35 mmol) (Sigma-Aldrich, USA) wurde in Dioxan (15 ml) gelöst und die Lösung mit der Rückgratpolymerlösung gemischt und 6 h bei 313 K gerührt. Unreagiertes mPEG wurde mittels Dialysetüten mit Porengröße von Molekulargewichts-Cutoff (MWCO) 6-8 kDa (Sigma-Aldrich, USA) entfernt. Das resultierende kammförmige Poly(VEP-co-GMA)-graft-PEG wurde bei Raumtemperatur unter Vakuum bis zur konstanten Masse getrocknet. Die Strukturen und einige Charakteristika des PNC sind in Abb. 2 dargestellt und wurden zuvor beschrieben [29].

Zur Herstellung der wässrigen PNC-Lösungen wurden 0,09 g PNC in 0,9 ml DMSO gelöst. Diese PNC-Lösung wurde zu 8,0 ml 0,9 % NaCl-Lösung gegeben. Dann wurde die Lösung 0,5 h gerührt und 10 s soniziert. Wässrige Dispersionen der Komplexe wurden durch Tropfen der DMSO-Lösung von 4-Thiazolidinonen und PNC in Wasser in folgender Reihenfolge erhalten: 0,045 g PNC wurden in 0,15 ml DMSO (Sigma-Aldrich, USA) gelöst, und 0,0015 g Les-3288 (oder Les-3833) wurden in 0,10 ml DMSO gelöst. Die Lösungen von PNC und 4-Thiazolidinonen wurden gemischt und zu 4,25 ml 1 % wässriger NaCl-Lösung gegeben und 10 s soniziert.

Dieser oberflächenaktive PNC enthält hydrophile PEG-Ketten, die an das hydrophobe Rückgrat graftet sind (Abb. 2a). In wässrigen Lösungen bildet der amphiphile PNC micellartige Strukturen, die wasserunlösliche Verbindungen (z. B. Medikamente) lösen können oder diese Verbindungen können auf der Oberfläche der Nanopartikel adsorbiert werden, wodurch ihre Biokompatibilität erhöht wird. Die entwickelte Technik zur Erlangung hochstabiler wässriger Dispersionen der 4-Thiazolidinon-basierten Chemotherapeutika besteht in der Nukleation nanoskaliger Medikamententeilchen, die auftritt, wenn die verdünnten Lösungen in DMSO in die ausfällende Salzlösung mit polymerem Tensid PNC übertragen werden, das Polymerbeschichtung für die Nanopartikeloberfläche bereitstellt. Als Ergebnis wurde der Komplex durch Aggregation und Sedimentation stabilisiert und die Dispersion verhindert. Zusätzlich sind die nanoskaligen Komplexe der 4-Thiazolidinon-Derivate vor möglichen Interaktionen mit der umgebenden biologischen Mikroumgebung geschützt. Dieser Schutz ermöglicht es ihnen, länger im Körper zu verbleiben, ohne Stabilität zu verlieren, und sich im Zielgewebe oder -organ anzureichern, ohne negative Nebenwirkungen zu verursachen. Somit bietet eine solche Modifikation verbesserte Aggregations- und Sedimentationsstabilität wässriger Dispersionen der Antikrebs-Wirkstoff-Nanopartikel.

Die Größen der Polymermizellen des PNC und der Komplexe des PNC mit den heterocyclischen 4-Thiazolidinonen wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) mit einem Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments GmbH, Stuttgart, Deutschland) und DynaPro NanoStar (Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA) und durch Photonenkorrelationsspektren mit nicht-invasivem Rückstreuung (NIBS) bei 25 °C gemessen. Die Proben für DLS-Messungen wurden wie oben beschrieben hergestellt und bei Bedarf mit bidestilliertem Wasser, pH 6,5–7,0, verdünnt. Drei bis fünf Messungen wurden für jede Probe durchgeführt (jede Messung bestand aus 5 Zyklen und der Bereich zwischen den Messungen betrug 5 min). Abbildung 3 zeigt die Größenverteilung der Mizellstrukturen des PNC und der Nanopartikel der Komplexe des PNC mit den heterocyclischen 4-Thiazolidinonen (Les-3833 und Les-3288) analysiert durch DLS. Die Größe und Morphologie der PNC-Mizellen sowie der PNC-beschichteten 4-Thiazolidinon-Nanopartikel wurden mit einem Transmissions-Elektronenmikroskop JEM-200А (JEOL, Japan) bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV untersucht [30, 31]. Die Proben wurden wie oben beschrieben hergestellt und bei Bedarf mit bidestilliertem Wasser verdünnt. Proben wurden durch Aufsprühen der getesteten Lösung auf ein Substrat mittels Ultraschall-Dispergator UZDN-1A (Ukrrospribor Ltd., Ukraine) hergestellt, was eine gleichmäßige Beschichtung auf dem Substrat erleichtert. Ein dünner amorpher Kohlenstofffilm auf einem Kupfergitter wurde als Substrat verwendet. Die Größen und Morphologie der PNC-Mizellen und der Komplexe mit den heterocyclischen 4-Thiazolidinonen (Les-3288 und Les-3833), untersucht mit DLS- und TEM-Methoden, sind in Abb. 3 dargestellt.

Die DLS- und Transmissions-Elektronenmikroskopie-Studien (TEM) demonstrierten, dass die Größen der PNC-Mizellen 50 ± 25 nm betrugen und die durch Komplexe des PNC mit den heterocyclischen 4-Thiazolidinonen Les-3833 und Les-3288 gebildeten Nanopartikel 140 ± 25 nm bzw. 155 ± 30 nm betrugen. Die Dispersionen der Komplexe des PNC mit 4-Thiazolidinon-Derivaten sind hochstabil und durch die adsorbierte PNC-Hülle auf der Thiazolidinon-Nanopartikeloberfläche vor Aggregation und Sedimentation geschützt. Wie in Abb. 4 gezeigt, sind Änderungen in den Größen der in dem wässrigen System dispergierten Nanopartikel bei mehrfacher Verdünnung mit Wasser sowie nach 6-monatiger Alterung der wässrigen Systeme der Komplexe des PNC mit 4-Thiazolidinonen vernachlässigbar.

Zellkultur

Ratten-Gliom-Zellen der C6-Linie wurden von der Zellkultursammlung am Institut für Molekularbiologie und Genetik, Nationale Akademie der Wissenschaften der Ukraine (Kiew, Ukraine) bezogen. Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Sigma, USA) kultiviert, supplementiert mit 10 % fötalem Kälberserum (Sigma, USA). Zellen wuchsen in einem CO₂-Inkubator bei 37 °C, 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit. Die Wiederaussaat der Zellen erfolgte im Verhältnis 1:5 alle 2–3 Tage.

Evaluierung der zytotoxischen Wirkung der untersuchten Substanzen

Zellen wurden in 24-Well-Platten bei einer Konzentration von 100.000 Zellen/ml in einem Well gesät (Greiner Bio-One North America, Inc., Monroe, NC, USA). Die untersuchten Substanzen wurden nach einer 24-stündigen Anpassungsperiode, die nach der Zellaussaat begann, in Konzentrationen von 0,1, 0,5 und 1,0 µM zugegeben. Zellzählung wurde in regelmäßigen Abständen in der Hämozytometer-Zählkammer mit Trypan-Blau-Farbstoff (DV-T10282, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Corp., Waltham, MA, USA) bei 0,01 % Endkonzentration, 2 min nach Zugabe zur Zellsuspension, durchgeführt. Die toten Zellen nahmen diesen Farbstoff aufgrund Schädigung ihrer Plasmamembran auf.

Durchflusszytometrie

Zur Untersuchung von Zellzyklus und Apoptose wurden C6-Zellen mit Les-3288, Les-3833 und ihren Komplexen mit PNC sowie mit PNC in freier Form behandelt, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) gewaschen, durch Zentrifugation bei 1000 rpm für 5 min bei 4 °C pelletiert und in kaltem PBS (2 Millionen Zellen pro 1 ml PBS) resuspendiert. Dann wurden die Zellen durch Zugabe von Aliquoten von 4 ml absolutem Ethanol, abgekühlt auf −20 °C, mit vorsichtigem Mischen fixiert. Die fixierten Proben wurden bei −20 °C bis zur Verwendung aufbewahrt (nicht länger als 1 Woche). Für Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) Analyse wurden Zellproben bei 1000 rpm für 5 min bei 4 °C zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet in 1 ml PBS resuspendiert. Hundert Mikroliter DNase-freies RNase (Sigma, USA) wurden zu dieser Suspension gegeben und die Proben 30 min bei 37 °C inkubiert. Dann wurde jede Probe mit 100 µl Propidiumiodid (PI) (Sigma, USA, 1 mg/ml) supplementiert und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurden die Proben in Plastik-Falcon-Röhrchen überführt und die Zellsuspension mit einem FACSCalibur Durchflusszytometer (BD Biosciences, Mountain View, CA, USA) und Summit v3.1 Software (Cytomation, Inc., Fort Collins, CO, USA) zur Messung der Parameter von Zellzyklus und Apoptose überwacht.

Messung der Annexin-V-positiven (apoptotischen) Zellen wurde mittels FACS-Analyse durchgeführt. Ratten-Gliom-C6-Zellen wurden mit 0,1 mg/ml, 0,5 mg/ml und 1 mg/ml Konzentrationen von PNC, Les-3288, Les-3833 und ihren polymeren Konjugaten behandelt, wie unter den Abbildungen angegeben. Am Ende des Experiments wurden die Zellen vom Boden der Schale mit Trypsin-EDTA-Lösung abgelöst, zweimal mit PBS gewaschen und mit Annexin V-FITC unter Verwendung eines Apoptose-Nachweis-Kits (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) gemäß Herstelleranweisungen gefärbt. Gewaschene Zellen wurden 15 min in Annexin-V-Bindepuffer (BD Pharmingen) inkubiert, der 1/50 Volumen FITC-konjugierter Annexin-V-Lösung enthielt. Dann wurden die Proben mit einem geeigneten Volumen des Annexin-V-Bindepuffers verdoppelt und sofort im FL1/FL2 (FITC-PI) Kanal eines Durchflusszytometers (Becton Dickinson, USA) gemessen. Annexin-V-einfach-positive Zellen wurden als apoptotisch klassifiziert.

DNA-Kometen-Assay

Der DNA-Kometen-Assay wurde unter alkalischen Bedingungen durchgeführt. Zehntausend Zellen wurden in 75 µl niedrigschmelzendem Agarose (0,5 %) pro Probe gemischt. Nach dem Mischen wurde die Probe auf einen Objektträger pipettiert, der zuvor mit 1,5 % normalem Agarose bedeckt war. Die Proben wurden 18 h bei 4 °C in Lyse-Lösung (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM Tris-Base, 10 % DMSO, 1 % Triton X-100) inkubiert. Zum Entwinden der DNA und Expression alkalilabiler Schäden wurden Objektträger 20 min bei Raumtemperatur in alkalischer Lösung inkubiert (im Dunkeln durchgeführt). Für Elektrophorese (~74 V/cm für 30 min) wurden Objektträger in eine horizontale Kammer überführt und 1x Elektrophorese-Puffer (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA, pH > 13) hinzugefügt. Die Objektträger wurden in eiskaltem, 100 % Methanol fixiert und getrocknet. Objektträger wurden mit 80 µl 1× Ethidiumbromid (EtBr) für 5 min gefärbt und dann in gekühltem destilliertem Wasser getaucht, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Die DNA-Kometen wurden mit einem Mikroskop (Carl Zeiss, Deutschland) visualisiert und die Bilder mit der Software 'CASP' (Casplab-1.2.3b2 Software, CASPlab, Wroclaw, Polen) analysiert. Hundert Kometen pro Probe wurden gezählt. DNA-Schaden wurde in fünf Genotoxizitätsstufen nach Kometenschwanzgröße kategorisiert: 0 (0–5 % Schaden), 1 (5–25 %), 2 (25–45 %), 3 (45–70 %) und 4 (mehr als 70 %) [32]. Der Schadensindex (DI) wurde wie zuvor beschrieben berechnet [33].

DNA-Interkalations-Assay mit Methylgrün-Farbstoff

Die Verbindungen Les-3288 und Les-3833 wurden auf die Fähigkeit untersucht, in das DNA-Molekül zu interkalieren, mittels Methylgrün-Assay [34]. Lachssperma-DNA (10 mg/ml) wurde 1 h bei 37 °C mit 15 µl Methylgrün-Lösung (1 mg/ml in H₂O) inkubiert. Die Verbindungen wurden bei 1 µg/ml zugegeben und 2 h bei 37 °C im Dunkeln inkubiert. Das gesamte finale Probenvolumen betrug 1 ml. Absorption von Methylgrün wurde nach 2 h Inkubation bei 37 °C bei 630 nm mit einem BioTek 76 883 Mehrkanal-Mikrophotometer (BioTek, Winooski, VT, USA) gemessen. EtBr wurde als positiver Kontrolle verwendet.

Datenanalyse und Statistik

Alle Experimente wurden dreimal mit drei Parallelproben in jeder Variante wiederholt. Varianzanalyse (ANOVA) wurde für Gruppenvorvergleiche verwendet. Daten der Verteilung von C6-Ratten-Gliom-Zellen in verschiedenen Phasen des Zellzyklus wurden durch Einfaktorielle ANOVA analysiert, gefolgt von Tukeys post-hoc Mehrfachvergleichstest. Alle Daten werden als Mittelwert ± SD präsentiert. Ein p-Wert von < 0,05 wurde als statistisch signifikant betrachtet.

Ergebnisse

Zytotoxischer Effekt (Trypan-Blau-Ausschluss-Test) von 4-Thiazolidinon-Derivaten in freier Form und in Komplex mit dem polymeren Nanoträger

Die Ergebnisse des Trypan-Blau-Ausschluss-Tests demonstrierten, dass die wässrigen Formen der Les-3288 und Les-3833 Komplexe mit dem PNC eine verstärkte Toxizität gegenüber Gliom-C6-Zellen (24 h und 48 h Behandlung) aufwiesen im Vergleich zur Zytotoxizität, die bei Verwendung der freien Form dieser Verbindungen beobachtet wurde (Abb. 5 und 6). Der höchste zytotoxische Effekt wurde bei 0,1 und 0,5 µM Dosen von Les-3288 und Les-3833 Verbindungen in ihren Komplexen mit dem PNC beobachtet, während bei der höchsten Dosis (1,0 µM) dieser Verbindungen eine Verstärkung der Komplexierung mit dem PNC nur im Fall von Les-3288 für 24 h detektiert wurde (Abb. 5 und 6).

Komplexierung von Les-3833 und Les-3288 Verbindungen mit polymerem Nanoträger verstärkt ihre pro-apoptotische Aktivität in vitro gegenüber Ratten-Gliom-C6-Zellen

Zwei alternative Ansätze wurden verwendet, um den modulierenden Effekt des PNC auf das zytotoxische Potenzial der ausgewählten 4-Thiazolidinon-Derivate zu bewerten. Zunächst wurde Zellzyklusanalyse durchgeführt, um den Einfluss der Medikament-PNC-Komplexe auf den Zellzyklus zu untersuchen. Zusätzlich wurde Annexin V/PI-Doppelfärbung genutzt, um den genauen Zelltodtyp zu unterscheiden, der durch diese Nanokomposite induziert wird.

Les-3288 und Les-3833 Verbindungen bei niedrigen Dosen (0,1 µg/ml und 0,5 µg/ml) erzeugten keinen sichtbaren Effekt auf entweder Zellzyklusfortschritt oder Apoptose-Induktion, wie in Abb. 7 und Tabelle 1 gezeigt. Allerdings erhöhte die Komplexierung beider Verbindungen mit dem PNC die Zellzahl in Prä-G₁-Phase signifikant (4-fach für Les-3288 und 6-fach für Les-3833), was einen massiven Anstieg ihres pro-apoptotischen Potenzials anzeigt. Es sollte betont werden, dass PNC in freier Form keinen Einfluss auf Zellzyklus oder Apoptose-Induktion hatte; somit kann das beobachtete Auftreten einer großen Population von Prä-G1-Zellen unter Behandlung mit den Thiazolidinon-Nanoträger-Komplexen nicht durch einen einfachen synergistischen Effekt des PNC und der experimentellen Medikamente erklärt werden.

Um zu bestätigen, dass der beobachtete Sub-G1-Peak aus apoptotischen Zellen besteht, wurden die Ergebnisse des Annexin V/PI-Färbung-Assays analysiert. Wir beobachteten keine signifikante Externalisierung von Phosphatidylserin (Hauptmarker früher Apoptose, detektiert durch FITC-konjugiertes Annexin V) während der C6-Gliom-Behandlung mit niedrigen (0,1 und 0,5 µg/ml) und hohen Dosen von Les-3288 (1,0 µg/ml), was darauf hindeutet, dass diese Verbindung ein schwacher Apoptose-Induktor ist. Stattdessen fanden wir eine Zunahme der nekrotischen Zellpopulation (von 1,2 % in Kontrolle auf 11,25 % für Les-3288, 1,0 µg/ml), was anzeigen könnte, dass Les-3288 zumindest teilweise nekrotischen Zelltod verursacht. Allerdings veränderte die Komplexierung von Les-3288 mit dem PNC den Wirkmechanismus dieses Medikaments vollständig. Es gab einen massiven Anstieg der Zahlen früher apoptotischer (Annexin V(+)/PI(−)) und später apoptotischer Zellen (Annexin V(+)/PI(+)), während die Gesamtmenge rein nekrotischer Zellen auf dem Niveau der Kontrollzellen (unbehandelt) blieb (Abb. 8a). Somit verstärkt die Bindung von Les-3288 an den PNC nicht nur seine pro-apoptotische Aktivität gegenüber Gliomzellen stark, sondern verringert auch sein potenzielles pro-nekrotisches Zelltod-Mechanismus. Diese Ergebnisse könnten für die klinische Praxis von entscheidender Bedeutung sein, da pro-nekrotische Medikamente aufgrund massiver Entzündungsinduktion, die für Patienten unpraktisch ist, nicht empfohlen werden.

Überraschenderweise beobachteten wir nicht den gleichen Effekt für den Les-3833+PNC-Komplex. Tatsächlich war die pro-apoptotische Aktivität des Les-3833+PNC-Komplexes niedriger im Vergleich zu Les-3288 in freier Form bei allen getesteten Konzentrationen (Abb. 8b). Ein so drastischer Unterschied zwischen beiden Verbindungen könnte durch die Spezifität ihrer chemischen Struktur erklärt werden, und wir spekulieren, dass im Fall von Les-3833 die Struktur des Polymers optimiert werden sollte, um bessere Ergebnisse zu erzielen.

Kometen-Assay der DNA-Schäden in Ratten-Gliom-C6-Zellen verursacht durch 4-Thiazolidinon-Derivate in freier Form und komplexiert mit dem PNC

Alkalischer Kometen-Assay ermöglicht den Nachweis von Einstrang-DNA-Brüchen in alkalilabilen DNA-Stellen. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mittels des Mittelwerts des Olive-Schwanzmoments (OTM) geschätzt. Unsere Daten zeigten, dass Behandlung von C6-Ratten-Gliom-Zellen mit Les-3288, Les-3833 und PNC (Konzentration 0,5 µg/ml) für 3 h (Abb. 9 und 10) keine signifikanten DNA-Schäden verursachte (OTM = 0,7299 ± 0,1276, OTM = 1,466 ± 0,3086, OTM = 0,5846 ± 0,1078, jeweils), im Vergleich zu unbehandelten Zellen in der Kontrolle (OTM = 0,4541 ± 0,07273). Allerdings verursachte Zellbehandlung mit dem Les-3833 + PNC Komplex (OTM = 2,3880 ± 0,2212) signifikantere DNA-Schäden als Zellbehandlung mit der freien Form von Les-3833. Ein solcher Anstieg des Schadens wurde für die Wirkung des Les-3288+PNC Komplexes nicht beobachtet (Abb. 9 und 10).

Eine Erhöhung der Zellinkubationszeit auf 6 h (Abb. 11 und 12) verursachte größere DNA-Schäden in allen Experimentiergruppen: Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833, Les-3833+PNC und Dox (positive Kontrolle). Allerdings schienen die Effekte der Les-3288+PNC und Les-3833+PNC Komplexe niedriger zu sein als die Effekte der freien Formen von Les-3288 und Les-3833. Es sollte angemerkt werden, dass die DNA-schädigende Wirkung der Komplexe beider Derivate mit dem PNC geringer war als die Wirkung dieser Derivate in freier Form.

Die Ergebnisse wurden mittels des Mittelwerts von TailDNA% evaluiert. Die erhaltenen Daten zeigen, dass Inkubation von C6-Ratten-Glioblastom-Zellen mit Substanz Les-3288, Les-3288+PNC, Les-3833 und PNC (alle bei 0,5 µg/ml Konzentration) während 3 h (Abb. 13) nicht zu signifikanten DNA-Schäden führt (TailDNA% von 4,157 ± 0,682; TailDNA% von 3,530 ± 1,012, 8,807 ± 0,878; 3,298 ± 0,514, jeweils) im Vergleich zur Kontrolle (TailDNA% = 3,638 ± 0,406), aber Zellbehandlung mit dem Les-3833+PNC Komplex (TailDNA% = 19,53 ± 1,48) verursacht signifikantere DNA-Schäden als die freie Form von Les-3833. Eine Erhöhung der Inkubationszeit auf 6 h (Abb. 14) führt in allen Fällen zu größeren DNA-Schäden. Wiederum war der TailDNA%-Wert, der von der Wirkung der Komplexe beider Derivate mit dem PNC detektiert wurde, niedriger als der dieser Indikator für die Wirkung dieser Derivate in freier Form.

Wir verwendeten auch ein alternatives, fünf-Kategorie-Klassifikationssystem zur Klassifizierung der DNA-Migration und berechneten den DI. Tabelle 2 fasst die Prozentsätze der Ratten-Gliom-C6-Zellen für jede Genotoxizitätsstufe während 3 h Behandlung zusammen. In der Kontrolle (unbehandelte Zellen) wurden höhere Prozentsätze von Zellen in Stufe 0 (81,3 %) und 1 (18,6 %) detektiert im Vergleich zu diesen Stufen in Les-3288 und PNC-behandelten Zellen. Komplexierung von Les-3288 mit dem PNC führte nicht zu einer großen Veränderung im Verteilungsmuster der DNA-Kometen. Im Gegensatz dazu zeigten Les-3833-behandelte Zellen einen niedrigeren Prozentsatz an Zellen in Stufe 0 (38,6 %) und einen höheren Prozentsatz in Stufe 1 (60,0 %), während Les-3833 + PNC-behandelte Zellen einen signifikant niedrigeren Prozentsatz an Zellen in Stufe 0 (8,0 %) und viel höhere Prozentsätze an Zellen mit Stufen 1 (76,0 %), 2 (13,3 %) und 3 (2,6 %) demonstrierten. Der integrative Indikator von DNA-Schaden (DI) im Fall der Anwendung sowohl von Les-3288 als auch seines Komplexes mit dem PNC unterschied sich nicht signifikant von dem für Kontrolle oder Verwendung von freiem PNC, während der DI von der Verwendung sowohl von Les-3833 als auch seines Komplexes mit dem PNC sogar höher war als der DI von der Verwendung von Dox.

Während dieses Zeitintervalls demonstrierten Les-3833 + PNC-behandelte Zellen einen höheren Prozentsatz an Zellen mit Stufe 4 (5,3 %) DNA-Schaden als Zellen, behandelt mit Les-3288 und den anderen experimentellen Verbindungen, aber die Prozentsätze an Zellen in Stufen 2 und 3 waren niedriger (16,0 % und 12,0 %, jeweils) als jene von Behandlung mit anderen Verbindungen (Tabelle 2). Tabelle 3 fasst die Prozentsätze der Ratten-Gliom-C6-Zellen mit DNA-Schaden nach 6 h Behandlung zusammen. Im Allgemeinen wurde eine Tendenz zum Auftreten von DNA-Kometen höherer Klassen detektiert, wenn Komplexe von Les-3833 und Les-3288 verwendet wurden, im Vergleich zu einem Spektrum von DNA-Kometenklassen, induziert von freien Formen dieser Agenten (Tabelle 3). Allerdings wurde der integrative Indikator von DNA-Schaden (DI), berechnet für die Wirkung der Komplexe von Les-3833 und Les-3288, niedriger als ein solcher Indikator für die Wirkung freier Formen dieser Agenten gefunden. Eine mögliche Erklärung könnte ein sehr hohes DI-Niveau bei 6 h Wirkung der untersuchten Agenten sein, das sogar höher ist als der Level jenes Indikators, der für die Wirkung von Dox gefunden wurde (Tabelle 3). Somit beobachteten wir Zeitabhängigkeit der DNA-Schäden, verursacht durch Komplexe von Les-3833 und Les-3288: bei 3 h Behandlung gab es einen Anstieg des DI im Fall der Wirkung von Les-3833 Komplexen, im Vergleich zur Wirkung der freien Form von Les-3833; jedoch bei 6 h Behandlung gab es eine Abnahme der DNA-Schäden für die Wirkung der Komplexe sowohl von Les-3833 als auch Les-3288, im Vergleich zu solchen Schäden, die für die Wirkung der freien Formen dieser Agenten beobachtet wurden. Es gab keine signifikante Zeitabhängigkeit für die Wirkung des PNC, während ein signifikanter zeitabhängiger Anstieg (von 3 auf 6 h) im DI (von 41,2 + 0,40 auf 185,2 + 0,23) für die Wirkung von Dox detektiert wurde.

DNA-Interkalation durch 4-Thiazolidinon-Derivate – Les-3288 und Les-3833

Die Verbindungen Les-3288 und Les-3833 demonstrierten eine gewisse Fähigkeit zur Interkalation in DNA-Moleküle mit etwa 15 % bzw. 10 % Ersetzung von Methylgrün-Farbstoff. EtBr, ein bekannter DNA-Interkalations-Agent, wurde als positive Kontrolle verwendet und zeigte, dass er den Methylgrün-Farbstoff viel effizienter ersetzt (70 %) (Abb. 15). Somit sind Les-3288 und Les-3833 nicht in der Lage, effektiv zwischen zwei komplementären Basenpaaren in doppelsträngiger DNA zu interkalieren.

Diskussion

Es gibt zwei große Probleme, die die Steigerung der Behandlungseffizienz für Krebspatienten behindern: (1) nicht-adressierte Wirkungen vieler Antikrebsmedikamente, die zu allgemeiner Toxizität und schweren negativen Nebenwirkungen durch Schädigung normaler Gewebe und Organe führen; (2) schnelle (6–12 Monate) Entwicklung von Resistenz von Tumorzellen gegen angewendete Antikrebsmedikamente, was zu einem Verlust der Wirksamkeit der Medikamentenwirkung führt. Zusätzlich gibt es ein drittes, technisches Problem der geringen Wasserlöslichkeit vieler Antikrebsmedikamente. Allerdings kann die Bindung dieser Medikamente mit spezifischen Trägern nanoskaliger Größe helfen, das Löslichkeitsproblem zu lösen.

In dieser Studie adressierten wir das erste und dritte der oben genannten Probleme durch (a) Auswahl neuartiger synthetischer Substanzen (4-Thiazolidinon-Derivate: Les-3288 und Les-3833), die sowohl hohe Antikrebsaktivität als auch geringere allgemeine Toxizität in tumor-tragenden Tieren besitzen [7, 8, 23] und (b) Anwendung einer neuartigen Medikamentenabgabe-Plattform, die stabile wässrige Formen der Komplexe der wasserunlöslichen 4-Thiazolidinon-Derivate mit einem PEGylierten Polymer bereitstellt.

Die 4-Thiazolidinon-Derivate – Les-3288 und Les-3833 – sind heterocyclische Verbindungen mit Molekularmasse von 400–600 Da. Diese und andere verwandte Derivate wurden an der Lviv Nationalen Medizinischen Universität (Ukraine) synthetisiert, und die meisten wurden unter dem Developmental Therapeutic Program am National Cancer Institute in Bethesda, MA, (USA) getestet [35,36,37,38]. Basierend auf diesen Evaluierungen ihrer antineoplastischen Aktivität wurden die vielversprechendsten Substanzen für weitere Untersuchung der Mechanismen ihrer zytotoxischen Wirkung und Antikrebs-Effekte ausgewählt [25]. Les-3833 zeigte hohe Toxizität gegenüber B16F10, WM793 und SK-Mel-28 Melanomzellen und gegen menschliche Lungen A549, Brust MCF-7, Kolon HCT116, Ovarial SKOV3 Krebszellen und Leukämiezellen (L1210, Jurkat, HL-60 Linien) [23, 25, 39]. Les-3288 und Les-3833 zeigten hohe Toxizität gegen Säugetier-Gliomzellen (C6, U251, U373 Linien) [23, 24].

Früher fanden wir, dass Les-3288 und Les-3833 die giftigsten unter den anderen untersuchten 4-Thiazolidinon-Derivaten gegenüber Ratten-Gliom-C6-Zellen und menschlichen Glioblastom-U251-Zellen waren [23, 24], obwohl ihre Anwendung für Zellbehandlung sehr kompliziert war aufgrund ihrer absoluten Unlöslichkeit in Wasser. Nur die Verwendung von DMSO mit zusätzlicher Erhitzung war effektiv für die Herstellung einer löslichen Form der Derivate (siehe „Materialien und Methoden“). Somit war es vernünftig, nach einem Weg zu suchen, die Abgabe dieser Derivate an Zielzellen zu verbessern, und wir verwendeten einen synthetischen PNC, um diese Aufgabe zu erfüllen. Die Komplexierung der untersuchten Derivate von 4-Thiazolidinon mit dem angewendeten PNC verstärkte auch die Effektivität ihrer antineoplastischen Wirkung. Die Mechanismen der pro-apoptotischen Wirkung dieser Verbindungen wurden durch Western Blot und FACS-Analysen demonstriert [23, 24]. Es sollte angemerkt werden, dass in gesunden Versuchstieren Les-3288 und Les-3833 viel weniger negative Nebenwirkungen wie Kardiotoxizität [40], Hepatotoxizität [8] und Nephrotoxizität [7] produzieren als das weit verbreitete Antikrebs-Chemotherapeutikum Dox.

In einer früheren Studie zeigten wir, dass Les-3288 keine ROS-Produktion während seiner pro-apoptotischen Wirkung in vitro und Effekte in experimentellen Labortieren induzierte [23], während die Wirkung von Les-3833 zu solcher Produktion führte; diese war jedoch geringer als die von Dox. ROS gelten als Haupteffektoren negativer Nebenwirkungen von Antikrebsmedikamenten, besonders Dox [41, 42]. Somit könnten die Les-3288 und Les-3833 Verbindungen prospektive Antikrebsmedikamente sein, da sie Antitumor-Aktivität besitzen, aber nicht die allgemeine Toxizität auf dem für effektive Antikrebsmedikamente wie Dox charakteristischen Niveau demonstrieren.

Ein großes Hindernis für die Förderung von Les-3288 und Les-3833 als Antikrebsmedikamente ist ihre schlechte Wasserlöslichkeit. Dieses Problem existiert auch für andere Antikrebsmedikamente, wie Taxole [2, 4]. Für Paclitaxel wurde dieses Problem durch Verwendung eines speziellen Öls für die Herstellung der medizinischen Formulierung gelöst [2, 4, 43]. Spezifische Abgabeplattformen gelten jedoch als vielversprechender für die Schaffung „intelligenter“ Medikamente, die effektive Wirkung im Organismus besitzen [3, 13]. Spezifische funktionale Polymer-Tenside mit Block-, Kamm- und Block/verzweigter Architektur, einschließlich PEG-haltiger, sowie abgeleitete wässrige Formen wurden entwickelt und für die Anwendung als Träger für die Abgabe von Dox [26, 27] und dem Metall-Chemotherapeutikum KP-1019 [10] an der Abteilung für Organische Chemie der Lviv Polytechnischen Nationalen Universität vorgeschlagen.

Da die 4-Thiazolidinon-Derivate wasserunlösliche Verbindungen sind, wurde DMSO verwendet, um ihre wasserlöslichen Formen herzustellen. Um die negativen Konsequenzen der Verwendung eines toxischen Lösungsmittels wie DMSO zu vermeiden, komplexierten wir diese Derivate mit dem oben genannten PNC. Hochdisperse und stabile nanoskalige wässrige Dispersionen dieser Substanzen wurden erhalten und für die Behandlung von Ratten-Gliom-C6-Zellen angewendet.

Die Verwendung von Komplexen der 4-Thiazolidinon-Derivate mit dem PNC führte zu reduzierter allgemeiner Toxizität dieser Verbindungen in Versuchstieren. Früher fanden wir, dass bei Anwendung experimenteller Antitumor-Wirkstoffe (Les-3288, Les-3833, Les-3882) in Komplex mit einem synthetischen polymeren Träger ihre Wirkung von viel kleineren Änderungen in den biochemischen Parametern im Blutsерum begleitet wurde, die charakteristisch für Kardiotoxizität [40], Hepatotoxizität [8] und Nephrotoxizität [7] sind, im Vergleich zu denen für Dox. Somit reduziert die Komplexierung dieser Antitumor-Wirkstoffe mit dem PNC und ihre Anwendung in Form wasserlöslicher stabiler Abgabesysteme ihre toxischen Effekte in Versuchstieren im Vergleich zur Wirkung dieser Substanzen in freier Form [44]. Mehrere Systeme für Paclitaxel-Abgabe wurden vorgeschlagen, einschließlich polymerer Nanopartikel, lipid-basierter Formulierungen, Polymer-Konjugate, anorganische Nanopartikel, Kohlenstoffnanoröhren, Nanokristalle und Cyclodextrin-Nanopartikel [43].

Somit verstärkte die Komplexierung von Les-3288 mit dem PNC die pro-apoptotische Aktivität dieses experimentellen Medikaments signifikant, was uns erlaubte, es zu präklinischen Studien an Tier-Tumormodellen voranzutreiben. Die Komplexierung von Les-3833 mit dem gleichen Typ Nanoträger war weniger effizient, und somit sollte ein anderer Polymer-Typ verwendet werden.

Die entwickelten wässrigen Formen der Komplexe sowie die freien Derivate wurden für die Behandlung von Ratten-Gliom-C6-Zellen angewendet. Es wurde festgestellt, dass diese wässrigen Formen der Komplexe des PNC mit den 4-Thiazolidinon-Derivaten – Les-3288 und Les-3833 – die pro-apoptotische Wirkung dieser Verbindungen verstärkten. In einer anderen Studie demonstrierten wir, dass die Induktion von Apoptose durch Les-3288 nicht von ROS-Induktion begleitet war, im Gegensatz zur Wirkung von Dox und Les-3833 [23]. Somit deuten hohe Antitumor-Aktivität von Les-3288 zusammen mit seiner geringen allgemeinen Toxizität bei Targeting der Malignität in NK/Ly-Lymphom-tragenden Mäusen auf großes Potenzial für dieses experimentelle Antikrebsmittel hin. Die präsentierten Daten sagen auch die potenzielle Nützlichkeit von Les-3288 und Les-3833 Verbindungen, komplexiert mit dem PNC, für Gliombehandlung voraus.

Zellteilung, Differenzierung und Tod sind principale physiologische Prozesse, die Gewebe-Homöostase in mehrzelligen Organismen regulieren. Eine Störung der genomischen Integrität und beeinträchtigte Regulation des Zelltods können beide zu unkontrolliertem Zellwachstum führen. Ein kompromittierter Zelltod-Prozess kann auch genomische Instabilität fördern. Es wird klar, dass Dysregulation von Zellzyklus und Zelltod-Prozessen eine entscheidende Rolle in der Entwicklung schwerwiegender Störungen wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Infektionen, Entzündungen und neurodegenerativen Erkrankungen spielt [45].

Wir haben festgestellt, dass einige der 4-Thiazolidinon-Derivate, nämlich Les-3288 und Les-3833, sogar effektiver als Dox in der Induktion von Apoptose in Ratten-C6-Gliom und menschlichen U251-Glioblastom-Zellen in vitro waren [23, 24]. Es sollte angemerkt werden, dass Hirntumoren zu den Malignomen gehören, die am resistentesten gegen angewandte Chemotherapien sind, und die Überlebensraten bei Patienten mit diesen Tumoren extrem niedrig sind [44].

Es wurde gezeigt, dass die Komplexierung mit diesem PNC die pro-apoptotische Wirkung der 4-Thiazolidinon-Derivate (Les-3288 und Les-3833) verstärkte [44]. In einer anderen Studie [23] demonstrierten wir, dass die Induktion von Apoptose durch Les-3288 nicht von ROS-Induktion begleitet war, im Gegensatz zur Wirkung von Dox und teilweise im Gegensatz zu der von Les-3833. Diese Daten könnten die geringere allgemeine Toxizität von Les-3288 im Vergleich zu Dox erklären [23, 24].

Die Ergebnisse der FACS-Analyse stimmen mit der Vermutung überein, dass eine Verstärkung der pro-apoptotischen Wirkung der untersuchten 4-Thiazolidinon-Derivate auf ihre Komplexierung mit einem neuartigen PNC zurückzuführen ist. Eine solche Komplexierung von Les-3288 und Les-3833 erhöhte den Anteil von Prä-G1-Zellen in der Population behandelter Ratten-Gliom-C6-Zellen, verringerte den Anteil von G1-Zellen und erhöhte die Wirkung von G2/M-Zellen. Diese Daten deuten auf eine Verstärkung sowohl der zytotoxischen Wirkung (Apoptose) als auch der zytostatischen Wirkung (Block in G2/M-Phase des Zellzyklus) der untersuchten Derivate, komplexiert mit dem PNC, hin. Im Allgemeinen wurde der Apoptose-Mechanismus des Gliomzell-Abtötens durch den Les-3288 + PNC Komplex und den Les-3833 + PNC Komplex durch die Ergebnisse der FACS-Analyse des Auftretens von Annexin V-einfach-positiven Ratten-Gliom-C6-Zellen demonstriert.

Die Beteiligung der Apoptose-Mechanismen an der Wirkung der untersuchten 4-Thiazolidinon-Derivate wurde auch durch die Ergebnisse des DNA-Kometen-Assays bestätigt. Es wurde festgestellt, dass die Komplexierung von Les-3833 mit dem PNC zu einer Abnahme (im Vergleich zu freiem Les-3833) des Anteils von Ratten-Gliom-C6-Zellen in „0“ DNA-Kometen und simultanem Anstieg des Anteils von „1“, „2“ und „3“ Kometen (3-h Behandlung der Zellen) führte. Bei 6 h Behandlung durch den Les-3833+PNC Komplex gab es einen großen Anstieg (im Vergleich zu freiem Les-3833) des Anteils von „1“ Kometen, einen Anstieg des Anteils von Zellen mit dem stärksten DNA-Schaden („4“ Kometen) und eine Abnahme der Anteile von „2“ und „3“ Kometen. Es sollte angemerkt werden, dass die DNA-schädigenden Effekte von Les-3288 und Les-3833, gemessen bei 6 h, höher waren als solche Effekte der Komplexe dieser Derivate mit dem PNC (siehe Tabelle 3). Eine mögliche Erklärung hier könnte ein sehr hohes DI-Niveau bei 6 h Wirkung der untersuchten Agenten sein, das sogar höher ist als der Level jenes Indikators, der für die Wirkung von Dox gefunden wurde (Tabelle 3). Es gab keine Zeitabhängigkeit in der Wirkung des PNC, während ein signifikanter zeitabhängiger Anstieg (von 3 auf 6 h) im DI (von 41,2 + 0,40 auf 185,2 + 0,23) für die Wirkung von Dox detektiert wurde.

Wir verwendeten den DNA-Interkalations-Test, um die direkte Zielausrichtung der DNA durch die 4-Thiazolidinon-Derivate zu untersuchen und enthüllten nur schwache Ersetzung von Methylgrün-Farbstoff (15 % und 10 % Ersetzung für Les-3288 und Les-3833, jeweils), der in die DNA von Lachssperma interkaliert war, im Vergleich zur Ersetzung durch EtBr, verwendet als positive Kontrolle (70 %).

Somit war die Durchführung der Zytotoxizitäts-Experimente in vitro mit den 4-Thiazolidinon-Derivaten – Les-3288 und Les-3833 – bequemer aufgrund der Verwendung der wässrigen Formen der 4-Thiazolidinon-Derivate – Les-3288 und Les-3833 – komplexiert mit dem neuartigen PNC. Außerdem haben wir demonstriert, dass die neuartigen synthetischen 4-Thiazolidinon-Derivate (Les-3833 und Les-3288) Behandlungswirkungen in vivo gegenüber NK/Ly-Lymphom, transplantiert auf BALB/C-Mäuse, besaßen, und diese Effekte waren vergleichbar mit solchen Effekten von Dox. Gleichzeitig führte die Wirkung dieser Derivate zu viel weniger negativen Nebenwirkungen, gemessen als Änderungen in der Anzahl der Erythrozyten, Neutrophilen und Lymphozyten im Blut der Tiere und der Aktivität von Aspartat- und Alanin-Aminotransferasen in ihrem Blutsérum, im Vergleich zur Wirkung von Dox.

Schlussfolgerungen

Die Komplexierung von Les-3288 und Les-3833 mit dem PEG-haltigen PNC verstärkte ihre zytotoxische Wirkung auf Ratten-Gliom-C6-Zellen. Die zytotoxische Wirkung wurde durch apoptotische Mechanismen realisiert und durch FACS-Analyse als Vorhandensein der Prä-G1-Fraktion in den Ratten-Gliom-C6-Zellen und von Annexin-V-einfach-positiven Zellen bestätigt. DNA-Kometen-Analyse enthüllte Einstrangbrüche in der nuklearen DNA behandelter Gliom-C6-Zellen, die wahrscheinlich nicht durch Interkalation der untersuchten Verbindungen in das DNA-Molekül verursacht wurden. Die Les-3288 und Les-3833, stabilisiert durch den amphiphilen PEG-haltigen PNC, resultierten in wässrigen Formen und lieferten Verstärkung ihres Antitumor-Effekts in vitro im Vergleich zur freien Form der Medikamente.

Abkürzungen

DMSO:

Dimethylsulfoxid

Dox:

Doxorubicin

EtBr:

Ethidiumbromid

FACS:

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

PBS:

Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung

PEG:

Polyethylenglycol

PI:

Propidiumiodid

PNC:

Polymerer Nanoträger

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

VEP:

2-Tret-butylperoxy-2-methyl-5-hexen-3-in