Synergistisch verstärkte Hemmwirkung der Pullulan-Nanopartikel-vermittelten gemeinsamen Abgabe von Lovastatin und Doxorubicin an dreifach negative Brustkrebszellen

Einführung

Triple-negativer Brustkrebs (TNBC) ist ein spezieller Subtyp von Brustkrebs, dem ein Östrogenrezeptor (ER), Progesteronrezeptor (PR) und humaner epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor 2 (HER2) fehlen und der eine schlechtere Prognose als andere Brustkrebs-Subtypen hat. 1,2,3]. Verfügbare zielgerichtete Therapien hängen meist davon ab, auf spezifische Rezeptoren auf der Oberfläche der Tumorzelle abzuzielen. Da TNBC ein spezifischer Oberflächenmarker für das aktive Targeting für die Behandlung fehlt, sind andere Targeting-Ansätze es wert, untersucht zu werden. Zum Beispiel ermöglicht passives Targeting, das einen einzigartigen Effekt der verbesserten Permeabilität und Retention (EPR) auf solide Tumoren beinhaltet [4], Partikel eines bestimmten Größenbereichs, um auf die Tumorstelle zu zielen [5, 6]. Ein Nanopartikel (NP) ist eine Art Wirkstoffträger, der den EPR-Effekt nutzen und sich an festen Tumorstellen anreichern kann [4].

Vor kurzem haben wir gezeigt, dass Lovastatin (LV), eines der lipophilen Statine zur Behandlung von Hyperlipidämie [7], TNBC selektiv hemmt, indem es auf Krebsstammzellen abzielt [8, 9]. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die NP-Verkapselung die hemmende Wirkung von LV auf TNBC in einem Mausmodell der Brustkrebszellimplantation verstärken kann [8]. Unsere Studien legen zusammen mit früheren Ergebnissen [10, 11] nahe, dass lipophile Statine, insbesondere LV, als Krebsmedikamente für die TNBC-Behandlung wiederverwendet werden können. Es bleibt jedoch unbekannt, ob LV die Chemoresistenz überwinden oder die therapeutische Wirkung von Chemotherapeutika bei TNBC verstärken kann.

Die Synergie zwischen LV und verschiedenen Arten von Chemotherapeutika wie Doxorubicin (DXR), 5-Fluorouracil [12], Cisplatin [13] und 1-β-D-Arabinofuranosylcytosin [14] wurde bei verschiedenen Krebszelltypen berichtet. DXR ist eine Anthrazyklinverbindung mit komplizierten Eigenschaften der Bindung an DNA und Hemmung der Nukleinsäuresynthese. Darüber hinaus induzierte LV in Synergismus mit DXR die Apoptose von Eierstockkrebszellen [15]. Außerdem ist LV ein direkter Inhibitor des Effluxproteins P-Glykoprotein [16], einer ATP-getriebenen Pumpe, die DXR leicht in das extrazelluläre Kompartiment abgeben kann [17, 18]. Somit kann LV die therapeutische Wirkung anderer therapeutischer Mittel verstärken, und die Kombination von LV und diesen Arzneimitteln kann die therapeutische Wirksamkeit gegen TNBC verstärken.

Die aktuellen Kombinationstherapien sind voller Herausforderungen. Einerseits kann die kombinatorische Chemotherapie durch den schnellen Metabolismus, die schlechte Wasserlöslichkeit und die geringe Bioverfügbarkeit von Chemotherapeutika stark eingeschränkt werden [19, 20]. Andererseits ist es aufgrund der unterschiedlichen Pharmakokinetik, der Membrantransporteigenschaften und der unspezifischen Bioverteilung verschiedener Medikamente schwierig, ausreichende Konzentrationen und spezifische Verhältnisse der verabreichten Medikamente in einzelnen Zellen zu erreichen [21,22,23]. Diese Faktoren beeinflussen die therapeutische Wirksamkeit und das Ausmaß des Synergismus oder Antagonismus für die Kombination. Die Co-Einkapselung zweier therapeutischer Wirkstoffe in einen nanoskaligen Wirkstoffträger ist ein effizienter Weg, um diese Herausforderungen zu überwinden, da die Wirkstoffe, die in den Träger geladen sind, ein korrektes Verhältnis für die synergistischen Wirkungen beibehalten [24, 25].

Co-verkapselte Nanoträger umfassen hauptsächlich Liposomen, polymere Mizellen und Mikro- oder Nanokugeln [26,27,28,29]. Polymere Micellen haben aufgrund ihrer überlegenen Leistung (z. B. mit chemisch konjugierter und physikalisch verkapselter dualer Wirkstoffbeladung, hoher Wirkstoffbeladung und hoher Biokompatibilität) viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen [26, 30]. In unserer vorherigen Studie haben wir eine Reihe von NPs mit Pullulan, einem hydrophilen Polysaccharid mit hoher Biokompatibilität, hergestellt und die Auswirkungen verschiedener Faktoren auf ihr Wirkstofffreisetzungsverhalten untersucht [31]. In dieser aktuellen Studie haben wir eine neue polymere PLV-Mizelle mit unterschiedlichen Zufuhrverhältnissen von Pullulan und LV hergestellt und die Verteilung von Größe, Zetapotential und Morphologie charakterisiert. Wir wählten die kleinste resultierende NP für die Beladung mit DXR, da sie unter der Prämisse der Nutzung des EPR-Effekts wahrscheinlicher von Zellen internalisiert wird. Darüber hinaus haben wir die Wirkstoffbeladungsmenge, die Einkapselungseffizienz und die Wirkstofffreisetzungsmenge von PLV/DXR-NPs in Medien mit unterschiedlichen pH-Werten gemessen. Wir untersuchten die zelluläre Aufnahme von FITC-beladenen PLV/DXR-NPs, um den Eintritt von NPs in Tumorzellen und den Synergismus von DXR und LV in Kombination sowie die Zytotoxizität von NPs auf MDA-MB-231 (TNBC) und MDA-MB . zu untersuchen -453 (Nicht-TNBC) Zellen (Schema 1).

Schematische Darstellung von Nanopartikeln (NPs) und In-vitro-Zellexperiment. Der Pullulan-Lovastatin (PLV) NP wurde durch Selbstorganisation eines Polymers gebildet, das aus Pullulan und LV in einer wässrigen Lösung gebildet wurde. Bei der Bildung des NP wurde DXR in den hydrophoben Kern des NP geladen. Anschließend wurde PLV/DXR für In-vitro-Zellexperimente mit MDA-MB-231- und MDA-MB-453-Zellen verwendet, die Triple-negativen Brustkrebs (TNBC) bzw. Nicht-TNBC-Zellen darstellen

Materialien und Methoden

Materialien

Pullulan (200 kDa) stammte aus Hayashibara (Tokio). LV- und DXR-Hydrochlorid stammten von J&K Scientific (Beijing). 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-Hydrochlorid (EDCI) und 4-Dimethylaminopryidin (DMAP) stammten von Aladdin Reagent (Shanghai). Andere Reagenzien wie Lösungsmittel stammten von Sinopharm Chemical Reagent Co. (Beijing). Die Brustkrebszelllinien MDA-MB-231 (TNBC) und MDA-MB-453 (non-TNBC) wurden vom Center for Cell Resource, Shanghai Institutes for Biological Sciences erworben. CellTiterBlue-Reagenz stammte von Promega (Madison, WI, USA). Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) (Cat#SH30022.01) stammte von HyClone (USA) und fötales Rinderserum (FBS) (Cat#04-001-1ACS) stammte von Biological Industries (Israel).

Synthese von LV-verpflanztem Pullulan (PLV)

Zuerst wurde LV-Bernsteinsäuremonoester (LV-SA) durch die folgenden Schritte synthetisiert. Kurz gesagt, 0,60 g Bernsteinsäureanhydrid (SA, 6,0 mmol) und 2,0 g LV (5,0 mmol) wurden in 20 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und 48 h bei 50 °C gerührt. Die resultierende Reaktionslösung wurde langsam unter konstantem Rühren in eine 1500-ml-Eis-HCl-Lösung mit einem pH-Wert von 3 gegossen, um eine große Menge eines weißen Niederschlags auszufällen, und der pH-Wert der Suspension wurde mit konzentrierter HCl auf pH 3 eingestellt, gefolgt von einer Vakuumfiltration . Der Niederschlag wurde dann mit einer pH-3-Eis-HCl-Lösung und dann mit ddH₂ . gewaschen O zu neutral, um ein Rohprodukt zu ergeben. Schließlich wurde das Rohprodukt aus einem Aceton-Wasser-Lösungsmittelsystem umkristallisiert, um reines LV-SA zu erhalten, und die Ausbeute betrug 72 %. PLV wurde durch Konjugieren der Carbonsäuregruppe von LV-SA mit dem Hydroxyl von Pullulan bei Molverhältnissen von LV-SA zu Pullulan von 1/2, 1/3 und 1/4 hergestellt. Kurz gesagt, 0,5 µg (1,03 µMol) hergestelltes LV-SA, 0,15 µg DMAP (1,23 µMol) und 0,24 µg EDCI (1,23 µMol) wurden in 20 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst und 4 Stunden bei 50ºC gerührt. Pullulan (0,33 µg, 1/2; 0,50 µg, 1/3; 0,67 µg, 1/4) wurde in DMSO gelöst, um eine 2%ige (Gew./Vol.) Lösung zu erhalten. Dann wurde die Pullulanlösung langsam zur Reaktionslösung zur Reaktion bei 50ºC für 48 Stunden zugegeben. Die Reaktionsmischungen wurden in Dialysebeutel (MWCO&sub2; =~8~12~kDa) gefüllt und gegen 25 % Ethanol/Wasser und Wasser dialysiert. Anschließend wurden die Proben gefriergetrocknet [32]. Die PLV-Konjugate mit einem unterschiedlichen Zufuhrverhältnis von LV zu Pullulan wurden durch FTIR-Analyse unter Verwendung eines FTIR-Spektrophotometers (KBr-Pellets, Nicolet, TM Nexus 470-ESP, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) charakterisiert. PLV-Konjugate wurden auch durch ¹ . bestätigt H-NMR-Spektroskopie (DMSO-d6-Lösungsmittel, BRUKER AVANCE-500, Bruker, Billerica, MA, USA) und der Substitutionsgrad (DS) für LV für jedes Konjugat wurde berechnet.

Vorbereitung und Charakterisierung von NPs

Eine Menge von 50 mg PLV-Konjugat wurde in 12,5 ml DMSO unter leichtem Schütteln bei 37 °C (um das Konjugat vollständig aufzuquellen) gelöst, um 4 mg/ml Konjugatlösung zu erhalten. Eine 5-ml-Menge der Konjugatlösung wurde mit DMSO zur Dialyse gegen 1000 ml destilliertes Wasser 8 h lang mit 10-maligem Austausch unter Verwendung eines Dialysebeutels (8 bis 14 kDa) auf 2 mg/ml verdünnt. Dann wurde die Lösung unter Verwendung eines Sondentyps (GA92-IIDA Ultrasonic Cell Pulverizer, Suzhou Jiangdong Precision Instruments) bei 100   W mit Pulsen (Puls an 2,0 s, aus 2,0 s) für 2 min in einem Eiswasserbad beschallt . Selbstorganisierte PLV-NPs wurden erhalten und die Proben wurden bei 4 °C gelagert. Um die PLV/DXR-NPs herzustellen, wurden 2 µg DXR in 5 µl DMSO gelöst und dann tropfenweise in 5 µl Konjugatlösung gegeben, dann wurden PLV/DXR-NPs nach dem gleichen Verfahren hergestellt. In einem typischen Verfahren zur Herstellung von FITC-beladenen PLV/DXR-NPs wurde 1 µg DXR in 2 µl DMSO gelöst und dann tropfenweise in 2,5 µl Konjugatlösung gegeben. Dann wurde 1 µl FITC-Lösung (0,6 µg/ml) in DMSO tropfenweise zugegeben, und FITC-beladene PLV/DXR-NPs wurden nach dem gleichen Verfahren hergestellt.

PLV-NPs, PLV/DXR-NPs und FITC-beladene PLV/DXR-NPs wurden durch 0,45-μm-Membranen gefiltert, dann wurden Partikelgrößen, Zetapotentiale und Polydispersitätsindizes (PDI) durch dynamische Lichtstreuung (DLS, Zetasizer 3000 HS, Malvern Instruments, Malvern, Großbritannien). Die morphologischen Merkmale von PLV-NPs wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM; Tecnai G2 20 S-Twin, FEI Hong Kong) bei einer Beschleunigungsspannung von 80 kV beobachtet.

Bestimmung von Ladekapazität und Einschlusseffizienz

Eine PLV/DXR-NP-Lösung (5 ml) wurde 5 Minuten lang beschallt (Puls auf 2,0 Sekunden, aus 2,0 Sekunden), um das Arzneimittel aus den NPs freizusetzen. Die DXR-Absorption in der Lösung wurde bei 480 nm unter Verwendung eines UV-Vis-Spektrophotometers (Shimadzu UV-2550, Kyoto, Japan) gemessen, um die Arzneimittelkonzentrationen zu berechnen. DXR-Verkapselungseffizienz (EE) und Ladekapazität (LC) wurden wie folgt berechnet:

In-vitro-Wirkstofffreisetzung

Das Freisetzungsprofil von DXR aus PLV/DXR-NPs wurde in 0,1 µM Phosphatpufferlösung bei 37 °C nach dem Dialyseverfahren wie beschrieben [33] gemessen. Typischerweise wurden 6 ml PLV/DXR NPs (entspricht 139,4 mg DXR) in einen Dialysebeutel überführt (MWCO&sub2; =  3500  Da) und dann bei 37 °C in 15 ml PBS (pH 7,4 und 5,4) inkubiert. Zu vorbestimmten Zeiten wurden 3 ml externe Pufferlösung abgezogen und durch 3 ml frisches PBS (pH 7,4 oder 5,4) ersetzt. Die Menge an freigesetztem DXR wurde durch Fluoreszenzspektrophotometrie gemessen. Der Prozentsatz der Arzneimittelfreisetzung (Q %) wurde wie folgt berechnet:

wo W ist das NP-Gewicht, C _n ist die Probenkonzentration bei Tn , V ist das Gesamtvolumen des Freisetzungsmediums, V _n ist das Probenvolumen (2 mL) und C _ich ist die Probenkonzentration bei T _ich (ich = 0, 0.5, 1,…n Stunden, beide V ₀ und C ₀ sind gleich Null).

Zellkultur

Menschliche Brustkrebszelllinien MDA-MB-231 und MDA-MB-453 wurden in DMEM-Vollmedium mit 10 % FBS unter feuchten Bedingungen von 37 °C, 5 % CO₂ . kultiviert , und Normoxie (21 % O₂ .) ). Die experimentellen Zellen wurden alle von Zellen der logarithmischen Wachstumsphase abgeleitet.

In-vitro-Zytotoxizität

MDA-MB-231- und MDA-MB-453-Zellen, ausgesät in 96-Well-Platten (4× 10 ³ Zellen/Well in einem 100-μl-Volumen) wurden unter Routinekulturbedingungen für 24 h gezüchtet. Dann wurden PLV/DXR-NPs mit verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen (Massenverhältnis von DXR und LV betrug 8,13) zugegeben und 48 h lang inkubiert. Schließlich wurde 20 µl CellTiter Blue Reagenz (Promega) zur Messung der Zellproliferation zugegeben und 1-4 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Absorption bei 530/590 nm wurde unter Verwendung eines automatischen Mikroplattenlesegeräts gemessen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde als Prozentsatz der Extinktion gegenüber derjenigen der Kontrollgruppen ohne Behandlung ausgedrückt.

In-vitro-Synergistik-Effekt-Analyse

Die Isobolanalyse wurde verwendet, um den Synergismus und Antagonismus, die von gepaarten Arzneimitteln erzeugt werden, quantitativ zu bewerten. Nach dem Dosis-Äquivalent-Prinzip von Tallarida und dem Loewe-Additiv-Modell wird eine Isobole generiert, die eine Linie ist, um die additive Wirkung von gepaarten Arzneimitteln zu definieren [34, 35]. In der Praxis haben wir, wie zuvor beschrieben [8], zuerst die Dosis-Wirkungs-Kurven für freies DXR und freies LV erfasst und nach der Transformation der Medikamentendosis und -wirkung eine lineare Regression verwendet, um lineare Regressionsgleichungen zu erhalten, um die kombinierten Dosen der gepaarten zu berechnen Medikamente, die eine bestimmte Wirkung haben. Die Daten zum Auftragen der Isobole sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Punkte auf der Isobole setzen DXR/LV auf unterschiedliche Verhältnisse, um eine maximale Wirkung von 50 % zu erzielen. Ein IC₅₀ der gepaarten Medikamentendosis, die sich unterhalb der Isobole befindet, weist auf einen synergistischen Effekt hin, während ein IC₅₀ oberhalb der Isobole weist auf eine antagonistische Wirkung hin.

In-vitro-Zelluläre Aufnahme

PLV/DXR-FITC-NPs wurden durch Dialyse erhalten. Die zelluläre Aufnahme von PLV/DXR-FITC-NPs wurde unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroplatten-Readers getestet. MDA-MB-231- und MDA-MB-453-Zellen wurden ausgesät (2 × 10 ⁵ /well) auf 2,5-cm-Schalen und inkubiert bei 37 °C für 24 h. Die Zellen wurden dann mit Konzentrationen von PLV-DXR FITC NPs bei 37 °C für 1, 2 und 4 h inkubiert. Das Kulturmedium wurde dann entfernt und zweimal mit kaltem PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd für 5 min fixiert und unter Verwendung von DAPI enthaltendem Eindeckmedium auf Objektträger montiert. Dann wurde die zelluläre Aufnahme von NPs durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht.

Statistische Analyse

Die Daten sind als Mittelwert  ± SD ausgedrückt und wurden von Student's t . analysiert Prüfung. Unterschiede wurden bei P . als statistisch signifikant angesehen < 0.05.

Ergebnisse

In-vitro-Zytotoxizität und synergistische Wirkung von DXR und LV

Um die hemmende Wirkung von LV und DXR gegen die TNBC- und Nicht-TNBC-Zellproliferation zu bewerten, wurde die Lebensfähigkeit der Zellen durch den Alamar-Blau-Test bewertet. Wir haben zunächst die hemmende Wirkung von LV und DXR auf die beiden TNBC-Zelllinien durch einen kostenlosen Drogentest bestimmt. Eine Reihe von LV/DXR-Konzentrationsverhältnissen wurde erhalten, indem die Konzentration eines Arzneimittels konstant eingestellt und die des anderen Arzneimittels geändert wurde. Bei der MDA-MB-231-Zelllinie bewirkten sowohl LV als auch DXR eine konzentrationsabhängige Hemmung, aber LV hatte eine signifikante Hemmwirkung bei Konzentrationen bis zu 3,0 µM (Abb. 1).

Zytotoxizität von freiem Doxorubicin (DXR) und freiem Lovastatin (LV) in Brustkrebszellen. In-vitro-Zytotoxizität von freiem DXR, LV und DXR und LV kombiniert gegen MDA-MB-231 (a , b ) und MDA-MB-453 (c , d ) Krebszellen

Der IC₅₀ Werte für LV unter verschiedenen DXR-Behandlungen und für DXR unter verschiedenen LV-Behandlungen sind in Tabelle 2 gezeigt, und wir haben auch diese IC₅₀ . aufgetragen Werte (Abb. 2a), um den kombinierten Effekt von DXR/LV visuell widerzuspiegeln. Der IC₅₀ für freies DXR allein betrug 0,865 µM und für freies LV allein 10,07 µM. Wenn die DXR-Konzentration von 0,125 auf 0,625 µM (fünffacher Anstieg) angestiegen ist, beträgt der IC₅₀ für LV sank von 10,92 auf 0,28 µM (39-fache Reduktion), und wenn die DXR-Konzentration von 0,625 auf 3,125 µM (fünffache Erhöhung) anstieg, wurde der IC₅₀ der LV-Wert sank von 0,28 auf 0,0004085 µM (685-fache Reduktion). Wenn die LV-Konzentration von 1,0 auf 3,0 µM (dreifacher Anstieg) ansteigt, beträgt der IC₅₀ der DXR-Wert sank von 1,005 auf 0,3033 µM (3,3-fache Reduzierung) und wenn die LV-Konzentration von 3,0 auf 10 µM (3,3-fache Erhöhung) anstieg, wurde der IC₅₀ der DXR-Wert sank von 0,3033 auf 0,007196 µM (42-fache Reduktion). Somit könnte DXR für dieselbe Hemmungsrate der MDA-MD-231-Zellproliferation die benötigte LV-Menge signifikant reduzieren, und LV könnte auch die benötigte DXR-Menge signifikant reduzieren. Dieser Befund ist für die Tumorchemotherapie essentiell, da DXR ein hochwirksames Chemotherapeutikum mit unerwünschten Nebenwirkungen ist und in niedriger Konzentration gehalten werden sollte und LV minimale Nebenwirkungen hat [36]. Bei MDA-MB-453-Zellen zeigte DXR eine konzentrationsabhängige Hemmung, während LV bei den untersuchten Konzentrationen keine signifikante Hemmung zeigte. Darüber hinaus hatte DXR bei Konzentrationen von bis zu 3,0 µM eine signifikante Hemmwirkung auf MDA-MB-453-Zellen, was weit weniger wirksam war als bei MDA-MB-231-Zellen (Abb. 1). Wir haben kürzlich festgestellt, dass LV im Vergleich zu Nicht-TNBC-Zelllinien selektiv eine Reihe von TNBC-Zelllinien hemmt [8]; daher könnte die Kombination von LV und DXR für die Behandlung von TNBC geeignet sein, aber nicht von Nicht-TNBC-Zellen.

Synergie von DXR und LV. IC₅₀ Werte für DXR und LV mit unterschiedlichen LV- und DXR-Konzentrationen, berechnet von GraphPad Prism 7 (a ) und die Isobolenmethode (b )

Um den Synergismus von DXR und LV weiter quantitativ zu bewerten, verwendeten wir die Isobolenmethode. Mit unterschiedlichen DXR/LV-Verhältnissen, um eine maximale Wirkung von 50 % zu erzielen (Tabelle 1), haben wir eine Isoole aufgetragen, die den additiven Effekt des DXR/LV-Verhältnisses anzeigt (Abb. 2b). Der IC₅₀ DXR/LV-Dosen mit 0,025/7,09, 0,3033/3,0 und 0,625/0,28 (μM/μM) lagen unter der Isobolisierung, was darauf hindeutet, dass DXR/LV bei diesen Verhältnissen einen synergistischen Effekt erzeugen würde. Somit würde dieser synergistische Effekt (1 + 1 > 2) weiterhin pharmakologisch statistisch minimierte Medikamentendosen bei maximaler Medikamentenwirksamkeit erreichen [37]. Diese drei synergistischen Verhältnisse schienen diese Ergebnisse zu repräsentieren:(1) Eine niedrige Dosis von DXR (0,025 µM) könnte die therapeutische Wirksamkeit von LV besser verbessern, da 0,025 µM DXR eine größere negative Steigung für die Dosis-Wirkungs-Kurve von LV erzeugen könnte (Abb . 2b); (2) Bei hoher DXR-Konzentration könnte die Zugabe einer kleinen Menge LV die DXR-Wirkung gegen MDA-MB-231-Zellen stark unterstützen, da der IC₅₀ für DXR allein betrug 0,865 µM, aber die Zugabe von nur 0,28 µM LV reduzierte den IC₅₀ von DXR auf 0,625 µM, d. h. 0,28 µM LV ersetzten vollständig die Wirksamkeit von 0,24 µM DXR (Tabelle 2); und (3) wenn die LV-Dosis etwa das Zehnfache der DXR-Dosis betrug, sollte das DXR/LV-Verhältnis die beste synergistische Wirkung haben, da der Punkt (0,3033, 3,0) am weitesten von der Isobole entfernt war (Abb. 2b).

Synthese und strukturelle Charakterisierung von PLV-Konjugaten

Die amphiphilen PLV-Konjugate wurden wie in Schema 2 gezeigt synthetisiert. PLV wurde durch Veresterung von Pullulan und LV erhalten. Die Strukturen der PLV-Konjugate wurden durch FTIR und ¹ . bestätigt H-NMR-Spektren (Abb. 3). Laut FTIR-Analyse (Abb. 3a) wurden PLV-Konjugate erfolgreich hergestellt. Für die Spektren von PLV-Konjugaten zusätzlich zur Aufrechterhaltung der charakteristischen Peaks von Pullulan (1644, 1642 und 1648 cm ⁻¹ ), die verstärkten Peaks bei 1459 cm ⁻¹ und 1360 cm ⁻¹ zeigte auch die Biegeschwingungsspitzen von –CH₃ und –CH₂ – bzw. für LV. Darüber hinaus beobachteten wir eine hohe Wellenzahlverschiebung von –C=O-Streckungsabsorptionspeaks (Esterbindung in LV) bei 1725 cm ⁻¹ von PLV-Konjugaten aufgrund der neu erzeugten Esterbindung, und diese Peaks wurden mit einem erhöhten Molverhältnis von LV zu Pullulan verstärkt (Abb. 3a).

Chemische Synthese amphiphiler PLV-Konjugate. LV und Bernsteinsäureanhydrid (SA) reagierten unter der Katalyse von Pyridin, um LV-SA bei 50°L zu bilden. Dann wurde LV-SA durch eine Esterbindung unter der Katalyse von EDC und DMAP an Pullulan gebunden, um das PLV-Polymer zu bilden

Strukturelle Charakterisierung von Pullulan-Lovastatin (PLV)-Konjugaten. a FTIR-Spektren für Pullulan, LV, PLV (1/2), PLV (1/3) und PLV (1/4), Spitzenwerte bei 1644, 1642 und 1648 cm ⁻¹ als charakteristische Spitzen von Pullulan. Die gestrichelten Linien bei 1360, 1459 und 1725 cm ⁻¹ zeigen die Biegeschwingungsspitzen von –CH₃ – und –CH₂ – für LV. b ¹ H-NMR-Spektren für Pullulan, LV, PLV (1/2), PLV (1/3) und PLV (1/4)

Wir haben die erfolgreiche Synthese von PLV-Konjugaten durch ¹ . bestätigt H-NMR-Spektren (Abb. 3b). Die ¹ H-NMR-Spektren zeigten die charakteristischen Peaks von Pullulan und neue Peaks, die dem CH₃ . zugeordnet wurden , CH₂ , und CH-Protonen der LV-Einheit bei 0.5~2.7 ppm (roter Rahmen), was die erfolgreiche Konjugation von LV an Pullulan anzeigte. Wir verwendeten die charakteristischen Peaks von Pullulan bei 4,94~5,14 ppm (a), die den α-1,6- und α-1,4-glykosidischen Bindungsprotonen von C₁ . entsprechen die Glukoseeinheiten in Pullulan zu definieren [38]. Die Signale bei 4,12 ppm (b) entsprachen dem Proton des C₁₃ im LV. Somit wurde der DS der LV-Reste pro 100 Glucoseeinheiten Pullulan aus dem Verhältnis von C₁₃ . berechnet Protonen (4,05~4,15 ppm) von LV zu Zuckerprotonen (4,94~5,14 ppm) mit der folgenden Gleichung:DS = I _4.05~4.15 /Ich _4.94~5.14 × 100 %. Die DS-Daten für LV finden Sie in Tabelle 3.

Charakterisierungen von PLV-NPs

Das synthetisierte PLV-Konjugat konnte sich in wässriger Lösung zu Micellen selbst anordnen. Die durchschnittliche Größe und der Polydispersitätsindex (PDI) betrugen 177,2 nm bzw. 0,138 für PLV (1/2) NPs; 189,7 nm und 0,160 für PLV (1/3) NPs; und 219,8 nm und 0,050 für PLV (1/4) NPs (Tabelle 3; Abb. 4a, b). Darüber hinaus betrug das Zetapotential für PLV (1/2), PLV (1/3) und PLV (1/4) NPs − 11,66, − 10,51 bzw. − 8,30 mV. Die Größe der PLV-NPs nahm mit zunehmendem DS von LV ab, ohne dass sich das Zetapotential signifikant änderte. Die Größenänderung wird hauptsächlich auf die Verstärkung der hydrophoben Wechselwirkung zwischen den LV-Gruppen zurückgeführt, was zur Bildung kompakterer hydrophober Kerne führt [39]. Wir haben zuvor Pullulan-NPs mit unterschiedlichen DS-Werten von Cholesterin untersucht und festgestellt, dass bis zu einem gewissen Grad die Größe der gebildeten NPs umso kleiner ist, je größer der hydrophobe DS des amphiphilen Polymers ist [33]. Da in dieser Studie der DS der hydrophoben Gruppe LV größer war, war auch die Größe der NPs kleiner. Außerdem zeigten TEM-Bilder (Abb. 4c), dass die NPs im Allgemeinen eine Kugelform mit guter Monodispersität hatten. PLV (1/2) NPs, bei denen der höchste DS zur höchsten LV-Beladung und die kleinste Größe führt, wurden für die folgenden Experimente ausgewählt.

Charakterisierung von Nanopartikeln (NPs). a Partikelgröße und Verteilung von PLV. b Zetapotential von PLV. c Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von PLV (1/2). d Partikelgröße und Verteilung von PLV/DXR und FITC-beladenem PLV/DXR. e Zetapotential von PLV/DXR und FITC-beladenem PLV/DXR. f Foto von PLV, PLV/DXR und FITC-geladenem PLV/DXR

PLV/DXR-NPs wiesen auch eine sphärische Morphologie und eine größere Größe von 225,6 nm auf als leere PLV-NPs. Die Einkapselungseffizienz und Beladungskapazität von PLV/DXR-NPs betrug 20,92 % bzw. 1,93 %. Die hydrophobe Wechselwirkung zwischen dem hydrophoben Kern der NPs und der hydrophoben Gruppe des Wirkstoffs bestimmt die Menge der Wirkstoffbeladung in den NPs. Wenn man bedenkt, dass die Wasserlöslichkeit des in diesem Experiment verwendeten DXR-Hydrochlorids etwas größer war, war die hydrophobe Wechselwirkung zwischen DXR und dem hydrophoben Kern der NPs schwach, was dazu führte, dass weniger DXR tatsächlich in den NPs eingekapselt war. Um die Aufnahme von NPs durch Tumorzellen weiter zu klären, wurde FITC in PLV/DXR-NPs geladen. Bei FITC-Beladung betrug die mittlere Größe der FITC-beladenen PLV/DXR-NPs 253,8 nm und das mittlere Zetapotential − 15,09 mV (Abb. 4d, e).

In-vitro-Wirkstofffreisetzung

Um das Freisetzungsverhalten von DXR aus PLV/DXR-NPs aufzuzeigen, wurden In-vitro-DXR-Freisetzungsprofile in PBS bei pH 7,4 und 5,4 untersucht, die die Bedingungen in normalen physiologischen Geweben bzw. in der intrazellulären Mikroumgebung nachahmen. PLV/DXR-NPs zeigten zwei Phasen der DXR-Freisetzung:eine schnelle Freisetzung in den ersten 8 Stunden und eine anhaltende Freisetzung danach (Abb. 5), was mit dem Freisetzungsprofil typischer NPs übereinstimmt. Darüber hinaus wurde bei einer pH-Abnahme von 7,4 auf 5,4 die kumulative DXR-Freisetzung signifikant auf 76,15% bzw. 97,90% nach 72 h beschleunigt. Daher war die Freisetzung von DXR aus PLV/DXR-NPs bis zu einem gewissen Grad pH-sensitiv, was besonders nützlich ist, um die therapeutische Wirksamkeit zu verbessern und Nebenwirkungen in vivo zu reduzieren [40].

In-vitro-Freisetzungsprofile von DXR aus PLV/DXR in phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei pH 7,4 vs. 5,4 zu unterschiedlichen Zeiten nach der Dialyse

Zelluläre Aufnahme von FITC-beladenen PLV/DXR-NPs

Wir erhielten fluoreszenzmikroskopische Bilder von MDA-MB-231 (Abb. 6a) und MDA-MB-453 (Abb. 6b) Zellen bei 0,5, 1 bzw. 4 h nach Exposition mit FITC-beladenen PLV/DXR-NPs und fanden einen zeitabhängigen Anstieg der Intensität sowohl der roten als auch der grünen Fluoreszenz von 0,5 auf 4 h nach der NP-Behandlung (Abb. 6), was auf eine zeitabhängige zelluläre Aufnahme von DXR- bzw. FITC-beladenen NPs hinweist. Außerdem war die Menge an FITC, die in MDA-MB-231-Zellen eindrang, größer als diejenige, die in MDA-MB-453-Zellen eindrang. Eine weitere Quantifizierung der Fluoreszenzintensität ergab einen signifikanten Unterschied in der Aufnahme von DXR zwischen MDA-MB-231- und MDA-MB-453-Zellen eine Stunde nach der NP-Behandlung (Abb. 6c).

Aufnahme von Medikamenten in PLV/DXR-NPs durch Brustkrebszellen. Fluoreszenzmikroskopische Bilder von FITC-beladenem PLV/DXR, aufgenommen mit MDA-MB-231 (a ) und MDA-MB-453 (b ) Zellen bei 0,5, 1 und 4 h (blau für DAPI, rot für DXR, grün für FITC). c Quantitative Analyse der zellulären Aufnahme von DXR in MDA-MB-231- und MDA-MB-453-Zellen nach PLV/DXR-Behandlung

In-vitro-Zytotoxizität von PLV/DXR-NPs

Nachdem wir die hemmende Wirkung von DXR und LV auf die Lebensfähigkeit von MDA-MB-231- und MDA-MB-453-Zellen bestätigt und die synergistische Wirkung von DXR und LV nachgewiesen hatten, bestimmten wir die In-vitro-Zytotoxizität von PLV/DXR-NPs auf diese beiden Zellen Linien. MDA-MB-231- und MDA-MB-453-Zellen wurden mit PLV/DXR-NPs in einer Konzentration inkubiert, die der des freien DXR äquivalent war. Die Zytotoxizität von PLV/DXR-NPs nahm mit steigender DXR-Konzentration zu und war für MDA-MB-231-Zellen größer als für MDA-MB-453-Zellen (Fig. 7a). Dieser Befund stimmt mit dem Zytotoxizitätstrend freier Wirkstoffe überein (Abb. 7b) und weist darauf hin, dass das Laden von freien Wirkstoffen in NPs das Hemmverhalten der Wirkstoffe nicht beeinflusste. PLV/DXR-NPs hatten eine stärkere Hemmwirkung auf die Proliferation von MDA-MB-231 als MDA-MB-453-Zellen, was mit der bevorzugten Hemmwirkung von LV auf TNBC übereinstimmt. Die Wachstumshemmung von MDA-MB-231-Zellen war bei PLV/DXR-NPs größer als bei freiem DXR (IC₅₀ 0,6012 vs 0,865 μM), was darauf hindeutet, dass NPs die zelluläre Aufnahme und Retention des beladenen Wirkstoffs in der Zelle erleichtern könnten, was im Vergleich zu freiem Wirkstoff zu einer erhöhten Zytotoxizität führt.

In-vitro-Zytotoxizität von NP-verabreichten Arzneimitteln gegenüber freien Arzneimitteln. Zytotoxizität von PLV/DXR (a ) und kostenlose DXR (b ) gegen MDA-MB-231- und MDA-MB-453-Zellen

Diskussion

In dieser Studie setzten PLV/DXR-NPs, die für die in-vitro-Wirkstofffreisetzungsprofilierung vorbereitet wurden, DXR innerhalb von 72 h nachhaltig frei, was bei pH 5,4 (97,9%) robust war. PLV/DXR-NPs hemmten die Proliferation von TNBC-MDA-MB-231 stärker als Nicht-TNBC-MDA-MB-453-Zellen. Beide Zelllinien zeigten eine zeitabhängige Aufnahme der NPs, aber MDA-MB-231-Zellen nahmen mehr NPs auf als MDA-MB-453-Zellen. Somit könnte die gleichzeitige Abgabe von NP auf Pullulan-Basis von LV und DXR die Proliferation von TNBC-Brustkrebszellen effizient hemmen, was auf ein leistungsfähiges Wirkstoffabgabesystem zur Behandlung von TNBC hinweisen könnte.

In letzter Zeit hat die Verwendung von LVs in der TNBC-Prävention und -Behandlung Anerkennung gefunden, und Studien haben weiter gezeigt, dass LV bevorzugt die Proliferation von TNBC-Zellen hemmt und Apoptose induziert [10, 41]. Klinisch liegen LVs jedoch meist in oralen Präparaten vor, andere Antitumor-Medikamente für die Chemotherapie, einschließlich DXR, liegen jedoch meist in Injektionsform vor. Diese Situation führt zu einer unerwünschten chemotherapeutischen Wirksamkeit bei der Kombination von LV und anderen Arzneimitteln, da es schwierig ist, das Tumorgewebe mit der erwarteten Dosis und Zeit zu erreichen. Die Formulierung von LV als Injektion ist wegen seiner Wasserunlöslichkeit schwierig zu erreichen. Daher sind Nano-Abgabesysteme erforderlich, damit LV für die Anti-Tumor-Wirksamkeit verwendet werden kann und die gleichzeitige Verkapselung mehrerer Medikamente für eine einfachere Kombinations-Chemotherapie ermöglichen.

Unsere Gruppe stellte vor kurzem ein Nanokomposit auf Cerasom-Basis her, um LV zu verkapseln, das das Problem der Wasserlöslichkeit von LV bis zu einem gewissen Grad löste, aber die Wirkstoffbeladungseffizienz war im Allgemeinen nicht hoch (5~6%) [8]. Zhanget al. entwickelten Camptothecin-Floxuridin-Konjugat-Nanokapseln, um LV zu beladen. Diese Nanokapseln, bestehend aus zwei von der US-amerikanischen Food and Drug Administration zugelassenen Chemotherapeutika, erreichten eine ultrahohe Wirkstoffbeladungskapazität für Camptothecin-Floxuridin (68,3%), aber die Beladungseffizienz für LV war immer noch gering (2,8%) [29]. In der vorliegenden Studie verwendeten wir LV für die hydrophobe Modifikation von Pullulan, um amphiphile PLV-Konjugate zu erhalten, und stellten dann PLV/DXR-NPs her, die nicht nur das Problem der Wasserlöslichkeit von LV lösten, sondern auch eine hohe Wirkstoffbeladungskapazität (15,69% für LV und 1,93% für DXR).

Die Strategie, zwei oder mehr Anti-Tumor-Medikamente in einen Nanocarrier einzukapseln, ist für eine effiziente Wirkstoffabgabe weithin akzeptiert [42]. Sui et al. verwendeten DXR-transplantierte Pullulan-NPs, die Sorafenib beladen, um eine synergistische Chemotherapie gegen murines Mammakarzinom zu erreichen [30]. Unsere Studie verwendete eine ähnliche Methodik für PLV/DXR-NPs und zeigte eine höhere inhibitorische Wirksamkeit für MDA-MB-231-Zellen im Vergleich zu DXR allein. PLV/DXR-NPs zeigten jedoch keine synergistischen Wirkungen, die mit der Verzögerung der NP-Endocytose und der LV-Freisetzung zusammenhängen könnten, die weitere Untersuchungen verdient.

Der Kombinationsindex wird häufig verwendet, um die synergistischen Wirkungen zweier Medikamente zu quantifizieren [43,44,45]. Die zur quantitativen Bewertung synergistischer Effekte verwendete Isobologramm-Analysemethode kann falsch-positive Ergebnisse effektiv vermeiden [35]. In dieser Studie haben wir das optimale Synergieverhältnis aus einer Reihe von DXR/LV-Verhältnissen basierend auf einer Isobologrammanalyse gescreent.

Unsere Forschung liefert eine Begründung für die Entwicklung eines effizienteren Co-Delivery-Systems, um synergistisch verstärkte inhibitorische Wirkungen auf TNBC hervorzurufen. Da unsere Arbeit vorläufig ist und auf der Annahme basiert, dass der EPR-Effekt möglich ist, sind weitere Untersuchungen der In-vivo-Wirksamkeit dieses neuartigen Co-Delivery-Systems bei TNBC unter Verwendung von orthotopen Brusttumorwachstumsmodellen und von Patienten abgeleiteten Xenotransplantatmodellen gerechtfertigt.

Schlussfolgerung

In dieser Studie entwickelten wir neuartige duale Wirkstoff-beladene NPs durch chemisches Pfropfen von LV auf Pullulan und physikalisches Einkapseln von DXR, das eine ausgezeichnete Monodispersität, eine hohe Wirkstoffbeladungskapazität und ein gutes Wirkstofffreisetzungsverhalten aufwies. Die PLV/DXR-NPs zeigten ein nachhaltiges pH-sensitives Freisetzungsverhalten von DXR. PLV/DXR-NPs internalisierten und hemmten die Proliferation von TNBC MDA-MB-231 effektiver als Nicht-TNBC MDA-MB-453-Zellen. Darüber hinaus demonstrierten wir die synergistische Wirkung einer freien DXR/LV-Mischung, die ein kombiniertes Chemotherapieregime für eine potenzielle zukünftige klinische Behandlung von TNBC darstellt.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Schlussfolgerungen in diesem Manuskript basieren auf den Daten, die alle in diesem Papier präsentiert und gezeigt werden.

Abkürzungen

¹ H-NMR:

Protonenkernmagnetische Resonanz

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

DMAP:

4-Dimethylaminopryidin

DMEM:

Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium

DMSO:

Dimethylsulfoxid

DS:

Substitutionsgrade

DXR:

Doxorubicin

EDCI:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid

EE:

Verkapselungseffizienz

EPR:

Verbesserte Durchlässigkeit und Retention

ER:

Östrogenrezeptor

FBS:

Fötales Rinderserum

FTIR:

Fourier-Transformations-Infrarot

HER2:

Humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2

LC:

Ladekapazität

LV:

Lovastatin

LV-SA:

Lovastatin-Bernsteinsäuremonoester

NP:

Nanopartikel

PDI:

Polydispersitätsindizes

PLV:

Pullulan-verkapseltes Lovastatin

PLV/DXR-NPs:

Mit Doxorubicin beladene PLV-Nanopartikel

PR:

Progesteron-Rezeptor

SA:

Bernsteinsäureanhydrid

TNBC:

Triple-negativer Brustkrebs