Hochregulieren von MicroRNA-410 oder Herunterregulieren von Wnt-11 erhöht Osteoblasten und reduziert Osteoklasten, um Osteonekrose des Femurkopfes zu lindern

Einführung

Die Hüftkopfnekrose (ONFH) als eine der bekanntesten Erkrankungen der Hüftgelenke führt zu starken Schmerzen oder Gelenkeinschränkungen und tritt vor allem im mittleren Lebensalter auf [1]. Die Therapie des erwachsenen ONFH mit 8,12 Millionen Patienten in China ist für Chirurgen nach wie vor eine Herausforderung [2]. Viele Risikofaktoren sind mit dem Auftreten von ONFH verbunden, wie Hyperlipidämie, Autoimmunerkrankungen, Gerinnungsstörungen Alkoholismus und Hyperkortisonismus [3]. Die chirurgische Behandlung umfasst eine Kerndekompression mit oder ohne Adjuvans, beispielsweise autologes Knochenmark, während ein Hüfttotalersatz (THR) bei senilen Patienten oder fortgeschrittene Osteonekrose, die nicht durch Gelenkretention behandelt wird, zurückgehalten wird [4]. Allerdings hat ONFH bei Patienten, die häufig eine THR benötigen, eine unbefriedigende Prognose [5]. Daher besteht ein dringender Bedarf, ein genaues therapeutisches Ziel für die Behandlung von ONFH zu erforschen.

MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige Regulatoren der Zellfunktion und Genexpression, die eine enorme Funktion auf die endotheliale Homöostase ausüben und eine neue Behandlung darstellen können [6]. Eine Studie hat berichtet, dass miR-410 bei mehreren menschlichen perniziösen Krebsarten abnormal exprimiert wurde und als Tumorinhibitor bei Endometrium-, Lungen-, Myelom- und Brustkrebs verwendet werden kann [7,8,9,10]. Eine andere Studie zeigte, dass es eine neuroprotektive Wirkung von miR-410 auf das Parkinson-Zellmodell gibt, die durch 6-Hydroxydopamin induziert wird, indem es den PTEN/AKT/mTOR-Signalweg unterdrückt [11]. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass miR-410 malignes biologisches Verhalten von Kindern mit akuter lymphatischer Leukämie moduliert, indem es auf FKBP5- und AKT-Signalwege abzielt [12]. Ein Artikel hat auch die hemmende Wirkung von miR-410 auf Angiotensin II Typ 1 bei Bauchspeicheldrüsenkrebs gezeigt [13]. Wnt-Protein ist eine Art Cystein-reiche sezernierte Lipoglykoproteine, die eine enorme Funktion auf die Entwicklung und Krankheit ausüben [14]. Wnt-11 gehört zum Wnt-Signalweg und ist ein positiver Regulator, der eine zentrale Rolle bei der Karzinogenese spielt [15]. Es gibt eine Studie, die über die klinische Bedeutung der Expression von Plattenepithelkarzinom-Antigen und Wnt11 beim Zervixkarzinom berichtet [16]. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass synergetische Signale von TGF-β1 und Wnt11 die Expression von sm-α-Aktin in der glatten Muskulatur durch Rho-Kinase-Aktin-MRTF-A-Signalgebung steuern [17]. Basierend auf der obigen Literatur war das Ziel der vorliegenden Studie, die Rolle von miR-410, das Wnt-11 reguliert, bei der Prävention von ONFH zu untersuchen Mechanismus zur Prävention von ONFH.

Materialien und Methoden

Ethikerklärung

Die Studie wurde unter Genehmigung des Institutional Review Board des Beijing Shijitan Hospital der Capital Medical University durchgeführt und folgte den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki. Die Teilnehmer gaben ihr schriftliches Einverständnis zur Teilnahme an dieser Studie. Alle Tierversuche standen im Einklang mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren der National Institutes of Health. Das Protokoll wurde vom Ausschuss für Ethik von Tierversuchen des Beijing Shijitan Hospital der Capital Medical University genehmigt.

Studienfächer

Ausgewählt wurden insgesamt 30 Patienten, die von Januar 2017 bis September 2018 in der orthopädischen Abteilung des Beijing Shijitan Hospital der Capital Medical University behandelt werden. Von diesen Patienten wurden 15 Patienten mit ONFH in einer THR-Operation behandelt, das Durchschnittsalter der Patienten betrug 50,6 ± 4,3  Jahre und die Körpermasse betrug 57,0 ± 5,6 kg bei 7 Männern und 8 Frauen (ONFH-Gruppe). Weitere 15 Patienten mit Oberschenkelhalsfraktur wurden mit einer THR-Operation behandelt, das Durchschnittsalter betrug 59,6 ± 3,3  Jahre und die Körpermasse betrug 50,0 ± 5,6 kg bei 9 Männern und 6 Frauen (Kontrollgruppe). Es gab keinen deutlichen Unterschied in Geschlecht, Alter und Gewicht zwischen den beiden Gruppen (P> 0,05), was vergleichbar war. Die Gewebe im subchondralen nekrotischen Bereich wurden durch Meißeln entlang der Längslinie des Hüftkopfes entnommen und bei –80°C gelagert. Jede Gruppe wurde pathologisch bzw. molekularbiologisch untersucht.

Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung

Die Proben wurden mit 4 % Paraformaldehyd befestigt und mit 10 % Ethylendiamintetraessigsäure entkalkt, und die Entkalkungslösung wurde einmal wöchentlich ersetzt. Die Farbe der Knochenprobe wurde beobachtet und der Entkalkungsgrad gemessen. Nach vollständiger Entkalkung wurde die Probe in Paraffin eingebettet und auf eine Dicke von 4 µm geschnitten. Die gebrannten Schnitte wurden der Reihe nach 10 min in Xylol I und Xylol II eingetaucht, und die entwachsten Schnitte wurden 2 min lang in absoluten Alkohol I, absoluten Alkohol II, 95 % Alkohol, 80 % Alkohol bzw. 70 % Alkohol eingetaucht. Dann wurden die Schnitte 3 min mit Hämatoxylin gefärbt und 2 min mit 1 % Salzsäurealkohol differenziert. Als nächstes wurden die Schnitte in 50 %, 70 % und 80 % Alkohol für 2 min der Reihe nach eingeweicht und in Eosin für 5 s eingetaucht. Als nächstes wurden die Schnitte in 95% Alkohol, absoluten Alkohol I und absoluten Alkohol II für 3 min eingetaucht und dann in Xylol I und Xylol II für 5 min eingetaucht. Schließlich wurden die Schnitte mit neutralem Gummi versiegelt und mikroskopisch untersucht.

Färbung mit alkalischer Phosphatase (ALP)

In jeder Probe wurde ein Abschnitt ausgewählt und 60 Minuten lang bei 60 °C gebacken. Die Paraffinschnitte wurden jeweils 15 min mit Xylol I und Xylol II entparaffiniert und nacheinander 5 min in absoluten Alkohol I, absoluten Alkohol II, 95 % Ethanol, 90 % Ethanol, 80 % Ethanol und 75 % Ethanol getaucht. und mit dreifach destilliertem Wasser 2 min dreimal gereinigt. Die Schnitte wurden mit etwas Substratflüssigkeit beträufelt, die im ALP-Färbekit (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China) hergestellt wurde, wobei die Substratflüssigkeit die Probe vollständig bedeckte, dann bei 37 °C ausgebrütet, wobei 15 Minuten lang Licht vermieden wurde. Die überflüssige Farbstofflösung wurde verworfen, und die Schnitte wurden sofort mit dem chromogenen Mittel A für 5 min betropft und mit dreifach destilliertem Wasser für 30 s gereinigt. Dann wurden die Schnitte 30 Sekunden lang mit dem chromogenen Mittel B gefärbt und 30 Sekunden lang mit Reagenz gegengefärbt. Das Foto wurde unter einem 200 × optischen Mikroskop aufgenommen und die Anzahl der Osteoblasten wurde über ein Bildanalysesystem für das Mikroskop (Image-Proplus 6.0) berechnet.

Färbung mit Tartrat-resistenter saurer Phosphatase (TRAP)

Für jede Probe wurde ein Abschnitt ausgewählt und 60 Minuten lang bei 60 °C geröstet. Die Paraffinschnitte wurden mit Xylol I und Xylol II 15 min entparaffiniert und der Reihe nach in absoluten Alkohol I, absoluten Alkohol II, 95 % Ethanol, 90 % Ethanol, 80 % Ethanol und 75 % Ethanol 5 min eingetaucht. Die Schnitte wurden mit etwas vorbereiteter Fixierlösung für 30 s fixiert. Die Schnitte wurden in das Färbegestell eingesetzt und in eine dunkle Box mit frisch zubereiteter TRAP-Färbelösung (Sigma, St. Louis, MO, USA) gelegt, die Färbelösung sollte vollständig mit den Schnitten bedeckt sein, dann wurden die Schnitte schraffiert 37 °C Wasserbadtopf für 1 h. Als nächstes wurden die Schnitte mit Hämatoxylin für 2 min gegengefärbt und getrocknet. Da die TRAP-Färbung mit der Zeit abklingen würde, würden die Schnitte ohne Versiegelung direkt mit dem Mikroskop untersucht. Das Bild wurde unter einem 200 × optischen Mikroskop aufgenommen und die Anzahl der Osteoklasten wurde durch ein Bildanalysesystem für ein Mikroskop (Image-Proplus 6.0) gezählt.

Immunhistochemische Färbung

Nach der Entkalkung wurden die Schnitte in Paraffinwachs eingebettet und auf eine Dicke von 4 µm geschnitten. Die Schnitte wurden mit herkömmlichem Xylol entparaffiniert, mit Gradientenalkohol dehydratisiert und mit 3% H₂ . schraffiert O₂ (Sigma-Aldrich Chemical Company, St. Louis, MO, USA) bei 7 °C 30 min lang gekocht und dann mit 0,01 m Zitronensäurepuffer bei 95 °C 20 min gekocht. Die Schnitte wurden mit normalem Schafserum-Arbeitsfluid für 10 min geblockt, gemischt mit primärem Antikörper Wnt-11 (1:100, Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) bei 4 °C über Nacht, sekundärer Antikörper (gebrauchsfertiger sekundärer Antikörper Kit (PV-6000), ZSGB-Bio, Peking, China) für 20 min und Meerrettichperoxidase-markierte Streptomyces Ovalbumin Arbeitsflüssigkeit (SA/HRP, Beijing ComWin Biotech Co. Ltd, Peking, China) für 2 min. Die Schnitte wurden mit Diaminobenzidin (DAB) (Sigma-Aldrich Chemical Company, St. Louis, MO, USA) entwickelt, mit Hämatoxylin (Shanghai Bogoo Biological Technology Co., Ltd., Shanghai, China) gegengefärbt und dann versiegelt. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ersetzte den primären Antikörper als Negativkontrolle (NC). Unter dem Lichtmikroskop wurden die positiven Zellen mit braunen Reaktanten im Zytoplasma lokalisiert, die stark positive Expression war dunkelbraungelb, die schwach positive Expression war hellbraungelb und die negative Expression hat keine Färbung. Die Färbung der Zellen wurde unter dem Lichtmikroskop beobachtet, fünf Hochleistungsfelder (400 ×) wurden für jeden Schnitt beobachtet und 100 Zellen wurden pro Feld gezählt. Der Durchschnittswert war das Beobachtungsergebnis jedes Abschnitts. Entsprechend dem Anteil und der Verteilung der positiven Zellen wurde wie folgt bestimmt:negativ (–), Einzelzellfärbung, die positiven Zellen weniger als 5 %; schwach positiv (+), verstreute oder kleinzellige Massenfärbung, die Anzahl der positiven Zellen betrug 5–24 %; positive (++), Flocken- oder Clusterzellfärbung, die Zahl der positiven Zellen betrug 25–50%; und stark positive (+++), diffuse Zellfärbung, betrug die Zahl der positiven Zellen mehr als 50%. Die Ergebnisse der Immunhistochemie wurden mit einem Doppelblind-Score von zwei Personen unabhängig voneinander ausgewertet.

Quantitative Reverse Transkription der Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR)

Die Gesamt-RNA wurde aus Gewebeproben mit dem Trizol-Extraktionskit (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) abstrahiert. Die Konzentration und Reinheit der RNA wurden bestimmt. Primer wurden von Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga, Japan) entwickelt und zusammengesetzt (zusätzliche Datei 1:Tabelle S1). Dann wurde RNA unter Verwendung des PrimeScript RT-Kits (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, China) revers in cDNA transkribiert. Die Reaktionslösung wurde für die quantitative Fluoreszenz-PCR unter Bezugnahme auf die Anweisungen von SYBR® Premix Ex Taq ^TM . verwendet II-Kit (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, China). Die quantitative Fluoreszenz-PCR wurde in einem ABI PRISM® 7300-System (Applied Biosystems, Massachusetts, USA) durchgeführt. U6 war die Ladekontrolle von miR-410 und Glyceraldehydphosphatdehydrogenase (GAPDH) war die internen Parameter von Wnt-11, ALP, Knochen-Gamma-Carboxyglutamat-Protein (BGLAP), Collα1, Tartrat-resistente saure Phosphatase 5 (ACP5), Cathepsin K (CTSK), Matrix-Metallopeptidase (MMP)9, Bcl-2 und Bax. Die relativen Transkriptionsniveaus der Zielgene wurden mit 2 ^−△△Ct . berechnet Methode [18].

Western Blot-Analyse

Das Gesamtprotein wurde aus dem Gewebe des Hüftkopfes abstrahiert. Die Proteinkonzentration jeder Probe wurde gemessen und die Probenbeladung wurde durch das entionisierte Wasser angepasst, um sicherzustellen, dass die Größe konsistent war. Natriumdodecylsulfat-Trenngel und Abstandsgel (10 %) wurden hergestellt. Nach Eisbaden und Zentrifugieren wurde die Probe durch Elektrophorese mit der gleichen Menge Microsampler aufgetrennt und anschließend das Protein auf dem Gel auf die Nitrozellulosemembran übertragen. Die Nitrozellulosemembran wurde mit 5% Magermilchpulver bei 4 °C über Nacht versiegelt und mit dem Primärantikörper Wnt-11 (1:150, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), ALP (1:100, Sigma, St Louis, MO, USA), BGLAP, Collα1 und MMP9 (1:1000), ACP5 (1:100), CTSK (1:500, Abcam, Cambridge, MA, USA) und Bcl-2 und Bax (1:500, Proteintech, Chicago, USA) und über Nacht geschlüpft. Und die Probe wurde mit dem durch HRP markierten Sekundärantikörper IgG (1:1000, Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd., Hubei, China) getropft und 1 h inkubiert. Die Membran wurde 1 min lang in eine Reaktionslösung mit verstärkter Chemilumineszenz (Pierce, Rockford, IL, USA) eingetaucht. Nach dem Entfernen der Flüssigkeit wurde die Probe mit dem Lebensmittelkonservierungsfilm bedeckt. Nach dem Entwickeln und Fixieren wurde das Ergebnis beobachtet. GAPDH war der interne Parameter, und das Proteinabdruckbild wurde mit der ImageJ2x-Software analysiert.

Etablierung von Rattenmodellen der ONFH

Neunzig männliche Sprague-Dawley (SD)-Ratten (Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., Shanghai, China) mit einem Gewicht zwischen 300 &mgr;g und 350 &mgr;g wurden ausgewählt. Die Umgebung wurde auf 18–25°C eingestellt und die Luftfeuchtigkeit betrug 45–70%. Die Ratten wurden in getrennten Käfigen aufgezogen, um Lärm zu vermeiden. Nach 1 Woche adaptiver Fütterung wurden Folgeexperimente durchgeführt.

Das Modell wurde von traumatischen ONFH etabliert. Die Modellierungsverfahren waren wie folgt:SD-Ratten wurden mit Bauchhöhle anästhesiert, gefolgt von Haarentfernung und Hautpräparation. Die Rattenhaut wurde geschnitten, die Gewebe wurden abgetrennt und das runde Ligament wurde nach Freilegung des Hüftkopfes abgeschnitten. Das Periost des Oberschenkelhalses von Ratten wurde abgeschabt und die Blutversorgung um den Oberschenkelkopf wurde zerstört. Die Gelenkkapsel, der Muskel und die Haut wurden Schicht für Schicht vernäht und erneut sterilisiert.

Tiergruppierung

Siebzig erfolgreich modellierte SD-Ratten wurden in sieben Gruppen aufgeteilt, mit 10 Ratten in jeder Gruppe:ONFH-Gruppe; agomir-NC-Gruppe (0,5 µl miR-410-Agonist NC (200 µnM, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangdong, China) wurde 1 Woche nach erfolgreicher Etablierung der ONFH um das Hüftgelenk injiziert, agomir-miR-410-Gruppe (0,5 µl miR-410-Agonist (200 µm, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Guangdong, China) wurde 1 Woche nach erfolgreicher Etablierung des ONFH um das Hüftgelenk injiziert), siRNA-NC-Gruppe (NC von 0,4 µmL zum Schweigen gebrachtes Wnt -11 Vektor (enthält 1 × 10 ⁹ Plaque-Forming Unit (PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) wurde 1 Woche nach erfolgreicher Etablierung von ONFH um das Hüftgelenk injiziert, Wnt-11-siRNA-Gruppe (0,4 µl stummgeschalteter Wnt-11-Vektor (enthält 1 × 10 ⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) wurde 1 Woche nach erfolgreicher Etablierung von ONFH um das Hüftgelenk injiziert), Agomir-miR-410 + überexprimierte (OE)-NC-Gruppe (0,5 ml miR-410-Agonist) und NC von 0,4 mL hochreguliertem Wnt-11-Vektor (enthält 1 × 10 ⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) wurde 1 Woche nach erfolgreicher Etablierung des ONFH um das Hüftgelenk injiziert) und die Gruppe Agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (0,5 ml miR-410-Agonist) und 0,4 µl hochregulierter Wnt-11-Vektor (enthält 1 × 10 ⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) wurde 1 Woche nach erfolgreicher Etablierung des ONFH um das Hüftgelenk injiziert. Inzwischen wurde die normale Gruppe (nur Kochsalzlösung wurde in die Bauchhöhle injiziert, 10 Ratten) als Kontrolle eingesetzt. Nach 4 Wochen ONFH wurden Mikro-CT, osteonometrische Analyse, Röntgenbeobachtung, Knochendichtemessung und Bestimmung des Serumcalcium- und -phosphatspiegels durchgeführt.

Mikro-CT-Test und Osteonometrieanalyse

Der rechte Femurkopf von Ratten wurde auf das Mikro-CT-Gerät (General Electric (GE) Company, Massachusetts, USA) gelegt und das zufällig ausgestattete Standardphantom wurde ebenfalls gescannt. Die Scanparameter sind wie folgt:Auflösung 27 µm × 27 µm × 27 µm, Scanstrom 450 mA, Scanspannung 80 kV und Einzelscanzeit 88 min. Die Mikrostruktur des Hüftkopfes der Ratte wurde im Detail beobachtet. Nach der Kalibrierung im Lichte der Spezifikation wurden drei quaderförmige Regionen von Interesse (ROI) zufällig aus verschiedenen Gruppen von Ratten für die Rekonstruktion ausgewählt (0,5 × 0,5 × 0,5 cm ³ ). Die Bildverarbeitung erfolgte mit der Maschinensoftware GE Microview, der ROI wurde mittels Knochenmesstechnik rekonstruiert und analysiert. Die Parameter Knochenmineraldichte (BMD) und Knochenvolumenfraktion (BV/TV) wurden ausgewählt.

Röntgenbeobachtung, BMD-Bestimmung und Bestimmung des Serum-Calcium- und -Phosphorspiegels

Vier Wochen nach der Operation wurde den Ratten jeder Gruppe über den Bauch 10 % Chloralhydrat injiziert. Nach der Anästhesie wurden die Ratten in Rückenlage gebracht und die Gliedmaßen wurden fixiert und dann durch Röntgenfotografie untersucht. Die Veränderung der Hüftkopfform und -dichte wurde beobachtet. Die Knochendichte des linken Oberschenkelrückgrats, des Oberschenkelkopfes und der Wirbelsäule wurde mit einem Dual-Energy-Röntgen-Knochendichte-Messinstrument getestet. 4 Wochen nach der Operation wurden die Ratten in jeder Gruppe vor der Blutentnahme 12 Stunden lang gefastet. Die Blutproben (5 ml) wurden morgens durch das Herz entnommen und in ein vakuumgereinigtes Koagulationsröhrchen gegeben. Das Serum wurde durch 15-minütige Zentrifugation bei 3000 U/min abgetrennt. Die Serum-Calcium- und -Phosphor-Spiegel wurden mit einem automatischen biochemischen Analysegerät gemessen.

Elektronenmikroskopische Beobachtung

Die Knochengewebemasse der Ratte wurde mit 3,5 % Glutaraldehyd befestigt, mit 5 % Salzsäurelösung und 1 % Osminsäure entkalkt, dann mit Gradientenaceton dehydratisiert, mit Uranacetat und Zitronensäure doppelt gefärbt und schließlich mit Epon-61 eingebettet. Nachdem der halbdünne Schnitt hergestellt worden war, wurde der ultradünne Schnitt mit einem Transmissionselektronenmikroskop betrachtet.

TdT-vermittelter dUTP-Biotin Nick End-Labeling (TUNEL) Assay

Die in Paraffin eingebetteten Schnitte wurden mit konventionellem Entparaffinieren und Dehydratisieren vorbehandelt. Die Schnitte wurden mit Pepsin (0,25~0,5% Salzsäurelösung) 25 Minuten lang ausgebrütet, dann mit 50 µl TUNEL-Reaktionsmischungslösung getropft und in einer Nassbox 60 Minuten lang ausgebrütet und mit 50 µl Mittel-Peroxidase betropft und in einem Wasser ausgebrütet Nassbox für 30 min. Die Schnitte wurden mit DAB-Reagenz entwickelt, ob die Schnitte gefärbt waren und wurden unter dem Mikroskop betrachtet. Die Schnitte wurden mit Wasser versetzt, um die Entwicklung zu stoppen, und mit Hämatoxylin 2 min gefärbt. Anschließend wurden die Schnitte in 95 % Ethanol I–II, absolutes Ethanol I–II für 3–5 min bzw. Xylol I–II für 3–5 min getaucht und mit neutralem Gummi versiegelt. Die Ergebnisse wurden unter dem Lichtmikroskop analysiert.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Nachdem die Ratten anästhesiert waren, wurde das Blut der Oberschenkelarterie entnommen und die Serumproben wurden durch Zentrifugation nach 1-stündiger Ruhe gesammelt. Auf Basis der Spezifikation des ELISA-Kits (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) wurden nacheinander sieben Standard-Wells mit verschiedenen Konzentrationsstandards (100 μL) und die Leer-Wells mit 100 μL Standard-Verdünnungslösung, und die verbleibenden Vertiefungen wurden mit 100 µl zu testender Probe angehängt. Die Enzymplatte wurde mit Folie beschichtet und 1 h lang platziert, und dann wurde die Flüssigkeit verworfen. Auf alle Wells wurde eine Lösung (100 µl) gegeben und die Enzymplatte für 1 µl mit dem Film bedeckt. Nach dem Waschen wurden 100 µl B-Lösung in alle Vertiefungen gegeben und die Enzymplatte wurde 30 min mit dem Film bedeckt. Dann wurde Tetramethylbenzidin-Substratlösung (90 µl) zugegeben, die Enzymplatte für 10–20 min mit dem Film bedeckt und 50 µl Terminierungslösung auf alle Vertiefungen gegeben. Der Wert der optischen Dichte (OD) jedes Wells wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen und die tatsächliche Konzentration der Probe wurde gezählt.

Dualer Luciferase-Reporter-Gen-Assay

Die Bindungsstellen und die Zielbeziehung von miR-410 und Wnt-11 3′ untranslated region (UTR) wurden mit Bioinformatik-Software http://www.targetscan.org vorhergesagt. Die Sequenz der Wnt-11-3′UTR-Promotorregion, die die miR-410-Bindungsstelle enthält, wurde zusammengestellt und in pMIR-REPORT ^TM . eingefügt Luciferase-Vektorplasmid (Ambion, Company, Austin, TX, USA) zur Formulierung des Wnt-11 3'UTR-Wildtyp-Plasmids (Wnt-11-WT). Und das mutierte Wnt-11-3'UTR-Plasmid (Wnt-11-MUT) wurde auf der Grundlage des Plasmids und der Mutationsbindungsstelle konstruiert. Befolgen Sie die Schritte des gekauften Plasmidextraktionskits (Promega, Madison, Wisconsin, USA), und die logarithmischen Zellen wurden in die 96-Well-Platten ausgesät. Als die Zellkonfluenz etwa 70 % betrug, wurde Lipofectamine 2000 für die Transfektion verwendet. Wnt-11-WT und Wnt-11-MUT wurden mit Mimetika NC bzw. miR-410 Mimetika (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China) vermischt und dann in 293 T-Zellen cotransfiziert. Die Zellen wurden nach 48 Stunden transfiziert und lysiert, und die Luciferase-Aktivität wurde mit einem Luciferase-Nachweiskit (BioVision, San Francisco, CA, USA) und einem Glomax 20/20 Luminometer (Promega, Madison, Wisconsin, USA) getestet.

Statistische Analyse

Alle Daten wurden mit der Software SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) verarbeitet. Die Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung übermittelt. Für Mehrgruppenvergleiche und die t . wurde eine einseitige Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt Test für Zweigruppenvergleiche und Fishers am wenigsten signifikanter Unterschied t Test (LSD-t) wurde nach ANOVA verwendet. P Wert <0,05 war ein Hinweis auf einen statistisch signifikanten Unterschied.

Ergebnisse

Pathologische Veränderungen in ONFH-Geweben klinischer Proben

Die HE-Färbung wurde verwendet, um die pathologischen Veränderungen des Hüftkopfes in der Gruppe mit Oberschenkelhalsfrakturen (Kontrollgruppe) und der ONFH-Gruppe zu beobachten; die Ergebnisse zeigten, dass in der Kontrollgruppe die Knochentrabekeldichte gut verteilt war und die Struktur Integrität war. In der ONFH-Gruppe gab es viele leere Knochenlakunen im Knochenkleinhirn, wobei die Knochenzellen abnahmen und sich die Knochenbälkchen kontinuierlich veränderten. Darüber hinaus gab es viele andere Gewebehyperplasien um das Knochenkleinhirn (Abb. 1a).

Pathologische Veränderungen in ONFH-Geweben klinischer Proben. a Ergebnisse der HE-Färbung in jeder Gruppe (200 ×). b Ergebnisse der TRAP-Färbung und die Zählung der TRAP-positiven Zellen in jeder Gruppe (200 ×). c Ergebnisse der ALP-Färbung und ALP-positiven Zellen zählen in jeder Gruppe (400 ×). *P <0,05 gegenüber der Kontrollgruppe

Die TRAP-Färbung zeigte, dass TRAP hauptsächlich in Osteoklasten gefunden wurde und häufig verwendet wurde, um reife Osteoklasten in Amaranth zu identifizieren. Im Vergleich zur Kontrollgruppe stieg die Zahl der TRAP-positiven Osteoklasten in der ONFH-Gruppe an, die Morphologie der Osteoklasten war vielfältig und die Zellen waren groß mit multinuklearem Aussehen. Im Knochenkleinhirn neben Osteoklasten wurden offensichtliche Knochendefekte beobachtet, die eine Knochenresorption zeigten (Abb. 1b).

Das Ergebnis der ALP-Färbung zeigte, dass ALP ein Markerenzym für die Differenzierung und Reifung von Osteoblasten war, das an der Regulierung der Reifungskalzifizierung der Knochenmatrix beteiligt war. Daher wurde die ALP-Expression häufig verwendet, um Osteoblasten zu identifizieren. Im Zytoplasma reifer Osteoblasten waren braune oder kaffeefarbene Partikel zu sehen. Im Vergleich zur Kontrollgruppe reduzierte sich die Zahl der ALP-positiven Osteoblasten in der ONFH-Gruppe (Abb. 1c).

MiR-410, ALP, BGLAP und Collα1 degradiert und Wnt-11, ACP5, CTSK und MMP9 verstärkt in ONFH-Geweben der klinischen Proben

Western-Blot-Analyse und RT-qPCR zeigten, dass die miR-410-Expression in der ONFH-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe abnahm, während die Wnt-11-Expression anstieg; die Expression der Osteoblasten-bezogenen Faktoren ALP, BGLAP und Collα1 wurde abgebaut; und die Expression der osteoklastenbezogenen Faktoren ACP5, CTSK und MMP9 stieg an (alle P <0,05) (Abb. 2a–c).

In ONFH-Geweben klinischer Proben nahmen MiR-410, ALP, BGLAP und Collα1 ab und Wnt-11, ACP5, CTSK und MMP9 zu. a Nachweis von miR-410, Wnt-11 und Osteoblasten- und Osteoklasten-bezogenen Genen durch RT-qPCR. b Wnt-11 und Osteoblasten- und Osteoklasten-verwandte Proteine, die durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen wurden. c Proteinbanden von Wnt-11 und Osteoblasten- und Osteoklasten-verwandten Proteinen. d Wnt11-Expression (400 ×) und Vergleich der Wnt11-Protein-positiven Rate, nachgewiesen durch immunhistochemische Färbung. *P <0,05 gegenüber der Kontrollgruppe

Die Wnt-11-Expression wurde durch Immunhistochemie getestet und die Ergebnisse zeigten, dass das Wnt-11-Protein hauptsächlich im Zytoplasma exprimiert wurde und die positive Expression im Wesentlichen bräunlich-gelb oder braun war. Im Gegensatz zur Kontrollgruppe war die positive Rate der Wnt-11-Proteinexpression in der ONFH-Gruppe erhöht (P <0,05) (Abb. 2d).

Hochreguliertes miR-410 und herunterreguliertes Wnt-11 erhöhen die BMD und BV/TV von Ratten

Mikro-CT ergab, dass der Hüftkopf in der Normalgruppe rund, die Dicke des Halses einheitlich und die Struktur der Knochenbälkchen durchgehend und gleichmäßig verteilt war. Der Hüftkopf der Ratten in der ONFH-Gruppe, der Agomir-NC-Gruppe, der siRNA-NC-Gruppe und der Agomir-miR-410 + OE-Wnt-11-Gruppe brach allmählich zusammen, der Knochenresorptionsbereich erschien allmählich, der Oberschenkelhals wurde dünner , und die Knochenbälkchen waren gebrochen und die Kontinuität zerstört. In der Agomir-miR-410-Gruppe, der Wnt-11-siRNA-Gruppe und der Agomir-miR-410 + OE-NC-Gruppe blieb das Aussehen der Ratten intakt, es trat kein Kollaps auf, es traten keine offensichtlichen Knochenresorptionsbereiche auf, die Knochenbälkchen wurden normal angeordnet und die Struktur war vollständig (Abb. 3a).

Stark exprimiertes miR-410 und schwach exprimiertes Wnt-11 erhöhen BMD und BV/TV von Ratten. a Mikro-CT-Ergebnisse von Ratten in jeder Gruppe. b Ergebnisse der BMD-Analyse. c Ergebnisse der BV/TV-Analyse. *P <0,05 gegenüber der Normalgruppe. ⁺ P <0,05 gegenüber der Agomir-NC-Gruppe. ^# P <0,05 gegenüber der siRNA-NC-Gruppe. ^& P <0,05 gegenüber der Agomir-miR-410 + OE-NC-Gruppe

Die Ergebnisse der Knochenmesstechnik zeigten, dass im Gegensatz zur Normalgruppe die BMD und BV/TV in der ONFH-Gruppe depressiv waren (beide P <0,05). In Bezug auf die Agomir-NC-Gruppe und die siRNA-NC-Gruppe sind BMD und BV/TV in der Agomir-miR-410-Gruppe und der Wnt-11-siRNA-Gruppe erhöht (alle P <0,05). Im Vergleich mit der Gruppe agomir-miR-410 + OE-NC wurden BMD und BV/TV in der Gruppe agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 fallengelassen (beide P <0,05) (Abb. 3b, c).

Überexpression von miR-410 und schlechte Expression von Wnt-11 erhöhen die BMD-Werte des Femurschafts, des Femurkopfes und der Wirbelsäule und erhöhen auch das Serumkalzium und Phosphorgehalt von Ratten

Röntgenaufnahmen zeigten, dass das Aussehen des Hüftkopfes in der normalen Gruppe rund war, die Hüftkopfdichte einheitlich war und die Struktur vollständig war. In der ONFH-Gruppe, der Agomir-NC-Gruppe, der siRNA-NC-Gruppe und der Agomir-miR-410 + OE-Wnt11-Gruppe wurde das Erscheinungsbild des Hüftkopfes von Ratten dünner und der Knochenresorptionsbereich erschien. Das Erscheinungsbild war gleichmäßig und die Dicke des Hüftkopfes der Ratten war in der Agomir-miR-410-Gruppe, der Wnt11-siRNA-Gruppe und der Agomir-miR-410-Gruppe + OE-NC-Gruppe vollständig (Abb. 4a).

Hochreguliertes miR-410 und herunterreguliertes Wnt-11 erhöhen die Knochenmineraldichte des Oberschenkelschafts, des Hüftkopfes und der Wirbelsäule und erhöhen auch den Serumkalzium- und -phosphatspiegel von Ratten. a Ergebnisse der Tierröntgenbeobachtung. b Comparison of the bone mineral density of the femoral shaft, femoral head, and spine in each group. c Comparison of the serum calcium and phosphorus levels in each group. *P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

BMD and serum calcium and phosphorus level determination reported that compared to the normal group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as the serum calcium and phosphorus levels, fell in the ONFH group (all P <0,05). In contrast with the agomir-NC group and siRNA-NC group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as serum calcium and phosphorus levels, ascended in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as the serum calcium and phosphorus levels in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, was abated (all P <0.05) (Fig. 4b, c).

Silencing Wnt-11 and Upregulating miR-410 Alleviate the Pathological Changes of Rat Tissues and Restrain Apoptosis of Osteocytes

The results of HE staining showed that the bone trabeculae were neat and clear and arranged regularly and tightly. Bone cells filled the bone lacunae, and the calcified zone was well connected to the subcartilage bone trabeculae in the normal group. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, the bone trabecula was sparse; thinned, and even broken; the structure was disordered; and some fragments appeared. Some osteocytes in the bone lacuna were necrotic and a large number of bone lacuna was in emptiness that no bone cells filled in, and obvious proliferation of granulation tissue was observed in the necrosis bone trabecular space, which was wrapped around the necrotic bone trabeculae. In the agomir-miR-410 group, the Wnt-11-siRNA group, and the agomir-miR-410 + OE-NC group, the appearance of the rats remained intact, no obvious bone resorption area appeared and the bone trabeculae were arranged normally and the structure was complete (Fig. 5a).

Poor expression of Wnt-11 and overexpression of miR-410 alleviate pathological changes of rats tissues and restrain apoptosis of osteocytes. a Morphological observation of the femoral head of rats in each group (200 ×). b Ultrastructural observation of bone cells in rats of each group (8000 ×). c The results of TUNEL staining (200 ×). d Detection of apoptosis rate by TUNEL assay. e Detection of the Bax and Bcl-2 mRNA expression by RT-qPCR. f , g Detection of the Bax and Bcl-2 protein expression by western blot analysis. *P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

Electron microscopic observation observed that the shape of the bone cells in the normal group was consistent with the lacunae, and there was a small gap between the cell and the lacunae wall. The organelles were abundant, the cells in the lacunae were normal, the nucleus was egg-shaped, the nuclear membrane was intact, the chromatin did not agglutinate, and the cytoplasmic pseudo-foot stretched to the peripheral bone small tube and was connected with the adjacent bone cells. Osteoblasts were located on the surface of the bone trabecula, the sample was long, and there were many organelles. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, a large number of lipid deposits were found in the cytoplasm of osteoblasts, the gap between capsule and lacunae well was further widened, edema bright bands appeared between the nuclear membrane and cytoplasm, nuclear margination showed with compression, nuclear membrane was intact, mitochondria in cytoplasm was swollen, and the endoplasmic reticulum and Gore apparatus disappeared. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the morphology of rat osteoblasts was normal, chromatin aggregation was found in the nucleus of a small number of cells, no obvious lipid droplets were found in the cytoplasm, and the nuclear membrane was intact (Fig. 5b).

The results of TUNEL staining demonstrated that compared to the normal group, the apoptosis rate of osteocytes in the ONFH group was raised (P <0,05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the apoptosis rate of osteocytes abated in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (both P <0,05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the apoptosis rate of osteocytes enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (P <0.05) (Fig. 5c, d).

Western blot analysis and RT-qPCR reported that the Bcl-2 expression reduced and Bax expression raised in the ONFH group compared to the normal group (both P <0,05). By comparison with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, Bcl-2 expression ascended and Bax expression descended in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). In contrast with the agomir-miR-410 + OE-NC group, the Bcl-2 expression declined and Bax expression appended in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (both P <0.05) (Fig. 5e–g).

Overexpression of miR-410 and Low Expression of Wnt-11 Increase the Number of Osteoblasts and Decrease the Number of Osteoclasts

TRAP staining revealed that in the normal group, the morphology of osteoclasts with positive TRAP staining was different, most of them were shuttle or fusiform, few large osteoclasts were polygons, and most of them were distributed around the bone cerebellum. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, TRAP-positive cells were ascended, the morphology of cells was diverse in large polygons and polykaryotes, bone resorption was found in the bone trabeculae adjacent to osteoclasts, and typical resorption lacunae were formed. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of cells positive for TRAP staining was reduced, the cells were in a long strip shape and the morphology was more regular, the polygonous polynuclear osteoclasts were rare, and the bone structure of adjacent bone trabeculae was relatively complete (Fig. 6a).

Overexpression of miR-410 and low expression of Wnt-11 increase the number of osteoblasts and decrease the number of osteoclasts. a Results of TRAP staining in osteoclasts of rats (200 ×). b Count of positive cells in TRAP staining. c Results of ALP staining in osteoblasts of rats in each group (200 ×). d Count of positive cells determined by ALP staining. *P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

ALP staining presented that in the normal group, in osteoblasts, which were positive for ALP staining, the morphology was small and round. The cells were distributed in aggregation, most of which were located in the bone trabecular space of bone marrow cavity and on the surface of some bone trabeculae. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, the number of osteoblasts positive for ALP staining was dispersedly distributed in the trabecular space of the bone marrow cavity. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of osteoblast-positive cells enhanced, and they were distributed in the trabecular space of the bone marrow cavity and the surface of the part of the bone trabecular (Fig. 6c).

By comparison with the normal group, the number of osteoblasts per unit area was suppressed and the number of osteoclasts was heightened in the ONFH group (both P <0,05). In relation to the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the number of osteoblasts per unit area was heightened and the number of osteoclasts was declined in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). In contrast to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of osteoblasts per unit area was declined and the number of osteoclasts was raised in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (both P <0.05) (Fig. 6b, d).

Highly Expressed miR-410 and Lowly Expressed Wnt-11 Elevate the Expression of Osteocalcin (OCN), ALP, BGLAP, and Collα1, as well as Abate C- and N-terminal Telopeptides of Type I collagen (NTX-1, CTX-1), ACP5, CTSK, and MMP9 expression in ONFH Rats

The results of ELISA revealed that in relation to the normal group, the level of osteogenic function index ALP and OCN degraded while the levels of osteoclast function index NTX-1 and CTX-1 heightened in the ONFH group (all P <0,05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, ALP and OCN ascended and NTX-1 and CTX-1 descended in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). By comparison with the agomir-miR-410 + OE-NC group, ALP and OCN dropped and NTX-1 and CTX-1 appended in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (all P <0.05) (Fig. 7a).

Highly expressed miR-410 and lowly expressed Wnt-11 elevate the expression of OCN, ALP, BGLAP, and Collα1 as well as abate NTX-1, CTX-1, ACP5, CTSK, and MMP9 expression in ONFH rats. a Detection of osteogenesis and osteoclast function indices in the serum of rats in each group by ELISA. b Detection of osteoblast- and osteoclast-related genes by RT-qPCR. c , d Detection of osteoblast- and osteoclast-related genes protein expression by western blot analysis. *P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

The results of western blot analysis and RT-qPCR revealed that in relation to the normal group, the expression of osteoblast-related factors ALP, BGLAP, and Collα1 degraded, and osteoclast-related factors ACP5, CTSK, and MMP9 expression ascended (all P <0,05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the expression of ALP, BGLAP, and Collα1 elevated, and ACP5, CTSK, and MMP9 expression abated in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). By comparison with the agomir-miR-410 + OE-NC group, the expression of ALP, BGLAP, and Collα1 depressed, and ACP5, CTSK, and MMP9 expression heightened in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (all P <0.05) (Fig. 7b–d).

Elevated Wnt-11 and Decreased miR-410 are Found in ONFH Tissues of Rats as well as Wnt-11 is the Target Gene of miR-410

The targeting relationship between miR-410 and Wnt-11 gene was analyzed by an online analysis software. It was displayed that a specific binding region existed between Wnt-11 gene sequence and miR-410 sequence, implying that Wnt-11 was the target gene of miR-410 (Fig. 8a). Luciferase activity assay was utilized to verify this relationship (Fig. 8b). The results presented that compared to the NC group, the luciferase activity depressed in the miR-410 mimics group (P <0.05), but there was no significant difference in the luciferase activity of MUT 3′UTR (P> 0.05), indicating that miR-410 could specifically bind to Wnt-11.

Increased Wnt-11 and decreased miR-410 are found in ONFH tissues as well as Wnt-11 is the target gene of miR-410. a Prediction of binding sites of miR-410 on Wnt-11 3′UTR. b Luciferase activity detection for verifying the relationship between miR-410 and Wnt-11. c Detection of miR-410 and Wnt-11 expression by RT-qPCR. d , e Wnt-11 protein expression determined by western blot analysis. f Expression of Wnt-11 in femoral head of rats in each group detected by immunohistochemistry (200 ×). g Comparison of the positive rate of Wnt-11 protein expression in each group. *P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

The results of western blot analysis and RT-qPCR revealed that in relation to the normal group, miR-410 expression declined and Wnt-11 expression raised in the ONFH group (both P <0,05). By comparison with the agomir-NC group, miR-410 raised and Wnt-11 reduced in the agomir-miR-410 group (both P <0,05). In contrast with the siRNA-NC group, Wnt-11 declined in the Wnt-11-siRNA group (P <0,05). Wnt-11 enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group relative to that in the agomir-miR-410 + OE-NC group (P <0.05) (Fig. 8c–e).

>Wnt-11 expression was verified by immunohistochemistry. Wnt-11 protein was mainly expressed in the cytoplasm, and the positive expression was mainly brownish yellow or brown. Compared to the normal group, the positive rate of Wnt-11 protein expression in the ONFH group was raised (P <0,05). By comparison with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the positive rate of the Wnt-11 protein expression descended in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (both P <0,05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the positive rate of Wnt-11 protein expression enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (P <0.05) (Fig. 8f, g).

Discussion

ONFH, a kind of bone destruction disease, is caused by blood supply failure and coagulation and fibrinolysis system disorder and finally causes the femoral head to collapse [19]. A previous study has discussed miRNA expression in bone marrow mesenchymal stem cells induced by hormone in mice with ONFH [20]. Also, a recent study has provided a proof that the expression profile of miRNA of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in osteogenesis related to steroid-induced ONFH [21]. Furthermore, it was revealed the Li-nHA/GM/rhEPO stents can elevate both Wnt and HIF-1/VEGF pathways and promote osteogenesis and angiogenesis, which is beneficial to the repair of ONFH induced by glucocorticoids [22]. Based on these facts, the study aimed to explore the effects of miR-410 in the prevention of ONFH by targeting Wnt-11.

Our study has provided substantial evidence in relation to the notion that miR-410, ALP, BGLAP, and Collα1 degraded and Wnt-11, ACP5, CTSK, and MMP9 enhanced in ONFH tissues. A recent study has promoted that the expression of miR-410 in osteosarcoma is declined, and the anti-tumor effect is shown [23]. Another study has presented miR-410 expression was reduced in human estrogen receptor-positive tissues of breast cancer [24]. It is reported that secreted factor Wnt-11 expression is ascended in several types of cancer, containing colorectal cancer, where it advances the migration and invasion of cancer cells [25]. Similarly, a previous study has proved that Wnt-11 expression is heightened in hormone-independent prostate cancer [26]. ALP is a useful index for the state diagnosis and clinical prognosis of the disease [27]. OCN (bone gamma-carboxyglutamate protein; BGLAP) is a widely conserved molecule related to mineralization of bone matrix [28]. ACP5 is necessary for osteoclast differentiation and bone resorption, and it promotes cell movement by regulating adhesion kinase phosphorylation [29]. CTSK is a critical protease in charge of osteopontin, degrading type I collagen and other bone matrix proteins [30]. MMPs can degrade and modify most of the components of extracellular matrix and basement membrane and push forward an immense influence on cancer invasion and metastasis [31]. Also, our study revealed that Wnt-11 is the target gene of miR-410. Similarly, Zhang et al. found that miR-410 targeted the inferred binding site in the Wnt3a 3′-UTR to modulate the Wnt signaling pathway [32].

In addition, it was revealed that upregulated miR-410 and downregulated Wnt-11 increased BMD and BV/TV of ONFH rats. It has been suggested previously that a decrease of spinal BMD and an increase of urinary DPD/Cr ratio in non-traumatic ONFH patients [33]. Another study has verified that BMD of the femoral head and lumbar vertebrae in the ONFH group were degraded relative to that in the control group [34]. Additionally, imaging analysis revealed muscone can restore BMD and BV/TV ratio of the necrotic femoral head, while histologic examination further confirmed the protective effect of muscone on alcohol-induced ONFH [35]. A result emerged from our data that highly expressed miR-410 and lowly expressed Wnt-11 restrained apoptosis of osteocytes. A study has demonstrated that silencing miR-410 can induce cell proliferation and reduce the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells induced by oxidized low-density lipoprotein [36]. It is reported that the descended miR-410 expression and ascended SOCS3 expression could reduce the expression of anti-apoptosis factor Bcl-2 and promoted the apoptosis of cells [37]. In addition, in androgen deficient LNCaP cells, the downregulation of Wnt-11 can prevent neuroendocrine-like differentiation and lead to apoptosis of prostate cancer cells [26]. The study also showed that the downregulation of Wnt-11 and upregulation of miR-410 enhanced ALP, BGLAP, and Collα1 expression and reduced ACP5, CTSK, and MMP9 expression. A study has indicated that Wnt-11 expression heightened in cervical cancer cells may result in activation and phosphorylation of JNK-1 by activating Wnt/Jnk pathway and boosts the proliferation and migration/invasion of tumor cells [15]. It has been suggested that Wnt-11 gene silencing in colorectal cancer cell lines reduced the invasive ability of cells [25]. Furthermore, the overexpression of miR-410 can restrain the invasion, migration, proliferation, and epithelial mesenchymal transformation of osteosarcoma cells via directly targeting TRIM44 [23]. Furthermore, a previous study stated that upregulated miR-410 inhibited the growth of cholangiocarcinoma in a xenograft mouse model by inducing apoptosis [38].

Conclusion

In summary, our investigation revealed that miR-410 was lowly expressed and Wnt-11 was highly expressed in ONFH, and upregulating miR-410 or downregulating Wnt-11 increased osteoblasts and reduced osteoclasts to alleviate ONFH. However, clinical researches might be further carried out to detect the efficacy of miR-410 and Wnt-11 for the treatment of ONFH.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Not applicable

Change history

Abkürzungen

ALP:

Alkaline phosphatase

ANOVA:

Analysis of variance

BMD:

Bone mineral density

EDTA:

Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA:

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

GAPDH:

Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase

GE:

General Electric

HE:

Hematoxylin-eosin

LSD-t:

Least significant difference t test

miR-410:

MicroRNA-410

miRNAs:

MicroRNAs

NC:

Negativkontrolle

OD:

Optische Dichte

ONFH:

Osteonecrosis of femoral head

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

ROI:

Regions of interest

RT-qPCR:

Reverse Transkription quantitative Polymerase-Kettenreaktion

SD:

Sprague-Dawley

SDS:

Natriumdodecylsulfat

THR:

Total hip replacement

TRAP:

Tartrate resistant acid phosphatase

TUNEL:

TdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling