Zielgerichtete Regulation von miR-410/Wnt-11 steuert Knochenbildung und hemmt Osteoklasten zur Behandlung von Femurkopfnekrose

Zusammenfassung

Hintergrund

Über die funktionelle Rolle von microRNA-410 (miR-410) bei Femurkopfnekrose (ONFH) ist wenig bekannt. Ziel der vorliegenden Studie war es, die Regulation von Wnt-11 durch miR-410 zu untersuchen, um den osteogenen und osteoklastischen Mechanismus zur Prävention von ONFH zu modulieren.

Methoden

Es wurden 15 ONFH-Proben und 15 normale Proben gesammelt. Pathologische Veränderungen des Femurkopfs, Osteoblasten und Osteoklasten in den klinischen Proben wurden beobachtet. Das Rattenmodell der ONFH wurde mit agomir-miR-410, Wnt-11-siRNA oder überexprimiertem Wnt-11 (oe-Wnt-11) injiziert. MiR-410, Wnt-11, osteoblastenbezogene Faktoren (alkalische Phosphatase ALP, Bone Gamma-Carboxyglutamat-Protein BGLAP, Collα1) sowie osteoklastenbezogene Faktoren (saure Phosphatase 5 ACP5, Cathepsin K CTSK, MMP9) und Bcl-2/Bax-Expression wurden mittels RT-qPCR und Western Blot analysiert. Osteogene Funktionsindizes (ALP, OCN) und osteoklastische Funktionsindizes (NTX-1, CTX-1) im Serum wurden per ELISA bestimmt.

Ergebnisse

In ONFH-Geweben klinischer Proben waren miR-410, ALP, BGLAP und Collα1 erniedrigt, während Wnt-11, ACP5, CTSK und MMP9 erhöht waren. Hochregulierung von miR-410 und Downregulierung von Wnt-11 steigerten die Knochenmineraldichte (BMD) und BV/TV bei Ratten, erhöhten die BMD von Femurschaft, Femurkopf und Wirbelsäule sowie die Serum-Calcium- und Phosphatspiegel, hemmten die Apoptose von Osteozyten, steigerten OCN, ALP, BGLAP und Collα1-Expression und senkten ACP5, CTSK, NTX-1, CTX-1 und MMP9-Expression.

Schlussfolgerung

Die Studie legt nahe, dass die Hochregulierung von miR-410 oder die Downregulierung von Wnt-11 Osteoblasten vermehrt und Osteoklasten reduziert, um ONFH zu lindern. Damit könnte miR-410 ein potenzielles therapeutisches Target für die ONFH-Behandlung darstellen.

Einleitung

Femurkopfnekrose (ONFH) ist eine der häufigsten Erkrankungen des Hüftgelenks, führt zu starken Schmerzen oder Gelenksteifigkeit und betrifft 주로 mittelalte Menschen [1]. Die Therapie der adulten ONFH, von der in China 8,12 Millionen Patienten betroffen sind, bleibt für Chirurgen eine Herausforderung [2]. Risikofaktoren sind Hyperlipidämie, Autoimmunerkrankungen, Gerinnungsstörungen, Alkoholismus und Hyperkortisonismus [3]. Chirurgische Optionen umfassen Kernentlastung mit oder ohne adjuvante Therapie (z. B. autologes Knochenmark), während Totalendoprothese (THR) für ältere Patienten oder fortgeschrittene Nekrosen vorbehalten ist, die nicht durch Gelenkerhalt behandelt werden können [4]. Die Prognose ist jedoch oft unbefriedigend, da viele Patienten letztlich eine THR benötigen [5]. Daher besteht dringender Bedarf an präzisen therapeutischen Targets für die ONFH-Behandlung.

MicroRNAs (miRNAs) sind wesentliche Regulatoren zellulärer Funktionen und Genexpression, die die endotheliale Homöostase stark beeinflussen und neue Therapieansätze eröffnen [6]. miR-410 ist in verschiedenen menschlichen Krebserkrankungen abnormal exprimiert und wirkt als Tumorsuppressor bei Endometrium-, Lungenkrebs, Myelom und Brustkrebs [7-10]. Eine neuroprotektive Wirkung von miR-410 in einem Parkinson-Zellmodell (6-Hydroxydopamin-induziert) über den PTEN/AKT/mTOR-Signalweg wurde beschrieben [11]. miR-410 moduliert maligne Verhaltensweisen bei akuter lymphoblastischer Leukämie im Kindesalter über FKBP5 und AKT-Signalwege [12]. Ein hemmender Effekt von miR-410 auf den Angiotensin-II-Typ-1-Rezeptor in Pankreaskarzinom wurde nachgewiesen [13]. Wnt-Proteine sind cysteinreiche sekretierte Lipoglykoproteine mit entscheidender Rolle in Entwicklung und Krankheit [14]. Wnt-11 gehört zum Wnt-Signalweg und ist ein positiver Regulator mit zentraler Rolle in der Karzinogenese [15]. Klinische Signifikanz der Expression von Plattenepithelkarzinom-Antigen und Wnt11 im Zervixkarzinom wurde berichtet [16]. TGF-β1 und Wnt11 synergisieren über Rho-Kinase-Aktin-MRTF-A-Signaling zur sm-α-Aktin-Expression in glatter Muskulatur [17]. Basierend auf dieser Literatur untersuchten wir die Rolle von miR-410 bei der Regulation von Wnt-11 zur ONFH-Prävention mit der Hypothese, dass miR-410 über Wnt-11 die osteogenen und osteoklastischen Mechanismen moduliert.

Materialien und Methoden

Ethikstatement

Die Studie wurde vom Institutional Review Board des Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, genehmigt und folgte der Deklaration von Helsinki. Alle Teilnehmer gaben schriftliche Einwilligung. Tierexperimente entsprachen den NIH-Richtlinien und wurden vom Ethikkomitee des Beijing Shijitan Hospital genehmigt.

Studienprobanden

30 Patienten der Orthopädie des Beijing Shijitan Hospital (Januar 2017 – September 2018) wurden eingeschlossen. 15 ONFH-Patienten (THR-Operation, Medianalter 50,6 ± 4,3 Jahre, BMI 57,0 ± 5,6 kg, 7 m/8 w) und 15 Patienten mit Femurhalsfraktur (THR, Medianalter 59,6 ± 3,3 Jahre, BMI 50,0 ± 5,6 kg, 9 m/6 w) dienten als Kontrollgruppe. Keine signifikanten Unterschiede in Geschlecht, Alter, Gewicht (P > 0,05). Gewebe aus dem subchondralen nekrotischen Bereich wurden entlang der Femurkopf-Längsachse entnommen und bei −80 °C gelagert. Jede Gruppe wurde pathologisch und molekularbiologisch untersucht.

Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbung

Proben wurden in 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit 10 % EDTA dezalkalisiert (wöchentlicher Lösungswechsel). Nach vollständiger Dezalkalisierung Paraffin-Einbettung, 4 µm Schnitte. Entparaffinierung: Xylol I/II (je 10 min), abgestufte Alkohole (absolut I/II, 95 %, 80 %, 70 %, je 2 min). Hämatoxylin 3 min, Differenzierung in 1 % Salzsäure-Alkohol 2 min. Wiederholte Alkoholschritte (50 %, 70 %, 80 %, je 2 min), Eosin 5 s. Dehydrierung: 95 % Alkohol, absolut I/II (je 3 min), Xylol I/II (je 5 min). Eindecken mit neutralem Gummi, Mikroskopie.

Alkalische Phosphatase (ALP) Färbung

Ein Schnitt pro Probe, 60 °C 60 min. Entparaffinierung: Xylol I/II (je 15 min), abgestufte Ethanolreihen (absolut I/II, 95 %, 90 %, 80 %, 75 %, je 5 min), dreimal bidestilliertes Wasser (je 2 min). Substratlösung (ALP-Färbekit, Nanjing JianCheng) aufgetragen, 37 °C 15 min im Dunkeln. Überschüssige Lösung entfernt, Chromogen A 5 min, 30 s Wasser. Chromogen B 30 s, Gegenfärbung 30 s. Fotografie unter 200× Mikroskop, Osteoblastenzahl via Image-Pro Plus 6.0.

Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) Färbung

Ein Schnitt pro Probe, 60 °C 60 min. Entparaffinierung wie oben. Fixierung 30 s. Färberack in Dunkelbox mit frischer TRAP-Lösung (Sigma), 37 °C Wasserbad 1 h. Gegenfärbung Hämatoxylin 2 min, Trocknung. Ohne Eindecken direkt mikroskopieren (TRAP-Färbung verblasst). 200× Mikroskop, Osteoklastenzahl via Image-Pro Plus 6.0.

Immunhistochemische Färbung

Nach Dezalkalisierung Paraffineinbettung, 4 µm Schnitte. Entparaffinierung (Xylol), Dehydrierung (abgestufter Alkohol), 3 % H₂O₂ (Sigma-Aldrich) 7 °C 30 min, Antigenretrieval: 0,01 M Zitronensäurepuffer 95 °C 20 min. Blockierung: normales Schafserum 10 min. Primärantikörper Wnt-11 (1:100, Invitrogen) 4 °C über Nacht. Sekundärantikörper (PV-6000, ZSGB-Bio) 20 min. Streptavidin-Peroxidase (S-A/HRP, Beijing ComWin) 2 min. Entwicklung: DAB (Sigma-Aldrich), Gegenfärbung Hämatoxylin (Shanghai Bogoo), Eindecken. PBS statt Primärantikörper als Negativkontrolle. Lichtmikroskopie: positive Zellen braun im Zytoplasma; stark positiv = dunkelbraun, schwach positiv = hellbraun, negativ = keine Färbung. 5 Hochleistungsfelder (400×) pro Schnitt, 100 Zellen/Feld. Mittelwert pro Schnitt. Bewertung: negativ (−) <5 % positive Zellen; schwach positiv (+) 5–24 %; positiv (++) 25–50 %; stark positiv (+++) >50 %. Doppelblinde Auswertung durch zwei unabhängige Beobachter.

RT-qPCR

Gesamt-RNA aus Gewebeproben mittels Trizol-Kit (Invitrogen). Konzentration/Reinheit bestimmt. Primer von Takara Bio (Otsu, Japan) (Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Reverse Transkription: PrimeScript RT Kit (Takara, Dalian). Fluoreszenz-qPCR: SYBR Premix Ex Taq II (Takara, Dalian) auf ABI PRISM 7300 (Applied Biosystems). U6 als Referenz für miR-410; GAPDH für Wnt-11, ALP, BGLAP, Collα1, ACP5, CTSK, MMP9, Bcl-2, Bax. Relative Expressionslevel via 2^−ΔΔCt-Methode [18].

Western Blot

Gesamtprotein aus Femurkopfgewebe. Proteinkonzentration bestimmt, Probenbeladung durch bidestilliertes Wasser angeglichen. 10 % SDS-Trenngel und Spacergel. Nach Eisbad und Zentrifugation Elektrophorese mit gleicher Probenmenge, Transfer auf Nitrozellulosemembran. Blockierung: 5 % Magermilchpulver 4 °C über Nacht. Primärantikörper: Wnt-11 (1:150, Santa Cruz), ALP (1:100, Sigma), BGLAP, Collα1, MMP9 (1:1000), ACP5 (1:100), CTSK (1:500, Abcam), Bcl-2, Bax (1:500, Proteintech) über Nacht. Sekundärantikörper IgG-HRP (1:1000, Wuhan Boster) 1 h. ECL-Lösung (Pierce) 1 min. Dokumentation. GAPDH als Internkontrolle. Bildanalyse mit ImageJ2x.

Etablierung des Ratten-ONFH-Modells

90 männliche Sprague-Dawley-Ratten (300–350 g, Shanghai SLAC). Umgebung: 18–25 °C, 45–70 % Luftfeuchtigkeit, Einzelnaufzucht, geräuscharm. 1 Woche Adaptation. Traumatisches ONFH-Modell: Narkose (intraperitoneal), Haarentfernung, Hautdesinfektion. Hautschnitt, Gewebetrennung, Rundligaturdurchtrennung nach Femurkopfexposition. Femurhals-Periostabschabung, Zerstörung der Femurkopf-Blutversorgung. Schichtweiser Verschluss von Gelenkkapsel, Muskel, Haut, erneute Desinfektion.

Tiergruppierung

70 erfolgreich modellierte Ratten in 7 Gruppen (je 10 Tiere): ONFH-Gruppe; agomir-NC (0,5 ml miR-410-Agonist-NC, 200 nM, Guangzhou RiboBio, 1 Woche post Modellierung); agomir-miR-410 (0,5 ml miR-410-Agonist, 200 nM); siRNA-NC (0,4 ml NC Wnt-11-silencing-Vektor, 1×10⁹ PFU, Shanghai GenePharma); Wnt-11-siRNA (0,4 ml Wnt-11-silencing-Vektor, 1×10⁹ PFU); agomir-miR-410 + OE-NC (0,5 ml miR-410-Agonist + 0,4 ml NC Wnt-11-Überexpressionsvektor, 1×10⁹ PFU); agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 (0,5 ml miR-410-Agonist + 0,4 ml Wnt-11-Überexpressionsvektor, 1×10⁹ PFU). Zusätzlich Normalgruppe (nur Kochsalzlösung i.p., 10 Ratten). Nach 4 Wochen ONFH: Micro-CT, Osteometrie, Röntgen, Knochendichtemessung, Serum-Ca/P-Bestimmung.

Micro-CT und Osteometrie

Rechter Femurkopf im Micro-CT (GE Healthcare), Auflösung 27 µm³, 450 mA, 80 kV, 88 min Scanzeit. Detaillierte Mikrostrukturanalyse. Nach Kalibrierung: 3 zufällige quaderförmige ROIs (0,5×0,5×0,5 cm³) pro Gruppe, Rekonstruktion und Analyse mit GE Microview Software. Parameter: BMD, BV/TV.

Röntgen, BMD, Serum-Ca/P

4 Wochen post-OP: 10 % Chloralhydrat i.p. Narkose, Rückenlagerung, Fixierung, Röntgen. Femurkopf-Form und -Dichte beurteilt. Knochendichte von linkem Femurschaft, Femurkopf, Wirbelsäule per DXA. 12 h Nüchternheit, 5 ml Blut via Herzpunktion in Serumröhrchen. 3000 rpm 15 min Zentrifugation. Serum-Ca/P per automatischem Biochemieanalysator.

Elektronenmikroskopie

Knochengewebe: 3,5 % Glutaraldehyd, Dezalkalisierung (5 % HCl, 1 % Osmiumsäure), Dehydrierung (Acetongradient), Doppelfärbung (Uranacetat, Zitronensäure), Einbettung Epon-61. Semidünnschnitte, Ultradünnschnitte, Transmissionselektronenmikroskopie.

TUNEL-Assay

Paraffinschnitte: Entparaffinierung, Dehydrierung. Pepsin (0,25–0,5 % HCl) 25 min. 50 µl TUNEL-Reaktionsmischung, 60 min Feuchtkammer. 50 µl Peroxidase-Antikörper, 30 min Feuchtkammer. DAB-Entwicklung, Mikroskopie. Entwicklungsstopp mit Wasser, Hämatoxylin 2 min. Dehydrierung: 95 % Ethanol I/II, absolut I/II (je 3–5 min), Xylol I/II (je 3–5 min), Eindecken neutralem Gummi. Lichtmikroskopische Auswertung.

ELISA

Nach Narkose Schenkelarterienblut, Serum nach 1 h Ruhe durch Zentrifugation. ELISA-Kit (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology) nach Protokoll: 7 Standardkonzentrationen (100 µl), Blankowellen (100 µl Verdünnungspuffer), Proben (100 µl). 1 h Inkubation, Waschen. Lösung A (100 µl) 1 h. Waschen. Lösung B (100 µl) 30 min. TMB-Substrat (90 µl) 10–20 min. Stopp-Lösung (50 µl). OD-Messung (Mikroplattenreader), Konzentrationsberechnung.

Dual-Luciferase-Reportergenassay

Bindungsstellen miR-410/Wnt-11 3′UTR via TargetScan (https://www.targetscan.org). Wnt-11 3′UTR-Promotorsequenz mit miR-410-Bindungsstelle in pMIR-REPORT Luciferase-Vektor (Ambion) → Wnt-11-WT. Mutante Bindungsstelle → Wnt-11-MUT. Plasmid-Extraktionskit (Promega). Logarithmisch wachsende Zellen in 96-Well-Platten, ~70 % Konfluenz, Lipofectamine 2000 Transfektion. Wnt-11-WT/MUT + mimics NC/miR-410 mimics (GenePharma) Co-Transfektion in 293T-Zellen. 48 h post-Transfektion Lysat, Luciferase-Aktivität (BioVision Kit, Glomax 20/20 Luminometer, Promega).

Statistische Analyse

SPSS 21.0 (IBM). Messdaten: Mittelwert ± SD. Einfaktorielle ANOVA (Mehrfachvergleiche), t-Test (Zweiervergleiche), Fisher's LSD-t post-hoc nach ANOVA. P < 0,05 = signifikant.

Ergebnisse

Pathologische Veränderungen in ONFH-Geweben klinischer Proben

HE-Färbung zeigte: Kontrollgruppe – gleichmäßige Trabekuladichte, intakte Struktur. ONFH-Gruppe – zahlreiche leere Knochenlakunen im Knochenmark, verminderte Knochenzellen, gestörte Trabekelkontinuität, Gewebehyperplasie um Knochenmark (Abb. 1a).

TRAP-Färbung: TRAP markiert reife Osteoklasten (amaranthfarben). ONFH-Gruppe: erhöhte TRAP-positive Osteoklastenzahl, diverse Morphologie, große multinuukleäre Zellen. Offensichtliche Knochendefekte adjacent zu Osteoklasten → Knochenresorption (Abb. 1b).

ALP-Färbung: ALP markiert differenzierte/reife Osteoblasten (braune/kaffeefarbene Granula im Zytoplasma). ONFH-Gruppe: reduzierte ALP-positive Osteoblastenzahl vs. Kontrolle (Abb. 1c).

MiR-410, ALP, BGLAP, Collα1 erniedrigt; Wnt-11, ACP5, CTSK, MMP9 erhöht in ONFH-Geweben

Western Blot und RT-qPCR: miR-410 in ONFH-Gruppe erniedrigt, Wnt-11 erhöht; Osteoblastenfaktoren (ALP, BGLAP, Collα1) erniedrigt; Osteoklastenfaktoren (ACP5, CTSK, MMP9) erhöht (alle P < 0,05) (Abb. 2a–c).

Immunhistochemie: Wnt-11 Protein vorwiegend zytoplasmatisch, braun/braungelb. ONFH-Gruppe: signifikant erhöhte Wnt-11-Protein-Positivrate vs. Kontrolle (P < 0,05) (Abb. 2d).

Hochregulierte miR-410 und downregulierte Wnt-11 steigern BMD und BV/TV bei Ratten

Micro-CT: Normalgruppe – runder Femurkopf, gleichmäßiger Hals, kontinuierliche, gleichmäßig verteilte Trabekel. ONFH-, agomir-NC-, siRNA-NC-, agomir-miR-410+OE-Wnt-11-Gruppe: progressiver Femurkopfkollaps, Resorptionsareale, verdünnter Hals, gebrochene Trabekel. agomir-miR-410-, Wnt-11-siRNA-, agomir-miR-410+OE-NC-Gruppe: intakter Femurkopf, keine Resorption, normale Trabekelstruktur (Abb. 3a).

Knochenmetrie: vs. Normalgruppe: BMD und BV/TV in ONFH-Gruppe erniedrigt (P < 0,05). vs. agomir-NC und siRNA-NC: BMD und BV/TV in agomir-miR-410- und Wnt-11-siRNA-Gruppe erhöht (P < 0,05). vs. agomir-miR-410+OE-NC: BMD und BV/TV in agomir-miR-410+OE-Wnt-11-Gruppe erniedrigt (P < 0,05) (Abb. 3b, c).

Überexpression von miR-410 und niedrige Wnt-11-Expression erhöhen BMD von Femurschaft, Femurkopf, Wirbelsäule und Serum-Ca/P

Röntgen: Normalgruppe – runder Femurkopf, gleichmäßige Dichte, intakte Struktur. ONFH-, agomir-NC-, siRNA-NC-, agomir-miR-410+OE-Wnt-11-Gruppe: verdünnter Femurkopf, Resorptionsareale. agomir-miR-410-, Wnt-11-siRNA-, agomir-miR-410+OE-NC-Gruppe: gleichmäßige, intakte Femurkopfdicke (Abb. 4a).

BMD und Serum-Ca/P: vs. Normalgruppe: BMD (Femurschaft, -kopf, Wirbelsäule) und Serum-Ca/P in ONFH-Gruppe erniedrigt (P < 0,05). vs. agomir-NC und siRNA-NC: BMD und Serum-Ca/P in agomir-miR-410- und Wnt-11-siRNA-Gruppe erhöht (P < 0,05). vs. agomir-miR-410+OE-NC: BMD und Serum-Ca/P in agomir-miR-410+OE-Wnt-11-Gruppe erniedrigt (P < 0,05) (Abb. 4b, c).

Wnt-11-Silencing und miR-410-Hochregulierung lindern pathologische Veränderungen und hemmen Osteozyten-Apoptose

HE-Färbung: Normalgruppe – ordentliche, dicht gepackte Trabekel, gefüllte Knochenlakunen, gut verbundene Kalzifizierungszone. ONFH-, agomir-NC-, siRNA-NC-, agomir-miR-410+OE-Wnt-11-Gruppe: spärliche, verdünnte, gebrochene Trabekel, gestörte Struktur, Fragmente, nekrotische Osteozyten, leere Lakunen, Granulationsgewebeproliferation. agomir-miR-410-, Wnt-11-siRNA-, agomir-miR-410+OE-NC-Gruppe: intakter Femurkopf, normale Trabekel (Abb. 5a).

Elektronenmikroskopie: Normalgruppe – Osteozytenform passend zu Lakunen, kleiner Spalt, reichhaltige Organellen, eiförmiger Kern, intakte Kernmembran, keine Chromatinagglutination, zytoplasmatische Pseudopoden zur Vernetzung. Osteoblasten auf Trabekeloberfläche, langgestreckt, viele Organellen. ONFH-, agomir-NC-, siRNA-NC-, agomir-miR-410+OE-Wnt-11-Gruppe: Lipideinlagerungen in Osteoblasten, erweiterter Zell-Lakunen-Spalt, Ödem-Bänder zwischen Kernmembran und Zytoplasma, Chromatinmargination, intakte Kernmembran, geschwollene Mitochondrien, Verlust von ER und Golgi. agomir-miR-410-, Wnt-11-siRNA-, agomir-miR-410+OE-NC-Gruppe: normale Osteoblastenmorphologie, geringe Chromatinaggregation, keine Lipidtröpfchen, intakte Kernmembran (Abb. 5b).

TUNEL: vs. Normalgruppe: Apoptoserate in ONFH-Gruppe erhöht (P < 0,05). vs. agomir-NC und siRNA-NC: Apoptoserate in agomir-miR-410- und Wnt-11-siRNA-Gruppe erniedrigt (P < 0,05). vs. agomir-miR-410+OE-NC: Apoptoserate in agomir-miR-410+OE-Wnt-11-Gruppe erhöht (P < 0,05) (Abb. 5c, d).

Western Blot/RT-qPCR: vs. Normalgruppe: Bcl-2 erniedrigt, Bax erhöht in ONFH-Gruppe (P < 0,05). vs. agomir-NC und siRNA-NC: Bcl-2 erhöht, Bax erniedrigt in agomir-miR-410- und Wnt-11-siRNA-Gruppe (P < 0,05). vs. agomir-miR-410+OE-NC: Bcl-2 erniedrigt, Bax erhöht in agomir-miR-410+OE-Wnt-11-Gruppe (P < 0,05) (Abb. 5e–g).

Überexpression von miR-410 und niedrige Wnt-11-Expression erhöhen Osteoblastenzahl und verringern Osteoklastenzahl

TRAP-Färbung: Normalgruppe – diverse Osteoklastenmorphologie (schützen-/spindelförmig, wenige große polygonale), verteilt um Knochenmark. ONFH-, agomir-NC-, siRNA-NC-, agomir-miR-410+OE-Wnt-11-Gruppe: erhöhte TRAP-positive Zellen, diverse große polygonale/polykaryotische Zellen, Knochenresorption an adjacenten Trabekeln, typische Resorptionslakunen. agomir-miR-410-, Wnt-11-siRNA-, agomir-miR-410+OE-NC-Gruppe: reduzierte TRAP-positive Zellen, langgestreckte reguläre Morphologie, seltene polykaryotische Osteoklasten, relativ intakte adjacent Trabekelstruktur (Abb. 6a).

ALP-Färbung: Normalgruppe – kleine runde ALP-positive Osteoblasten, aggregiert in Trabekelraum und auf Trabekeloberfläche. ONFH-, agomir-NC-, siRNA-NC-, agomir-miR-410+OE-Wnt-11-Gruppe: dispers verteilte ALP-positive Osteoblasten im Trabekelraum. agomir-miR-410-, Wnt-11-siRNA-, agomir-miR-410+OE-NC-Gruppe: erhöhte ALP-positive Zellen, verteilt im Trabekelraum und auf teilweiser Trabekeloberfläche (Abb. 6c).

Zellzahlen: vs. Normalgruppe: Osteoblasten/Flächeneinheit erniedrigt, Osteoklasten erhöht in ONFH-Gruppe (P < 0,05). vs. agomir-NC und siRNA-NC: Osteoblasten erhöht, Osteoklasten erniedrigt in agomir-miR-410- und Wnt-11-siRNA-Gruppe (P < 0,05). vs. agomir-miR-410+OE-NC: Osteoblasten erniedrigt, Osteoklasten erhöht in agomir-miR-410+OE-Wnt-11-Gruppe (P < 0,05) (Abb. 6b, d).

Hoch exprimierte miR-410 und niedrig exprimierte Wnt-11 steigern OCN, ALP, BGLAP, Collα1 und senken NTX-1, CTX-1, ACP5, CTSK, MMP9 in ONFH-Ratten

ELISA: vs. Normalgruppe: Osteogenese-Indizes (ALP, OCN) erniedrigt, Osteoklasten-Indizes (NTX-1, CTX-1) erhöht in ONFH-Gruppe (P < 0,05). vs. agomir-NC und siRNA-NC: ALP, OCN erhöht; NTX-1, CTX-1 erniedrigt in agomir-miR-410- und Wnt-11-siRNA-Gruppe (P < 0,05). vs. agomir-miR-410+OE-NC: ALP, OCN erniedrigt; NTX-1, CTX-1 erhöht in agomir-miR-410+OE-Wnt-11-Gruppe (P < 0,05) (Abb. 7a).

Western Blot/RT-qPCR: vs. Normalgruppe: ALP, BGLAP, Collα1 erniedrigt; ACP5, CTSK, MMP9 erhöht in ONFH-Gruppe (P < 0,05). vs. agomir-NC und siRNA-NC: ALP, BGLAP, Collα1 erhöht; ACP5, CTSK, MMP9 erniedrigt in agomir-miR-410- und Wnt-11-siRNA-Gruppe (P < 0,05). vs. agomir-miR-410+OE-NC: ALP, BGLAP, Collα1 erniedrigt; ACP5, CTSK, MMP9 erhöht in agomir-miR-410+OE-Wnt-11-Gruppe (P < 0,05) (Abb. 7b–d).

Erhöhtes Wnt-11 und erniedrigtes miR-410 in ONFH-Rattengeweben; Wnt-11 ist Target-Gen von miR-410

Bioinformatik (TargetScan): Spezifische Bindungsregion zwischen Wnt-11 und miR-410 → Wnt-11 ist Target von miR-410 (Abb. 8a). Luciferase-Assay bestätigt (Abb. 8b): vs. NC-Gruppe: Luciferase-Aktivität in miR-410-mimics-Gruppe erniedrigt (P < 0,05); keine Signifikanz bei MUT 3′UTR (P > 0,05) → spezifische Bindung.

Western Blot/RT-qPCR: vs. Normalgruppe: miR-410 erniedrigt, Wnt-11 erhöht in ONFH-Gruppe (P < 0,05). vs. agomir-NC: miR-410 erhöht, Wnt-11 erniedrigt in agomir-miR-410-Gruppe (P < 0,05). vs. siRNA-NC: Wnt-11 erniedrigt in Wnt-11-siRNA-Gruppe (P < 0,05). vs. agomir-miR-410+OE-NC: Wnt-11 erhöht in agomir-miR-410+OE-Wnt-11-Gruppe (P < 0,05) (Abb. 8c–e).

Immunhistochemie: Wnt-11 zytoplasmatisch, braun/braungelb. vs. Normalgruppe: Wnt-11-Positivrate in ONFH-Gruppe erhöht (P < 0,05). vs. agomir-NC und siRNA-NC: Wnt-11-Positivrate in agomir-miR-410- und Wnt-11-siRNA-Gruppe erniedrigt (P < 0,05). vs. agomir-miR-410+OE-NC: Wnt-11-Positivrate in agomir-miR-410+OE-Wnt-11-Gruppe erhöht (P < 0,05) (Abb. 8f, g).

Diskussion

ONFH, eine Knochenzerstörungskrankheit, resultiert aus Blutzufuhrversagen und Gerinnungs-/Fibrinolyse-Störungen, führt zum Femurkopfkollaps [19]. Frühere Studien untersuchten miRNA-Expression in Knochenmark-Mesenchymalstammzellen (hormoninduzierte ONFH, Maus) [20] und miRNA-Expressionsprofile in osteogenen Knochenmark-MSCs (steroidinduzierte ONFH) [21]. Li-nHA/GM/rhEPO-Stents aktivieren Wnt- und HIF-1/VEGF-Wege, fördern Osteogenese und Angiogenese bei glucocorticoid-induzierter ONFH [22]. Vor diesem Hintergrund untersuchten wir die Effekte von miR-410 via Wnt-11-Targeting zur ONFH-Prävention.

Unsere Studie belegt: miR-410, ALP, BGLAP, Collα1 erniedrigt; Wnt-11, ACP5, CTSK, MMP9 erhöht in ONFH-Geweben. miR-410-Expression ist im Osteosarkom erniedrigt mit antitumoröser Wirkung [23]. miR-410 reduziert in ER-positivem Brustkrebs [24]. Wnt-11-Expression erhöht in diversen Krebsarten (kolorektal: Migration/Invasion [25]; hormonunabhängiges Prostatakarzinom [26]). ALP als diagnostischer/prognostischer Index [27]. OCN (BGLAP) – konserviertes Molekül der Knochenmatrixmineralisation [28]. ACP5 essenziell für Osteoklastendifferenzierung/Resorption, fördert Zellbewegung via Adhäsionskinase-Phosphorylierung [29]. CTSK – Schlüsselerotease für Osteopontin, Typ-I-Kollagen, andere Knochenmatrixproteine [30]. MMPs degradieren/modifizieren ECM und Basalmembran, treiben Krebsinvasion/Metastasen [31]. Wnt-11 ist Target von miR-410; analog fand Zhang et al. miR-410 Targeting von Wnt3a 3′UTR zur Wnt-Signalweg-Modulation [32].

Hochregulierte miR-410 und downregulierte Wnt-11 steigerten BMD und BV/TV bei ONFH-Ratten. Frühere Arbeiten: reduzierte Wirbelsäulen-BMD und erhöhtes Harn-DPD/Cr bei nicht-traumatischer ONFH [33]; erniedrigte BMD von Femurkopf und Lendenwirbeln in ONFH vs. Kontrolle [34]; Muscone stellt BMD und BV/TV nekrotischen Femurkopfs wieder her, histologischer Schutz bei alkoholinduzierter ONFH [35]. Hoch miR-410/niedrig Wnt-11 hemmten Osteozyten-Apoptose. miR-410-Silencing induziert Proliferation und reduziert Apoptose in HUVECs (oxLDL-induziert) [36]. Erniedrigtes miR-410/erhöhtes SOCS3 reduziert Bcl-2, fördert Apoptose [37]. Wnt-11-Downregulation in androgen-defizienten LNCaP-Zellen verhindert neuroendokrine Differenzierung, induziert Apoptose [26]. Downregulation von Wnt-11 und Upregulation von miR-410 steigerten ALP, BGLAP, Collα1 und senkten ACP5, CTSK, MMP9. Wnt-11 in Zervixkarzinom aktiviert JNK-1 via Wnt/JNK, fördert Proliferation/Migration/Invasion [15]. Wnt-11-Silencing in kolorektalen Krebszelllinien reduziert Invasivität [25]. miR-410-Überexpression hemmt Invasion, Migration, Proliferation, EMT in Osteosarkomzellen via TRIM44-Targeting [23]. miR-410-Hochregulierung inhibiert Cholangiokarzinom-Wachstum in Xenograft-Mausmodell via Apoptoseinduktion [38].

Schlussfolgerung

Zusammenfassend zeigte unsere Untersuchung: miR-410 niedrig, Wnt-11 hoch exprimiert in ONFH. Hochregulierung von miR-410 oder Downregulierung von Wnt-11 vermehrt Osteoblasten, reduziert Osteoklasten und lindert ONFH. Klinische Studien zur Wirksamkeit von miR-410 und Wnt-11 bei ONFH-Behandlung sind weiterhin erforderlich.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Nicht anwendbar

Änderungshistorie

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Abkürzungen

ALP:

Alkalische Phosphatase

ANOVA:

Varianzanalyse

BMD:

Knochenmineraldichte

EDTA:

Ethylendiamintetraessigsäure

ELISA:

Enzyme-linked immunosorbent assay

GAPDH:

Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase

GE:

General Electric

HE:

Hämatoxylin-Eosin

LSD-t:

Least significant difference t-Test

miR-410:

MicroRNA-410

miRNAs:

MicroRNAs

NC:

Negativkontrolle

OD:

Optische Dichte

ONFH:

Osteonekrose des Femurkopfs

PBS:

Phosphate-buffered saline

ROI:

Regions of interest

RT-qPCR:

Reverse Transkription quantitative Polymerase-Kettenreaktion

SD:

Sprague-Dawley

SDS:

Natriumdodecylsulfat

THR:

Totalendoprothese

TRAP:

Tartrat-resistente saure Phosphatase

TUNEL:

TdT-vermittelte dUTP-Biotin-Nick-End-Markierung