Schutzwirkung von Kohlenstoffpunkten aus Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata gegen Deinagkistrodon acutus Gift-induzierte akute Nierenverletzung

Einführung

Deinagkistrodon acutus (D. acutus) , aus der Familie der Viperidae, gilt als eine der gefährlichsten Landschlangen Chinas [1]. Vergiftung durch D. Akut ist mit einer Reihe von Symptomen wie Blutungen, Thrombozytopenie und möglichen direkten Nierenschäden verbunden [2, 3]. Die akute Nierenschädigung (AKI) ist die schwerwiegendste systemische Wirkung und die häufigste Komplikation einer Vergiftung durch D. Akut die direkt zu anhaltender Nierenfunktionsstörung und hoher Morbidität führt [4, 5]. Die aktuelle topische Behandlung beinhaltet die Verwendung von vom Pferd stammendem hyperimmunem Antivenin als Gegenmittel. Seine Wirksamkeit ist jedoch bei der Neutralisierung lokaler Gewebeschäden, insbesondere beim Auftreten von AKI, begrenzt und hat mehrere unbefriedigende Wirkungen wie anaphylaktische und pyrogene Reaktionen [6]. Darüber hinaus tragen auch die relativ hohen Kosten und die geringe Stabilität von Antivenin zur unbefriedigenden Behandlung von Menschen bei, die von D gebissen wurden. Akut , insbesondere in freier Wildbahn oder in ländlichen Gebieten [7,8,9]. Daher besteht ein dringender Bedarf an wirksamen, sicheren und erschwinglichen Komplementärarzneimitteln zur Behandlung von D. Akut Gift-induzierte AKI.

Carbon Dots (CDs), eine neue Klasse von Kohlenstoff-Nanomaterialien mit einer Größe < 10 nm, wurden durch die Trennung und Reinigung von einwandigen Kohlenstoff-Nanoröhren im Jahr 2004 zufällig entdeckt [10] und haben im letzten Jahrzehnt aufgrund ihrer bemerkenswerten neuartige Eigenschaften wie merkliche Biokompatibilität, geringe Toxizität, hohe Wasserlöslichkeit und reichlich vorhandene Rohstoffe [11,12,13]. Das Aufkommen von CDs hat zur Erforschung der Entwicklung verschiedener „intelligenter“ Nanosysteme beigetragen, hauptsächlich für Bioimaging [14], Biomedizin [15], Wirkstofftransport [16] und Photokatalyse [17].

Bemerkenswert ist, dass die Entwicklung von CDs mit inhärentem Bioaktivitätspotenzial viele Strategien für die Entdeckung einer neuen Generation von Arzneimitteln zur wirksamen Kontrolle oder Behandlung einiger Krankheiten aufgrund der bemerkenswerten oben genannten Vorteile bietet. Über verschiedene Bioaktivitäten wie antibakterielle, antibakterielle, antivirale und entzündungshemmende Wirkungen [18], hämostatische [19], peroxidaseähnliche [20], krebsbekämpfende, antivirale und entzündungshemmende Wirkungen [21] wurden berichtet. Diese Effekte haben die Aufmerksamkeit von Wissenschaftlern auf sich gezogen, um zusätzliche pharmazeutische und biomedizinische Anwendungen von CDs zu untersuchen. Insbesondere die lindernden Aktivitäten von CDs, die von Schizonepetae Spica Carbonisata [22] auf D. Akut Gift-induzierte Blutungen haben eine neue Perspektive auf die Untersuchung der positiven Auswirkungen von CDs auf AKI induziert durch D. Akut Schlangenbiss, der bisher weniger verstanden wurde.

Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) Carbonisata (PCCC)-CDs werden durch direkte Pyrolyse von PCC (einer Art der traditionellen chinesischen Medizin, die seit> 1000 Jahren verwendet wird) unter Verwendung einer einstufigen Pyrolysebehandlung synthetisiert. PCCC-CDs sind hypotoxische CDs mit einem Durchmesser von 1,2 bis 4,8 nm. Es wurde berichtet, dass PCCC-CDs bemerkenswerte hämostatische Wirkungen aufweisen, was nicht nur die biomedizinische Anwendung von CDs erweitert hat, sondern auch Pionierarbeit bei der Aufklärung der hämostatischen Materialbasis von PCCC geleistet hat [23]. Bemerkenswert ist, dass PCCC, eine traditionelle chinesische Medizin, die durch Holzkohleverarbeitung hergestellt wird, erstmals in den Taiping Holy Prescriptions for Universal Relief . erwähnt wurde (978–992 AD, in China). Das Sicherheitsprofil und die zufriedenstellende therapeutische Wirksamkeit von PCCC, wie Hämostase und Entzündungshemmer, förderten seine kontinuierliche klinische Anwendung über mehr als 1000 Jahre, was in der Pharmakopöe der Volksrepublik China anerkannt wurde (PPRC, 2015). Die Untersuchung zusätzlicher zugrunde liegender Bioaktivitäten von PCCC-CDs war jedoch eine Herausforderung. Insbesondere gibt es wenig Informationen über die Hemmung von AKI, die durch D induziert wird. Akut Vergiftung.

Darüber hinaus wurde berichtet, dass eine Schlangenbissvergiftung möglicherweise die Nierenphysiologie direkt durch die nephrotoxischen Komponenten oder durch Aktivierung oder Modulation von Immun- und Entzündungsmediatoren gefährdet [24]. Diese Effekte betreffen hauptsächlich biomedizinische Parameter [25] (Serumkreatinin (SCR), Blutharnstoffstickstoff (BUN), Urin-Gesamtprotein (UTP) und Mikroalbuminurie (MALB)-Konzentration), entzündliche Zytokine (Interleukin (IL)-1β), entzündungshemmendes Zytokin (IL-10) und monozytenchemotaktisches Protein 1 (MCP-1), die Veränderung der Nierenhistologie und der Thrombozytenzahl (PLT). In der vorliegenden Studie synthetisierten wir PCCC-CDs mit einer grünen, einstufigen Pyrolyse-Methode und untersuchten zum ersten Mal ihre Schutzwirkung gegen die Entwicklung dieser Anomalien bei AKI, die durch intraperitoneale Injektion von D an Mäuse hervorgerufen wurden. Akut Gift.

Material und Methoden

Chemikalien

Das PCC-Material wurde von Beijing Qiancao Herbal Pieces Co., Ltd. (Beijing, China) bezogen und das PCCC wurde in unserem Labor hergestellt. Dialysemembranen mit einem Molekulargewicht von 1000 Da wurden von Beijing Ruida Henghui Technology Development Co., Ltd. (Beijing, China) bezogen. Das Zellzählkit (CCK)-8 wurde von Dojindo Molecular Technologies, Inc. (Kumamoto, Japan) bezogen. Das lyophilisierte Schlangengift von D. Akut wurde von der Schlangenfarm An Ren (Kreis Yujiang, Yingtan, Jiangxi, China) für experimentelle Zwecke zur Verfügung gestellt. Andere chemische Reagenzien von analytischer Qualität wurden von Sinopharm Chemical Reagents Beijing (Beijing, China) bezogen. Maus-MCP-1, IL-10 und IL-1β Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kits wurden von Cloud-Clone Crop erworben. (Wuhan, China). Alle Experimente wurden mit entionisiertem Wasser (DW) durchgeführt.

Tiere

Tiermanagement und Forschungsprotokolle wurden vom Institutionellen Ausschuss für Ethik bei Tierversuchen der Pekinger Universität für Chinesische Medizin unterstützt und genehmigt. Männliche Kunming-Mäuse (mit einem Gewicht von 30,0 ± 2,0 g) wurden von Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. mit einem Konformitätszertifikat für Labortiere gekauft und in Käfigen bei konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit an einer 12-Stunden-Lampe gehalten. Dunkelzyklus mit ad libitum Zugang zu Nahrung und Wasser.

Vorbereitung der Giftlösung

Lyophilisiertes Gift wurde in normaler Kochsalzlösung unter mildem Mischen für 20 min gelöst (Endkonzentration:5 mg/ml) und bei -20 °C gelagert, bis es gebraucht wurde.

Vorbereitung von PCCC-CDs

Das PCCC wurde unter Verwendung eines einstufigen Pyrolyseverfahrens mit PCC als einziger Vorstufe nach früheren Methoden hergestellt [23]. Kurz gesagt, die PCC-Proben wurden in separate Porzellantiegel gegeben und 1 Stunde lang bei 350 °C in einem vorgeheizten Ofen erhitzt. Nach dem Abkühlen auf 30 °C wurden die erhaltenen homogenen schwarzen Rückstände zu feinem Pulver gemahlen und zweimal in Wasser bei 100 °C jeweils 1 h lang gekocht. Dann wurde die Lösung durch Vorfiltrieren der Suspension durch eine 0,22 µm Celluloseacetat-Membran gesammelt. Nicht-kohlenstoffhaltige Verunreinigungen wurden durch 72 h Dialyse gegen DW (beibehaltenes Molekulargewicht:1000   Da) entfernt. Die PCCC-CDs-Lösung wurde konzentriert und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert. Das Flussdiagramm in Abb. 1 veranschaulicht den obigen Prozess.

Illustration des Bildungsprozesses von Kohlenstoffpunkten (CDs) aus Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) durch Pyrolysebehandlung

Charakterisierung von PCCC-CDs

Die Morphologie der CDs wurde unter Verwendung eines Transmissionselektronenmikroskops (TEM, JEM-2100 Electron, JEOL, Japan) mit einer Elektronenenergie von 200  kV untersucht. Strukturelle Details wurden mit hochauflösendem TEM (HRTEM) unter Verwendung eines Tecnai G2 20 Elektronenmikroskops (FEI, USA) untersucht. Das Ultraviolett-Vis-Spektrum (UV-Vis) und die Fluoreszenzeigenschaften wurden aufgezeichnet und unter Verwendung von UV-Vis- (CECIL, Cambridge, UK) bzw. Fluoreszenz-Spektroskopie (F-4500, Tokio, Japan) gemessen. Fourier-Transformations-Infrarot-(FTIR)-Spektroskopie wurde verwendet, um die Informationen der funktionellen Oberflächengruppen in einem Spektralfenster zwischen 400 und 4000 cm ^− 1 . zu analysieren .

Zytotoxizitätstests

Humane L02-Hepatozyten und die humanen embryonalen Nieren-293 T-Zelllinien wurden verwendet, um die potentielle Zytotoxizität von PCCC-CDs unter Verwendung eines CCK-8-Assays zu bestimmen. L02-Zellen wurden in Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) kultiviert, während 293 T-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glucosegehalt, das 10 % FBS enthielt, gezüchtet wurden. Beide Zelllinien wurden bei 37°C in angefeuchtetem 5% CO₂ . inkubiert .

L02- und 293 T-Zellen wurden mit einer Dichte von 2,0 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen/Well in 96-Well-Platten und kultiviert bei 37°C in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂ für 24 h. Anschließend wurden beide Zelltypen mit 100 µl unterschiedlicher Konzentrationen (5000, 2500, 1250, 625, 156, 78, 39 und 19,5 µg/mL) der PCCC-CD-Lösungen in serumfreiem Medium behandelt und weitere 24 Minuten inkubiert h. Anschließend wurde das Medium mit den PCCC-CDs entfernt und die Zellen wurden zweimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen. Die Zytotoxizität wurde durch Ablesen der Platte bei 450 nm unmittelbar nach Zugabe von 10 μL des CCK-8-Reagenzes und Inkubation für 4 h bei 37 °C bestimmt.

D. Akut Gift-induzierte AKI und Behandlung

D. Akut Gift-induziertes AKI-Modell

Das AKI-Mausmodell wurde durch intraperitoneale Injektion von D an Mäuse etabliert. Akut Schlangengift. Die Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in die folgenden fünf Gruppen von jeweils 36 Tieren eingeteilt:Kontrolle; Modell; und Hoch-, Mittel- und Niedrigdosis-PCCC-CDs-Behandlungsgruppen. Die Modellgruppe erhielt D. Akut Gift bei 1 mg/kg (0,15 mg/ml, 0,2 ml) Körpergewicht und 0,5 ml normaler Kochsalzlösung intraperitoneal, während die PCCC-CD-Behandlungsgruppen mit hoher, mittlerer und niedriger Dosis ein äquivalentes Volumen an Schlangengift und PCCC erhielten -CD-Extrakt in Dosen von 8,0, 4,0 bzw. 2,0 mg/kg. Als Kontrollen dienten Mäuse, denen nur normale Kochsalzlösung (NS) intraperitoneal injiziert wurde. Sechs Mäuse aus jeder Gruppe wurden 1, 3 und 12 Stunden nach der Verabreichung von NS getötet, D. Akut Gift und PCCC-CDs nach dem oben beschriebenen Schema, während an Tag 1, 2 und 5 getötete Mäuse kontinuierlich mit NS verabreicht wurden, D. Akut Schlangengift und PCCC-CDs zweimal täglich.

Analyse von UTP- und MALB-Konzentrationen

Nach Verabreichung der jeweiligen Behandlungen wurden die Tiere der Kontroll-, Modell- und PCCC-CDs- (4,0 mg/kg) behandelten Gruppen sofort in geeignete Stoffwechselkäfige zur Urinsammlung gesetzt, bis die Inkubationszeit endete (24 h). Die Konzentrationen von UTP und MALB wurden mit einem automatischen biochemischen Analysegerät analysiert.

Analyse von Biomarkern der Nierenfunktion

Die Nierenfunktion wurde durch Messung der SCR- und BUN-Spiegel bewertet. Bevor die Mäuse eingeschläfert wurden, wurden Blutproben aus dem retroorbitalen Plexus entnommen und dann für mindestens 4 h bei 4 °C in Plastikröhrchen gegeben. Serum wurde durch Zentrifugation bei 750 × g . gewonnen für 15 Minuten und die BUN- und SCR-Werte wurden mit einem automatischen biochemischen Analysegerät analysiert.

Nachweis von entzündlichen Zytokinspiegeln

Die rechten Nieren der Mäuse wurden entnommen, schnell in Trockeneis eingefroren und bei –80 °C bis zur Verwendung in den folgenden Verfahren gelagert. Gewebeproben (100 mg) aus den verschiedenen Gruppen wurden mit PBS auf Eis homogenisiert und dann bei 750 × g . zentrifugiert für 15min. Die Überstände wurden gesammelt, um die Spiegel von MCP-1, IL-10 und IL-1β unter Verwendung der entsprechenden ELISA-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen.

Nierenhistologie

Die Gewebeproben der linken Mausniere wurden in 10% neutral gepuffertem Formalin bei 4 °C für mehr als 48 Stunden fixiert, dehydriert, in Paraffin eingebettet, in Schnitte geschnitten und dann mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Morphologische Veränderungen wurden zwischen den Kontroll-, Modell- und den mit PCCC-CDs behandelten Gruppen verglichen.

Thrombozytopenische Aktivität

Die PLT wurde mit Blut durchgeführt, das den Mäusen aus dem retroorbitalen Plexus entnommen und unter Verwendung eines automatisierten Hämatologie-Analysegeräts (XS-800i, Sysmex Corporation Co., Ltd., Kobe, Japan) nachgewiesen wurde.

Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit dem Statistical Package for the Social Sciences (SPSS, Version 13.0) durchgeführt. Die normalverteilten Daten und homogenen Varianzen werden als Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Für Mehrfachvergleiche wurde eine einseitige Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von dem Test der geringsten signifikanten Differenz (LSD) verwendet. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Charakterisierung von PCCC-CDs

TEM wurde verwendet, um die Morphologie und Größenverteilung von PCCC-CDs direkt zu beobachten (Abb. 2a, c und d). Die hergestellten CDs waren kugelförmig und einheitlich in der Größe, wobei die meisten bei 2,84 ± 0,89 nm ohne deutliche Aggregationen lagen. Das HRTEM-Bild zeigte Gitterstreifen (0,24 nm) der CDs, die graphitischem Kohlenstoff entsprachen, wie in Abb. 2b gezeigt.

a und c Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Bilder von Phellodendri Cortex Carbonisatus Carbon Dots (PCCC-CDs), b Hochauflösendes TEM-Bild von PCCC-CDs, d Größenverteilung von PCCC-CDs

Wie in Fig. 3a dargestellt, zeigten die CDs eine deutlich blaue Fluoreszenz mit einem Peakmaximum bei 445 nm nach 370 nm Anregung. Dementsprechend zeigten die im UV-Vis-Spektrum angezeigten optischen Informationen auf den PCCC-CDs einen starken Absorptionspeak bei 265 nm, entsprechend dem π-π*-Übergang konjugierter organischer Moleküle auf den CDs-Oberflächen (Abb. 3b).

Optische Eigenschaften von Phellodendri Cortex Carbonisatus Carbon Dots (PCCC-CDs). a Fluoreszenzspektren, b ultraviolett-sichtbare Spektren (UV-Vis) und c Fourier-Transformations-Infrarotspektrum (FTIR)

Darüber hinaus wurden die funktionellen Gruppen der formulierten CDs anhand des FTIR-Spektrums im Detail identifiziert, wie in Abb. 3c dargestellt. Der Peak bei 3433 cm ^− 1 wurde den Absorptionsbanden von O–H- und N–H-Streckschwingungen zugeordnet, während C–H-Streckschwingungen bei 2923 cm ^− 1 . auftraten und 2853 cm ^− 1 . Darüber hinaus ist der Absorptionspeak bei 1624 cm ^− 1 zeigte die Anwesenheit von C=O an. C–O–C-Bindungen wurden bei 1109 cm ^− 1 . beobachtet , und der Peak bei 1400 cm ^− 1 wurde der C-N-Streckung zugeschrieben. Diese Ergebnisse stimmten mit denen früherer Berichte überein.

In-vitro-Zytotoxizität

Zur Beurteilung der Zytotoxizität wurden L02- und 293-T-Zellen verschiedenen Konzentrationen der PCCC-CDs für 24 h ausgesetzt und die Lebensfähigkeit mit dem CCK-8-Assay untersucht. Wie in Fig. 4a dargestellt, war die Lebensfähigkeit von L02-Zellen, die mit PCCC-CDs behandelt wurden,> 85% im Vergleich zu der der Kontrollzellen, selbst bei einer Konzentration von 5 mg/ml. Ebenso beeinflussten die PCCC-CDs das 293 T-Zellwachstum bei Konzentrationen von bis zu ungefähr 2500 μg/ml nicht (Abb. 4b). Diese Ergebnisse zeigten, dass die PCCC-CDs eine geringe Zytotoxizität aufwiesen.

Zelllebensfähigkeit durch CCK-8-Assay von (a ) L02-Zellen und (b ) 293 T-Zellen inkubiert mit PCCC-CDs für 4 h

Auswirkung von PCCC-CDs auf UTP- und MALB-Konzentrationen

Im Vergleich zum UTP-Spiegel in der Kontrollgruppe (0,98 ±   0,38 mg/l) stiegen die UTP-Spiegel in der D. Akut mit Gift behandelt (3,08 ± 0,92 mg/l, P < 0,01) und PCCC-CDs (2,36 ± 0,83 mg/l, P < 0,05) Gruppen (Abb. 5a). Darüber hinaus nahm der UTP-Spiegel nach der PCCC-CD-Behandlung im Vergleich zu den Spiegeln nach der Giftverabreichung ab (P < 0,05). Darüber hinaus erhöhte sich der MALB-Spiegel offensichtlich 24 Stunden nach der intraperitonealen Injektion von D. Akut Gift (17,78 ± 5,96 mg/l, P <0,01) im Vergleich zu der Kontrollgruppe (2,02 ±   0,91 mg/l). Im Gegensatz dazu zeigten die mit PCCC-CD behandelten Mäuse eine Tendenz zur Abnahme des MALB-Spiegels (14,25 ± 4,16 mg/l, Abb. 5b).

Auswirkungen von Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-Kohlenstoffpunkten (PCCC-CDs) auf das Gesamtprotein im Urin (UTP) und die Mikroalbuminurie (MALB) im Urin. a UTP und b MALB. Mäuse wurden mit normaler Kochsalzlösung (NS), D.acutus . behandelt Gift (Dav, 1 mg/kg) und PCCC-CDs (4 mg/kg) + Dav (1 mg/kg). Die Daten sind als Mittelwert ± SD von sechs Tieren jeder Gruppe dargestellt. *p  0,05 und ** p  0,01 verglichen mit der mit NS behandelten Kontrollgruppe. ^# p  0,05 im Vergleich zur Dav-Gruppe

PCCC-CDs linderten Nierenfunktionsstörungen bei D. Akut Gift-induzierte AKI-Mäuse

Die Nierenfunktion wurde durch Messung der BUN- und SCR-Spiegel bewertet, die in den Fig. 1 und 2 gezeigt sind. 6 und 7. Die mit D. behandelten Mäuse. Akut Gift hatte signifikant höhere BUN-Werte (12,07 ±   1,00 µmol/l [1 Tag], P <0,01; 11,43 ± 1,37 mmol/l [2 Tage], P <0,01; 14,83 ± 2,53 mmol/l [5 Tage], P < 0,01) und SCR (12,83 ± 1,43 μmol/l [1 Tag], P <0,01; 13,48 ± 2,26 µmol/l [2 Tage]; P < 0,01. 13,80 ± 1,90 μmol/L [5 Tage], P <  0,01) als die mit NS behandelten Mäuse (BUN:8,95 ± 1,04 [1 Tag], 9,53 ± 1,40 [2 Tage] und 9,07 ± 1,57 [5 Tage] mmol/l; SCR:9,40 ±   0,89 [1 Tag] , 10,27 ± 2,04 [2 Tage] und 9,85 ± 1,99 [5 Tage] μmol/l) von Tag 1 bis 5 (Abb. 6a und 7a). Bemerkenswert ist, dass die Behandlung mit niedrig dosierten PCCC-CDs im Vergleich zur Modellgruppe den Anstieg der SCR-Spiegel signifikant hemmte (9,77 ±   0,79 µmol/ml, P < 0,01) und BUN (10,50 ± 1,38 mmol/L, P < 0,05), während hoch (9,62 ± 1,87 μmol/ml, P < 0,01) und mittel (10,75 ± 1,48 μmol/ml, P <  0,05) Dosen hemmten den Anstieg des SCR (Fig. 7b), aber nicht BUN (Fig. 6b), der durch D induziert wurde. Akut Gift am Tag 1. Die SCR-Spiegel (Abb. 7c) der mit PCCC-CD mit hoher, mittlerer und niedriger Dosis behandelten Gruppen nahmen ab (10,97 ±   0,88, 10,42 ±   1,75 und 10,68 ±   1,41 µmol/ml, jeweils; P < 0,05) als in der Modellgruppe an Tag 2. Darüber hinaus sanken die BUN-Spiegel im Vergleich zur Modellgruppe signifikant im Hoch-(9,57 ± 0,52 mmol/l, P < 0,01) und niedrig dosiert (10,72 ± 2,04 mmol/l, P <0,05) PCCC-CDs-Gruppe, aber nicht die Gruppe mit mittlerer Dosis (Fig. 6c) an Tag 2. Wie in den Fign. 6d und 7d wurden hemmende Effekte bei hohen Werten beider Indizes beobachtet (12,28 ±   1,65 µmol/l, P <0,01 (BUN); 11,38 ± 1,80 μmol/ml, P < 0,05 (SCR) bzw. mittel (12,40 ± 1,33 mmol/l, P <0,05 (BUN); 10,83 ± 2,57 µmol/ml, P <  0,05 (SCR) Dosen von PCCC-CDs. Darüber hinaus wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und den mit PCCC-CDs behandelten Gruppen in der SCR beobachtet.

Auswirkungen von Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata - Kohlenstoffpunkte (PCCC-CDs) auf den Blutharnstoffstickstoff (BUN). a Die BUN-Konzentration ändert sich in 1 h, 3 h, 12 h, 1 Tag, 2 Tag und 5 Tag. Die BUN-Werte in (b ) 1 Tag (c ) 2 Tag (Tag ) 5 Tage. Mäuse wurden mit normaler Kochsalzlösung (NS), D.acutus . behandelt Gift (Dav, 1 mg/kg) und hohe (H), mittlere (M) und niedrige (L) Dosen von PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Die Daten sind als Mittelwert ± SD von sechs Tieren jeder Gruppe dargestellt. *p  0,05 und ** p  0,01 verglichen mit der mit NS behandelten Kontrollgruppe. ^# p  0,05 im Vergleich zur Dav-Gruppe

Auswirkungen von Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-Kohlenstoffpunkten (PCCC-CDs) auf das Serumkreatinin (SCR). a Die SCR-Konzentration ändert sich in 1 h, 3 h, 12 h, 1 Tag, 2 Tagen und 5 Tagen. Die SCR-Werte in (b ) 1 Tag (c ) 2 Tage (d ) 5 Tage. Mäuse wurden mit normaler Kochsalzlösung (NS), D.acutus . behandelt Gift (Dav, 1 mg/kg) und hohe (H), mittlere (M) und niedrige (L) Dosen von PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Die Daten sind als Mittelwert ± SD von sechs Tieren jeder Gruppe dargestellt. *p  0,05 und ** p  0,01 im Vergleich zur Kontrollgruppe, die mit normaler Kochsalzlösung (NS) behandelt wurde. ^# p  0,05 im Vergleich zur Dav-Gruppe

PCCC-CDs hemmten die Zytokinsekretion

Die Auswirkungen von drei Konzentrationen von PCCC-CDs auf die Produktion von chemoattraktiven (MCP-1) und proinflammatorischen (IL-1β) und entzündungshemmenden (IL-10) Zytokinen als Reaktion auf Injektionen von D. Akut Gift wurde untersucht. Abbildung 8 zeigt, dass die Giftinjektion die im Mausmodell freigesetzte IL-1β erhöhte (1 h:58,19 ± 5,35 ng/ml, P <0,01; 3 h:56,57 ± 3,54 ng/ml, P <0,01; 12 h:49,48 ± 7,74 ng/ml, P <0,05; Tag 1:41,09 ± 4,82 ng/ml, P <0,05; Tag 2:47,96 ± 8,33 ng/ml, P <0,05; Tag 5:45,11 ± 6,95 ng/ml, P < 0,05) im Vergleich zu den Spiegeln bei der NS-behandelten Maus (1 h:35,96 ± 4,72 ng/ml, 3 h:34,94 ± 2,58 ng/ml, 12 h:36,42 ± 5,25 ng/ml, Tag 1:34,47 ± 3,67 ng /ml, Tag 2:39,84 ± 3,71 µg/ml, Tag 5:36,82 ± 8,27 µg/ml). Wie in Abb. 8b–d gezeigt, Vergleich mit D. Akut Gift-induzierte Gruppe zeigte, dass 1-, 3- und 12-stündige Exposition gegenüber hoch- (50,09 ± 7,68 ng/ml, P <0,05 [1 h]; 40,36 ± 8,51 ng/ml, P < 0,01 [3 h]; 39,87 ± 4,64 ng/ml, P < 0,05 [12 h]) und niedrig- (46,64 ± 3,83 ng/ml, P <0,01 [1 h]; 37,65 ± 9,61 ng/ml, P < 0,01 [3 h]; 38,75 ± 6,64 ng/ml, P < 0,05 [12 h]) Dosis PCCC-CDs senken signifikant die Spiegel von IL-1β. Darüber hinaus reduzierten mitteldosierte PCCC-CDs den IL-1β-Spiegel signifikant (41,50 ±   11,08 ng/ml, P < 0,01) im Vergleich zu mit Gift behandelten Mäusen nach 3 h, aber nicht zu anderen Zeitpunkten.

Auswirkungen von Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-Kohlenstoffpunkten (PCCC-CDs) auf den IL-1β-Spiegel im Nierengewebe. a Der IL-1β-Spiegel ändert sich in 1 h, 3 h, 12 h, 1 Tag, 2 Tagen und 5 Tagen. IL-1β-Spiegel in (b ) 1 h, (c ) 3 Stunden, (d ) 12 h, (e ) 1 Tag, (f ) 2 Tage und (g ) 5 Tage. Mäuse wurden mit normaler Kochsalzlösung (NS), D.acutus . behandelt Gift (Dav, 1 mg/kg) und hohe (H), mittlere (M) und niedrige (L) Dosen von PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Die Daten sind als Mittelwert ± SD von sechs Tieren jeder Gruppe dargestellt. *p < 0,05 und ** p <  0,01 im Vergleich zur Kontrollgruppe, die mit normaler Kochsalzlösung (NS) behandelt wurde. ^# p  0,05 im Vergleich zur Dav-Gruppe

Die Spiegel des entzündungshemmenden Zytokins IL-10 stiegen im D. Akut mit Gift behandelte Gruppe zu verschiedenen Zeitpunkten (23,27 ±   0,72 ng/ml, P <0,01; 22.03 ± 0.96 ng/ml, P <0,05; 21,76 ± 1,99 ng/ml, P <0,05; 26,31 ± 6,55 ng/ml, P <0,01; 3 h, 12 h, Tag 1 bzw. Tag 2) verglichen mit der NS-behandelten Gruppe (Fig. 9). Im krassen Gegensatz dazu war die Behandlung mit hoch- und mitteldosierten PCCC-CDs (17,17 ± 4,04 bzw. 17,25 ±   5,64 ng/ml, beide P <  0,05) hemmte die durch Gift induzierte Sekretion von IL-10 nach 3 h, während niedrig dosierte PCCC-CDs die Spiegel nach 3 h, 12 h und Tag 1 hemmten (17,17 ± 5,24, 17,83 ± 4,11 und 18,31 ±   2,14 ng/ ml bzw. alle P < 0,05). Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der mit PCCC-CDs behandelten und der NS-Gruppe beobachtet.

Auswirkungen von Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-Kohlenstoffpunkten (PCCC-CDs) auf den IL-10-Spiegel im Nierengewebe. a Der IL-10-Spiegel ändert sich in 1 h, 3 h, 12 h, 1 Tag, 2 Tagen und 5 Tagen. Der IL-10-Spiegel in (b ) 1 h, (c ) 3 h, (d ) 12 h, (e ) 1 Tag, (f ) 2 Tage und (g ) 5 Tage. Mäuse wurden mit normaler Kochsalzlösung (NS), D.acutus . behandelt Gift (Dav, 1 mg/kg) und hohe (H), mittlere (M) und niedrige (L) Dosen von PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Die Daten sind als Mittelwert ± SD von sechs Tieren jeder Gruppe dargestellt. *p < 0,05 und ** p <  0,01 im Vergleich zur Kontrollgruppe, die mit normaler Kochsalzlösung (NS) behandelt wurde. ^# p  0,05 im Vergleich zur Dav-Gruppe

Außerdem zeigt Fig. 10 die Injektion von D. Akut Gift erhöhte die MCP-1-Freisetzung in der Modellgruppe signifikant (1 h:197,45 ± 22,34 ng/ml, P <0,01; 3 h:182,42 ± 12,94 ng/ml, P <0,01; 12 h:169,20 ± 26,74 ng/ml, P <0,01; 24 h:142,81 ± 25,85 ng/ml, P <  0,05) im Vergleich zur NS-behandelten Kontrolle (1 h:115,82 ± 14,80 ng/ml; 3 h:106,46 ± 13,76 ng/ml; 12 h:120,35 ± 15,75 ng/ml; und 24 h:108,81 ± 25,60 ng/mL; ml). Bemerkenswerter ist, dass die Behandlung von vergifteten Mäusen mit den drei PCCC-CD-Dosen den Anstieg der MCP-1-Spiegel hemmte. Das Medium- (3 h:136,84 ± 39,94 ng/ml, P <0,01; 12 h:127,48 ± 13,75 ng/ml, P < 0,01) und niedrig- (1 h:152,13 ± 18,89 ng/ml, P <0,05; 3 h:129,54 ± 30,85 ng/ml, P <0,01; 12 h:118,75 ± 19,96 ng/ml, P <  0,01) Dosis PCCC-CDs hemmten den Anstieg der MCP-1-Spiegel nach 1, 3 und 12 h, außer bei mittlerer Dosis nach 1 h (178,20 ±   22,79 ng/ml). Die Behandlung mit hochdosierten PCCC-CDs verringerte den MCP-1-Spiegel effektiv erst nach 3 Stunden (131,42 ± 24,62 ng/ml, P < 0.01).

Auswirkungen von Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-Carbon Dots (PCCC-CDs) auf den MCP-1-Spiegel im Nierengewebe. a MCP-1 level changes in 1 h, 3 h, 12 h, 1 day, 2 days, and 5 days. MCP-1 levels in (b ) 1 h, (c ) 3 h, (d ) 12 h, (e ) 1 day, (f ) 2 days, and (g ) 5 days. Mice were treated with normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Data are represented as mean ± SD of six animals of each group. *p  < 0.05 and ** p < 0.01 compared with control group treated with normal saline (NS). ^# p < 0.05 compared with Dav group

In contrast, IL-1β, IL-10, and MCP-1 levels of the PCCC-CDs-treated groups at certain time points were not significantly different from those of the model group, and showed a decreasing tendency.

Effect of PCCC-CDs on the Inhibition of Thrombocytopenia

PLTs have a specific role in the pathogenesis of AKI; therefore, the PLT count was investigated and the results are shown in Fig. 11 [26]. Compared with the PLT values of the control group (1 h:[1228 ± 51] × 10 ⁹ ; 3 h:[1120 ± 36] × 10 ⁹ ; 12 h:[1245 ± 111] × 10 ⁹ ; day 1:[1177 ± 69] × 10 ⁹ ; day 2:[1195 ± 51] × 10 ⁹ ; and day 5:[1181 ± 46] × 10 ⁹ ), a drastic reduction occurred as early as 1 h after D. acutus venom administration, with a nadir occurring at 3 h. Subsequently, the PLT steadily increased up to day 5 (1 h:[354 ± 70] × 10 ⁹ , P <0,01; 3 h:[315 ± 77] × 10 ⁹ , P <0,01; 12 h:[435 ± 91] × 10 ⁹ , P <0,01; day 1:[663 ± 226] × 10 ⁹ , P <0,01; day 2:[941 ± 248] × 10 ⁹ , P < 0.05; day 5:[1083 ± 89] × 10 ⁹ ). Of note, even at this time interval, the PLT values were significantly lower than those of control mice. In addition, administration of PCCC-CDs at a dose of 8 mg/kg markedly inhibited the venom-induced thrombocytopenia induced at 1 h ([435 ± 91] × 10 ⁹ , P < 0.05), 3 h ([599 ± 290] × 10 ⁹ , P < 0.05), 12 h ([929 ± 92] × 10 ⁹ , P < 0.01), day 1 ([1028 ± 248] × 10 ⁹ , P < 0.01), and day 2 ([1183 ± 89] × 10 ⁹ , P < 0,01). This inhibitory effect was also observed at a dose of 2 mg/kg PCCC-CDs at 3 h and day 2 and 4 mg/kg PCCC-CDs at day 2, in addition to increased PLT. Although there was no significant difference between the model and medium-dose groups, an increasing tendency was observed at other different time points.

Effects of Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) on platelet (PLT) counts in the blood. a PLT changes in 1 h, 3 h, 12 h, 1 day, 2 days, and 5 days. PLT in (b ) 1 h, (c ) 3 h, (d ) 12 h, (e ) 1 day, (f ) 2 days, and (g ) 5 days. Mice were treated with normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Data are represented as mean ± SD of six animals of each group. *p  < 0.05 and ** p < 0.01 compared with control group treated with normal saline (NS). ^# p < 0.05 compared with Dav group

Histopathological Observations

The renal injury in the venom group was histologically evaluated. As shown in Fig. 12a, in contrast to the NS-treated group, which showed normal glomeruli and tubular cellularity, marked changes were observed in the renal parenchyma of the D. acutus venom-treated group. These changes include marked haemorrhage, renal tubular dilation, and degeneration. Cotreatment with PCCC-CDs prevented D. acutus venom-induced renal damage, and the histopathological examination of the architecture of the renal tissues was almost normal with mild haemostasis, renal tubular dilation, and degeneration.

Effects of Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) on histopathological changes in kidney tissues in D.acutus venom (Dav)-induced AKI mice. After D.acutus venom challenged, kidney tissues from each experimental group were prepared for histological evaluation. Histological changes of kidney obtained from mice of different groups normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg) in (a ) 1 h, (b ) 3 h, (c ) 12 h, (d ) 1 day, (e ) 2 days, and (f ) 5 days

Discussion

As an emerging nanomaterial, CDs are beginning to occupy an important niche as innovative materials for next-generation nanomedicines. Compared to traditional heavy-metal-based quantum dots, CDs are good candidates for biomedical application because of their unique characteristics that have considerable potential advantages in the development of novel medicines with relatively low toxicity [27, 28].

The derived PCCC-CDs particles were quasi-spherical and well-dispersed in water, with abundant functional groups present on the surface. This observation is consistent with previously reported findings [23]. In addition, the as-prepared CDs showed low toxicity against L02 and 237 T cells, which indicated its suitability for biomedical applications.

The current study is the first, to the best of our knowledge, to demonstrate the remarkable bioactivities of PCCC-CDs on AKI induced by D. acutus snakebite. D. acutus is widely called “five pacer” or “hundred pacer” in Chinese folk medicine on account of the folkloric description that the people or animals bitten by D. acutus could not walk more than 100 steps. More than 90% of the population of D. acutus is found in China, and the frequency of critical conditions and even death related to the bite of this snake is higher than that by many other venomous snakes [29]. AKI is the most serious systemic effect and common complication, which leads to secondary renal ischemia and failure. An enhanced knowledge of relevant information on AKI induced by D. acutus envenomation would contribute to the development of novel therapeutic approaches. However, in contrast to the considerable knowledge available on the nephrotoxicity of snake venom in general [30, 31], information on the AKI induced by D. acutus venom is rare, which led us to investigate this potential medicine that is still in the early stages of development.

In this study, we established an AKI model by intraperitoneally injecting D. acutus venom into mice to assess the complex and multifactorial pathogenesis of venom-induced AKI. Furthermore, the model provided a tool for investigating the protective effects of PCCC-CDs against AKI induced by D. acutus venom.

Current experiments have shown the development of substantial AKI with distinct changes in inflammatory cytokines and serum and urinary biochemical index, as well histopathological evidence of renal injury after intraperitoneal injection of snake venom [31]. These findings indicated the possible factors that may mainly contribute to the venom toxicity are [32] (1) direct venom cytotoxicity against the kidney and (2) renal inflammatory reactions.

Specifically, renal insufficiency was confirmed approximately 24 h post venom injection based on oliguria associated with proteinuria and elevated serum biomarkers (SCR and BUN). We further affirmed the renal involvement in the D. acutus venom-treated group using biochemical analysis, which showed significantly elevated UTP and MALB levels compared with those of the control group. These findings indicated the presence of glomerular malfunction and tubular reabsorption in the venom-treated group [33], which were supported by evidence of histopathological change. In contrast, a significant reduction in the levels of UTP and MALB was observed in the envenomated medium-dose PCCC-CD-treated group. In addition, serum biochemical indicators (SCR and BUN) are other vital parameters used to determine the elevation of renal dysfunction in AKI and they remain clinical indicators in its diagnosis [34]. Injecting snake venom from day 1 to 5 also dramatically increased the levels of SCR and BUN, whereas treatment with PCCC-CDs reversed these effects, resulting in a faster recovery than that of the control group. More importantly, the distinct changes in the kidney tissue, marked haemorrhage, renal tubular dilation, and degeneration further indicated the direct impairment of the kidney by the venom. The attenuating effects of PCCC-CDs on the histopathological changes were demonstrated in this study. These results suggested that PCCC-CDs inhibited the AKI-induced abnormal manifestation of urinary and serum biochemical markers associated with kidney dysfunction as well as renal histological damage. Furthermore, these effects may be attributable to the amelioration of the direct nephrotoxicity of the D. acutus venom by the PCCC-CDs [35]. The protective effects of PCCC-CDs were evidenced by the inhibition of D. acutus venom-induced direct kidney damage.

An intense inflammatory response is a common feature induced by envenomation by venomous animals such as snakes and caterpillars [35,36,37]. The signs of systemic inflammation with mononuclear cell infiltration, neutrophilic leukocytosis, tubular epithelial cell degeneration, and necrosis have also been shown in kidney impairment induced by injecting snake venom. MCP-1 is a small molecule protein that plays a vital role in recruiting and activating leukocytes during inflammatory responses [38]. In addition, mononuclear phagocytes and lymphocytes may contribute to acute renal cell injury by different mechanisms such as the secretion of proinflammatory mediators, which may then induce resident renal cells to express chemokines [39]. The involvement of MCP-1, inflammatory cytokines (IL-1β) and anti-inflammatory cytokine (IL-10) in the inflammatory response in the pathogenesis of AKI in mice injected with D. acutus venom only was demonstrated in the present study. This observation indicated that the underlying mechanism of the D. acutus venom-induced AKI may be associated with the renal inflammatory response. The evidence that exposure to PCCC-CDs significantly reduced levels of IL-1β, IL-10, and MCP-1 suggests that CDs may exhibit renoprotection by inhibiting renal inflammatory reactions.

Furthermore, PLTs play a crucial role in acute haemostatic and inflammatory processes and are associated with diverse inflammatory pathologies [40, 41]. They are highly sensitive and respond quickly to biological changes when an organism is injured or bleeding, as the first cells to arrive at the site of acute injury to interact with endothelial cells and leukocytes [42]. PLTs are involved in the pathogenesis of AKI [43], and are considered a prognostic marker that is significantly associated with a worse outcome of AKI [44]. This study provided evidence that D. acutus venom conspicuously decreased the PLT count, which was consistent with the results of studies reporting that thrombocytopenia can be induced by snake venom [34, 45]. We observed that exposure to PCCC-CDs significantly elevated the PLT counts, which was consistent with the findings of a previous study [23].

The abnormalities of AKI induced by D. acutus venom were, to our knowledge, demonstrated for the first time in the current study and mainly included renal dysfunction associated with proteinuria, oliguria, elevated BUN and SCR levels, pathological kidney damage, inflammatory responses, and thrombocytopenia.

Remarkably, the PCCC-CDs demonstrated protective activity against D. acutus venom-induced AKI by inhibiting the associated impairments, as evidenced in this study for the first time. This study was a preliminary evaluation of the beneficial effects of PCCC-CDs on AKI induced by D. acutus venom, and further investigations of the underlying mechanism would be the focus of future studies.

Conclusion

The impressive protective effects of PCCC-CDs on D. acutus venom-induced AKI have been demonstrated in this study, for the first time, to the best of our knowledge. The AKI-related effects were mainly manifested as renal dysfunction, pathological kidney damage, inflammatory responses, and thrombocytopenia. These results indicated that PCCC-CDs have potential application prospects for use as a complementary medicine for the treatment of abnormalities induced by D. acutus venom-induced AKI. Furthermore, this provides a novel strategy for the study of active ingredients of traditional Chinese medicine formulations, and further broadens the biomedical applications of CDs.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

All data generated or analysed during this study are included in this published article.

Abkürzungen

AKI:

Acute kidney injury

BUN:

Blood urea nitrogen

CDs:

Karbonpunkte

D. acutus :

Deinagkistrodon acutus

HE:

Haematoxylin and eosin

IL:

Interleukin

MALB:

Microalbuminuria

MCP-1:

Monocyte chemotactic protein 1

PCC:

Phellodendri Chinensis Cortex

PCCC-CDs:

Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots

PLT:

Platelet counts

SCR:

Serum creatinine

UTP:

Urinary total protein