Einstufige, schnelle und umweltfreundliche Synthese von multifunktionalen Goldnanopartikeln für die tumorgerichtete Bildgebung und Therapie

Einführung

Doxorubicin (DOX) ist ein häufig verwendetes Krebsmedikament, das bei einer Vielzahl von Krebschemotherapien weit verbreitet ist, wie z ], und so weiter. Langfristige und hohe Dosierungen von DOX führen jedoch zu Arzneimittelresistenz [7], Übelkeit [8], Haarausfall [9] und akuter und chronischer Toxizität [10], die zu Herzinsuffizienz führen können [11]. Daher ist es sehr notwendig, einen Wirkstoffträger mit guter Biokompatibilität und hoher Wirkstoffbeladungsfähigkeit zu entwickeln. In den letzten Jahren wurden viele Nanomaterialien wie Quantenpunkte [12, 13], Chitosan [14, 15] Silizium-Nanomaterialien [16, 17], polymere Nanomaterialien [18, 19, 20], fluoreszierende Nanopartikel [21, 22, 23,24] und metallische Nanomaterialien [25,26,27,28,29,30] wurden als DOX-Transportvektoren für die Tumordiagnose und -therapie entwickelt. Goldnanomaterialien werden aufgrund ihrer einzigartigen chemischen und optischen Eigenschaften, ihrer geringen Toxizität, ihrer guten Biokompatibilität und ihrer Oberflächenmodifikation der Kontrollfähigkeit [31, 32] unter diesen Nanomaterialien häufig verwendet. Bisher gibt es drei Arten von Ansätzen für die Konjugation von DOX an BSP. Die erste ist die Konjugation von DOX an die Oberfläche von GNPs mit Hilfe von Hydrazin [25], 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) [26], pH-sensitivem Mittel [27], DCC/ NHS-System [28]. Die zweite besteht darin, GNPs mit DOX für mindestens 24 h zu inkubieren [29]. Die dritte besteht darin, auf der Oberfläche von Gold-Nanopartikeln (GNPs) konjugiertes Citrat durch DOX zu ersetzen [30]. Obwohl diese DOX-konjugierten GNPs in der Tumortherapie eingesetzt wurden, ist die Anwendung aufgrund fehlender Spezifität noch begrenzt. Vor kurzem hat die Gruppe von El-sayed [27] GNPs mit DOX, RGD-Peptiden und nuklearen Lokalisierungssignal-(NLS)-Peptiden funktionalisiert. Der Höhepunkt ihrer Arbeit ist, dass die GNPs über eine rezeptorvermittelte Endozytose von RGD-Peptiden in Tumorzellen eindringen und dann mithilfe von NLS-Peptiden in den Zellkern gelangen, wodurch DOX effektiv in die DNA-Synthese eingreift. Leider dauerte es mindestens 120 Stunden, um Peptide oder Medikamente Schicht für Schicht an die GNPs zu koppeln, und jeder Prozess benötigte mindestens 24 Stunden. In ähnlicher Weise hatten alle oben erwähnten Verfahren einige gemeinsame Probleme, wie beispielsweise mehrere Schritte, hohe Kosten, komplizierte Vorbereitung und Nachbearbeitung. Daher ist es notwendig, eine einfache und schnelle Methode zur Synthese multifunktionaler Gold-Nanomaterialien zu entwickeln.

In diesem Beitrag haben wir erstmals eine einstufige Strategie zur Herstellung der DOX-konjugierten GNPs auf Basis der chemischen Konstitution von DOX vorgestellt. Darüber hinaus präsentierten wir eine bequeme synthetische Methode zur Herstellung eines multifunktionalen DOX-Transportvektors, damit DOX besser funktioniert, der in der Tumordiagnose und -therapie verwendet werden kann. Der Hauptunterschied zwischen unserer Arbeit und anderen besteht darin, dass wir die DOX-, RGD- und NLS-Peptide als reduzierende Reagenzien und stabilisierende Reagenzien verwenden, um die GNPs herzustellen und all diese drei Substanzen an der Oberfläche der GNPs konjugieren zu lassen, um DRN-GNPs zu bilden inzwischen. Unsere früheren Arbeiten [33,34,35] hatten bewiesen, dass RGD und andere Peptide verwendet werden können, um Goldionen zu reduzieren, um Goldnanomaterialien herzustellen. Der N-Terminus des NLS kann modifiziert werden, indem die Cystein-Cystein-Tyrosin (CCY)-Sequenz verwendet wird, um CCYNLS zu konstruieren, das Goldionen reduzieren kann, während der Targeting-Effekt von NLS noch erhalten bleibt [36]. Wir fanden auch, dass DOX zwei phenolische Hydroxylgruppen besitzt, die unter basischen Bedingungen stark reduzierbar sind [37, 38], sodass es auch Goldionen reduzieren kann, um die GNPs zu bilden. Darüber hinaus kann die antitumorale Wirkung von DOX nicht beeinflusst werden, da es durch die Aminogruppe von Kohlenstoff 7 und die Hydroxylgruppe von Kohlenstoff 9 in die DNA eingelagert wird [39]. In der Zwischenzeit können Schwefel, Sauerstoff und Stickstoff an den Peptiden und DOX mit den GNPs kombiniert werden, um das Kolloid stabil zu halten [33]. Die Ergebnisse zeigen, dass die DRN-GNPs erfolgreich hergestellt wurden und in der Tumorbildgebung, -diagnose und -therapie gut funktionierten (Schema 1). Nach unserem Kenntnisstand ist dies der erste Bericht über die Synthese von DOX-, RGD- und NLS-Peptiden konjugierten multifunktionalen GNPs mit einer einstufigen Methode und deren Anwendung in der Tumordiagnose und -therapie.

Schematische Darstellung der Synthese von DRN-GNPs, der Aufnahme durch Hela-Zellen und der Tumordiagnose von DRN-GNPs

Materialien und Methoden

Materialien

HAuCl₄ 4H₂ O wurde von Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. bezogen, zyklische RGD-Peptide (die Aminosäuresequenz ist Arginin-Glycin-Aspartat-Tyrosin-Glutaminsäure (c(RGDyE))) und Natriumhydroxid waren die gleichen wie in Ref.-Nr. [35]. Doxorubicin wurde von Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. bezogen. CCYNLS-Peptide (die Aminosäuresequenz ist Cystein-Cystein-Tyrosin-Prolin-Prolin-Lysin-Lysin-Lysin-Arginin-Lysin-Valin, CCYPPKKKRKV) wurden geliefert von China Peptides Co., Ltd (Shanghai, China). Die Hela-Zelllinie und die MCF-7-Zelllinie wurden von Guangzhou Youdi Biological Technology Co. Ltd. bereitgestellt. Fetales Rinderserum (FBS) und Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) wurden von GibcoBRL Life Technologies bezogen. Das Proliferations- und Zytotoxizitäts-Assay-Kit (MTT) wurde von Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd. gekauft.

Synthese von DOX-GNPs, NLS-GNPs, DR-GNPs, DN-GNPs, DRN-GNPs

Zur Herstellung der DOX-GNPs wurde DOX-Lösung (0,2 mg/ml, 1,0 ml) unter magnetischem Rühren in die Chlorgoldsäurelösung (0,86 mM, 1,0 ml) gegeben, dann wurde NaOH (2 M, 5 μl) zu pH-Wert anpassen. Zur Herstellung von NLS-GNPs wurde CCYNLS-Peptidlösung (0,5 mM, 1,0 ml) unter magnetischem Rühren in die Chlorgoldsäurelösung (3,44 mM, 1,0 ml) gegeben, dann wurde NaOH (2 M, 20 µl) zugegeben, um den pH-Wert einzustellen . Zur Herstellung von DR-GNPs wurden DOX-Lösung (0,2 mg/ml, 1,0 ml) und RGD-Peptidlösung (1,0 mM, 1,0 ml) unter magnetischem Rühren in die Chlorgoldsäurelösung (1,72 mM, 2,0 ml) gegeben, dann NaOH (2 M, 15 &mgr;l) wurde zugegeben, um den pH einzustellen. Zur Herstellung von DN-GNPs wurden DOX-Lösung (0,2 mg/ml, 1,0 ml) und CCYNLS-Peptidlösung (0,5 mM, 1,0 ml) unter magnetischem Rühren in die Chlorgoldsäurelösung (1,72 mM, 2,0 ml) gegeben, dann NaOH (2 M, 20 &mgr;l) wurde zugegeben, um den pH einzustellen. Zur Herstellung von DRN-GNPs wurden Lösungen von DOX (0,2 mg/ml, 1,0 ml), CCYNLS-Peptiden (0,5 mM, 1,0 ml) und RGD-Peptiden (1,0 mM, 1,0 ml) in die Chlorgoldsäurelösung (1,72 ) gegeben mM, 3,0 ml) unter magnetischem Rühren, dann wurde NaOH (2 M, 35 &mgr;l) zugegeben, um den pH einzustellen. Alle Reaktionen wurden 30 min bei 100 °C in einem Rückflusssystem und einem pH-Wert von 10–12 fortgesetzt. Alle GNPs wurden durch Zentrifugation bei 55.000 U/min für 30 Minuten (Optima MAX-TL, Beckman Coulter) gereinigt. Nach dem Entfernen des Überstands wurden die GNPs in Reinstwasser redispergiert.

Charakterisierung

Die Charakterisierungen der Spektren der GNPs wurden unter Verwendung eines UV 3150 Spektrophotometers (Shimadzu, Japan), eines Nicolet Avatar FTIR Modell 330 Spektrometers (Thermo, Amerika) und einer ESCALab250 Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) mit den gleichen analytischen Bedingungen durchgeführt als ref. [35]. Die Transmissionselektronenmikroskop(TEM)-Bilder der GNPs wurden von einem TEM (JEM-2100F, JEOL, Japan) erhalten, das bei einer Beschleunigungsspannung von 200 kV betrieben wurde.

Dynamische Lichtstreuung und Zeta-Potential-Messungen

Ein Zeta PALS Zeta Potential Analyzer (Brookhaven Instrument Corporation) wurde verwendet, um die dynamische Lichtstreuung (DLS) der DOX-GNPs, NLS-GNPs, DR-GNPs, DN-GNPs und DRN-GNPs zu messen, die bei 90° . arbeiteten Winkel mit einem Festkörperlaser (λ =670 nm) bei Raumtemperatur. Ausgestattet mit einer AQ-827-Elektrode wurde der Analysator verwendet, um die Zeta-Potentiale der GNPs zu messen.

ICP-Analyse

Die quantitative Analyse von Au im BSP war dieselbe wie in Lit. [35].

Die Stabilität von DR-GNPs, DN-GNPs und DRN-GNPs dispergiert in PBS-, HCl-, NaOH-, NaCl-Lösung

Wir mischten 100 µl der präzipitierten GNPs und 500 µl hochkonzentrierte 0,2 M PBS-, 0,5 M HCl-, 0,5 M NaOH- bzw. 1,0 M NaCl-Lösung. Zwölf Stunden später machten wir ihre Fotos und testeten ihre UV-Absorptionsspektren.

Zellkultur

Die Hela- und MCF-7-Zellen wurden in einem Inkubator kultiviert (befeuchtet mit 5 % CO₂ balancierte Luft) bei 37 °C für 24 h. Das Kulturmedium war DMEM mit 10 % FBS. Die Anzahl der lebenden Zellen wird von einer Zellenzähltafel gezählt.

Zytotoxizitäts-Assay von freiem DOX und DRN-GNP

Die Hela- und MCF-7-Zellen in der exponentiellen Phase wurden in die Wells von 96-Well-Platten gegeben (ca. 5 × 10 ³ Zellen/Well) und jeweils 24 h inkubiert. Dann wurden die DRN-GNPs der Konzentrationen 0, 20, 40, 60, 80 und 100 µg/ml (die entsprechende DOX-Konzentration betrug 0,0, 7,8, 15,6, 23,4, 31,2 und 39,0 µg/ml) mit jeder Vertiefung inkubiert und jeweils 24 h bei 37 °C inkubiert. Die Kontrollgruppe wurde durch Zugabe von nur PBS-Pufferlösung eingestellt und ihre Lebensfähigkeit wurde auf 100 % festgelegt. Das MTT (20 μl, 5 mg/ml) wurde in jede Vertiefung gegeben und etwa 4 h bei 37 °C inkubiert. Dann wurde das Kulturmedium vorsichtig abgesaugt und für 10 min wurden 150 &mgr;l zweier Dimethylsulfoxid in jede Vertiefung gegeben, bis die Kristalle vollständig gelöst waren. Ein Mikroplatten-Lesegerät (Thermo Multiskan Mk3) wurde verwendet, um den OD-Wert jeder Vertiefung bei 490 nm zu messen. Drei Vertiefungen für jede Gruppe wurden hergestellt und die berechneten Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt

Durchflusszytometrie-Experiment

Die Hela- und MCF-7-Zellen in der exponentiellen Phase wurden in jede Vertiefung von zwei 12-Well-Platten (ca. 5 × 10 ⁴ Zellen/Well) und jeweils 24 h inkubiert. Dann wurde die DRN-GNPs-Lösung in jede der Vertiefungen gegeben (Endkonzentrationen mit 0, 20, 40, 60, 80 und 100 µg/ml) und jeweils 24 h bei 37 °C inkubiert. Entfernen des Kulturmediums und Hinzufügen von Trypsin-Lösung (mit EDTA) in die Vertiefungen, um die Zellen zu verdauen. Dann die Trypsinlösung aus den Wells entfernen, das Kulturmedium in die Wells geben und die Zellen in Zentrifugenröhrchen überführen. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 1000 g wurde der Überstand entfernt und die Zellen in jedem Röhrchen wurden gesammelt und in PBS-Lösung gezählt. Ungefähr 5–10 × 10 ⁴ der Zellen wurden in ein weiteres Zentrifugenröhrchen überführt und erneut 5 min bei 1000 g zentrifugiert. Entfernen des Überstands und Hinzufügen von 100 μL AnnexinV-Pufferlösung in die Röhrchen. Zugabe von 5 µl AnnexinV-FITC und 5 µl Propidiumjodid in die Röhrchen und vorsichtiges Mischen mit den Zellen. Die Röhrchen wurden bei Raumtemperatur (20–25 °C) für 15 Minuten im Dunkeln inkubiert und dann mit einem Durchflusszytometer (BD Accuri C6) getestet.

Optische Dunkelfeldstreubildgebung und Transmissionselektronenmikroskopiestudien an Zellkultur

Die Hela- und MCF-7-Zellen wurden auf dem 8-Loch-Zellkultur-Objektträger etwa 7 × 10 ³ . implantiert Zellen für jede Vertiefung. Die DRN-GNPs wurden mit einer Endkonzentration von 35 µg/ml in jede Vertiefung gegeben. Nach 24-stündiger Inkubation entfernten wir physisch und freies absorbiertes GNP durch dreimaliges Spülen dieser Zellen mit PBS-Lösung. Anschließend fixierten wir sie für 20 min mit 4% Paraformaldehyd, beschichteten sie mit einigen Tropfen Glycerin und versiegelten diese 8-Loch-Zellkultur-Objektträger mit weiteren Deckgläsern. Ein Dunkelfeld-Mikroskop (Zeiss Imager Z1) wurde verwendet, um die Zellen in x 200-Vergrößerung und im Reflexionsmodus zu beurteilen. Die Belichtungszeit für Hellfeld- und Dunkelfeldaufnahmen bei einer Spannung von 5 V betrug 1 ms bzw. 400 ms.

Für TEM-Studien wurden Hela- und MCF-7-Zellen mit den DRN-GNPs (35 µg/mL) jeweils 24 h in einer Zellkulturflasche inkubiert. Nach Inkubation und Absaugen der gemischten Lösung aus Medium und DRN-GNPs spülten wir die Zellen dreimal mit PBS-Lösung und verdauten sie dann mit Trypsin. Die Zellen wurden mit etwas DMEM-Medium in ein Zentrifugenröhrchen überführt. Die Zellen wurden 10 min zentrifugiert (1500 U/min), das DMEM-Medium wurde vorsichtig abgesaugt und die 3%ige Glutaraldehydlösung (normalerweise das 40-fache des Materialvolumens) wurde vorsichtig in das Röhrchen gegeben, um die Zellen im Boden der zu fixieren Röhre länger als 1 h. Die Zellen wurden durch Zugabe von 1% Osmiumtetroxid für 1 h weiter fixiert, mit Ethanol dehydratisiert und dann in Spurr (Sigma-Aldrich Co., USA) eingebettet. Die Zellen wurden aus dem Röhrchen herausgenommen, in Abschnitte geschnitten, mit wässrigem Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und dann auf ein Kupfergitter (300 mesh) montiert. Die Proben wurden mit einem FEI TECNAI-12 Transmissionselektronenmikroskop (Arbeitsspannung 120 kV) gemessen.

Tierversuche

Tierthemen

Athymische weibliche Nacktmäuse wurden vom Animal Experimental Center der Southern Medical University (Guangzhou, China) für in vivo erworben Tumortherapie-Test. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Tiermanagementregeln des Gesundheitsministeriums der Volksrepublik China (Dokument Nr. 55, 2001) und den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren der China Pharmaceutical University durchgeführt.

Therapeutische Wirksamkeit von freiem DOX und seinen Konjugaten bei tumortragenden Mäusen

Kurz gesagt, 36 Nacktmäuse (Alter 5–6 Wochen, Gewicht 16–18 g) wurden zufällig in sechs Gruppen eingeteilt. Ihnen wurden subkutan Hela-Zellen injiziert (5 × 10 ⁶ .). Zellen in PBS) in die rechte Fossa axillaris. Fünf Tage später wurde den Mäusen der Kontrollgruppe Kochsalzlösung (0,154 mol/l, 0,2 ml) über die Schwanzvene injiziert. Mäusen von freien DOX-, DR-GNPs-, DN-GNPs- und DRN-GNPs-Gruppen wurde auch durch die Schwanzvene injiziert. Um die Anti-Tumor-Wirksamkeit der DRN-GNPs zwischen der intravenösen Injektion und der Tumorinjektion zu vergleichen, haben wir eine Gruppe festgelegt, der die gleiche Menge an DRN-GNPs an der Tumorstelle injiziert wird. Diese fünf Gruppen behielten bei jeder Maus eine Dosis von 0,3 mg/kg Äquivalent an freiem oder konjugiertem DOX bei. Jede Maus wurde einmal täglich einer Schwanzvene oder einer Tumorinjektion unterzogen. Das Körpergewicht und das Tumorvolumen jeder Maus wurden 14 Tage lang täglich überwacht. Um die therapeutischen Wirkungen von DOX, DR-GNPs, DN-GNPs und DRN-GNPs weiter zu untersuchen, wurden die Tumoren der sechs Gruppen nach 14-tägiger Behandlung zur pathologischen Analyse exzidiert. Tumore und die inneren Organe Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere der Mäuse wurden aus den Mäusen isoliert, mit 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Die in Scheiben geschnittenen Tumorgewebe wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt und mit dem optischen Mikroskop von Olympus untersucht.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese und Charakterisierung von DOX-GNPs, NLS-GNPs, DN-GNPs, DR-GNPs, DRN-GNPs

Bei der Synthese der DOX-GNPs änderte sich bei Zugabe der NaOH-Lösung in die gemischte Lösung aus DOX- und Chlorgoldsäurelösung die Farbe der Lösung sofort von orange nach schwach violett, dann wurde sie bei 100 °C in a . weinrot Rückflusssystem unter magnetischem Rühren in einer Minute, was die Bildung der DOX-GNPs anzeigt. Das Ergebnis zeigte, dass die Reduktionsfähigkeit von DOX sehr stark ist, da DOX zwei phenolische Hydroxylgruppen (den Kohlenstoff Nr. 6 und Nr. 11) mit starker Reduktionsfähigkeit unter basischen Bedingungen besitzt. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang fortgesetzt, bis sich die Farbe nicht änderte.

Um eine Verwechslung der orangeroten Farbe von DOX und der weinroten Farbe der GNPs zu vermeiden, liefern wir weitere Beweise durch die Charakterisierung ihrer UV-Absorptionsspektren (wie in Abb. 1a gezeigt). DOX hat einen charakteristischen Absorptionspeak nahe 485 nm und einen Peak bei 530 nm; jedoch verschwand der Peak bei 480 nm im Spektrum der Produktlösung und es entstand ein charakteristischer Peak bei 520 nm, ein charakteristischer Peak der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) der GNPs. Trotzdem ist die Bildung von GNPs zwischen den 520 nm des GNPs und 530 nm des DOX-Peaks noch nicht vollständig bestimmt. Berücksichtigt man, dass die GNPs bei Hochgeschwindigkeitszentrifugation ausgefällt werden und die DOX-Moleküle nicht, können wir im Produkt des Bodens des Zentrifugenröhrchens (Einschub von Abb. 1a(3-4)) einen violetten Niederschlag sehen und DOX do auch nicht (Einschub von Abb. 1a (1-2)).

a UV-Vis-Absorptionsspektren von DOX und den hergestellten DOX-GNPs, der Einschub von (a ) sind die Bilder von DOX (1, ​​2) und DOX-GNPs (3, 4) vor (1, 3) und nach der Zentrifugation (2, 4). b TEM-Aufnahme von DOX-GNPs. c FTIR-Spektren von DOX und den vorbereiteten DOX-GNPs. d XPS-Spektrum von DOX-GNPs

DOX weist bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht von 365 nm eine rote Fluoreszenz auf; jedoch verschwand die Fluoreszenz von DOX nach der Synthese von GNPs. Es gibt zwei mögliche Gründe; der erste ist, dass der Extinktionskoeffizient der GNPs sehr stark ist, sie neigen dazu, die Fluoreszenz von Molekülen zu löschen, wenn sie sich nahe an der Oberfläche der GNPs befinden (< 5 nm) [40]. Steigt der Abstand auf 20 nm oder mehr an, ist das Plasmonenfeld der Nanopartikel zu groß, um ihr Fluoreszenzsignal zu löschen [41]. Der andere Grund ist, dass die fluoreszierende Gruppe von DOX zerstört wurde, nachdem sie die Rolle des Reduktionsmittels gespielt hatte. Wie in Abb. 1c gezeigt, sind, obwohl die Zahl der Infrarot-Absorptionspeaks der DOX-GNPs deutlich geringer ist als die des DOX, viele der Eigenschaften von DOX erhalten geblieben, wie die charakteristischen IR-Absorptionspeaks bei 2910 cm&supmin; ⁻¹ (C-H, Dehnungsvibration) [42], 1631 cm ⁻¹ (Carbonylstreckschwingung) [43], 1114 cm ⁻¹ (C-O, C-N Dehnungsvibration) [44] und 867 cm ⁻¹ (N-H, C-H, Biegeschwingung außerhalb der Ebene) [45]. Diese repräsentativen Peaks von DOX wurden auch in den Spektren der DOX-GNPs angezeigt, was darauf hindeutet, dass das DOX erfolgreich an die DOX-GNPs gebunden wurde. Interessanterweise ist der Peak bei 1214 cm ⁻¹ charakteristischer Peak für die C-O-Streckschwingung der phenolischen Hydroxylgruppe [46] verschwand in den Spektren von DOX-GNPs. Die phenolische Gruppe kann Au-Ionen zu GNPs reduzieren und wurde dann zur Carbonylgruppe transportiert. Wir vermuten, dass die Wirkung von DOX nicht beeinflusst wird, da es durch die Aminogruppe von Kohlenstoff 7 und die Hydroxylgruppe von Kohlenstoff 9 in die DNA eingelagert wird [39].

Aus den TEM-Ergebnissen können wir beobachten, dass die Partikelgröße der DOX-GNPs etwa 6 nm beträgt (Abb. 1b). Der berechnete Anteil von Au (I) betrug 31,93% aus dem XPS-Spektrum der DOX-GNPs (Abb. 1d), was hoch genug ist, um die Stabilität des Kolloids aufrechtzuerhalten. Wenn jedoch die Ablagerung von DOX-GNPs in 0,2 M PBS-Pufferlösung mit Hochgeschwindigkeitszentrifugation nach dem Entfernen des Überstands dispergiert wurde, wurde die Farbe dieser Lösung purpurschwarz und es gab sichtbare unlösliche Flocken. Es zeigte, dass die Stabilität der DOX-GNPs in der Umgebung der hohen Salzkonzentration nicht sehr gut war. Es kann erklärt werden, dass DOX nur eine Aminogruppe, aber keine Sulfhydrylgruppe besitzt, was für DOX nicht ausreicht, um die Oberfläche von GNPs über Au-S- und Au-N-Bindungen zu verbinden. Daher sind weitere Anstrengungen erforderlich, wenn DOX-GNPs als Kontrastmittel und Antitumormaterial für die Tumorbildgebung und -therapie verwendet werden.

Wir synthetisierten DRN-GNPs mit DOX, den RGD-Peptiden und NLS-Peptiden als Reduktions- und Stabilisierungsmittel. Die RGD-Peptide können spezifisch auf einige Tumorzellen abzielen, die das α_v . überexprimiert haben β₃ integrieren, und die NLS-Peptide können spezifisch auf den Zellkern abzielen. Abbildung 2a zeigt die UV-Vis-Spektren der hergestellten DOX-GNPs, NLS-GNPs, DRN-GNPs; die Eigenschaften ihres Oberflächenplasmonen-Absorptionspeaks betrugen 520–530 nm [33]. Aus dem Einschub ist auch zu erkennen, dass das BSP eine leuchtend rote Weinfarbe aufwies. TEM-Bilder (zusätzliche Datei 1:Abbildung S1) zeigen, dass die Partikelgröße von NLS-GNPs und DRN-GNPs etwa 10 nm und 5 nm betrug und die GNPs gleichmäßig verteilt sind, es wurde keine offensichtliche Koagulation gefunden.

a UV-Vis-Absorptionsspektren und die Fotoaufnahmen von DOX-GNPs (a ), NLS-BSP (b ) und DRN-BSP (c ). b UV-Vis-Absorptionsspektren von basischem DOX, RGD-Peptiden, NLS-Peptiden und dem Überstand von DRN-GNPs. c FTIR-Spektren von NLS-Peptiden, NLS-GNPs und DRN-GNPs. Der Abstand zwischen dem Spektrum der GNPs und dem Spektrum der NLS-Peptide wird für den Kontrast deutlich vergrößert

Um die Synthese von NLS-GNPs und DRN-GNPs zu validieren, charakterisierten wir die FTIR-Spektren der NLS-Peptide und der GNPs in Abb. 2c. Einige FTIR-Peaks von NLS-Peptiden wurden in den Spektren von NLS-GNPs und DRN-GNPs gefunden, wie z. B. der C-H-Streckschwingungsabsorptionspeak (2840–2972 cm ⁻¹ ) [47], C=O-Streckschwingungsabsorptionspeak (1630–1700 cm ⁻¹ ) [48] und =C-H in der Ebene liegende Biegeschwingungsspitze (1300–1475 cm ⁻¹ ) [49]; es zeigte, dass die CCYNLS-Peptide erfolgreich an die Oberfläche von GNPs konjugiert wurden. Wir fanden auch, dass der Schwingungspeak des Benzolgerüsts des Tyrosinterminals im NLS-Peptid bei 1529 cm ⁻¹ und der phenolische Hydroxyl-C-O-Streckschwingungspeak bei 1193 cm ^–1 [49] verschwand in den Infrarotspektren von NLS-GNPs und DRN-GNPs, d. h. das Benzolgerüst des Tyrosinterminals wurde in eine Chinonstruktur transportiert, nachdem es seine Rolle als Reduktionsmittel gespielt hatte.

Wir zentrifugieren die DRN-GNPs mit hoher Geschwindigkeit, sammeln die überstehende Flüssigkeit, die fast farblos war, und testen dann über UV-Vis-Spektren in Abb. 2b, ob noch Reaktanten übrig sind. Die UV-Absorptionspeaks der RGD- und NLS-Peptide stammen von Tyrosinresten, der Absorptionspeak lag bei 275 nm. Die phenolische Hydroxylgruppe wurde jedoch unter alkalischen Bedingungen zu negativen Sauerstoffionen, was die Elektronendichte des Benzolrings erhöht, der Peak wurde nach 292 nm rot verschoben. Den charakteristischen Peak im UV-Vis-Spektrum des Überstands der DRN-GNPs sahen wir nicht, was bedeutet, dass beide Peptide an der Reaktion teilnahmen. DOX besitzt drei Absorptionspeaks im Bereich von 450–600 nm, aber der Überstand der DRN-GNPs weist diese Peaks nicht auf. Außerdem wurde im Überstand der DRN-GNPs kein DOX gefunden, da seine Farbe hellbraun war, aber die Farbe von DOX unter Grundbedingungen war transparent hellviolett. Daraus kann geschlossen werden, dass die drei Materialien fast vollständig reagieren. In ähnlicher Weise werden auch die DR-GNPs und DN-GNPs auf diese Weise erklärt, siehe Zusatzdatei 1:Abbildung S2.

Wir verwendeten XPS-Spektroskopie, um die Wertigkeit von Au für die NLS-GNPs und DRN-GNPs zu untersuchen. Wie in Abb. 3a, b gezeigt, stimmen zwei Peaks mit Bindungsenergien von etwa 83,6 eV und 87,0 eV mit der Emission von Au 4f7/2- und 4f 5/2-Photoelektronen überein [33]. Ihre Position der Au 4f7/2-Bindungsenergie beider GNPs beträgt fast 84,0 eV. Für die NLS-GNPs kann es in Au (0) (83,5 eV) und Au (I) (84,1 eV) entfaltet werden, ihr Peakflächenverhältnis beträgt 57% bzw. 43%. Ähnlich kann es für die DRN-GNPs in Au (0) (83,6 eV) und Au (I) (84,4 eV) entfaltet werden, die Peakflächenverhältnisse betragen 62 % bzw. 38 %, haben also einen höheren Anteil von Au (I). Die Ladung kann Au(I)-S-Komplexe bilden, die dazu beitragen, die kolloidale Stabilität der GNPs aufrechtzuerhalten. Interessanterweise identifizierten wir drei Arten von S in den XPS-Spektren von NLS-GNPs, DN-GNPs und DRN-GNPs in Zusatzdatei 1:Abbildung S3. Die blauen und schwarzen Kurven repräsentieren die Oxidationsstufen von Schwefel, violette Kurven repräsentieren die S-H-Bindung und die grüne Kurve repräsentiert die Au-S-Bindung. Die Bildung einer Au-S-Bindung zeigte, dass die NLS-Peptide erfolgreich an die Oberfläche dieser drei GNPs konjugiert wurden.

XPS-Spektrum des Au 4f des (a ) NLS-BSP, (b ) DRN-BSP. Die Au 4f7/2-Bindungsenergie der Originalspektren (schwarz) und der angepassten Ergebnisse (rot) konnte in zwei Komponenten zerlegt werden, Au(0)-blaue Kurve und Au(I)-violette Kurve. UV-sichtbare Absorptionsspektren und Bilder von DRN-GNPs dispergiert in PBS, NaCl, NaOH bzw. HCl (c ).

Darüber hinaus zeigten die Peaks von N 1s, C 1s und O 1s der XPS-Spektren, dass die Peptide und DOX an GNPs gebunden waren (zusätzliche Datei 1:Abbildung S4).

Die XRD-Spektren (Zusatzdatei 1:Abbildung S5) zeigten, dass die Kristallstruktur dieser GNPs eine flächenzentrierte kubische Kristallstruktur ist, da alle ihre XRD-Spektren vier Peaks bei 38,2°, 44,5°, 64,7° und 77,8° . enthielten entsprechend den Ebenen (111), (200), (220) und (311) [33].

Stabilität des DRN-BSP

Die Daten der dynamischen Lichtstreuung (DLS) und des Zetapotentials dieser fünf BSP sind in Tabelle 1 dargestellt; ihre hydrodynamische Größe ist größer als die durch TEM charakterisierte, was auf eine bestimmte Menge hydratisierter Moleküle um den Kern der wasserlöslichen GNPs zurückgeführt werden kann. Ihre Zeta-Potentiale waren aufgrund der an der Oberfläche der GNPs konjugierten Carboxylgruppe negativ. Die GNPs-Lösung zeigt eine gute kolloidale Stabilität, wenn der Absolutwert des Zetapotentials größer als 30 mV ist; je größer der Absolutwert, desto besser die Stabilität. Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass sie alle eine gute kolloidale Stabilität aufweisen. Im Vergleich dazu war der Wert des Zetapotentials der NLS-GNPs am höchsten, was möglicherweise daran liegt, dass ihre Oberfläche voller NLS-Peptide ist, die über . starke Au-S-Bindungen bilden können die Thiolgruppe. Der absolute Wert des Zetapotentials von DOX-GNPs lag nahe 30 mV; es stimmte mit dem zuvor Erwähnten überein, dass die DOX-GNPs nicht sehr stabil waren, wenn sie in PBS-Pufferlösung dispergiert wurden. Die Spektrendaten wurden in Zusatzdatei 1 angezeigt:Abbildung S6.

Die Veränderungen der charakteristischen Oberflächenplasmonenresonanz(SPR)-Banden der GNPs können verwendet werden, um die Aggregation von GNPs unter Verwendung der UV-Vis-Spektrometrie zu bestimmen [49]. Wir haben ihre UV-Vis-Spektren gemessen und die DRN-GNPs fotografiert (Abb. 3c), wenn sie in hohem Salz (1 M NaCl und 0,2 M PBS), starker Säure (0,5 M HCl) und starker Base ( 0,5 M NaOH)-Lösungen. Weder eine Farbänderung der Lösung noch eine Verschiebung des UV-Vis-Spektrums wurden unter verschiedenen harten Bedingungen beobachtet, außer in der HCl-Lösung, in der sich ihre Farbe in ein leichtes Purpur änderte und der Ultraviolett-Absorptionspeak rot um 20 nm verschoben wurde, was bedeutet, dass die GNPs unter starken Säurebedingungen leicht koagulierten . Der Grund dafür könnte sein, dass die kolloidale Stabilität der negativ geladenen GNPs unter stark sauren Bedingungen beeinflusst wurde, jedoch nicht in der neutralen PBS-Puffer- und Alkaliumgebung. Wir können daraus schließen, dass die DRN-GNPs unter Bedingungen mit hohem Salz- und Alkaligehalt sehr stabil sind, was darauf hindeutet, dass unsere synthetisierten DRN-GNPs für die In-vitro-Zellbildgebung und In-vivo-Antitumortherapie verwendet werden sollten.

Plasmonische Dunkelfeldstreubildgebung von Tumorzellen und Zell-TEM-Mikroskopie

Für die gezielte Bildgebung von Tumorzellen mit DRN-GNPs haben wir die Hela-Zellen als Testgruppe und die MCF-7-Zellen als Kontrollgruppe ausgewählt. Der Grund ist, dass die Hela-Zellen das Integrin α_v . überexprimieren β₃ [50] die MCF-7-Zellen jedoch nicht, sodass sie keine spezifische Bindung von RGD aufweisen; es ist eine gute Kontrollgruppe [51]. Die Aufnahme von DRN-GNPs durch diese beiden Zelllinien nach 24 h Inkubation mit einer Endkonzentration von 35 µg/ml wurde durch eine aufrecht stehende Fluoreszenzmikroskopie im Dunkelfeldmodell bestimmt. Die ohne GNPs behandelten Zellen zeigen keine plasmonische Lichtstreuung (Fig. 4 A-Hela-Zellen, 5C-MCF-7-Zellen). Bilder von Hela-Zellen, die mit den DRN-GNPs behandelt wurden, zeigen, dass Streusignale von den GNPs stark im Zellkern lokalisiert sind (Abb. 4b und 5e). Allerdings konnten wir das Streulicht der MCF-7-Zellen nach der Inkubation mit den DRN-GNPs kaum sehen, obwohl durch den passiv verstärkten Permeations- und Retentionseffekt der Tumorzellen (EPR effect) (Figs. 4d and 5f), the enhanced permeability and retention (EPR) effect is a unique phenomenon of solid tumors related to their anatomical and pathophysiological differences from normal tissues. For example, angiogenesis leads to high vascular density in solid tumors, large gaps exist between endothelial cells in tumor blood vessels, and tumor tissues show selective extravasation and retention of macromolecular drugs [52]. So they might not be clearly detected under the same experimental condition. The results demonstrated that the endocytosis of Hela cells via receptor-mediated endocytosis was facilitated by the RGD peptides on the GNPs’ surface. The NLS peptides could also maintain their activity to specifically targeted nucleus. So our synthesized DRN-GNPs could be a very potential contrast agent for tumor targeted imaging.

The contents of the rows are listed as follows:“PBS buffer” represents the cells incubate with PBS buffer, “DRN-GNPs” represents the cells incubate with DRN-GNPs. The subscript of “1” represents the bright field images of cells, “2” represents the dark field images of cells, and “3” represents the overlapping images (bright-field and dark-field) of cells. All of the scale bars are 20 μm. The picture of E is a small region chosen from B₃ in Fig. 4, the picture of F is a small region chosen from D₃ in Fig. 4, the scale bars are 10 μm

TEM images of DRN-GNPs incubated in Hela and MCF-7 cells for 24 h. A₁ , A₂ , and A₃ are corresponding to HeLa cells while B₁ and B₂ are to MCF-7 cells

Table 2 shows the ratio values between the cells’ densitometric mean grey and the background in the same image, which has a positive correlation with the taken up amounts of DRN-GNPs by these two cell lines. The ratios of the cells incubated with PBS buffer and the MCF-7 cells were nearly 1.0, the brightness of cells was nearly close to the background. The ratio of Hela cells incubated with DRN-GNPs was 4.80, that means the synthesized DRN-GNPs could be specifically targeted and entered the tumor cells overexpressed the integrin α_v β₃ .

To confirm receptor-specific internalization of the DRN-GNPs, we investigated the cellular uptake of the DRN-GNPs by Hela and MCF-7 cells utilizing the TEM technique (see Fig. 5). There was a large amount of DRN-GNPs localized in the nucleus and cytoplasm regions of α_v β₃ -positive Hela cells (Fig. 5(A₁ - A₃ )). On the other hand, only a negligible amount of particles was found inside the cytoplasm regions of α_v β₃ -negative MCF-7 cells (Fig. 5(B₁ -B₂ )), they might be accumulated in the MCF-7 cells by means of the passive targeting EPR effect. We found that there were high contrast black continuous regions in the MCF-7 cells’ nucleus; they were uranyl acetate, which stained the nucleus, and they were different from the granular particles in the nucleus of Hela cells. The TEM images are consistent with the dark-field imaging results, indicating that the RGD and NLS peptides on the surface of GNPs facilitated the DRN-GNPs targeting Hela cells’ nucleus. So our synthesized DRN-GNPs could be used as a perfect contrast agent for tumor targeted imaging and diagnosis.

Cellular Therapeutic Efficacy Evaluation

To evaluate the therapeutic efficacy of DOX and DRN-GNPs at cell level, MTT assay was firstly carried out to study cell viability of Hela and MCF-7 cells under the treatment of these two samples for 24 h. DRN-GNPs demonstrated almost the same inhibition effect by killing nearly 70% of cells at the same DOX’s concentration (39.0 μg/mL, Fig. 6(A, B)). In line with the MTT results, when the concentration of DRN-GNPs was 40 μg/mL, the number and state of the Hela and MCF-7 cells were relatively good, so the concentration of 35 μg/mL was the suitable concentration for imaging. We observed that when the DRN-GNPs’ concentration was high to 60 μg/mL (Fig. 6(C₃ )), the Hela cells became necrosis obviously. When the concentration of DRN-GNPs goes high to 100 μg/mL, salient reduction of the number cells can be observed and clear cellular morphological change as the characteristic of necrosis was observed. The same concentration of conjugated DOX still exhibited nearly the same anti-tumor efficacy compared with the free DOX. These results indicated that our synthesized DRN-GNPs could be used not only as a contrast agent but also as a good drug delivery system.

MTT assay was used to qualitatively display in vitro anti-tumor activity of DOX and DRN-GNPs on Hela (a ) and MCF-7 cells (b ) for 24 h (100%). The concentrations of C₀ -C₅ are 0, 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL for DRN-GNPs; the corresponding DOX’s concentrations are 0, 7.8, 15.6, 23.4, 31.2, 39.0 μg/mL. Data are represented as means ± standard deviations of triplicate samples (n =3). Images of Hela cells incubated with different concentration of DRN-GNPs (c )

The result detected by the flow cytometry in Fig. 7 also demonstrates the anti-tumor efficacy of DRN-GNPs. Viability of Hela cells when exposed to DRN-GNPs of different concentrations was measured by flow cytometry based assays. Two modes of cell death, apoptosis and necrosis, were measured using Annexinv-FITC and propidium iodide (PI) dyes, respectively (Fig. 7). Similar to the results of MTT assay, the data showed that DRN-GNPs induced cell necrosis was dose-dependent. The proportion of necrotic cells was 8% without incubating with DRN-GNPs; when the concentration was high to 100 μg/mL, the proportion of necrotic cells was 23.84%; that means our synthesized DRN-GNPs could kill Hela cells efficiently. The difference between the results of MTT and flow cytometry can be explained that the difference of cell number and the methods.

Representative two-dimensional contour density plots to determine fractions of live, apoptotic, and necrotic cells, when exposed to DRN-GNPs at different concentrations (0–100 μg/mL) for 24 h, respectively. Cell necrosis and apoptosis were measured by using PI and Annexinv-FITC dyes

Therapy Evaluation of DRN-GNPs in Tumor-Bearing Mice

To further determine whether DRN-GNPs induced a combined therapeutic effect on tumor cells in vivo, we evaluated the anti-tumor effect of DRN-GNPs in tumor-bearing mice for long-term intravenously injection of drugs. The saline group and the drugs of free DOX, DR-GNPs, and DN-GNPs intravenously injected groups were set as the control groups, in which the concentration of conjugated DOX was the same as that of the free DOX. We observed that the tumor sizes of DRN-GNPs-treated groups were obviously smaller than that of the saline, DOX, DN-GNPs, and DR-GNPs-treated groups (Fig. 8a). The tumor volume and body weight of the mice were monitored every 2 days. Significant variation of tumor volume and tumor weight among all of the treated groups is shown in Fig. 8d, f; the tumor volumes and tumor weight of DN-GNPs and DR-GNPs-treated groups were smaller than that of the free DOX-treated group, but still larger than that of the DRN-GNPs-treated groups because of the less targeted activity. That might be because DOX molecules are small, lack targeting, and they have a short half-life in vivo; therefore, they might be cleared out quickly. However, DRN-GNPs possess of strong stability in the blood system, long half-life, and highly targeted ability, so they can be targeted to the tumor site, and then play the anti-tumor effect of DOX. Between the DRN-GNPs intravenously injected and tumor-injected groups, the anti-tumor efficacy of the latter group is better than that of the former group because the drugs do not need a complex system of blood circulation into the focus. The tumor inhibition rate of DOX is less than 50%, and the rates of all of the DOX-conjugated GNPs are larger than 50%; they can be high to 66.7% and 57.7%, respectively. The HE stain results showed that there was a certain degree of damage for liver organs in the intravenous injected DRN-GNPs group (Fig. 9). Furthermore, the bio-toxicity of DOX, DR-GNPs, and DN-GNPs on tumor-bearing mice were also assessed by histological analysis. As shown in Fig. 8b, tumor cell volume of saline group is comparatively larger than that of treatment groups, and tumor cells demonstrate with more mitotic figures. All the results showed that the tumor inhibition effect of DRN-GNPs was the best among the GNPs. Thus, our synthesized DRN-GNPs could be used as a perfect DOX delivery system for tumor therapy.

a Tumor images isolated from tumor-bearing mice after treatment of saline, free DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection). b The histological images of tumors of the mice after treated with saline, free DOX, DN-GNPs, DR-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection). c Body weight, tumor volume (d ), tumor inhabitation rate (e ), and tumor’s weight (f ) of tumor-bearing mice during 14 days treatment; data are represented as means ± standard deviations (n =6)

The histological images of the main organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) of the mice after treated with saline, free DOX, DR-GNPs, DN-GNPs, and DRN-GNPs (tumor injection and intravenous injection)

Conclusion

In this study, we have successfully developed a one-step method to prepare the multifunctional DRN-GNPs in about half an hour. The GNPs have also been successfully applied to the tumor targeted imaging and tumor therapy both in vitro and in vivo. The success shows that it is possible to make a fully use of the reducing and stabilizing ability of the DOX, RGD peptides, and CCYNLS peptides, which will make the GNPs’ synthesis process simple and efficient. More importantly, the one-step synthesized DRN-GNPs still possess good colloidal stability in the physiological system, and the peptides conjugated on the surface remained the targeted ability and DOX still possesses its anti-tumor ability. To our knowledge, this is the first report for synthesis of DOX, RGD and CCYNLS peptides conjugated multifunctional GNPs with a one-step method, and their application in tumor imaging, diagnosis, and therapy. This strategy is in line with the development direction of green chemistry, and it would lay the foundation for large-scale applications within the near future. We expect that our report will provide a new way for the one-step synthesis of multifunctional nanomaterials used for tumor imaging and therapy.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

All datasets are presented in the main paper or in the additional supporting files.

Abkürzungen

CCYNLS peptides:

The sequence of amino acid is cysteine-cysteine-tyrosine-proline-proline-lysine-lysine-lysine-arginine-lysine-valine

Cyclic RGD peptides:

The sequence of amino acid is arginine-glycine-aspartate-tyrosine-glutamic acid

DOX:

Doxorubicin

DR-GNPs:

DOX-RGD-GNPs, DN-GNPs:DOX-NLS-GNPs, DRN-GNPs:DOX-RGD-NLS GNPs

GNPs:

Goldnanopartikel