Gezielte Ultraschallbildgebung & Therapie von Ovarialtumoren mittels pH-responsiver Perfluorpentan-Protein-Nanopartikel

Zusammenfassung

In dieser Studie entwickelten wir einen multifunktionalen Ultraschall (US)-Therapeutikum, das Perfluorpentan (PFP) in Ferritin (FRT) einkapselt und das tumorzielende Molekül Folsäure (FA) konjugiert (FA-FRT-PFP). Die hergestellten FA-FRT-PFP wiesen einen durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 42,8 ± 2,5 nm, ein Zeta-Potenzial von −41,1 ± 1,7 mV und zeigten gute Stabilität in physiologischer Lösung und bei Temperaturen auf. FRT ist ein pH-sensitives Käfigprotein, das bei pH 5,0 disassembliert und Poren bildet, die PFP laden können. Die Anpassung auf neutralen pH schließt die Poren und kapselt PFP im FRT zu Nanopartikeln ein. Bei pH 5,0 verstärkten 3 min niederintensiver fokussierter Ultraschall (LIFU, 2 W/cm²) das US-Signal von FA-FRT-PFP signifikant durch den akustischen Tröpfchenverdampfungseffekt (ADV). Unter identischen Bedingungen verursachten 4 min LIFU-Bestrahlung das Platzen der durch FA-FRT-PFP erzeugten Blasen. FA-FRT-PFP konnte effizient in Ovarialkrebszellen zielgerichtet eingebracht werden und verstärkte den US-Kontrast von FA-FRT-PFP nach 3 min LIFU-Bestrahlung signifikant. Nach 4 min LIFU-Bestrahlung nahm die Zelllebensfähigkeit signifikant aufgrund von Nekrose ab, wahrscheinlich aufgrund der FA-FRT-PFP-vermittelten Freisetzung von PFP in der sauren Umgebung der Lysosomen nach Eintritt in die Tumorzellen. PFP wird dann in Blasen transformiert, die unter LIFU-Bestrahlung platzen und physikalische Schockwellen erzeugen, die zur Zerstörung der Zellstruktur und Nekrose führen, was Tumortherapie erreicht. Zusammengefasst zeigt dies, dass FA-FRT-PFP sowohl ein neuartiges als auch vielversprechendes US-Theranostikum für zukünftige klinische Anwendungen ist.

Einleitung

Ovarialkrebs ist einer der tödlichsten weiblichen Krebserkrankungen weltweit [1–3]. Die Behandlung von Ovarialkrebs bleibt klinisch abhängig von Strahlentherapie, Chemotherapie, Chirurgie und anderen Begleittherapien [4–6]. Doch Mängel in diesen Strategien behindern weiterhin Verbesserungen der Überlebensraten der Patienten. Um diese Mängel zu überwinden, sind effektivere und sicherere Diagnosemethoden erforderlich. In den letzten Jahren hat die Integration von Bildgebung und Therapeutika in eine einzige Behandlungsplattform als heißes Thema an Bedeutung gewonnen [7–9].

Ultraschall (US)-Technologie wird aufgrund ihrer nicht-invasiven, nicht-strahlenden, kostengünstigen und spezifischen Eigenschaften breit in klinischer Diagnose und Tumorbehandlung eingesetzt [10–12]. In den letzten Jahrzehnten wurde eine akustische Antwortplattform (ARP) mit US-Bildgebungs- und Therapeutikfähigkeiten für effektive Tumordiagnose und -behandlung entwickelt [13–16]. ARP umfasst hauptsächlich Mikroblasen oder Nanoblasen (MB oder NB) und Nanopartikel (NP)-basierte Plattformen [16, 17]. Unter diesen ARPs zeigen MB oder NB gute akustische Antwortfähigkeiten, aber aufgrund ihrer großen Größe ist die in vivo Gewebedurchdringung schwach und die Probenstabilität gering. NPs zeigen aufgrund ihrer geringen Größe stärkere Gewebedurchlässigkeit und einen längeren pharmakokinetischen Zyklus. Allerdings sind die akustischen Antwortfähigkeiten von NPs begrenzt. Es ist daher dringend, ARPs mit kleiner Größe, hoher Stabilität und starker Responsivität zu designen.

Flüssige Fluorkohlenwasserstoffe durchlaufen einen Flüssig-Gas-Phasenübergang in Reaktion auf externe Stimulation [18, 19]. Natalya und Kollegen entwickelten eine Nanoemulsion mit flüssigem Fluorkohlenwasserstoff, die unter niederintensivem fokussiertem Ultraschall (LIFU) akustische Tröpfchenverdampfung (ADV) erzeugte [20–22]. Die Emulsionen bildeten Blasen und lösten gleichzeitig Medikamentenfreisetzung aus, wodurch Tumorbehandlung ermöglicht wurde. Allerdings führte eine versiegelnde Materials schicht um den flüssigen Fluorkohlenwasserstoff zu einer Erhöhung der Intensität und Zeit des für die Tumorbehandlung erforderlichen Ultraschalls, was zu Schäden am umliegenden gesunden Gewebe führte. Eine weitere Optimierung des flüssigen Fluorkohlenwasserstoff-Trägers ist daher gefragt.

In dieser Studie entwickelten wir ein Ferritin (FRT)-Nanopartikel, beladen mit flüssigem Fluorkohlenwasserstoff Perfluorpentan (PFP), welches weiter mit dem Tumortarget-Molekül Folsäure (FA) kombiniert wurde zu FA-FRT-PFP. Ferritin ist ein hoch biokompatibles endogenes Käfigprotein, das pH-Sensitivität aufweist [23–25]. Das Protein kann in saurer Umgebung disassemblieren und in alkalischer Umgebung reassemblieren. Dies erlaubt kontrolliertes Beladen und Freisetzen von Ferritin in Reaktion auf pH-Änderungen [26–28]. PFP ist ein häufig verwendetes Phasenübergangsmaterial mit Siedetemperatur von 29 °C. Die niedrige Siedetemperatur erleichterte den einfachen Phasenübergang durch LIFU, was sicherer als HIFU war. PFP wurde in Ferritin geladen, und das resultierende FA-FRT-PFP hatte einen Durchmesser von ~47,3 ± 2,8 nm mit hoher Stabilität in physiologischen Lösungen und Temperaturen. Laut Ergebnissen hatte FA-FRT-PFP folgende Vorteile: (1) PFP konnte einfach durch pH-Änderung von sauer zu neutral in FRT geladen werden; (2) unter LIFU (2 W/cm², 3 min) und pH = 5,0 setzt FA-FRT-PFP PFP frei und durchläuft Phasenänderungen, die US-Bildgebungssignale durch ADV verstärken; (3) unter langfristiger LIFU-Bestrahlung (4 min) und pH = 5,0 explodiert das aus FA-FRT-PFP freigesetzte PFP und erzeugt eine physikalische Schockwelle, die Tumorzellen effektiv durch Nekrose zerstören kann. Meines Wissens ist dies das erste Beispiel für PFP-Beladung in FRT als Tumor-US-Theranostikum. Diese Ergebnisse zeigen, dass FA-FRT-PFP + LIFU eine neue Strategie für integrierte Tumordiagnose und -behandlung darstellt.

Materialien und Methoden

Materialien

Agarosegel, Ferritin (FRT), Folsäure (FA) und Perfluorpentan (C₃F₈, PFP) wurden von Sigma (St. Louis, MO, USA) bezogen. NH₂-PEG₂₀₀₀-FA und NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH wurden von Xi'an Ruixi Biotechnology Co., Ltd. (China) geliefert. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) kamen von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Zellzählkit-8 (CCK-8) wurde von Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan) bezogen. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS), Penicillin-Streptomycin, Trypsin-EDTA und fötales Kälberserum (FBS) wurden von Gibco (Grand Island, NY, USA) gekauft.

Zellkultur

Menschliche Ovarialkrebszelllinie SK-OV-3 wurde vom Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, bereitgestellt. Normale Ovarialepithelzellen HUM-CELL-0088 stammen von PriCells, Wuhan, China. Die Zellen wurden in DMEM-Medium mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung kultiviert. Die Zellen wurden in einem Inkubator mit feuchter Atmosphäre bei 5 % CO₂ und 37 °C gehalten.

Herstellung von FA-FRT-PFP

Zunächst wurde das Target-Molekül FA durch Veresterungsreaktion mit FRT konjugiert [29]. Kurz: NH₂-PEG₂₀₀₀-FA (10 mg) und FRT-Lösung wurden in Gegenwart von EDC (5 mg/mL) und NHS (20 mg/mL) gemischt. Nach 3 h Reaktion bei Raumtemperatur mit leichtem Rühren wurde das Gemisch durch Dialyse gegen destilliertes Wasser (MW cut-off = 1,2 kDa) für 24 h gereinigt. Die resultierende Lösung waren FA-FRT-Nanopartikel. Zweitens wurde die Beladung von PFP in den Hohlraum von FRT durch Denaturierung und Renaturierung des Proteins durchgeführt [30]. Kurz: FA-FRT wurde in 5 mL PBS auf 2 mg/mL verdünnt und auf pH = 5,0 mit 30 min leichtem Rühren bei Raumtemperatur eingestellt, um vollständige Dissoziation des FRT zu gewährleisten. Anschließend wurden 500 µL PFP in einem Eisbad zur Lösung gegeben und 5 min lang Puls-Sonikation (5 s an, 5 s Pause) bei 80 W im Eisbad unterzogen. Nach der Sonikation wurde der pH-Wert der Mischung auf neutral (pH = 7,4) eingestellt. Da PFP ölig und in Wasser unlöslich ist, wurde überschüssiges PFP leicht durch Flüssigkeitstrennung entfernt, um FA-FRT-PFP zu erhalten. FRT-PFP wurde analog hergestellt, außer dass NH₂-PEG₂₀₀₀-FA durch NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH ersetzt wurde.

Charakterisierung von FA-FRT-PFP

Größen und Zeta-Potenziale der Nanopartikel wurden mit einem Zeta Sizer (Malvern, NanoZS, UK) getestet. Die Morphologie von FA-FRT-PFP wurde per Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, Hitachi, Japan) und invertierter Fluoreszenzmikroskopie (Olympus, Japan) beobachtet. Die chemische Struktur der Nanopartikel wurde per Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (Bruker Tensor 27, Bruker Optik, Ettlingen, Deutschland) detektiert. Die zelluläre Aufnahme von FA-FRT-PFP wurde per konfokaler Laserscanning-Mikroskopie (LEXT OLS4100, Olympus, Japan) detektiert. FITC/PI-doppelt gefärbte Zellen wurden per Durchflusszytometrie (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) analysiert.

Leistung der pH- und Ultraschall-responsiven Gaserzeugung

FA-FRT-PFP bei pH = 5,0 und 7,5 wurde mit unterschiedlichen akustischen Intensitäten von LIFU (1,5 und 2,0 W/cm²) und für unterschiedliche Gesamtzeiten (1, 2, 3 und 4 min) im Agarosegel-Modell bestrahlt, dann wurden US-Bilder mit US-Gerät (Esaote Mylab 90, Italien) mit Frequenz 5–12 MHz und mechanischem Index (MI) 0,06 beobachtet. Anschließend wurde das Erscheinungsbild von FA-FRT-PFP per Lichtmikroskopie zeitlich verfolgt. Die US-Intensität des Interessensbereichs im US-Bild wurde mit ImageJ-Software analysiert.

Zelluläre Aufnahme

Kurz: 1 mg FITC wurde in 1 mL DMSO gelöst und dann mit FRT-PFP und FA-FRT-PFP 30 min mit sanfter Agitation gemischt. Dann wurde die Mischlösung über Nacht in deionisiertem Wasser dialysiert, um freies FITC und DMSO zu entfernen und FITC-markierte Nanopartikel zu erhalten. Anschließend wurden SK-OV-3 und normale Ovarialzellen (HUM-CELL-0088) 24 h im Medium kultiviert, und dann wurden freies FITC, FITC-markierte FRT-PFP und FA-FRT-PFP 5 h mit SK-OV-3-Zellen koinkubiert. Zusätzlich wurde FITC-markiertes FA-FRT-PFP 5 h mit FA-vorbehandelten SK-OV-3-Zellen inkubiert. Die Zellen wurden 3-mal mit PBS gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit 0,2 mg/mL DAPI-Lösung 10 min gefärbt. Die Zellen wurden per konfokaler Laserscanning-Mikroskopie abgebildet, um Fluoreszenzbilder aufzunehmen. Das Fluoreszenzsignal wurde per Durchflusszytometer quantifiziert.

Ultraschallbildgebung In Vitro

SK-OV-3-Zellen wurden 24 h in FA-freiem Medium kultiviert, dann wurden PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP und FA-FRT-PFP + FA 6 h mit SK-OV-3-Zellen inkubiert. Die Zellen wurden gesammelt und mit Agarosegel vermischt, dann mit oder ohne LIFU 3 min bestrahlt (1 s an, 1 s Pause für insgesamt 3 min; 1 MHz; 2,0 W/cm²). Schließlich wurden US-Bilder aufgenommen.

In Vitro Antikrebs-Wirksamkeit

SK-OV-3-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 10⁴ Zellen/Well ausgesät und 24 h anhaften gelassen. Für die Zytotoxizität von FA-FRT wurden verschiedene Konzentrationen (0, 20, 40, 100, 200 und 500 µg/mL) FA-FRT mit SK-OV-3-Zellen kultiviert. Nach 24 h Behandlung wurden die Zellen mit DMEM-Medium mit 10 % CCK-8 20 min im Inkubator behandelt. Die Absorption der Zellen bei 450 nm Wellenlänge wurde mit einem Multimode-Plattenleser (Thermo Scientific) detektiert, um die Zelllebensfähigkeit zu charakterisieren. Zusätzlich wurden SK-OV-3-Zellen und normale Ovarialzellen (HUM-CELL-0088) mit PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP und FA-FRT-PFP + FA 3 h behandelt und dann mit LIFU bestrahlt (1 s an, 1 s Pause für insgesamt 4 min; 1 MHz; 2,0 W/cm²). Die behandelten Zellen wurden weitere 21 h inkubiert. Als Kontrolle wurden ohne LIFU Zellen mit PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP und FA-FRT-PFP + FA 24 h behandelt. Danach wurde die Lebensfähigkeit der behandelten Zellen per CCK-8-Assay detektiert.

Zelltod-Analyse

Zur Beurteilung der Art des Zelltods wurden SK-OV-3-Zellen in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/mL ausgesät. Nach 24 h wurden die Zellen mit PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP und FA-FRT-PFP + FA 3 h behandelt, dann mit LIFU bestrahlt (1 s, Pause 1 s für insgesamt 4 min; 1 MHz; 2,0 W/cm²). Die behandelten Zellen wurden weitere 23 h inkubiert. Als Kontrolle wurden Zellen mit PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP und FA-FRT-PFP + FA 24 h ohne LIFU behandelt. Die Zellen wurden trypsinisiert, bei 1500×g 3 min zentrifugiert, 3-mal mit eiskaltem PBS gewaschen und in 200 mL Bindungspuffer resuspendiert. Anschließend wurden 5 µL Annexin V-FITC und 10 µL PI zugegeben und 15 min im Dunkeln mit den Zellen inkubiert. Die gefärbten Zellen wurden per Durchflusszytometer analysiert.

Western Blot

Der Western Blot wurde gemäß früherer Literatur durchgeführt. Die Zellen wurden mit 40 µg/mL PBS (Kontrolle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA und FA-FRT-PFP kombiniert mit oder ohne LIFU-Bestrahlung (2,0 W/cm², 4 min) und weiterer 21 h Inkubation behandelt. Anschließend wurden die behandelten Zellen in RIPA-Puffer (Sigma) lysiert. 50 µg jedes Proteins mit Laemmli-Probenpuffer wurden 5 min gekocht und SDS-PAGE unterzogen. Die Proteine wurden auf PVDF-Membran (Bio-Rad Laboratories) mittels semitrockenem Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories) transferiert. Blots wurden zunächst 1 h bei Raumtemperatur in TBS-Blockierpuffer mit entweder 2 % Milch oder 2 % BSA (für phosphospezifische Antikörper) inkubiert und dann über Nacht bei 4 °C mit den jeweiligen primären Antikörpern in TBST (enthält 0,1 % Tween20 und 2 % BSA) inkubiert. Anschließend wurden Blots gewaschen und mit entsprechenden sekundären Antikörpern (Santa Cruz) in TBST inkubiert und mit SuperSignal West Pico Chemilumineszenz-Substrat (Thermo) detektiert.

Statistische Analyse

Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Analysen wurden mit Student's t-Test durchgeführt. *P < 0,05, **P < 0,01 wurden als statistisch signifikant betrachtet.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung und Charakterisierung von FA-FRT-PFP

FA-FRT-PFP wurde synthetisiert und für Tumortherapie verwendet (Abb. 1). Phasenübergangs-Tröpfchen wurden durch pH-induzierte reversible Disassemblierung und Reassemblierung von FRT in FRT geladen. PFP mit LIFU-induziertem ADV wurde in Zellen geliefert und wirkte als US-Bildgebungsmittel. Abb. 2a–c zeigen TEM-Bilder von FRT, FRT-PFP und FA-FRT-PFP, die kugelförmige Morphologie aufwiesen. Die mittleren Partikelgrößen von FRT, FRT-PFP und FA-FRT-PFP betrugen 6,9 ± 0,3 nm, 43,8 ± 1,6 nm und 47,3 ± 2,8 nm (Abb. 2d), was zeigt, dass PFP-Beladung und FA-Konjugation die Größe von FRT vergrößerten. Die mittleren Zeta-Potenziale von FRT und FA-FRT-PFP betrugen −43,2 ± 3,1 mV, −46,9 ± 2,2 mV und −41,5 ± 2,7 mV (Abb. 2e). Zudem wurde die Konjugation von FA mit FRT durch FT-IR charakterisiert (Zusatzdatei 1: Abb. S1). Das FT-IR-Spektrum zeigte Absorptionsbänder bei ~1110 cm⁻¹, die der vibrationsbedingten C–O–C-Etherbindung von PEG entsprechen; Absorptionspeaks bei ~1601 cm⁻¹ und ~1710 cm⁻¹ gehören zu vibrationsbedingten C=O-Bindungen von PEG und FRT sowie –COOH und –CONH₂ von FA und FRT; Bänder bei ~2820 cm⁻¹, ~2920 cm⁻¹ und ~2950 cm⁻¹ entsprechen asymmetrischen und symmetrischen C–H-Streckschwingungen von –CH₂ von FA und PEG; Absorptionspeaks bei ~1440 cm⁻¹ sind mit dem Phenylring von FA assoziiert. Das Ergebnis bestätigt die erfolgreiche Konjugation von FA mit FRT. Über den 28-tägigen Lagerzeitraum blieben Größe und PDI von FA-FRT-PFP in Wasser, PBS, Salzlösung und FBS ohne signifikante Änderung (Abb. 3a, b), was zeigt, dass FA-FRT-PFP exzellente Stabilität aufweist. Abb. 3c zeigt die Größenänderung von FA-FRT-PFP bei verschiedenen Temperaturen von 25 °C bis 45 °C. Die Größe von FA-FRT-PFP blieb nahezu unverändert, wenn die Temperatur auf 25–40 °C reduziert wurde, was hohe Stabilität unter 40 °C anzeigt. Bei 45 °C änderte sich die Größe von FA-FRT-PFP von 42,1 nm auf 6 nm, wahrscheinlich aufgrund starker Gasifizierung des PFP in FA-FRT-PFP, was zum Bruch der Nanopartikel führte. Die Gasifizierungstemperatur von FA-FRT-PFP stieg von 29 °C (Gasifizierungstemperatur von PFP unter Normaldruck) auf 45 °C, wahrscheinlich aufgrund der Bedeckung durch die FRT-Hülle [21, 31–33].

Schematische Darstellung der Synthese von FA-FRT-PFP und seiner Anwendung in Tumor-Theranostik

a–c TEM-Bilder von FRT, FRT-PFP und FA-FRT-PFP. d, e Größen- und Zeta-Potenzialverteilung von FRT, FRT-PFP und FA-FRT-PFP

a, b Größen- und PDI-Änderung von FA-FRT-PFP in Wasser, PBS, Salzlösung und FBS über 28 Tage. c Größenänderung von FA-FRT-PFP bei verschiedenen Temperaturen von 25 °C bis 45 °C

pH- und LIFU-responsive US-Verstärkung

US-Phantom-Experimente von FA-FRT-PFP wurden bei verschiedenen pH-Werten und LIFU-Leistungsintensitäten durchgeführt. Wie in Abb. 4a gezeigt, war ohne LIFU-Bestrahlung (vorher) das US-Signal in allen Gruppen schwach. Bei pH 7,5 nach 3 min LIFU-Bestrahlung zeigte FA-FRT-PFP ein schwaches US-Signal sowohl bei 1,5 als auch 2,0 W/cm², während bei pH = 5,0 unter gleicher LIFU-Bestrahlungszeit FA-FRT-PFP eine stärkere US-Signalintensität aufwies. Dies demonstrierte, dass FA-FRT-PFP zeit- und akustische-intensitätsabhängige ADV-Effekte zeigt. Dies lag daran, dass bei pH = 5,0 FA-FRT-PFP disassemblierte und PFP freisetzte, was den Phasenübergang erleichterte. Interessanterweise zeigte FA-FRT-PFP bei pH = 5,0 und 2,0 W/cm² LIFU bei verlängerter Bestrahlungszeit von 4 min eine schwächere US-Signalintensität im Vergleich zu kürzerer Bestrahlung, wahrscheinlich weil LIFU unter dieser Bedingung zu stark ist und Blasen platzen lässt. Diese Ergebnisse demonstrierten, dass FA-FRT-PFP PFP freisetzen, Phasenübergänge und Explosion bei 2,0 W/cm² LIFU-Bestrahlung bei pH = 5,0 erzeugen kann. Die US-Intensitätsergebnisse sind in Abb. 4b, c dargestellt. Abb. 4d–g zeigen die Morphologie von FA-FRT-PFP-Lösungen nach 3 min LIFU-Bestrahlung (2,0 W/cm²) bei pH = 7,5 und 5,0. FA-FRT-PFP bei pH = 5,0 und 2,0 W/cm² LIFU erzeugte große Blasen, was unsere Ergebnisse weiter validiert.

a US-Bilder von FA-FRT-PFP gemischt mit Agarosegel bei verschiedenen pH-Werten und bestrahlt mit unterschiedlicher LIFU-Leistungsintensität. b, c Entsprechende statistische Daten der US-Signale in a. d–g Optische Mikroskopiebilder von FA-FRT-PFP gemischt mit Agarosegel bei verschiedenen pH-Werten und bestrahlt mit 2,0 W/cm² für 3 min

Zellaufnahme

Abbildung 5 zeigt die zelluläre Aufnahmekapazität von FA-FRT-PFP. Frei FITC-behandelte Zellen zeigten vernachlässigbare Fluoreszenz, aber nach Markierung auf FA-FRT-PFP war ein starkes Fluoreszenzsignal evident, was zeigt, dass FA-FRT-PFP starke zelluläre Aufnahmekapazität besitzt. FRT-PFP-behandelte und FA-FRT-PFP-behandelte Zellen, die mit FA vorinkubiert waren, zeigten schwächere FITC-Fluoreszenz. Dies demonstrierte weiter, dass FA das aktive Targeting der Nanopartikel verbessert. Zudem zeigte FA-FRT-PFP ein vergleichbares Aufnahmeverhalten wie FCM (Abb. 5c, d). Die Aufnahmeraten von FA-FRT-PFP betrugen 46,5 ± 2,8 %, was signifikant höher war als freies FITC (Kontrolle), FRT-PFP und FA-FRT-PFP + FA. Darüber hinaus zeigt Zusatzdatei 1: Abb. S2 die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln in normalen Ovarialzellen. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA und FA-FRT-PFP Gruppen in der zellulären Aufnahme. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass normale Ovarialzellen (HUM-CELL-0088) niedrigere FA-Rezeptorexpression im Vergleich zu SK-OV-3-Zellen aufweisen.

Zelluläre Aufnahme. a, b Konfokale Fluoreszenzbilder von Zellen behandelt mit freiem FITC und FITC-markierten FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA und FA-FRT-PFP. Grün und Blau repräsentieren FITC- und DAPI-Fluoreszenz. Skalenbalken = 25 µm. c, d FITC-Fluoreszenzsignal und entsprechende statistische Daten in Zellen behandelt mit freiem FITC und FITC-markierten FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA und FA-FRT-PFP

In Vitro Ultraschallbildgebung

Zur Bestätigung, dass FA-FRT-PFP Ultraschallbildgebung durch ADV in vitro verstärkt, wurden Nanopartikel 5 h mit Zellen inkubiert und mit oder ohne LIFU (2,0 W/cm²) bestrahlt. Wie in Abb. 6a gezeigt, zeigten Zellen in allen Testgruppen ohne LIFU-Bestrahlung keine verstärkten Ultraschallsignale, während nach LIFU-Bestrahlung FA-FRT-PFP-behandelte Zellen hohe US-Intensitäten im Vergleich zu Kontrollgruppen FRT-PFP und FA-FRT-PFP + FA aufwiesen. Für Ultraschallbildgebung wurde die quantitative Analyse der Grauwerte mit ImageJ-Software berechnet. Die Ergebnisse waren konsistent mit den US-Bilddaten (Abb. 6b) und zeigten, dass die US-Intensität von FA-FRT-PFP-behandelten Zellen nach Bestrahlung mit LIFU bei 2,0 W/cm² für 3 min verstärkt wurde. FA-FRT-PFP gelangt in Zellen und disassembliert in der sauren Umgebung der Lysosomen (pH ≈ 5,0), setzt PFP in das Zytoplasma frei [34, 35]. Nach LIFU-Bestrahlung erzeugt PFP leicht Phasenübergänge von Tröpfchen zu Gas, was die US-Intensität verstärkt.

Ultraschallbildgebung in vitro. a Ultraschallbilder und entsprechende statistische Daten (b) von PBS (Kontrolle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA und FA-FRT-PFP-behandelten Zellen mit oder ohne LIFU-Bestrahlung (2,0 W/cm², 3 min)

In Vitro Antikrebs-Wirksamkeit und Zelltod-Analyse

Abb. 7a zeigt die Zytotoxizität von FA-FRT-PFP bei Konzentrationen bis 0,5 mg/mL. Ohne LIFU-Bestrahlung zeigte FA-FRT-PFP keine offensichtliche Unterdrückung der Lebensfähigkeit in SK-OV-3-Zellen. CCK-8-Assays wurden verwendet, um die antikrebs Wirksamkeit von FA-FRT-PFP kombiniert mit LIFU zu analysieren. Wie in Abb. 7b gezeigt, zeigten FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA und FA-FRT-PFP ohne LIFU-Bestrahlung keine bemerkenswerte Zytotoxizität im Vergleich zu Kontrollgruppen. In Kombination mit 4 min LIFU-Bestrahlung zeigte FA-FRT-PFP signifikante Zytotoxizität, die höher war als FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, mit maximalen Zellinhibitionsraten von nahezu 90 % bei 40 µg/mL. Dies könnte daran liegen, dass FA-FRT-PFP leichter in das Zytoplasma und dann in Lysosomen aufgenommen wird im Vergleich zu FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA. In der sauren Umgebung der Lysosomen setzte FA-FRT-PFP PFP in das Zytoplasma frei. Unter 4 min LIFU-Bestrahlung gasifizierte das freigesetzte PFP, was Kavitation und Platzen verursachte und eine Reihe physikalischer Schockkräfte erzeugte, die die Tumortötungseffekte signifikant verstärkten [36–38]. Zudem zeigt Zusatzdatei 1: Abb. S3 die Zytotoxizität von Nanopartikeln in normalen Ovarialzellen. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA und FA-FRT-PFP Gruppen in der Zytotoxizität bei Kombination mit LIFU. Das Ergebnis könnte daran liegen, dass HUM-CELL-0088-Zellen niedrige FA-Rezeptorexpression aufweisen und keinen FA-Targeting-Effekt zeigen.

In vitro antikrebs Wirksamkeit. a Zelllebensfähigkeit von SK-OV-3-Zellen nach 24 h Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen von FA-FRT-PFP. b Zelllebensfähigkeit von SK-OV-3-Zellen behandelt mit 40 µg/mL PBS (Kontrolle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA und FA-FRT-PFP kombiniert mit oder ohne LIFU-Bestrahlung (2,0 W/cm², 4 min) und weiterer 21 h Inkubation

Wie in Abb. 8a, b gezeigt, zeigten Zellen ohne LIFU-Bestrahlung minimalen Zelltod in allen Gruppen. Nach 4 min LIFU-Bestrahlung zeigten FA-FRT-PFP-behandelte Zellen signifikante Nekrose (~91,6 %) im Vergleich zu anderen Gruppen aufgrund der physikalischen Schockwellen, die durch LIFU-induzierte PFP-Kavitation oder Blasenplatzen erzeugt wurden. Darüber hinaus zeigt Zusatzdatei 1: Abb. S4 die TNF-Proteinexpression der Zellen. Ohne LIFU exprimierten Zellen kaum TNF-Protein. Mit LIFU wiesen Zellen in der FA-FRT-PFP-Gruppe hohe TNF-Expression auf im Vergleich zu FRT-PFP und FA-FRT-PFP + FA Gruppen, was zeigt, dass TNF-Protein ein vitaler FA-FRT-PFP + LIFU-induzierter todesbezogener Protein war [39]. Basierend auf der exzellenten in vitro Krebs-Therapie-Wirkung [40–42] ist FA-FRT-PFP vielversprechend für zukünftige in vivo Krebstherapie.

a Durchflusszytometrie-Analyse und entsprechende statistische Daten von SK-OV-3-Zellen behandelt mit 40 µg/mL PBS (Kontrolle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA und FA-FRT-PFP kombiniert mit oder ohne LIFU-Bestrahlung (2,0 W/cm², 4 min) und weiterer 23 h Inkubation

Fazit

Zusammenfassend entwickelten wir erfolgreich FRT-basierte und PFP-beladene Phasenübergangs-Nanopartikel modifiziert mit einem FA-Target-Molekül (FA-FRT-PFP). Als neuartiges gezieltes US-Theranostikum hatte FA-FRT-PFP multiple Vorteile: (1) FA-FRT-PFP besaß nanoskalige Partikelgröße; (2) FRT wurde als Träger verwendet, der disassemblieren und reassemblieren kann, um PFP-Tröpfchen bei sauren und neutralen Bedingungen zu laden und freizusetzen; (3) unter 3 min LIFU-Unterstützung und sauren Bedingungen setzte FA-FRT-PFP PFP frei und erzeugte Phasenübergänge durch ADV, was seinen US-Kontrast signifikant erhöhte; (4) unter 4 min LIFU-Bestrahlung und saurer Umgebung konnte das freigesetzte PFP leicht einen intrazellulären "Explosionseffekt" induzieren, was physikalische antitumorale Eigenschaften ergab. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass FA-FRT-PFP mit LIFU-Unterstützung eine neuartige Strategie für Ultraschall-Molekularbildgebung und Tumortherapie bietet.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Schlussfolgerungen in diesem Manuskript basieren auf Daten, die alle in diesem Papier präsentiert und gezeigt werden.

Abkürzungen

ADV:

Akustische Tröpfchenverdampfung

ARP:

Akustische Antwortplattform.

CCK-8:

Zellzählkit-8

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid

FA:

Folsäure

FBS:

Fötales Kälberserum

FITC:

Fluoresceinisothiocyanat

FRT:

Ferritin

LIFU:

Niederintensiver fokussierter Ultraschall

NHS:

N-Hydroxysuccinimid

PFP:

Perfluorpentan

US:

Ultraschall