Entwurf von pH-empfindlichen Liposomen mit Aptamer-Gold-Nanopartikeln, die Morin zur Behandlung von Krebs einkapseln

Einführung

Eine der häufigsten Todesursachen [1], Krebs, kann zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten und Schäden für den Menschen führen. Erhebliche Anstrengungen wurden auf die Entwicklung intelligenter Medikamente zur Krebsbehandlung gerichtet [2]. Aufgrund ihrer Fähigkeit, Medikamente zu schützen, bis sie den Zielort erreichen, können Polymer-Nanopartikel möglicherweise die Abgabe von therapeutischen Medikamenten verbessern [3]. Um sicherzustellen, dass das therapeutische Mittel an das aktive Zentrum abgegeben wird, werden hochreaktive Nanopartikel verwendet. Solche Nanopartikel können so gestaltet werden, dass sie unter verschiedenen biologischen Stimuli in ihren Materialeigenschaften variieren. Reaktive Nanopartikel werden unter Verwendung verschiedener Stimuli entworfen, einschließlich externer Stimuli (z. B. Temperatur und Licht) und biologischer Stimuli (z. B. pH- oder Redoxbedingungen). pH-responsive NPs haben aufgrund von pH-Änderungen nach der Endozytose von Nanopartikeln das Interesse der Forschung geweckt. Auch Materialien, die auf den pH-Wert reagieren, ziehen Aufmerksamkeit auf sich, da die pH-responsive Funktion leicht in eine Reihe von Polymerstrukturen integriert werden kann, um eine Reihe von Nanopartikeln zu entwickeln, die auf den pH-Wert reagieren. Nanopartikel können auf den pH-Wert durch Änderung der Oberflächenchemie, Änderung der Partikelgröße oder -form und Abbau oder Freisetzung von Substanzen reagieren. Diese Änderung der Nanopartikeleigenschaften kann verwendet werden, um die zelluläre Aufnahme und kontrollierte Freisetzung zu regulieren. Daher bieten pH-responsive Nanopartikel eine leistungsstarke Strategie für das Design von therapeutischen Abgabesystemen.

Morinhydrat (3,5,7,2′,4′-Pentahydroxyflavon) (Abb. 1) ist ein natürlicher Wirkstoff, der aus chinesischen Kräuterarzneimitteln oder Pflanzen isoliert wird [4]. Es ist eine Progesteronverbindung und ein Sekundärmetabolit von Phenol in Pflanzen. Morin ist in der Natur weit verbreitet und übt gute antioxidative, krebsbekämpfende [5] und signifikante entzündungshemmende Wirkungen aus. Das Potenzial von Morin für verschiedene Anwendungen hat großes Interesse geweckt [6], aber dieses Potenzial wird durch die geringe Wasserlöslichkeit und Bioverfügbarkeit der Substanz [7] erheblich eingeschränkt.

Chemische Struktur von Morinhydrat

Liposomen (hohl) aus ua Lecithin und Ceramid haben eine Doppelschichtstruktur aus amphiphilen Lipidmolekülen [8]. Liposomen bieten wünschenswerte Eigenschaften wie Biokompatibilität, Funktionalität, reduzierte Nebenwirkungen und die Fähigkeit, große Arzneimittelmengen einzukapseln [9, 10]. Sie können hydrophile und hydrophobe Wirkstoffe effizient transportieren und vor äußeren Einflüssen schützen und sie erfolgreich in gezielte Geweberegionen transportieren [11]. Eine verbesserte Wirksamkeit ist in das Design integriert, um die pH-getriggerte Freisetzung des Antikrebsmaterials innerhalb des Tumorinterstitiums über pH-empfindliche Liposomen zu erleichtern [12,13,14,15]. Diese pH-empfindlichen Liposomen sind spezielle Liposomen, die Arzneimittel in Gewebeumgebungen freisetzen und in sauren Umgebungen, wie Endosomen von Krebsgewebe, schnell destabilisieren [16,17,18].

Um die Selektivität und Wirksamkeit der Tumorbehandlung zu erhöhen, sollten pH-sensitive Liposomen modifiziert werden, um tumorgerichtete Nanopartikel zu bilden [19]. DNA-Aptamere wurden kürzlich als hochselektive und empfindliche Biosensor- und Bildgebungssensoren sowie als potenzielle Wirkstoffe für auf Krebs gerichtete Therapeutika entwickelt [20]. Das einzelsträngige DNA-Aptamer AS1411 hat sich aufgrund seiner hohen Bindungsaffinität für Krebszellkerne als Chemotherapeutikum bewährt [21]. Dieses Aptamer (Apt) wurde mit Au-NPs kombiniert, um ein Zweikomponenten-Nanokonstrukt aus Apt-beladenen Au-NPs herzustellen, das mit Krebszellkernen wechselwirken kann. Einige Studien haben auch gezeigt, dass das Design von Liposom-Nanopartikel-Hybriden einen reichhaltigen Werkzeugkasten für die Herstellung solcher multifunktionaler Modalitäten bieten kann [22]. Ein hybrides vesikuläres Liposom-Au-NP-System bestehend aus kationischen Liposomen und Au-NPs wurde entwickelt, um die Wirkstoffpenetration in das Tumorinterstitium zu verbessern und die Antikrebsaktivität zu erhöhen [23, 24].

Gold-Nanopartikel (Au-NPs) gelten als gute Wirkstoffträger und können mit bioverwandten Molekülen modifiziert werden, um die krebsspezifische Spezifität zu verbessern [25]. Bei der Oberflächenmodifizierung von Au-NPs kann das Aptamer der Sulfhydrylgruppe verwendet werden, um die Oberfläche von Au-NPs zu modifizieren, die durch die kovalente Au-S-Bindung angesteuert werden kann, und die entsprechende Sulfhydrylgruppe auf der Nanogoldoberfläche kann an die Nanogoldoberfläche [26]. Aus technischer und anwendungstechnischer Sicht bieten ligandengebundene Goldnanomaterialien eine leistungsstarke Plattform, um eine gezielte Identifizierung, Detektion und Behandlung zu erleichtern.

In der aktuellen Studie verwendeten wir pH-sensitive Liposomen, die Morin einkapselten, und assemblierten Au-Apt, das auf der Oberfläche der Liposomen modifiziert wurde (Apt-Au@MSL, Abb. 3a). Morin, das sich durch geringe Wasserlöslichkeit und Bioverfügbarkeit auszeichnet, wurde transformiert. Die Morphologie, Größe und andere Eigenschaften des hergestellten Apt-Au@MSL wurden charakterisiert. Der neue Nanopartikel zeigte auf Tumore gerichtete Eigenschaften und eine hohe Antikrebsaktivität. Die Antikrebsaktivität von Apt-Au@MSL wurde in vitro und in vivo untersucht (Abb. 2).

Vorgeschlagenes schematisches Diagramm unseres entwickelten Apt-Au@MSL, das Morin für die Wirkstoffabgabe an Krebszellen mit tumorgerichteter Eigenschaft enthält.

Materialien und Methoden

Materialien

L-α-Phosphatidylcholin (PC), Cholesterin (Chol), Cholesterylhemisuccinat (CHEMS), Morin (≥ 99,99%), Natriumcitrat (99,9%), HAuCl₄ ·3H₂ O (≥ 99,9%), Polyvinylpyrrolidon (PVP, 40.000 Gew.), NaOH (≥ 98,0%) und HCl (37%) wurden von Sigma-Aldrich Chemical Co. (USA) bezogen. Das Aptamer AS1411 mit einer Disulfid-Modifikation wurde von TaKaRa (Dalian, China) mit der folgenden Sequenz synthetisiert:5'-HS-T-(C6-S-S-C6)-TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG G-3'. Thiazolylblau-Tetrazoliumbromid (MTT), Propidiumiodid (PI), Calcein und Alexa Fluor 488 Annexin V wurden von Sigma-Aldrich Chemical bezogen. Alle wässrigen Lösungen wurden in zweifach destilliertem Wasser hergestellt. Alle anderen Reagenzien waren die besten im Handel erhältlichen.

Synthese von Au-NPs

Bis zu 1 ml HAuCl₄ ·4H₂ O (1%) wurde in 25 ml Milli-Q-Wasser (pH-Wert =5,5) gelöst und 50 mg PVP wurden in die Lösung gegeben. Die erhaltene Lösung wurde in einen Dreihalskolben (150 ml) gegossen und mit Mikrowellen (MW)-Bestrahlung für 5 Minuten unter mechanischem Rühren behandelt. Anschließend wurden 1,5 ml Natriumcitratlösung (1%) schnell in die Lösung gegeben und für 3 Minuten mit MW bestrahlt. Die Lösung wurde durch Zentrifugation bei 10000 U/min für 5 Minuten gesammelt

Synthese von Apt-Au-NPs

Die Disulfidbindung der Aptamere wurde mit Tris(2-carboxyethyl)phosphin gespalten. Nach 30 min wurde die Aptamerlösung (100 µl, 100 µM) zu 10 ml 5 nM Lösung von Au-NPs gegeben und dann 24 h inkubiert, um Au-Apt-NPs zu bilden. Nach 1 Tag salzen wir die Mischlösung zweimal mit 2,5 ml einer 500 mM NaCl-Lösung, getrennt nach 4 Stunden [27].

Herstellung von pH-empfindlichen Liposomen

Liposomen, die aus Ei-PC zu CHEMS zu Chol in einem Molverhältnis von 33:13:5 und 5% Morin zusammengesetzt waren, wurden durch Filmhydratation hergestellt. Ei-PC, CHEMS, Chol und 2 mg Morin wurden in 8 ml CHCl₃ . gelöst , und die organischen Lösungsmittel wurden bei 40°C mit einem Rotationsverdampfer entfernt. Für Morin-Liposomen wurde der resultierende dünne Lipidfilm mit 2% (w/v) PBS hydratisiert und dann mit einer Eisbadsonde für 15 min beschallt. Das endgültige Liposom wurde synthetisiert und im kolloidalen System stabilisiert. Bei pH-sensitiven Apt-Au@Morin-Liposomen (Apt-Au@MSL) wurde der Lipidfilm mit 475 µg/ml Au-Apt-NPs in 5 % Dextrose hydratisiert und anschließend beschallt [23].

Charakterisierung

Es wurden Ultraviolett-Vis-Spektroskopie (UV-Vis, S-3100 Photodiode Array, Scinco Co., Ltd., Korea) und Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie (FT-IR) durchgeführt (Nicolet iS50, USA, Thermo Fisher Scientific). Die Morphologie des Apt-Au@MSL wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, HT7700, Tokyo Japan, Hitachi) untersucht. Der Freisetzungsprozentsatz von Morin wurde durch UV-Vis-Spektroskopie nachgewiesen. Die Morphologie der Morin-Liposomen und Apt-Au@MSL wurde auch durch Rasterelektronenmikroskopie (REM, S-4800, Hitachi, Japan) beobachtet. Dynamische Lichtstreuung (DLS) und Zetapotenzialmessungen wurden verwendet, um die optischen Eigenschaften und Größen von Morin-Liposomen und Apt-Au@MSL auf einem Brookhaven ZetaPALS Potenzialanalysator zu charakterisieren.

Zellkultur

Die menschlichen Krebszelllinien SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7 und Hs68 wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) gekauft und in RPMI mit 10 % fötalem Rinderserum bei 37 °C und gehalten 5 % CO₂ .

In-vitro-Aktivitätsstudie zur Krebsbekämpfung

SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7 und Hs68 wurden auf 96-Well-Platten ausgesät (2,0 × 10 ³ Zellen/Well) und dann mit Apt-Au@MSL in unterschiedlichen Konzentrationen (0, 5, 10, 15, 20 und 30 µg/ml) kultiviert. Als Kontrollgruppen wurden Au-NPs und Morin zugewiesen. Die leere Gruppe bestand aus unbehandelten Zellen. Die 96-Well-Platten wurden in einem befeuchteten Inkubator inkubiert. Nach der Inkubation wurden 9,6 ml MTT-Lösung (5 mg/ml) in jede Vertiefung gegeben und weitere 2 h inkubiert. Jede Gruppe wurde dreifach getestet und IC₅₀ die Werte wurden aus den mittleren OD-Werten der Dreifachtests gegen die Arzneimittelkonzentrationskurven abgeleitet. Die Helligkeit jeder Gruppe wurde durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie erhalten [28].

Die Zelladhäsion wurde unter Verwendung eines elektronischen Echtzeitsensorsystems (RT-CES; ACEA Biosciences, Inc.) alle 10 min für 75 h überwacht. Um die Zelladhäsion zu bestimmen, wurde jede Vertiefung in der Platte mit Zellen (1,0 × 10 ⁴ Zellen/Well) mit frischem Medium auf ein Endvolumen von 200 µl aufgefüllt und dann in einer Apt-Au@MSL-Lösung mit unterschiedlichen Konzentrationen (10, 20 und 30 µg/ml) bei 10 Stunden inkubiert für 12 Stunden [29] . Die Leergruppe bestand aus unbehandelten Zellen und die Kontrollgruppen bestanden aus den Morin- und Morin-Liposomen-Gruppen.

Fluoreszenzmikroskopie

SGC-7901-Zellen wurden in den 48-Well-Platten über Nacht bei 37 °C, 5 % CO₂ . gezüchtet . Die Zellen wurden dann mit Apt-Au@MSL-Lösungen (10 und 30 µg/ml) in unterschiedlichen Konzentrationen für 12 Stunden behandelt. Die Kontrollgruppen bestanden aus den Morin- und Morin-Liposomen-Gruppen. Anschließend wurde das Medium entfernt. Die leere Gruppe bestand aus unbehandelten Zellen. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden gefärbt und dann durch gemeinsames Färben von lebenden und toten Zellen gemessen (der LIVE/DEAD-Test). Nach einer Co-Färbung mit Calcein-AM/PI für 30 min wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, um den überschüssigen Farbstoff zu entfernen, und Fluoreszenzbilder wurden durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) erhalten (für Calcein-AM, Ex = 488 nm und Em = 515 nm;PI Ex = 535 nm und Em = 615 nm [30]).

Analyse des apoptotischen Zelltods

Um die Antikrebswirkung von Apt-Au@MSL zu messen, wurde jede Vertiefung in einer Platte mit sechs Vertiefungen mit SGC-7901-Zellen (1,0 × 10 ⁵ Zellen/Well) und dann in Apt-Au@MSL-Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen (5, 10, 20 und 30 µg/ml) für 12 Stunden inkubiert. Die Leergruppe bestand aus unbehandelten Zellen und die Kontrollgruppen bestanden aus den Morin- und Morin-Liposomen-Gruppen. Nach der Behandlung wurden die Zellen gesammelt und zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit PI und Annexin V-FITC gefärbt und dann mit einem CytoFLEX-Analysator (Beckman Coulter) analysiert (für PI, Ex = 535 nm und Em = 615 nm; Annexin V-FITC, Ex = 488 nm und Em = 525 nm ) [31].

Studien zur Mauerzerstörung

Um die Zellwandzerstörung im Antikrebs-Assay zu untersuchen, wurden die SGC-7901-Zellen in Sechs-Well-Platten bei 37 °C und 5 % CO₂ . gezüchtet . Die ohne das Material kultivierten Zellen wurden als Leerwertgruppe verwendet. Nachdem die Zellen mit Apt-Au@MSL in unterschiedlichen Konzentrationen (5, 10, 20 und 30 µg/ml) für 12 Stunden kultiviert wurden, wurden sie mit Trypsin-EDTA-Lösung 0,25% behandelt. Alle Zellen (einschließlich der schwimmenden Zellen im Medium) wurden mit 2000 U/min für 5 Minuten gesammelt. Die gesammelten Zellen wurden dann 4 h in 2,5 % Glutardialdehydlösung nachfixiert [32]. Die fixierten Zellen wurden in einer Aceton-Gradientenreihe für 20 min dehydratisiert. Die Zellen wurden schließlich einer Reihe von Verfahren unterzogen, auf Kupfergitter montiert und durch TEM (HT-7700, Hitachi, Japan) beobachtet.

Western Blot Assay

Die Proteinexpression von SGC-7901-Zellen wurde durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen. SGC-7901-Zellen (4,0 × 105 Zellen/Vertiefung) wurden auf einer 9-cm-Kulturplatte und 20 μg/ml Apt-Au@MSL für 1, 6, 12 und 24 h inokuliert. Die Zellen wurden nach der Behandlung geerntet und in einem Zelllysepuffer auf Eis für 1 Stunde suspendiert. Die Mischung wurde bei 11.000g . in eine Zentrifuge gegeben bei 4 °C für 10 min, und der Überstand, der das gesamte zelluläre Protein enthält, wurde gesammelt. Die Gesamtproteinkonzentration im Überstand wurde unter Verwendung der BCA-Methode bestimmt. Das Protein wurde dann im Ladepuffer resuspendiert und 10 Minuten bei 100ºC gekocht. Proben mit gleichen Proteinmengen (40 µg/Spur) wurden einer SDS-PAGE (10% Tricin-Gele) unterzogen. Sie wurden dann auf Nitrozellulose (NC)-Membranen bei 100 V 1,5 h lang übertragen und unter Verwendung von 5 % fettfreier Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween-20 (TBST) 1 h lang blockiert. Dann wurde die NC-Membran mit den primären Antikörpern bzw. dem zweiten Antikörper inkubiert. Zielproteinbanden wurden auf der Membran unter Verwendung der ECL-Western-Blotting-Nachweisreagenzien sichtbar gemacht. β-Aktin wurde als interne Kontrolle der gleichen Proteinbeladung und -übertragung verwendet. Die Proteinexpression wurde mit der Quantity-One Software quantifiziert und die Expressionsrate wurde unter der Bande markiert [33].

Tiermodell

Männliche BALB/c-Nacktmäuse (~~17 µg) wurden vom Model Animal Research Center der Nanjing University gekauft und in einer axenischen Umgebung (spezifische pathogenfreie Tiere) gezüchtet. Tumormodelle wurden durch subkutane Injektion einer Zellsuspension (SGC-7901-Zellen, 100 μl, 1 × 10 ⁶ /ml) in die Schulter der Nacktmäuse. 15 Tage nach der subkutanen Injektion von Tumorzellen wurden helle Tumorbilder erstellt. Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen durchgeführt, die vom Labortierzentrum der Anhui Agricultural University (Genehmigungsnummer:SYXK 2016-007) genehmigt wurden. Ein Messschieber wurde verwendet, um den maximalen Längsdurchmesser (Länge) und den maximalen Querdurchmesser (Breite) jedes Tumors zu bestimmen. Das Tumorvolumen wurde dann mit der Formel Länge × Breite ² . berechnet × 0,5 [34].

In-vivo-Antikrebsstudie

Nachuntersuchungen wurden durchgeführt, als das Tumorvolumen 50 mm ³ . erreichte . Mäuse, die zufällig in fünf Gruppen eingeteilt wurden, wurden den folgenden intravenösen Behandlungen unterzogen:PBS (100 µl), Morin, Morin-Liposomen, Au-Apt und Apt-Au@MSL. Den Mäusen wurde eine Dosis von 2 mg/kg des Behandlungsmaterials intravenös in den Schwanz injiziert. Die Tumorgrößen der Mäuse wurden nach 24 Tagen gemessen. Das Körpergewicht und das Überleben der Mäuse wurden ebenfalls bestimmt. Die Mäuse wurden eingeschläfert und Tumor- und Organgewebe der Mäuse wurden für die H&E-Färbung gesammelt [35, 36].

Nach der Blockierung und Permeabilisierung wurden die Tumor-Objektträger mit PBS gewaschen, mit dem TUNEL-Assay gefärbt und einer DAPI-Gegenfärbung unterzogen. Fluoreszenzbilder wurden durch CLSM erhalten. Für die DAPI-Bildgebung Ex = 358 nm und Em = 461 nm und für den TUNEL-Assay Ex = 450–500 nm und Em = 515–565 nm [37].

Test zur Bewertung der Toxizität

Um die Toxizität der Apt-Au@MSL-Behandlung auf lebenswichtige Organe zu bewerten, wurden die Mäuse in den vier Behandlungsgruppen nach 30 Tagen getötet. Die wichtigen Organe (Leber, Milz, Niere, Herz, Lunge und Tumor) der Mäuse aus allen Gruppen wurden gesammelt und mit H&E gefärbt. Es wurden auch Blutproben gesammelt und der Blutzucker gemessen. Außerdem wurde das Gewicht der Mäuse bestimmt [38].

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierung

Ziel der vorliegenden Studie war es, ein neuartiges Liposom zu entwickeln, das die Vorteile von Nanopartikeln (Apt-beladene Au-NPs) besitzt und effektiv als Antikrebsmittel eingesetzt werden kann. Die grundlegenden Eigenschaften der neuen Liposomen sind wichtig, um weitere Studien durchführen zu können. Apt-Au@MSL wurde wie in einer früheren Studie beschrieben [23] mit geringfügigen Modifikationen synthetisiert und anschließend mit verschiedenen Methoden charakterisiert (Abb. 3). Abbildung 3b zeigt die Ergebnisse der UV-Vis-Spektroskopie, die den charakteristischen Peak zeigt und die Bildung von Au-NPs verfolgen kann. Im UV-vis-Spektrum von Au-NPs wurden charakteristische Peaks bei etwa 530 nm beobachtet. Insbesondere zeigte die UV-Vis-Spektrenanalyse eine starke UV-Absorption, die durch die Oberflächen-Apt-Modifikation beeinflusst wurde. Die gleichen Ergebnisse wurden beobachtet. Charakteristische Peaks wurden verdrängt, nachdem pH-sensitive Liposomen mit Morin beschichtet wurden. Der charakteristische Peak des hergestellten Apt-Au@MSL lag bei 362 und 550 nm. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Synthese erfolgreich abgeschlossen wurde. Zur weiteren Charakterisierung wurde eine FT-IR-Spektroskopie durchgeführt, um die Ergebnisse der Synthese zu überprüfen. Die charakteristische Rotverschiebung der Peaks von Morin-Liposomen und Apt-Au@MSL deutete ferner auf die erfolgreiche Modifikation von Morin hin (Abb. 3c). Wir führten einen Morin-Freisetzungsassay in PBS bei verschiedenen pH-Werten durch, um die pH-Empfindlichkeit von Apt-Au@MSL zu bestimmen. Diese drei pH-Werte simulieren die neutrale Umgebung des Blutkreislaufs, die leicht saure Umgebung des Tumors und die saure Umgebung des intrazellulären Körpers. Der Freisetzungsprozentsatz von Morin wurde durch UV-Vis-Spektroskopie nachgewiesen. Bei einem pH-Wert von   5,0 wurden etwa 54% Morin innerhalb von 24 Stunden freigesetzt, und in den folgenden 96 Stunden wurde eine kontinuierliche Freisetzung beobachtet; währenddessen wurden bei pH 7,4 nur etwa 10 % Morin innerhalb von 24 h freigesetzt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Apt-Au@MSL unter normalen physiologischen Bedingungen eine gute Stabilität aufweist und ein Austreten von Arzneimitteln verhindert; das Medikament wird jedoch schnell im Kernkörper freigesetzt. Dieses Arzneimittelfreisetzungsverhalten kann die Wirkung der Behandlung effektiv verbessern (Abb. 3d). TEM und SEM wurden durchgeführt, um die Strukturen des Liposoms und Apt-Au@MSL aufzuklären (Abb. 3f). TEM wurde durchgeführt, um die Strukturen der AuNPs aufzuklären. Wie in Abb. 3g gezeigt, haben die AuNPs eine Partikelgröße von etwa 10 nm, was mit der Größe der Modifikation auf den Liposomen übereinstimmt (Abb. 3g). Die SEM-Ergebnisse in Abb. 3e zeigen, dass rohe Liposomen ausschließlich unilamellare Vesikel mit einem uneinheitlichen Durchmesser von etwa 120 nm bilden, was mit der durch DLS bestimmten Größe übereinstimmt. Im Gegensatz dazu zeigt Apt-Au@MSL, dass die Morphologie von Hybridvesikeln einer Au-Apt-Modifikation zugeschrieben wird. Der Durchmesser von 150 nm stimmte auch mit der DLS-bestimmten Größe überein (Abb. 3i). Insbesondere ergab die TEM-Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen den pH-empfindlichen Liposomen und Au-Apt, dass die Au-NPs fast ausschließlich mit der vesikulären Lipiddoppelschicht assoziiert und an der Peripherie der Vesikel lokalisiert waren (Abb. 3h). Die ζ-Potentialmessungen sind in Abb. 3j dargestellt, und die Zeta-Potentiale von Au-NPs und Au-Apt sind negativ. Das Ergebnis zeigt, dass sowohl Au-NPs (− 57.1 ± 0.3 mV) als auch Au-Apt negativ geladen sind (− 31.7 ± 0.2 mV). Apt-Au@MSL wurde mit positiv geladenen Morin-Liposomen modifiziert und das Potential auf 36,4 ± 0,3 µmV geändert. Die Adsorption positiver und negativer Ladung ist der Mechanismus, durch den Au-Apt und Morin-Liposomen binden. Darüber hinaus stellt Abb. 3k die Änderung der Einkapselungsrate des Partikels im Laufe der Zeit dar, was die Stabilität des Partikels über einen bestimmten Zeitraum angibt. Wie in Abb. 3k gezeigt, ändert sich die Einkapselungsrate des Partikels innerhalb von 24 h kaum, was darauf hindeutet, dass das Partikel über einen bestimmten Zeitraum eine gute Stabilität aufweist. Die Standardkurve der Morin-Konzentration gegen die UV-Vis-Absorption von Morin wurde erstellt, um die Einkapselungsrate von Morin-Liposom und Apt-Au@MSL zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass die Einschlusseffizienz von Morin-Liposom und Apt-Au@MSL 90,2 % und 89,6 % erreichen kann, wie in Tabelle S1 und Abb. S1 gezeigt

Charakterisierungsbilder. a Schematische Darstellung der Synthese von Apt-Au@MSL. b UV-Absorptionsspektren von Morin, Au-NPs, Au-Apt, Morin-Liposom und Apt-Au@MSL. c FT-IR-Spektrometer von Morin, Morin-Liposom und Apt-Au@MSL. d Das Freisetzungsverhalten von Morin aus Apt-Au@MSL bei verschiedenen pH-Bedingungen. e REM-Aufnahme des Morin-Liposoms. f REM-Aufnahme des Apt-Au@MSL. g TEM-Aufnahme der Au-NPs. h TEM-Bild des Apt-Au@MSL. ich Durchmesser von Morin–Liposom und Apt-Au@MSL mindestens dreimal über DLS bestimmt. j ζ-Potenzial von Au-NPs, Apt-Au und Apt-Au@MSL. k Einschlusseffizienzrate (EE%) von Morin-Liposom und Apt-Au@MSL

Antikrebs-Aktivitätstest von Apt-Au@MSL

In Vitro

Morin weist eine überlegene Antitumoraktivität auf, weist jedoch aufgrund seiner geringen Wasserlöslichkeit eine geringe Bioverfügbarkeit auf. Nachdem Morin von pH-empfindlichen Liposomen eingekapselt und in ein wasserlösliches Material umgewandelt wurde, wurde die Oberfläche des Liposoms mit Au-Apt modifiziert, um die gezielte Antitumorwirkung zu erzielen. Abbildung 4a zeigt die Antikrebsaktivität von Apt-Au@MSL durch MTT-Assay in vitro. Die Arzneimittelkonzentration wird durch die Morinkonzentration definiert. Die mit Morin behandelte Gruppe zeigte im Vergleich zur Blindgruppe keine offensichtliche Antikrebsaktivität. Die Gruppe, die mit Morin behandelt wurde, das mit pH-empfindlichen Liposomen verkapselt war, zeigte jedoch eine verbesserte Antikrebsaktivität. Das Ergebnis legt nahe, dass die Antitumoraktivität von Morin-Liposomen der von rohem Morin überlegen war. Gleichzeitig stellten wir fest, dass die Antitumoraktivität des durch Apt (Apt-Au@MSL) modifizierten Liposoms verbessert wurde. Tabelle 1 listet die IC₅₀ . auf Werte von Morin, Morin-Liposomen, Apt-Au@MSL und Cisplatin. Morin, Morin-Liposomen und Apt-Au@MSL zeigten ein breites Spektrum an Antikrebsaktivitäten auf Tumorzellen. Sie zeigten eine deutliche Präferenz für SGC-7901-Zellen mit hoher Potenz und geringer Toxizität gegenüber normalen menschlichen Zellen. Der IC₅₀ der Wert von Apt-Au@MSL betrug 15,6 ± 1,5 µg/ml für die SGC-7901-Zellen. Diese Ergebnisse wurden durch RTCA-Tests weiter bestätigt. Die SGC-7901-Zellen wurden mit Apt-Au@MSL in verschiedenen Konzentrationen kultiviert; die Blindgruppe wurde mit PBS behandelt und die Kontrollgruppe bestand aus Morin und Morin-Liposomen. Haftung und Ausbreitung wurden mit iCELLigence überwacht (Abb. 4b). Die Ergebnisse waren denen des MTT-Tests weitgehend ähnlich. Die Antitumoraktivität von Apt-Au@MSL war signifikant höher als die von Morin und Morin-Liposomen. Apt-Au@MSL könnte die Proliferation von SGC-7901-Zellen mit einer Konzentrationserhöhung hemmen. Veränderungen der Zellmorphologie nach Apt-Au@MSL-Behandlung wurden auch durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Wie in Abb. 4c gezeigt, bewahren die SGC-7901-Zellen ohne Apt-Au@MSL die strukturelle Integrität der Zelle. Im Gegensatz dazu wird die Zellintegrität beeinträchtigt, nachdem Zellen mit Apt-Au@MSL in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt wurden.

a Zelllebensfähigkeit von SGC-7901-Zellen, die mit unterschiedlichem Material (Morin, Au-Apt, Morin-Liposom und Apt-Au@MSL) in verschiedenen Konzentrationen (0, 5, 10, 15, 20 und 30 µg/ml) inkubiert wurden. Die von PBS behandelte Zelle wurde als leere Gruppe gesetzt. b Die Zellproliferationskurve von SGC-7901-Zellen wurde durch das RT-CES-System nachgewiesen. Die verschiedenen Verbindungen wurden nach 10 h zugegeben. Die Konzentrationen von a , b , und c sind unterschiedlich Apt-Au@MSL (10, 20 bzw. 30 µg/mL). c Die hellen Zellbilder bei den verschiedenen Konzentrationen (0, 2,5, 5, 10, 20 und 30 μg/mL)

Analyse des apoptotischen Zelltods

Die quantitative Analyse der Apoptose wurde durch Durchflusszytometrie mit Annexin-FITC-Färbung durchgeführt. Die Zellen wurden mit PI und Annexin V-FITC gefärbt und dann mit einem CytoFLEX-Durchflusszytometer (Beckman Coulter) analysiert. Annexin V wurde verwendet, um frühe apoptotische Zellen nachzuweisen, die an das exponierte Phosphatidylserin gebunden waren, und PI-Markierung wurde verwendet, um die späten apoptotischen Zellen zu färben. Das Apoptoseverhältnis betrug 1,57% für die Leergruppen. Die mit Morin behandelten Zellen zeigten ein Apoptoseverhältnis von 3,51 %. Apt-Au@MSL zeigte bei verschiedenen Konzentrationen eine höhere Induktionsfähigkeit mit Apoptoseverhältnissen von 7,44 %, 10,75 %, 15,53 % und 40,77 % (Abb. 5). Die verstärkte Apoptose bestätigte auch die hervorragende Antikrebsaktivität, die durch Apt-Au@MSL induziert wurde. Das Apoptoseverhältnis der SGC-7901-Zellen stieg mit steigender Apt-Au@MSL-Konzentration.

Annexin V-FITC/PI-Färbung-basierte Durchflusszytometrie-Analyse der SGC-7901-Apoptose nach Behandlung mit verschiedenen Methoden. Die Konzentration von a , b , c , und d beträgt 5, 10, 20 bzw. 30 µg/ml

Antikrebs-Aktivitätsstudie durch Fluoreszenzassay

Die durch Apt-Au@MSL induzierte Antitumorwirkung auf SGC-7901-Zellen wurde intuitiv durch LIVE/DEAD-Fluoreszenzassays bewertet. Nachdem die Zellen mit Morin, Morin-Liposomen und Apt-Au@MSL in unterschiedlichen Konzentrationen inkubiert worden waren, wurden sie mit dem LIVE/DEAD-Kit 30 min unter dunklen Bedingungen co-gefärbt. In Abb. 6 zeigen die Zellen in der leeren Gruppe, dass alle grünen Fluoreszenzzellen lebende Zellen darstellen. Die Kontrollgruppen, einschließlich Morin und Morin-Liposomen, zeigen die Anzahl der rot fluoreszierenden Zellen. Die Zellen, die mit Apt-Au@MSL in unterschiedlichen Konzentrationen behandelt wurden, zeigten jedoch deutlich eine große Anzahl apoptotischer Zellen. Mit zunehmender Konzentration nahmen lebende Zellen allmählich ab. Der Prozentsatz der abgestorbenen Zellen nahm überwiegend zu und die Zelldichte nahm ab. Das Ergebnis bestätigte, dass Apt-Au@MSL die Tumorapoptose effektiv fördern kann.

Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von SGC-7901 inkubiert mit Apt-Au@MSL unterschiedlicher Konzentration und anschließender kurzer Färbung. Die leere Gruppe war PBS. Als Kontrollgruppe wurden Morin und Morin-Liposom eingesetzt

Zellintegritätsstudie

Um den Einfluss der Aufnahme und des Transports von Apt-Au@MSL zur SGC-7901-Zelle zu bestätigen, führten wir einen TEM-Assay durch. Die Veränderung der Zellmorphologie wurde durch TEM beobachtet. TEM-Bilder wurden durchgeführt, um die innere Struktur der Zellen zu beobachten und eine Referenz für Antikrebsmechanismen bereitzustellen. Wie in Abb. 7 gezeigt, zeigten die leeren Bilder der SGC-7901-Zellen ohne Behandlung signifikante Veränderungen in der Morphologie und im Aussehen klarer Zellwände. In der Kontrollgruppe (Morin und Morin-Liposomen) zeigte die Zellmorphologie eine partielle Schädigung und die Kernregion zog sich zusammen. Allerdings wurden auch nach Exposition gegenüber Apt-Au@MSL signifikante Veränderungen der Zellwand und der inneren Struktur beobachtet. Das Zytoplasma trat aus und die Kernstruktur wurde unklar. Viele Zellfragmente wurden um Hohlzellen herum gebildet. Außerdem zerfielen die Zellwände oder wurden zerstört. Ganze Profile wurden unklar, Zellen wurden beschädigt und das Zytoplasma leckte. Die roten Pfeile repräsentierten das Au-NP-Gebiet. As the concentration of the Apt-Au@MSL increased, more Au NP regions appeared in the nucleus. This occurrence suggested the release of Morin after Apt-Au@MSL entered the cell interior, hence the appearance of a large amount of Au NPs. These aforementioned results suggest that antitumor activity was associated with compromised cell integrity and nuclear structure.

TEM images of SGC-7901 cells treated with different concentration of Apt-Au-MSL (10, 20, and 30 μg/mL). The blank group was PBS. The Morin and Morin–liposome were set as control group. The red square is the enlarge area. The red arrow point to Au NPs

Molecular Mechanism Induced by Apt-Au@MSL

To explore the molecular mechanism of Apt-Au@MSL-induced apoptosis, we detected the expression levels of caspases and PARP. Activation of caspase-3, -8, and -9 was first detected with specific substrates. As shown in Fig. 8a, Apt-Au@MSL treatment induces dose-dependent activation of caspase-3, -8, and -9. Caspase-9 promotes mitochondria-mediated apoptosis more than does caspase-8, indicating that the mitochondria-mediated apoptosis signaling pathway is dominant. Western blot analysis further confirmed the existence of Apt-Au@MSL-induced apoptosis at the protein level. Figures 8b and c show that after cells are treated with Apt-Au@MSL, activation of caspases and cleavage of PARP shows time and dose dependence (Figs. 8b, c). In Fig. 8d, e, the Western blot analysis confirmed our results. In conclusion, Apt-Au@MSL inhibits the growth of SGC-7901 cells mainly by inducing apoptosis.

Apt-Au@MSL induced apoptosis in SGC-7901 cells. a SGC-7901 cells were treated with indicated concentrations of Apt-Au@MSL for 24 h. Then, the total protein was extracted and incubated with synthetic Apt-Au@MSL substrates for measuring caspase activities. Dose-dependent (b ) and time-dependent (c ) effects of Apt-Au@MSL on PARP and caspases expression. d , e Quantitative analysis of PARP, caspase-7, caspase-9, and caspase-3 expressions. Data are means ± SD, *P < 0,05, **P  < 0.01

Apt-Au@MSL Inhibits Tumor Growth

In Vivo

The in vivo antitumor activities of Apt-Au@MSL were evaluated using an SGC-7901 tumor xenograft model. A comparison of the images of the tumors with those of the control group (Morin and Morin–liposomes) showed that mice treated with Apt-Au@MSL markedly reduced the weight and size of the tumor (Fig. 9a). The relative tumor volume curves and the mice weight curves indicate that the Apt-Au@MSL in vivo exhibits a higher anticancer efficiency (Fig. 9b) than those of the other treatment groups. No significant difference in average tumor volume was indicated between the control group (Morin and Morin–liposomes) and the blank group. The tumor volume of the Apt-Au@MSL group was only nearly a tenth of the blank group and nearly a sixth of the control group. The result indicated that raw Morin and Morin–liposomes at 40 mg/kg exerted no effect on the growth rate of tumors. However, Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth. The body weight of mice in the different groups (PBS, Morin, Morin–liposomes, and Au-Apt groups) showed no marked fluctuation (Fig. 9c) during the treatment period. This result suggested that the treatment was tolerated and caused no acute side effects. Notably, we found that the mice with Apt-Au@MSL treatment showed markedly prolonged survival (Fig. 9d). The surviving mice in this group behaved normally, showing no apparent sign of unhealthy condition. These results demonstrated that the administration of Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth in xenograft mouse models.

a In vivo applications of Apt-Au@MSL and photographs of the mice tumor taken 24 days. A dosage of 2 mg/kg was administrated intravenously for all mice (n = 6–8). b Tumor weight of mice in different groups after 24 days. c Tumor volume index for the different treatment groups. The tumor sizes were measured at the indicated time points. d Survival rate of the mice in different group after tumor inoculation. Data are means ± SD (n  = 6-8). The intravenous injection of PBS was set as blank group (100 μL); the treated by Morin and Morin–liposome were set as control group. In vivo therapeutic effects of Apt-Au@MSL in SGC-7901-bearing mice. Data are means ± SD, *P < 0,05, **P  < 0.01

Histological Analysis of Anticancer Activity

H&E staining of tumor tissue and organ samples was conducted after fixation and treatment. Treatment efficacy with respect to tumor cell death was also evaluated by H&E staining of tumor tissue from different groups. In Fig. 10a, the mice treated with Au-Apt, Morin, and Morin–liposomes show the same extent of thermal damage as that of the mice in the blank group. No apparent apoptosis was observed in the blank group. The tumor tissue sections consisted of tightly packed tumor cells. However, Apt-Au@MSL treatment exhibited the most significant damage to the tumor tissue, with moderate cell apoptosis in the tumor. The result suggested anticancer activity in the mouse models treated with Apt-Au@MSL. To further investigate the ratio of apoptotic cells in tumors tissue in vivo, TUNEL assay was performed for the detection of apoptotic cells. As shown in Fig. 10b, the apoptotic cells in tumors can be stained with green fluorescence to indicate apoptosis. The merged images show fewer green fluorescent regions in the blank group and the control group (Morin and Au-Apt), indicating the presence of fewer apoptotic cells. The cells of the mice treated with Morin–liposomes appear partly apoptotic. Moreover, a large number of green fluorescent regions were observed in the group treated with Apt-Au@MSL, indicating a large amount of apoptotic cells. The results were consistent with that of H&E staining, confirming that Apt-Au@MSL can promote tumor apoptosis in vivo.

a H&E staining analysis of the tumors in mice. Histological analysis of the tumors in mice following different treatments as PBS, Morin, Morin–liposome, Au-Apt, and Apt-Au@MSL group. b Apoptotic cells were detected by a TUNEL assay (green) and co-stained by nuclear staining DAPI (blue)

In Vivo Toxicity Evaluation

The potential in vivo toxicity is often a significant concern for the clinical application of anticancer medicine. To verify the applicability of Apt-Au@MSL in vivo, the mice were evaluated under different treatments (Morin, Morin–liposomes, Au-Apt, and Apt-Au@MSL). Blood biochemical assays were also conducted to examine possible changes in the biochemistry of mice after treatment. As shown in Fig. 11a, the blood glucose index for blood function of the Apt-Au@MSL groups was similar to those of the blank and control groups. No difference in body weight was found in each group. A steady increase was observed, indicating that the drug exhibited no toxicity (Fig. 11b). H&E staining of organ sections (Fig. 11c) showed no sign of damage or inflammation in the group treated with Apt-Au@MSL, compared with the blank and control group. This finding indicated that PBS, Morin, Morin–liposomes, Au-Apt, and Apt-Au@MSL were negligible side effects in vivo. These results, as well those of H&E staining, further indicate safety in the use of Apt-Au@MSL for tumor treatment.

In vivo toxicity evaluation. a Blood glucose data detected in the mouse toxicity model. b Weight of mice in different groups after 24 days. c Images of H&E-stained major organs. Each value represents the mean ± SD (n = 3)

Conclusions

In conclusion, this study presents the synthesis of an antitumor nanomaterial, Apt-Au@MSL. Apt-Au@MSL exhibited excellent monodispersity and tumor-targeting properties. The polarity of Morin was modified, and the antitumor activity was enhanced. The pH of the solution was 5.0, and the release rate of Morin from Apt-Au@MSL was the maximum in the characterization experiments. Apt-Au@MSL showed that the morphology of hybrid vesicles was attributable to Au-Apt modification. The diameter of 150 nm was consistent with the size determined by DLS. We screened our model cancer cell by MTT assay and found that SGC-7901 cells could effectively suppress proliferation. The IC₅₀ of Apt-Au@MSL was 15.6 ± 1.5 μg/mL for the SGC-7901 cells. Fluorescent flow cytometric assays confirmed that Apt-Au@MSL could be used as an effective anticancer material and induced apoptosis in vitro. The Apt-Au@MSL found in the internal cell, as shown in the TEM images, suggested that Apt-Au@MSL could target the cancer cell. The administration of Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth in xenograft mouse models, as determined from tumor weight testing. H&E staining and TUNEL assay further confirmed that Apt-Au@MSL could promote tumor apoptosis in vivo. Both blood biochemistry testing and H&E staining suggested that these materials exhibit negligible acute toxicity and good biocompatibility in vivo.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

The authors declare that the materials, data, and associated protocols are promptly available to the readers without undue qualifications in material transfer agreements. All data generated and analyzed during this study are included in this article.

Abkürzungen

Apt:

Aptamers

Apt-Au:

Aptamers and Au nanoparticle

MSL:

Morin pH-sensitive liposome

AuNPs:

Goldnanopartikel

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

Apt-Au@MSL:

Aptamers and Au nanoparticle-modified Morin pH-sensitive liposome

PC:

L-α-Phosphatidylcholine

Chol:

Cholesterol

CHEMS:

Cholesteryl hemisuccinate

PVP:

Polyvinylpyrrolidon

PI:

Propidiumjodid

FT–IR:

Fourier-transform infrared spectroscopy

UV–Vis:

Ultraviolet–visible spectroscopy

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

PDI:

Polydispersitätsindex

ATCC:

American Type Culture Collection

CLSM:

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

TUNEL:

TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling

H&E staining:

Hematoxylin-eosin staining

RTCA:

Real-time unlabeled cell analysis