Hochoberflächen-Yolk-Shell-Calciumphosphat-Mikrokugeln aus organischen Phosphor- und Calciumquellen für verbesserte HEL-Adsorption

Zusammenfassung

Yolk-Shell-strukturierte Calciumphosphat-Mikrokugeln haben großes Potenzial für medizinische Anwendungen aufgrund exzellenter physikochemischer Eigenschaften und Biokompatibilität. Die Entwicklung einer Yolk-Shell-Struktur mit hoher Adsorptionskapazität bleibt jedoch eine Herausforderung. Hier wurde eine poröse Yolk-Shell-Mikrokugel (ATP-CG) aus Calciumphosphat mit hoher spezifischer Oberfläche (SBET = 143 m²/g, ca. dreimal so hoch wie ATP-CL-Mikrokugeln, synthetisiert durch Ersetzen der Calciumquelle durch Calcium-L-Lactat-Pentahydrat (CL)) erfolgreich durch Verwendung von Adenosin-5'-triphosphat-Dinatriumsalz (ATP) als Phosphorquelle und Calciumgluconat-Monohydrat (CG) als Calciumquelle via Selbsttemplating-Ansatz synthetisiert. Die Einflüsse des molaren Ca/P-Verhältnisses, der hydrothermalen Temperatur und Zeit auf die Morphologie der ATP-CG-Mikrokugeln wurden untersucht. Organische Calcium- und Phosphorquellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Yolk-Shell-Bildung. Adsorptionsversuche beleuchteten den Adsorptionsmechanismus zweier Yolk-Shell-Mikrokugeln mit unterschiedlichen Calciumquellen. Die Adsorptionskapazität von ATP-CG (332 ± 36 mg/g) ist etwa doppelt so hoch wie ATP-CL (176 ± 33 mg/g). Die höhere spezifische Oberfläche durch die Calciumquelle und einzigartige Oberflächenchemie der ATP-CG-Mikrokugeln spielen wichtige Rolle bei verbesserter HEL-Adsorptionsfähigkeit. Die hergestellte Yolk-Shell-Mikrokugel ist vielversprechend für Drug-Delivery-Anwendungen und bietet effektiven Ansatz zur Verbesserung der Arzneimitteladsorption.

Einleitung

Calciumphosphat hat in den letzten Jahren aufgrund exzellenter Biokompatibilität, hoher Beladungskapazität und Liefer-effizienz große Aufmerksamkeit erhalten. Calciumphosphat-basierte Biomaterialien werden breit in Biomedizin eingesetzt: Gewebetechnik, Knochenreparatur, Drug Delivery. Zur Erweiterung des Anwendungsbereichs und Leistungsverbesserung wurden verschiedene Calciumphosphat-Materialien mit diversen Morphologien/Mikrostrukturen berichtet: karbonathydroxylapatit (HAp) Mikrokugeln, HAp Mikroröhren, hohle HAp Mikrokugeln, mesoporöse Yolk@Cage-Schale Nanosphären aus amorphem Calciumphosphat (ACP).

Unter verschiedenen Morphologien ziehen Yolk-Shell-Mikrokugeln zunehmende Aufmerksamkeit auf sich, da sie nicht nur Materialwissenschafts-Frontier sind, sondern einzigartige morphologische Merkmale zeigen. In Yolk-Shell-Mikrokugeln kann der Hohlraum zwischen Eigelbkern und Schale als Speicherreservoir für verschiedene Frachten dienen, und die poröse Schale bietet Diffusionsweg für Gästemoleküle – Potenzial für Katalyse, Li-Ionen-Batterien, Photokatalyse, Biomedizin. Traditionell sind Opfer-Templatemethoden primär für Yolk-Shell-Synthese. Diese haben Erfolg in Struktur-/Eigenschaftseinstellung, aber Nachteile: aufwendige Verfahrensschritte, Tenside/Struktur-directing Reagenzien, potenziell gesundheitsschädlich. Selbsttemplating-Methoden werden nun breit für Yolk-Shell-Forschung genutzt. Anders als traditionelle Templating: Templates in Selbsttemplating sind nicht nur Vorlagen für Hohlräume, sondern auch Vorläufer der Yolk-Shell-Mikrokugeln. Selbsttemplating sind daher bequeme Ansätze. Einführung in Calciumphosphat-Yolk-Shell-Synthese bleibt jedoch Herausforderung.

Calciumphosphat-Materialien wurden für verschiedene Frachten genutzt: Proteine, DNA, siRNA. Doch schlechte Arzneimitteladsorptionskapazität muss dringend gelöst werden. Immobilisierungsansätze hängen von Oberflächeneigenschaften ab: Oberflächenpotenzial, Hydrophobizität/Hydrophilie, Wasserstoffbrücken, spezifische Oberfläche. Verbesserung von Oberflächeneigenschaften und spezifischer Oberfläche ist valider Ansatz zur Steigerung der Arzneimitteladsorption.

Hier wurden poröse Yolk-Shell-Calciumphosphat-Mikrokugeln durch ATP als Phosphorquelle und CG als Calciumquelle via Selbsttemplating hergestellt. Ohne Templatmittel zeigen sie besonders hohe spezifische Oberfläche. HEL-Adsorptionsverhalten von ATP-CG vs. ATP-CL (Calciumquelle durch CL ersetzt) untersucht. Ergebnisse zeigen: Differenz in spezifischer Oberfläche durch Calciumquelle und Oberflächenchemie spielen entscheidende Rolle bei verbesserter HEL-Adsorptionskapazität.

Methoden

Materialien

Adenosin-5'-triphosphat-Dinatriumsalz (ATP) von Macklin Biochemical Co., Ltd (Shanghai). Calciumgluconat-Monohydrat (CG) und Calcium-(L)-Lactat-Pentahydrat (CL) von Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai). Hühner-Ei-Lysozym (HEL, ~70000 U/mg) von Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Deutschland).

Synthese und Charakterisierung von ATP-CG und ATP-CL Yolk-Shell-Mikrokugeln

ATP-CG Synthese: 0,9 g CG in 20 ml Ultrapure Wasser bei 60 °C gelöst (Lösung C). 0,11 g ATP in 5 ml Ultrapure Wasser gelöst (Lösung P). Lösung C auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Lösung P unter starkem Rühren gemischt, pH mit 2 M NaOH auf 5 eingestellt. Endvolumen 30 ml mit Ultrapure Wasser, molares Ca/P-Verhältnis 3,3. In Mikrowellen-Verdauungssystem für mikrowellenhydrothermale Reaktion: 120 °C, 15 min. Niederschlag per Zentrifugation (4500 rpm, 10 min), mit Ultrapure Wasser gespült, 48 h lyophilisiert. ATP-CL per Literaturverfahren [24].

Kristallphase per XRD (Cu Kα, λ=0,154). Morphologie per REM, TEM, HRTEM. Zusammensetzung per FTIR. Spezifische Oberfläche per BET. Thermogravimetrie (TGA) bei 10 °C/min in N₂.

HEL-Adsorption und Charakterisierung

Adsorption: bestimmte Mengen Yolk-Shell-Mikrokugeln (ATP-CG: Ca/P=3,3, 120 °C, 15 min; ATP-CL: Ca/P=2,5, 120 °C, 30 min) in Wasser mit konstanter Ultraschallbehandlung 10 min zu 1,5 mg/ml Suspension dispergiert. 0,5 ml wässrige Lösungen mit verschiedenen HEL-Konzentrationen zu 1 ml Suspension, Endkonzentrationen 1–7,5 mg/ml. Schütteln (200 rpm) bei 37 °C, 6 h. Zentrifugation, HEL in Überstand per UV-Vis bei 280 nm. Zeta-Potenziale und Zusammensetzungen vor/nach Beladung per Zeta-Potenzial-Analysator, FTIR, TGA (10 °C/min, N₂).

Adsorptionsisotherme

Zur Untersuchung des Adsorptionsverhaltens Dubinin-Radushkevich (D-R) Isothermenmodell. Basiert auf Mikroporenfüllungstheorie, beschreibt nicht-ideale Sorption auf heterogener Oberfläche, unterscheidet Sorptionsmechanismus (physikalisch/chemisch). Modell: Qeq = Qm exp(-KDR ε²), ε = RT ln(1+1/Ceq), E = 1/√KDR. E < 8 kJ/mol: physikalische Adsorption; 8–16 kJ/mol: Ionenaustausch; >16 kJ/mol: chemische Adsorption.

Statistische Analyse der Arzneimitteladsorption

Daten als Mittelwert ± Standardabweichung. Signifikante Unterschiede (p < 0,05) per Einfaktorielle ANOVA. Alle Experimente in Triplicate, Analyse per DPS-Software.

Ergebnisse und Diskussion

Morphologie und chemische Charakterisierung der Mikrokugeln

ATP-CG Yolk-Shell-Mikrokugeln

REM-Bilder (Abb. 1) zeigen Morphologien unter verschiedenen Reaktionsbedingungen. Bei t = 5 oder 15 min: alle Produkte einheitliche Mikrokugeln. Bei t = 30 min: Nanosheets-selbstassemblierte Mikrokugeln (Abb. 1 f,i,l). Ca/P-Einfluss auf Morphologie bei t = 30 min: mit steigendem Ca/P allmähliche Bildung von Nanosheet-selbstassemblierten Mikrokugeln (Abb. 1 f,i,l). Erklärung: Unter mikrowellenhydrothermalem Prozess hydrolysieren ATP-Moleküle zu Adenosin-basierten Molekülen (ADP, AMP, Adenosin) und setzen Phosphationen (PO₄³⁻) frei. CG hydrolysiert zu Gluconat und Calciumionen (Ca²⁺). Phosphationen reagieren mit Calciumionen zu primären ACP-Kernen. Initiale ACP-Kerne wachsen und assemblieren zu ACP-Mikrokugeln. Verlängerte hydrothermale Zeit: weitere Hydrolyse von ATP/CG → mehr PO₄³⁻/Ca²⁺ → erhöhte Übersättigung und Nukleationsrate → Nanosheet-selbstassemblierte Mikrokugeln. Erhöhtes Ca/P: lokale hohe Ca²⁺-Konzentration beschleunigt Morphologietransformation ähnlich. Hydrothermale Zeit und Ca/P beeinflussen Produktmorphologie wesentlich.

FTIR-Spektren (Abb. 2) verschiedener Ca/P bei 120 °C, 15 min: Peaks bei 1620 cm⁻¹ (C=O), 1383 cm⁻¹ (C-O von CG), 912 cm⁻¹ (P-O von ATP) – unbehydrolysierte CG/ATP oder Derivate auf Mikrokugeloberfläche adsorbiert. Schwacher Peak PO₄³⁻ von HAp bei 1035 cm⁻¹, Peaks bei 1122 cm⁻¹ und 567 cm⁻¹ PO₄³⁻ von ACP – Produkte aus ACP und HAp. FTIR bestätigt erfolgreiche Calciumphosphat-Synthese mit ATP/CG.

SEM/TEM (Abb. 3) bei verschiedenen Ca/P (120 °C, 15 min): Ca/P 0,8 oder 1,67: poröse Mikrokugeln (Abb. 3b,d). Ca/P 2,5: Beginn Yolk-Shell-Transformation (Abb. 3f). Ca/P 3,3: vollständig Yolk-Shell-Mikrokugeln (Abb. 3h). Bruchkugeln und exponierte Kerne (Inset Abb. 3g) belegen Hohlstruktur zwischen Eigelb und Schale. Bildungsmechanismus: Niedriges Ca/P → poröse ACP-Mikrokugeln (Inhibition durch ATP/CG-Derivate auf Oberfläche). Erhöhtes Ca/P → metastabiles ACP wächst weiter (hohe Übersättigung). Kristallines HAp bildet auf externer Oberfläche (HRTEM Abb. 3i: Gitterabstand 0,308 nm → (210) von HAp). Hohlstrukturen durch Volumen-/Dichtedifferenz HAp vs. ACP. EDS-Mapping: Ca, P, O gleichmäßig verteilt. EDS (Abb. 3k) und XPS (Abb. 3l): Hauptelemente Ca, P, O – konsistent mit FTIR.

Einfluss hydrothermaler Zeit/Temperatur bei Ca/P=3,3 (Abb. 4): t=5 min: poröse Mikrokugeln. t=15 min: Yolk-Shell (Abb. 4c,d). t=60 min oder T=160 °C: Blätter/Röhrenbündel (Abb. 4e-l). Transformation porös → Yolk-Shell → Blatt/Stab durch weiteres ACP-Wachstum via kontinuierlicher Hydrolyse. Hydrolyse von ATP/CG-Derivaten auf ACP-Oberfläche beschleunigt ACP-Wachstum. Interessant: bei 60 min/160 °C Blätter/Stäbe auch aus ACP-Nanopartikeln entwickelt (rote Boxen), bestätigt per DTA (Abb. S1): exothermer Peak 650 °C → ACP-Kristallisation. Peak schwächer mit Zeit/Temperatur → Transformation ACP zu kristallinem Calciumphosphat.

Chemische Konstitution/Struktur bei Ca/P=3,3 unter verschiedenen Bedingungen per FTIR/XRD (Abb. 5): FTIR (Abb. 5a): HAp PO₄³⁻ Peaks 1037, 603 cm⁻¹; ACP PO₄³⁻ 1122 cm⁻¹; CG C=O 1620, C-O 1383 cm⁻¹; ATP P-O 912 cm⁻¹. Mit Zeit/Temperatur: CG/ATP-Peaks abnehmend (weitere Hydrolyse), HAp-Peaks zunehmend, ACP-Peaks abnehmend → Kristallphasentransformation zu HAp. XRD (Abb. 5b): amorpher Hump bei 2θ≈30° (5, 15 min). 60 min oder 160 °C: vollständige Transformation zu HAp (JDCPS 09-0432). Zunahme relativer Intensitäten (211), (300), (002) → erhöhte Kristallinität. XRD/FTIR bestätigen Phasentransformation mit Zeit/Temperatur.

ATP-CL Yolk-Shell-Mikrokugeln

Zum Adsorptionsvergleich ATP-CL per Mikrowellenhydrothermal [24]. Morphologie: weiterhin Yolk-Shell (Bruchkugeln Inset Abb. 6a, TEM Abb. 6b,c). Calciumquellenwechsel keine signifikante Morphologieänderung. SAED: diskrete Spots (Abb. 6d) → gut kristallisierte Mikrokugeln. EDS-Mapping (Abb. 6e): gleichmäßige Ca, P, O Verteilung. EDS (Abb. 6f): Ca, P, O vorhanden → Calciumphosphat.

HEL-Adsorption und Adsorptionsmechanismus

Abb. 7: Adsorptionskapazität beider Mikrokugeln steigt mit HEL-Anfangskonzentration. ATP-CG: Plateau bei 6,5 mg/ml, max. Kapazität ~332 ± 36 mg/g (Abb. 7a) – ca. doppelt so hoch wie ATP-CL (176 ± 33 mg/g, 6 mg/ml, Abb. 7b).

FTIR/TGA unterstützen Ergebnis (Abb. 8): HEL-adsorbierte Mikrokugeln zeigen ACP/HAp PO₄³⁻ Peaks (1134/1139, 563/568, 1039/1040 cm⁻¹) – keine signifikante Strukturänderung. Amid-Peaks HEL bei 1542/1545 cm⁻¹, CH₃/CH₂-Banden 2966–2927 cm⁻¹ in HEL-beladenen Mikrokugeln → erfolgreiche HEL-Adsorption. TGA: ATP-CG Gewichtsverlust vor/nach HEL 11,3 % / 36,7 % → ~340 mg/g HEL-Kapazität. ATP-CL: 21,1 % / 37 % → 189 mg/g. TGA-Ergebnisse nahe Abb. 7.

Ursache Kapazitätsunterschied: Gleichgewichtsadsorptionsdaten per D-R-Modell analysiert (Abb. 9, Tabelle 1). Korrelationskoeffizient ATP-CG > ATP-CL → D-R-Modell besser für ATP-CG. E < 8 kJ/mol → physikalische Sorption. Maximale Kapazität Qm ATP-CG ~381 mg/g – nahe Abb. 7a.

Da physikalische Sorption: Oberflächenpotenzial untersucht (Abb. 10a). Zeta-Potenzial ATP-CG, ATP-CL, HEL in Ultrapure Wasser: –17 mV, –22 mV, +20 mV. Nach HEL-Adsorption: ATP-CG +2,7 mV, ATP-CL +1,5 mV → Adsorption durch anziehende elektrostatische Kraft. Aber keine signifikante Zeta-Potenzialdifferenz zwischen Mikrokugeln (–17 vs. –22 mV) → elektrostatische Anziehung nicht Hauptursache Kapazitätsunterschied.

Weitere Aufklärung: Spezifische Oberfläche (Abb. 11a). BET SBET ATP-CG 143 m²/g – ca. dreimal ATP-CL (55 m²/g, Tabelle 2). Spezifische Oberfläche trägt zu Kapazitätsunterschied bei. Hohe SBET ATP-CG mainly durch niedrige Kristallinität [31]. Abb. 11b: ATP-CG niedrigere Kristallinität als ATP-CL. Kristallinitätsunterschied hauptsächlich durch unterschiedliche Synthesebedingungen. Allgemein: Kristallinität steigt mit Hydrolysegrad unter gegebenem Druck/Temperatur. Gluconsäure (pKa=3,39) saurer als Milchsäure (pKa=3,86) → langsamere Hydrolyserate → niedrigere Kristallinität. ATP-CG mit höherer SBET durch Calciumquellenwechsel erhalten.

Schlussfolgerungen

ATP-CG Yolk-Shell-Mikrokugeln entworfen mit ATP als organische Phosphorquelle und CG als organische Calciumquelle via mikrowellenunterstützter Hydrothermalmethode. Mikrokugeln zeigen hohe spezifische Oberfläche und Adsorptionskapazität. Einflüsse von Ca/P, hydrothermaler Temperatur und Zeit auf Morphologie/Struktur untersucht. Organische Phosphor- und Calciumquellen haben signifikanten Effekt auf Yolk-Shell-Bildung. Hydrothermale Bedingungen (Ca/P, Zeit, Temperatur) verantwortlich für Yolk-Shell-Formation. Spezifische Oberfläche und Oberflächenchemie (Oberflächenpotenzial) sind zwei Schlüsselfaktoren für Adsorptionskapazität, durch Vergleich HEL-Adsorption zweier Mikrokugeln mit unterschiedlichen Calciumquellen ermittelt.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle die Schlussfolgerungen stützenden Daten sind im Artikel enthalten.

Abkürzungen

BET:

Brunauer-Emmett-Teller-Messungen

FTIR:

Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

XRD:

Röntgendiffraktion

TGA:

Thermogravimetrie

HRTEM:

Hochauflösende TEM

SAED:

Selektierte-Bereich-Elektronenbeugung