Wiederhergestellte microRNA-133a-3p oder abgereichertes PSAT1 hemmt durch Schädigung des Endothelzellschadens induziertes intrakranielles Aneurysma durch Unterdrückung des GSK3β/β-Catenin-Wegs

Präsentation der Hypothese

In dieser vorliegenden Studie könnten wir spekulieren, dass die miR-133a-3p/PSAT1-Achse die durch Endothelzellschädigung induzierte IA durch Modulation des GSK3β/β-Catenin-Signalwegs beeinflussen könnte.

Testen der Hypothese

Um diese Hypothese zu verifizieren, sammelten wir klinische Proben, Endothelzellen (ECs) der menschlichen IA und etablierten IA-Rattenmodelle, um die Funktionen von miR-133a-3p und PSAT1 im IA-Prozess aufzuklären.

Implikationen der Hypothese

Unsere Studie bestätigt unsere Hypothese, dass eine Überexpression von miR-133a-3p oder eine Herunterregulierung von PSAT1 Endothelzellschäden hemmt und die Endothelzellproliferation durch Hemmung des GSK3β/β-Catenin-Signalwegs bei IA vorantreibt. Diese Ergebnisse liefern einen neuen Einblick in eine neuartige Zieltherapie für IA.

Einführung

Das intrakranielle Aneurysma (IA) ist eine Art zerebrovaskuläre Erkrankung, die durch eine unkonventionell vorgewölbte Arterie im Gehirn sowie eine durch eine IA-Ruptur verursachte Subarachnoidalblutung (SAH) gekennzeichnet ist, die mit einer hohen Letalität und Morbidität einhergeht [1]. Da es sich um eine destruktive Erkrankung handelt, ist die Pathogenese der IA nicht geklärt [2]. Die IA ist eine seltene familiäre Form, wird jedoch allgemein als Folge einer erworbenen Gefäßschädigung durch Bluthochdruck, Rauchen und andere traditionelle Risikofaktoren angesehen [3]. Endovaskuläres Coiling oder mikrochirurgisches Clipping wurden verwendet, um eine zukünftige Ruptur eines nicht rupturierten Aneurysmas bei Patienten mit hohem Rupturrisiko zu verhindern [4]. Obwohl bei IA-Operationen erhebliche Fortschritte erzielt wurden, zeigt sich bei IA-Patienten immer noch eine schlechte postoperative Erholung [5]. Die schwierige Situation der IA-Behandlung macht es notwendig, den Mechanismus weiter zu erforschen und eine neue therapeutische Strategie zu finden.

MicroRNAs (MiRNAs) sind eine Klasse nicht-kodierender RNAs, die die Expression von Zielgenen modulieren, indem sie die Translation auf posttranskriptioneller Ebene hemmen oder den mRNA-Abbau vermitteln [6]. Es wurde gezeigt, dass miR-133a-3p als Tumorinhibitor bei mehreren malignen Neoplasien und eine Überexpression von miR-133a-3p das Wachstum von Darmkrebszellen (CRC) hemmen kann [7]. Eine frühere Studie hat behauptet, dass miR-133a-3p angesichts der Blockierung der Autophagie-vermittelten Glutaminolyse die Metastasierung und das Wachstum von Magenkrebs weiter unterdrückt [8]. Eine Studie hat auch gezeigt, dass miR-133a-3p an der Regulierung der Herzentwicklung und der Herzhypertrophie beteiligt ist [9]. Eine Studie hat gezeigt, dass die Hochregulation von miR-195-5p die Angiogenese und Cisplatin-Resistenz bei Eierstockkrebs durch die Unterdrückung des Phosphoserin-Aminotransferase 1 (PSAT1)-abhängigen GSK3β/β-Catenin-Signalwegs verringert [10]. Eine andere Studie hat berichtet, dass miR-365 die Zellinvasion und das Zellwachstum bei Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus (ESCC) durch Modulation von PSAT1 unterdrückt [11]. PSAT1 ist ein Enzym, das an der Serinbiosynthese beteiligt ist; es wird ursprünglich aus dem Schafhirn gereinigt und weist in vielen Geweben hohe Konzentrationen auf [12]. Es wurde dokumentiert, dass PSAT1 die Zellzyklusprogression bei Brustkrebs durch Modulation des GSK3β/β-Catenin-Signalwegs vermittelt [13]. Liuet al. weist außerdem darauf hin, dass PSAT1 eine Rolle bei der Entwicklung von ESCC spielt und ein schlechtes Überleben prognostiziert; Daher kann es ein vielversprechendes Ziel für Krebstherapeutika sein [14]. Angesichts der oben genannten Analysen wurde erwartet, dass diese Studie einen Beitrag zu einem neuen Ansatz für die funktionelle Rolle der miR-133a-3p/PSAT1/GSK3β/β-Catenin-Achse bei IA leistet.

Materialien und Methoden

Ethikerklärung

Die Studie wurde vom Institutional Review Board des First Teaching Hospital der Tianjin University of Traditional Chinese Medicine genehmigt. Alle Teilnehmer unterschrieben eine Einverständniserklärung. Alle Tierversuche wurden mit dem Guide for the Care and Use of Laboratory Animal by International Committees zusammengezählt.

Studienfächer

Von Januar 2016 bis März 2018 wurden die Fälle von SAH durch IA ausgewählt, die in der Neurochirurgie des First Teaching Hospital der Tianjin University of Traditional Chinese Medicine behandelt wurden. Die pathologischen Proben von 75 mikrochirurgisch gewonnenen IA-Fällen wurden gesammelt und als IA-Gruppe klassifiziert, darunter 29 Männer und 46 Frauen im Alter von 31–55 Jahren mit einem Durchschnittsalter von 44,98 ± 6,79 Jahren. Als Kontrollgruppe wurden Patienten mit Hirntrauma ausgewählt, die gleichzeitig in der Neurochirurgie im First Teaching Hospital der Tianjin Universität für Traditionelle Chinesische Medizin behandelt wurden. Außerdem wurden 75 Fälle von normalem Gewebe der intrakraniellen Arteriolen durch traumatische Operationen oder interne Dekompressionen angesammelt, darunter 43 Männer und 32 Frauen im Alter von 34–56 Jahren mit einem Durchschnittsalter von 48,14 ± 8,68 Jahren. Patienten wurden ausgeschlossen, wenn sie Bluthochdruck, Diabetes oder Tumoren in der Vorgeschichte hatten. Es gab keinen deutlichen Unterschied in Geschlecht und Alter zwischen der IA-Gruppe und der Kontrollgruppe (beide P> 0,05).

Behandlung und Konservierung von Proben

Nach der chirurgischen Resektion wurden einige der Proben in zwei Gruppen mit Formaldehyd fixiert, mit Gradientenalkohol von niedriger bis hoher Konzentration dehydratisiert und mit Paraffin eingebettet. Dann wurden die Proben für Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung und immunhistochemische Färbung geschnitten. Einige Proben wurden schnell in Flüssigstickstofftanks gegeben und dann zum Nachweis der Western-Blot-Analyse und der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) der reversen Transkription in einen – 80 °C kryogenen Kühlschrank überführt. Einige Proben wurden mit Glutaraldehyd zur elektronenmikroskopischen Beobachtung fixiert und einige Proben wurden zur Isolierung von ECs verwendet.

Elektronenmikroskop-Beobachtung

Proben wurden mit 3% Glutaraldehyd fixiert und dann mit 1% Osmiumtetroxid erneut fixiert. Die Proben wurden mit Aceton entwässert, mit Epon812 eingebettet und in halbdünne Schnitte mit einer Dicke von 3 µm geschnitten. Zuletzt wurden die Proben mit Uranylacetat und Bleicitrat doppelt gefärbt und mit einem H-600IV Transmissionselektronenmikroskop (Hitachi, Tokio, Japan) beobachtet.

HE-Färbung

Die vorbereiteten Paraffinschnitte wurden 30 min bei 60 °C gebacken. Nachdem die obigen Schritte abgeschlossen waren, wurden die Gewebeschnitte in Xylol fixiert, mit absolutem Gradientenalkohol entwässert und mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gereinigt. Die Gewebeschnitte wurden mit Hämatoxylin gefärbt, einige Sekunden in Ammoniak behandelt, 2 min mit Eosin gefärbt, entwässert und geklärt. Dann wurden die Gewebeschnitte mit neutralem Gummi betropft und mit Deckglas versiegelt. Schließlich wurde ein Mikroskop (Nikon, Tokio, Japan) zum Beobachten und Aufzeichnen verwendet.

Immunhistochemische Färbung

Das Immunhistochemie-Kit wurde von Zymed Laboratories (San Francisco, CA, USA) hergestellt. Die Paraffinscheiben wurden entparaffiniert und hydratisiert, und die Paraffinscheiben wurden 5 min × 3 Mal in Xylollösung eingetaucht. Die Scheiben wurden 3 min × 2 Mal in 100 % absolutem Alkohol eingelegt und dann abwechselnd für 3 min in 95–75 % Alkohol eingeweicht. Nach dem Entparaffinieren wurden die Schnitte mit 3% Wasserstoffperoxid für 15 min inkubiert, um die Aktivität der endogenen Peroxidase zu eliminieren. Die Schnitte wurden mit Blockierungslösung betropft und mit normaler Ziegenserum-Arbeitslösung 15 min inkubiert, dann mit primärem Antikörper gegen Matrixmetalloprotease (MMP)-9 (5 µg/ml) und vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF) (1:250 .) sondiert , Abcam, Cambridge, MA, USA) (PBS für Negativkontrolle (NC)) und 1–2 h inkubiert. Die Schnitte wurden erneut mit Biotinylierungs-Sekundärantikörper-Arbeitslösung für 30–60 Minuten sondiert. Die Schnitte wurden mit Streptavidin/Peroxidase-Arbeitsflüssigkeit, markiert mit Meerrettich-Peroxidase, hinzugefügt, mit neu hergestellter Diaminobenzidin-(DAB)-Lösung getropft, gegengefärbt und blockiert. Das Bild wurde mit dem Nikon SPOT FlexTM-Bildgebungssystem bekannt gemacht. Der Bereich der MMP-9- und VEGF-Proteinexpression wurde durch eine immunhistochemische quantitative Analysesoftware gemessen. Fünf starke Gesichtsfelder wurden zufällig im Ansammlungsbereich positiver Zellen in jeder Probe nachgewiesen, und die durchschnittliche Extinktion jedes Screens wurde als Mittelwert für die statistische Analyse verwendet.

Isolation und Kultur von ECs

Die ECs wurden aus normalen intrakraniellen Arteriolengeweben und IA-Geweben isoliert und kultiviert. Das Gewebe wurde in 3 mm ² . geschnitten Fragmente und inkubiert für 25 min in 0,1% Collagenase B/0,1% Dispase (Roche, Basel, Schweiz). Das Gewebe wurde abgelöst, 2 min mit einer 2-ml-Pipette verrieben und DURCH ein 100-&mgr;m-Sieb (BD Biosciences, NJ, USA) filtriert, um ECs zu isolieren. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert und dann in einem Kulturmedium MV2 resuspendiert, das Wachstumsfaktoren und 20 % fötales Rinderserum (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) enthielt. Als nächstes wurden die Zellen auf mit Fibronektin (Sigma Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) beschichteten Schalen mit einer Dichte von 10 ⁴ . ausgesät Zellen/cm ² (1 μg/cm ² ) und 1 Tag lang mit 5 % CO₂ grown gezüchtet . Am Tag nach der Aussaat wurden die Zellen mit PBS gespült, um nicht gebundene Zellen zu entfernen, und in ein frisches Medium gegeben. Bei Erreichen einer Konfluenz von etwa 80–100 % wurden die Kulturen einer Immunseparation durch mit Ulex europaeus Agglutinin I (UEA) beschichtete (Vector Laboratories, Ltd., Peterborough, UK) Kügelchen (Dynabeads M-450 Tosylactivated, Oxoid, Hampshire, UK) ausgesetzt erhalten reine ECs. An die lektinbeschichteten Kügelchen gebundene ECs wurden mit einem Magnetpartikelkonzentrator angesammelt, während ungebundene Zellen durch zweimaliges Waschen mit Basalmedium entfernt wurden. UEA-positive Zellen wurden in Kulturmedium resuspendiert und auf mit Fibronektin beschichteten Schalen ausgesät, um ihre Adhäsion und ihr Wachstum zu verbessern. Die Kulturen wurden innerhalb von 4–6 Tagen konfluent.

Identifizierung von ECs

Die ECs wurden durch immunzytochemische Färbung mit einem Zelloberflächen-CD31-Antikörper und einem FVII-Faktor-verwandten Antigen identifiziert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gereinigt, mit 4% Paraformaldehyd fixiert, mit 3% H₂ . inkubiert O₂ für 10–15 min, um die endogene Peroxidase-Aktivität zu eliminieren, und dann mit 0,1 % Triton X-100 für 10 min inkubiert, um perforierte Zellen zu erhalten. Die Zellen wurden mit spezifischem Primärantikörper:Faktor VII (1:200), CD31 (1:400, Roche, Basel, Schweiz) getropft und bei 4 °C über Nacht inkubiert. Dann wurden die Zellen mit Immunglobulin G (1:50), das mit sekundärem Meerrettichperoxidase-Antikörper markiert war, getropft. Die Zellen wurden 45 min bei 37 °C inkubiert und durch DAB 4 min unter Vermeidung von Licht entwickelt. Dann wurde die Farbentwicklung mit destilliertem Wasser beendet und die Fotografie unter dem Mikroskop betrachtet. Die Zellen wurden unter dem Fluoreszenz-Inverted-Phase-Differenz-Mikroskop beobachtet, und die positiven Zellen und die Gesamtzahl der Zellen wurden zufällig aus 10 Gesichtsfeldern gezählt. Die Zellrate der positiven Färbung =(die Anzahl der positiven Zellen/die Gesamtzahl der Zellen) × 100 %. Die entsprechende NC-Gruppe wurde etabliert und der primäre Antikörper wurde durch PBS ersetzt und die anderen Schritte wurden wie oben durchgeführt.

Gruppierung und Transfektion von Zellen

Um die Wirkungen zwischen miR-133a-3p und PSAT1 auf ECs von IA zu untersuchen, wurden ECs in Kontrollgruppen (normale vaskuläre ECs ohne Transfektion), IA-Gruppe (IA-vaskuläre ECs ohne jegliche Transfektion), mimic NC-Gruppe (transfiziert mit miR -133a-3p mimic NC), miR-133a-3p mimic group (transfiziert mit miR-133a-3p mimic), kleine interferierende RNA (si)-NC Gruppe (transfiziert mit si-PSAT1 NC), si-PSAT1 Gruppe (transfiziert mit si-PSAT1) und miR-133a-3p-Mimic + Überexpression (oe)-PSAT1-Gruppe (transfiziert mit miR-133a-3p-Mimic und oe-PSAT1). Unter ihnen wurden mimic NC, miR-133a-3p mimic, si-PSAT1, si-NC und oe-PSAT1 von GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, China) entwickelt und komponiert. Die Transfektion wurde in strikter Übereinstimmung mit den Anweisungen von Lipofectamine ^TM . durchgeführt 2000 Transfektionsreagenz (Thermo Fisher Scientific, MA, USA).

Durchflusszytometrie

Das Medium in der Kulturschale wurde verworfen und die Zellen wurden zweimal mit PBS gespült. Die Zellen wurden mit 0,25 % Trypsin abgelöst, 5 min bei 800 U/min zentrifugiert und mit 1 × Bindungspuffer suspendiert, und die Zelldichte wurde auf 1 × 10 7 . eingestellt Zellen/ml. Die Zellsuspension (100 µL) wurde mit 5 µL Propidiumiodid (PI, 20 µg/mL) und Annexin V-FITC für 20 min inkubiert, dann mit 400 µL 1 x Bindungspuffer gemischt. Ein Durchflusszytometer (BD FACSARial I cell sorter) wurde verwendet, um die Zellapoptose innerhalb von 1 h nachzuweisen. Das Ergebnis war, dass der linke untere Quadrant (Q4) auf der Streukarte gesunde lebende Zellen zeigte (FITC ⁻ /PI ⁻ ), der rechte untere Quadrant (Q3) als die frühen apoptotischen Zellen (FITC ⁺ /PI ⁻ ) und der rechte obere Quadrant (Q2) waren die späten apoptotischen und apoptotischen Zellen (FITC ⁺ /PI ⁺ ); Apoptoserate =Prozentsatz der frühen Apoptose (Q3) + Prozentsatz der späten Apoptose (Q2).

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-Yl)-2, 5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay

Die Zellen wurden mit Trypsin abgelöst, um eine Zellsuspension herzustellen. Die Zellen wurden unter einem umgekehrten Mikroskop gezählt. Die Zellkonzentration wurde auf 5 × 10 ⁴ . eingestellt Zellen/ml. Die Zellen wurden in eine Kulturplatte mit 96 Vertiefungen ausgesät. Nach 48 h wurden die Zellen 4 h mit 20 µl MTT-Lösung inkubiert. MTT in jeder Vertiefung wurde mit 150 &mgr;l Dimethylsulfoxid gelöst. Der Wert der optischen Dichte (OD) von ECs wurde bei einer Wellenlänge von 570 nm gemessen. Die Proliferationsrate von ECs wurde anhand des OD-Werts berechnet.

Kratztest

Die Zellen in jeder Gruppe wurden in eine 24-Well-Platte mit 2 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen/Well. In jede Gruppe wurden drei parallele Vertiefungen gesetzt. Wenn eine Konfluenz von etwa 90 % erreicht war, wurde die Zellwachstumsebene mit einer sterilisierten 1-ml-Mikropipettenspitze zum Einmalgebrauch angekratzt; jede Vertiefung wurde einmal angekratzt und die Kratzlänge und -tiefe jeder Vertiefung waren konsistent. Nach dem Kratzen wurden die schwimmenden Zellen entfernt, das Kulturmedium durch frisches ersetzt und der Kratzabstand nach 24 h Kultur unter dem Mikroskop beobachtet. Der heilende Bereich der Kratzwunde wurde von der Software National Instrument Vision Assistant 8.6 gezählt. Die Zellmigration =Wundheilungsfläche/anfängliche Kratzwundefläche × 100 %.

Versuchstiere und Etablierung von IA-Rattenmodellen

84 Sprague-Dawley (SD)-Ratten im Alter von 7 Wochen und einem Gewicht von 180 bis 200 g (Laboratory Animals Center, Academy of Military Medical Sciences, Peking, China) wurden ausgewählt. Die Ratten wurden im Tierversuchszentrum untergebracht. Die Fütterungsbedingungen wurden bei 22–25 °C und 50–60 % Luftfeuchtigkeit mit natürlichem Licht kontrolliert. Alle Ratten wurden in Standard-Rattenkäfigen mit 4 Ratten pro Käfig gefüttert. Die Ratten wurden mit städtischem sanitärem Trinkwasser und gewöhnlichem Rattenfutter gefüttert. Die Kissen wurden alle 3 Tage gewechselt und der Käfig wurde gewaschen und sterilisiert. Die IA-Ratten wurden gemäß der Referenz [15] modelliert. Ein rupturiertes Aneurysma wurde identifiziert, wenn bei Ratten folgende Symptome auftraten [16]:1, verminderte Ess- oder Trinkaktivität durch Gewichtsverlust (ca. 10 % Gewichtsverlust) über 24 h; 2, Beugung des Rumpfes und der Vordergliedmaßen beim Anheben; 3, auf einer Seite in normaler Haltung gehen; 4, in Ruhe zur Seite gelehnt, keine Spontanaktivität. Die Ratten mit diesen Symptomen wurden 3 Monate nach der Operation euthanasiert. IA-Gewebe wurde während der Operation entnommen und mit PBS perfundiert, und der blaue Farbstoff, der Glutaminsäure enthielt, wurde in die Hirnarterie perfundiert.

Behandlung und Intervention von IA-Ratten

Die oben genannten 84 Ratten wurden zufällig in 7 Gruppen mit 12 Ratten in jeder Gruppe aufgeteilt. Die Behandlungsmethoden waren wie folgt:normale Gruppe (es wurde keine Modellierung durchgeführt); IA-Gruppe (stereotaktisch injiziert mit 100 &mgr;l Mischung aus PBS und Lipofectamine 2000); mimic NC-Gruppe (stereotaktische Injektion mit 100 &mgr;l Mischung aus miR-133a-3p mimic NC und Lipofectamine 2000); miR-133a-3p-Nachahmergruppe (stereotaktische Injektion mit 100 &mgr;l Mischung aus miR-133a-3p-Nachahmer und Lipofectamin 2000); si-NC-Gruppe (stereotaktische Injektion mit 100 µl Mischung aus si-PSAT1 NC und Lipofectamine 2000); si-PSAT1-Gruppe (stereotaktische Injektion mit 100 &mgr;l Mischung aus si-PSAT1 und Lipofectamine 2000); und miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1-Gruppe (stereotaktische Injektion mit 100 µl Mischung aus miR-133a-3p mimic und oe-PSAT1 und Lipofectamine 2000). Alle oben genannten Injektionen wurden einmal täglich durchgeführt und diese Ratten wurden 12 Wochen lang in einem spezifischen pathogenfreien (SPF) Tierlabor aufgezogen. Nach 12 Wochen wurden die Ratten in jeder Gruppe anästhesiert und die Brusthöhle wurde wie oben beschrieben geöffnet. Aus dem in die Aorta intubierten linken Ventrikel wurde Blut durch Durchschneiden der Cava freigesetzt. Gleichzeitig wurden 30 ml Kochsalzlösung mit Heparin-Natrium (37 °C) durch den Gang perfundiert, und dann wurde 10 % Polyformaldehyd/0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) langsam durch den Gang in das Gehirn injiziert. Nachdem die Perfusion fixiert war, wurde das Gehirn geöffnet. Der Arterienring an der Schädelbasis wurde durchtrennt und unter dem Operationsmikroskop entfernt, die Veränderungen der Aneurysmen wurden unter dem Mikroskop beobachtet und die pathologischen Charakteristika wurden begutachtet. Die Mimic NC, miR-133a-3p Mimic, si-NC, si-PSAT1 und oe-PSAT1 wurden von Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China) hergestellt.

Erkennung der Hämodynamik

Die Blutflussrate am Ende der linken Arteria carotis communis von Ratten wurde vor 3 Tagen der Operation und 12 Wochen nach der Interventionsbehandlung getestet. Die Methode war wie folgt:Die Ratten wurden zur Inhalation in den Tierrahmen des Anästhesiegeräts gesetzt und die Flussparameter wurden angepasst. Nachdem die Ratten stabil geatmet hatten und es keine offensichtliche Reaktion gab, wenn der Schwanz der Ratten berührt wurde, wurden die Ratten mit einem Gummiband auf dem experimentellen Operationstisch fixiert. Das Nackenhaar der Ratte wurde mit einem Elektrorasierer rasiert. Der Farbdoppler-Ultraschalldetektor wurde eingeschaltet, und die Blutflussgeschwindigkeit am Ende der linken Arteria carotis communis wurde gemessen und die Daten wurden aufgezeichnet, nachdem die Sonde mit einem geeigneten Kopplungsmittel bestrichen wurde. Nach der Messung wurden die Ratten vorsichtig zurück in den Käfig gesetzt, um die Atemwege frei zu halten, bis die Ratten nach der Narkose aufwachten.

RT-qPCR

Die Gesamt-RNA wurde auf der Grundlage des einfachen RNA-Gesamt-RNA-Extraktionskits (TIANGEN Biotechnology Co., Ltd., Peking, China) abstrahiert. Die hochwertige RNA wurde durch UV-Analyse und Formaldehyd-Denaturierungselektrophorese bestätigt, und die RNA wurde mit dem PrimeScript RT-Reagenzien-Kit in komplementäre DNA revers transkribiert. Die PCR-Reaktion wurde mit SYBR Permix Ex Taq ^II . durchgeführt (Takara, Dalian, Liaoning, China). PCR-Primer wurden von Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Beijing, China) entwickelt und zusammengesetzt (Tabelle 1). U6 wurde als interner Parameter für miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-Catenin, Bax, Bcl-2, Ki-67 und CyclinD1 mit Glyceraldehydphosphatdehydrogenase (GAPDH) als internem Parameter ausgewählt. Die Daten wurden mit 2 ^−ΔΔCt . gemessen .

Western Blot-Analyse

Die Gesamtproteine ​​wurden aus Zellen und Geweben extrahiert und die Proteinproben wurden mit dem Bicinchoninsäure-Protein-Assay-Kit (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China) quantifiziert. Die Proben wurden mit 1/4 Volumen 5 × Probenpuffer gemischt und 5 min gekocht. Das 10 % Trenngel und das 5 % konzentrierte Gel wurden für die Elektrophorese ausgewählt. Die Membran wurde 60 min in 5% Magermilchpulver ausgebrütet. An die Membran wurde der primäre Antikörper PSAT1 (1:500), GSK3β (1:500), β-Catenin (1:5000), Bax (1:1000), Bcl-2 (1:1000), CyclinD1 (1:200), Ki-67 (1:5000), MMP-9 (1 µg/ml), VEGF (1:1000) (alle von Abcam, Cambridge, MA, USA). Dann wurde die Membran mit sekundärem Antikörper (1:2000) für 60 min ausgebrütet. Die Membran wurde 1 min in die Elektrochemilumineszenz-Reaktionslösung (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China) getaucht, dann nach Entfernen der Flüssigkeit mit einer Lebensmittelfolie abgedeckt. Die Membran wurde mit Röntgenstrahlen belichtet und das Ergebnis nach Entwicklung und Fixierung beobachtet. GAPDH (1:10.000, Abcam) wurde als Ladekontrolle verwendet und das Proteinbild wurde mit der ImageJ2x-Software analysiert.

Dualer Luciferase-Reporter-Gen-Assay

Die Zielbeziehung zwischen miR-133a-3p und PSAT1 und die Bindungsstelle zwischen miR-133a-3p und PSAT1 3′ untranslated region (3′UTR) wurden von einer Bioinformatik-Website (https://cm.jefferson.edu/rna22 .) vorhergesagt /Vorberechnet/). Die Sequenz der PSAT1 3'UTR-Promotorregion, die die miR-133a-3p-Bindungsstelle enthält, wurde amplifiziert und in das pGL3-basische Luciferase-Plasmid (Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Japan) kloniert, um das Wildtyp-(WT)-Plasmid zu konstruieren ( PSAT1-WT) von PSAT1 3′UTR, während das mutante (MUT) rekombinante PSAT1-MUT-Plasmid durch Mutieren der miR-133a-3p-Bindungsstelle auf PSAT1-WT mit einem Punktmutationskit (Takara Bio Inc., Otsu, Shiga .) formuliert wurde , Japan). Die vaskulären ECs in der logarithmischen Wachstumsphase wurden in eine 96-Well-Platte ausgesät. Wenn die Konfluenz etwa 70 % erreicht, wurden die PSAT1-WT- und PSAT1-MUT-Plasmide mit nachahmenden NC- und miR-133a-3p-nachahmenden Plasmiden durch Lipofectamine 2000 gemischt und in vaskuläre ECs cotransfiziert. Die Zellen wurden gesammelt und 48 h nach der Transfektion lysiert, und die Luciferase-Aktivität wurde mit einem Luciferase-Nachweiskit (Promega Corporation, Madison, WI, USA) verifiziert.

Statistische Analyse

Alle Daten wurden mit der Software SPSS 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA) expliziert. Die Aufzählungsdaten wurden als Rate oder Prozentsatz angegeben und die Analyse wurde durch Chi-Quadrat-Test oder Fisher-Test bestimmt. Die normalverteilten Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung übermittelt. Der Vergleich zwischen zwei Gruppen wurde von t . durchgeführt Test, während der Vergleich zwischen mehreren Gruppen durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test analysiert wurde. A P Wert <0,05 wurde als signifikant angesehen.

Ergebnisse

Allgemeine Daten von Patienten mit IA

Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurden die allgemeinen Daten der IA-Gruppe und der Kontrollgruppe verglichen. Die spezifischen Informationen sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Ausdruck von miR-133a-3p hängt mit Anzahl und Größe von IA zusammen

Durch die Analyse der Beziehung zwischen der miR-133a-3p-Expression und den klinisch-pathologischen Merkmalen von IA wurde in Tabelle 3 detailliert dargestellt, dass angesichts der durchschnittlichen relativen Expression von miR-133a-3p in IA 75 Fälle von IA auf zwei verteilt wurden Gruppen:miR-133a-3p Gruppe mit hoher Expression (n =47) und miR-133a-3p Gruppe mit niedriger Expression (n =28). Die Beziehung zwischen miR-133a-3p und verschiedenen klinisch-pathologischen Parametern wurde statistisch durch Chi-Quadrat-Test oder Fisher-Test analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Expression von miR-133a-3p nicht mit Alter, Geschlecht, Form und Position des Aneurysmas zusammenhing (alle P> 0,05), aber assoziiert mit Anzahl und Größe des Aneurysmas (beide P <0,05).

MiR-133a-3p-Expression ist zurückgegangen und die Expression von PSAT1, GSK3β und β-Catenin ist in IA-Geweben erhöht

Die Expression von miR-133a-3p in IA wurde durch RT-qPCR bestimmt, und die Ergebnisse zeigten, dass in Bezug auf das normale Gewebe der intrakraniellen Arteriolen (die Kontrollgruppe) die Expression von miR-133a-3p in den IA-Geweben (das IA-Gruppe) (P <0,05) (Abb. 1a). RT-qPCR- und Western-Blot-Analysen zeigten, dass die Expression von PSAT1, GSK3β und β-Catenin in den IA-Geweben im Vergleich zu den normalen Geweben der intrakraniellen Arteriolen (alle P <0,05) (Abb. 1a–c).

Die Expression von MiR-133a-3p wird verringert und die Expression von PSAT1, GSK3β und β-Catenin wird in IA-Geweben erhöht. a Expression von miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β und β-Catenin in der IA-Gruppe und der normalen Gruppe. b Proteinbande der PSAT1-, GSK3β- und β-Catenin-Expression. c Proteinexpression von PSAT1, GSK3β und β-Catenin in der IA-Gruppe und der normalen Gruppe durch Western-Blot-Assay. n =75, *P <0,05 gegenüber der Kontrollgruppe. Die Messdaten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und Vergleiche zwischen zwei Gruppen wurden von unabhängigen Stichproben durchgeführt t testen

Pathologische Veränderungen des Aneurysmas und der MMP-9- und VEGF-Expression in IA-Geweben

Durch direktes Beobachten des normalen intrakraniellen Arteriolengewebes und des IA-Gewebes wurde gezeigt, dass in der Kontrollgruppe die Gefäße in den Arteriengeweben leuchtend rot waren und keine offensichtlichen atherosklerotischen Plaques und seitlichen Thromben im Lumen gefunden wurden. Der Tumor des Aneurysmagewebes der IA-Gruppe war meist braun oder dunkelrot, und das Aussehen war skrotiform oder fusiformis, und die Textur war meist zäh. Wenn der Tumor aufgeschnitten wurde, erschienen weiße oder dunkelrote atherosklerotische Plaques an der Tumorwand einiger Tumorproben, die flach, rund oder oval waren. In einigen Tumorproben war ein wandförmiger Thrombus in der Tumorhöhle vorhanden und die Textur des Thrombus war weich. Die Dicke der Tumorwand wurde vom Hals des Tumors allmählich dünner, von denen einige nur eine dünne Fasermembran an der Spitze des Tumors hatten, und einige von ihnen waren sogar gerissen. Die Spalte des geplatzten Aneurysmas befand sich an oder nahe der Spitze des Tumors.

Die HE-Färbung zeigte, dass unter dem Lichtmikroskop die Wanddicke des normalen Gewebes der intrakraniellen Arteriolen einheitlich war; die anatomische Struktur der inneren, mittleren und äußeren Schichten war klar und intakt; die Morphologie der Zellen in jeder Schicht war normal; das Sarkolemma der benachbarten Zellen bildete sich oft eng; und die entzündlichen Zellen der Wand waren selten. In der IA-Gruppe wurden die in der distalen lateralen Gefäßhöhle am oberen Ende der Bifurkation der intrakraniellen Arterie in der Aneurysmawand gebildeten lokalen Vorsprünge stumpf und kleiner, und die lokalen ECs gingen verloren. Eine kleine Anzahl von Proben zeigte eine Migration von der glatten Muskelzellschicht in die Intimaschicht und eine myogene Intimazellproliferation. ECs nahmen ab oder verschwanden sogar. Die Endothelzellschicht bestand aus hyperplastischen myointimalen Zellen und linear angeordneten ECs oder aus apoptotischen ECs und Blutzellen, die an das Lumen angelagert waren. Seine Vakuole degeneriert und präsentiert sich mit Unterbrechung der Kontinuität. Einige von ihnen wurden zusammen mit der Basalmembran abgeschält und die Kollagenfasern der Intima waren erhöht. Die Arteriosklerose war verändert, die Arteriolenwand war offensichtlich dünner und mit viel Bindegewebe gefüllt. In allen Schichten, hauptsächlich in den mittleren und äußeren Membranen, wurde eine entzündliche Zellinfiltration und partielle Diffusion beobachtet. In einigen Zellen wurden Lipid- und Cholesterinkristallablagerungen beobachtet. Einige der Tumorwände wurden vollständig oder lokal verdünnt und nach außen erweitert (Abb. 2a, b).

Pathologische Veränderungen des Aneurysmas und der Expression von MMP-9 und VEGF bei IA. a Normale Gewebeschnitte der intrakraniellen Arteriolen in der Kontrollgruppe unter HE-Färbung (× 10). b IA-Gewebeschnitte, gefärbt mit HE (× 10). c Ultrastruktur von normalem Gewebe der intrakraniellen Arteriolen in der Kontrollgruppe unter einem Elektronenmikroskop (× 10.000). d Ultrastructure of IA tissues under an electron microscope (× 10,000). e Expression of MMP-9 in the control group and the IA group by immunohistochemical staining (× 200). f Expression of VEGF in the control group and the IA group by immunohistochemical staining (× 200)

The sections of the normal intracranial arterioles tissues and IA tissues were observed by an electron microscope, and it performed that in normal intracranial arterioles tissues, the matrix fibers of the cerebral vascular wall could be seen clearly, and there was no endothelial injury, cell pyknosis, or degeneration. In the IA tissues, obvious endothelial cell injury, cell pyknosis, or vacuole degeneration were observed, the number of middle smooth muscle cells was declined, most of the nucleus pyknosis was appeared, and chromatin aggregation and apoptotic bodies could be seen. Some cells showed swelling of the mitochondria and disappearance of normal internal structure. The extracellular matrix that formed the cytoskeleton was blurred and showed amorphous floc. There were many fragments in the missing parts of the cells (Fig. 2c, d).

Immunohistochemical staining was utilized to test MMP-9 and VEGF expression, and the results revealed that there was no expression of MMP-9 and VEGF in 75 cases of the control group. It existed 60 cases of positive expression of MMP-9 in the 75 cases of IA samples. MMP-9 positive expression appeared in the inner and the outer membranes of IA wall, but the expression was not uniform. The positive expression was mainly characterized by a brownish yellow cytoplasm. The positive expression of VEGF was 66 cases in 75 cases of IA samples. In the wall of IA, there was a high positive expression in the middle and the outer membranes and a low positive expression in the intima. The positive expression was also mainly characterized by a brownish yellow cytoplasm (Fig. 2e, f). The expression of MMP-9 and VEGF in the two groups is shown in Table 4.

Identification of Vascular ECs

The expression of factor VIII and CD31 in ECs were analyzed by immunohistochemical staining. The results reported that vascular ECs reacted positively to factor VIII and CD31-related antigen antibodies, and the positive rate was 95%. In addition, there were a large number of brown particles in the cytoplasm, and the fifth passage of cells of brown staining was dramatically higher than the primary passage of cells (Fig. 3a, b).

Vascular ECs react positively to FVIII and CD31 related antigen antibodies. a Identification of ECs by CD31. b Identification of ECs by FVII

Upregulation of miR-133a-3p and Downregulation of PSAT1 Suppress Apoptosis and Advance Proliferation and Migration of ECs in IA

Flow cytometry, RT-qPCR, and western blot analysis were adopted for observing the apoptosis and Bax and Bcl-2 expression in ECs of IA after treated with miR-133a-3p mimic or si-PSAT1. It was indicated that compared to the control group, the apoptosis rate of cells and Bax expression was elevated in the IA group and the Bcl-2 expression was decreased (all P <0,05). The cell apoptosis and Bax and Bcl-2 expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group had no significant change (all P> 0,05). By comparison with the si-NC group and mimic NC group, the apoptosis rate of cells in the si-PSAT1 group and miR-133a-3p mimic group was suppressed, the Bax expression was declined, and the Bcl-2 expression was raised (all P <0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, the apoptosis rate and Bax expression were enhanced, and the Bcl-2 expression was reduced in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P <0.05) (Fig. 4a–e).

Highly expressed miR-133a-3p and lowly expressed PSAT1 inhibit apoptosis and promote proliferation and migration of IA ECs. a Detection of apoptosis of ECs by flow cytometry. b Detection of apoptosis rate of ECs in each group. c Bax and Bcl-2 expression in ECs detected by RT-qPCR. d Protein band of Bax and Bcl-2 expression. e Bax and Bcl-2 protein expression in ECs detected by western blot analysis. f MTT assay was used to detect proliferation activity of ECs in each group. g RT-qPCR was used to detect the expression of Ki-67 and CyclinD1 in each group of ECs. h Protein band of Ki-67 and CyclinD1 expression. ich Ki-67 and CyclinD1 protein expression in ECs detected by western blot analysis. j Detection of the migration of ECs in each group by scratch test. k Statistical results of endothelial cell migration in each group. N =3, *P <0.05 vs. the control group. #P <0.05 vs. the mimic NC group. &P <0.05 vs. the si-NC group. +P <0.05 vs. the miR-133a-3p mimic group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation; data were assessed by one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test

MTT assay, RT-qPCR, and western blot analysis were utilized to observe the proliferation and the expression of Ki-67 and CyclinD1 in ECs of IA after treated with miR-133a-3p mimic or si-PSAT1. It was displayed that in contrast to the control group, the proliferation activity and Ki-67 and CyclinD1 expression were reduced in the IA group (all P <0,05). There was no significant difference in the proliferation activity and Ki-67 and CyclinD1 expression of the IA group, mimic NC group, and si-NC group (all P> 0,05). In relation to the si-NC group and the mimic NC group, the proliferation activity and Ki-67 and CyclinD1 expression were heightened in the si-PSAT1 group and the miR-133a-3p mimic group (all P <0,05). In comparison to the miR-133a-3p mimic group, the proliferation activity and Ki-67 and CyclinD1 expression were reduced in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P <0.05) (Fig. 4f, i).

The migration of ECs in each group after treatment with miR-133a-3p mimic or si-PSAT1 for 24 h was observed by scratch test. It was revealed that the migration of cells in the IA group was inhibited relative to that in the control group (P <0,05). There was no markedly change in cell migration of the IA group, the si-NC group, and the mimic NC group (all P> 0,05). Compared to the si-NC group and the mimic NC group, the cell migration in the si-PSAT1 group and the miR-133a-3p mimic group was elevated (both P <0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, the cell migration was declined in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (P <0.05) (Fig. 4j, k).

Restored miR-133a-3p and Depleted PSAT1 Reduce PSAT1, GSK3β, and β-Catenin Expression in ECs of IA

RT-qPCR was used to detect miR-133a-3p expression in ECs of IA; it was yielded that compared to the control group, miR-133a-3p expression in the IA group was reduced (P <0,05). miR-133a-3p expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group did not change markedly (P> 0,05). MiR-133a-3p expression in the miR-133a-3p mimic group was enhanced relative to that in the mimic NC group (P <0,05). In contrast with the si-NC group, there was no distinct change in miR-133a-3p expression in the si-PSAT1 group (P> 0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, miR-133a-3p expression was showed no significant difference in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (P> 0.05) (Fig. 5a).

Upregulation of miR-133a-3p and downregulation of PSAT1 decrease PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in ECs of IA. a miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in ECs detected by RT-qPCR. b Protein bands of PSAT1, GSK3β, and β-catenin. c PSAT1, GSK3β, and β-catenin protein expression in ECs in each group detected by western blot analysis. N =3, *P <0.05 vs. the control group. #P <0.05 vs. the mimic NC group. &P <0.05 vs. the si-NC group. +P <0.05 vs. the miR-133a-3p mimic group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and data were assessed by one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test

The expression of PSAT1, GSK3β, and β-catenin in ECs of IA was tested by western blot analysis and RT-qPCR. It was indicated that in relation to the control group, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the IA group was raised (all P <0,05). PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group did not change dramatically (all P> 0,05). PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the miR-133a-3p mimic group and si-PSAT1 group was degraded relative to that in the mimic NC group and si-NC group (all P <0,05). In relation to the miR-133a-3p mimics group, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression was elevated in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P <0.05) (Fig. 5a–c).

Upregulating miR-133a-3p and Downregulating PSAT1 Alleviate the Pathological Changes of IA Tissues

By testing the hemodynamic changes of rats after modeling, we monitored the blood flow velocity of rats in each group 3 days before operation and 12 weeks after intervention treatment. It was performed that there was no obvious difference in blood flow velocity in each group 3 days before operation (P> 0,05). After 12 weeks of intervention, the blood flow velocity of rats in the IA group depressed relative to that in the normal group (P <0,05). There was no distinct difference in the degree of decrease of blood flow velocity in the IA group, mimic NC group, si-NC group, and miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P> 0,05). By comparison with the si-NC group and the mimic NC group, the blood flow velocity was heightened in the miR-133a-3p mimic group and the si-PSAT1 group (both P <0,05). In contrast to the miR-133a-3p mimic group, the blood flow velocity was declined in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (P <0.05) (Fig. 6a).

Upregulated miR-133a-3p and downregulated PSAT1 alleviate the pathological changes of IA tissues. a Hemodynamic changes at each time point after successful modeling in rats. b Changes of IA tissue after transfection. n =12, *P <0.05 vs. the normal group. #P <0.05 vs. the mimic NC group. &P <0.05 vs. the si-NC group. +P <0.05 vs. the miR-133a-3p mimic group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and data were assessed by one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test.

The changes of IA tissues were verified by HE staining. The results displayed that in the normal group, the elastic fibers in the middle layer of intracranial vascular tissue were neat, the normal elastic protein wave-like structure was appeared, and there was no broken and degradation. In relation to the normal group, the lumen of intracranial vascular tissue was enlarged, the normal elastic protein wave-like structure was disappeared, the elastic fiber in the middle layer of local elastic protein vessel was broken, and some of the elastic fibers were completely degraded in the IA group. There was no distinct change in the morphology of IA tissues in the si-NC group, mimic NC group, IA group, and miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group. In contrast with the si-NC group and the mimic NC group, the wave structure of elastic protein in intracranial vascular tissue of rats in the miR-133a-3p mimic group and the si-PSAT1 group was existed, and the local elastic protein vascular structure was slightly disordered, but there was no fracture and dissolution (Fig. 6b).

Highly Expressed miR-133a-3p and Lowly Expressed PSAT1 Reduce PSAT1, GSK3β, β-Catenin, VEGF, and MMP-9 Expression in IA Tissues in Vivo

The expression of miR-133a-3p in IA tissues in vivo was tested by RT-qPCR, it was suggested that in relation to the normal group, miR-133a-3p expression was declined in the IA group (P <0,05). miR-133a-3p expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group did not change obviously (all P> 0,05). MiR-133a-3p expression in the miR-133a-3p mimic group was elevated relative to that in the mimic NC group (P <0,05). By comparison with the si-NC group, there was no marked change in miR-133a-3p expression in the si-PSAT1 group (P> 0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, miR-133a-3p expression showed no significant difference in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (P> 0.05) (Fig. 7a).

Overexpression of miR-133a-3p and low expression of PSAT1 decrease PSAT1, GSK3β, and β-catenin, VEGF and MMP-9 expression in IA tissues in vivo and PSAT1 is a target gene of miR-133a-3p. a Detection of miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in IA tissues of rats in each group by RT-qPCR. b Protein bands of PSAT1, GSK3β, and β-catenin. c Detection of PSAT1, GSK3β, and β-catenin protein expression in IA tissues of rats in each group by western blot analysis. d Protein bands of VEGF and MMP-9. e Detection of VEGF and MMP-9 protein expression in IA tissues of rats in each group by western blot analysis. f Prediction of the target site of PSAT1 binding to the corresponding miR-133a-3p by Target Scan. g Result of dual luciferase reporter gene assay. a –e , n =12; f –g , N =3, *P <0.05 vs. the normal group/the Wt + NC group. #P <0.05 vs. the mimic NC group. &P <0.05 vs. the si-NC group. +P <0.05 vs. the miR-133a-3p mimic group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and data were assessed by one-way analysis of variance followed by Tukey’s post hoc test

The expression of PSAT1, GSK3β, and β-catenin in IA tissues in vivo was tested by western blot analysis and RT-qPCR. It was appeared that in contrast with the normal group, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the IA group was increased (all P <0,05). PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group did not change markedly (all P> 0,05). PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression in the miR-133a-3p mimic group and si-PSAT1 group was decreased compared with that in the mimic NC group and si-NC group (all P <0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, PSAT1, GSK3β, and β-catenin expression was enhanced in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P <0.05) (Fig. 7a–c).

Western blot analysis was used to verify the VEGF and MMP-9 expression in IA tissues in vivo; the results perceived that by comparison with the normal group, VEGF and MMP-9 expression in the IA group were enhanced (both P <0,05). VEGF and MMP-9 expression in the IA group, mimic NC group, and si-NC group did not change obviously (all P> 0,05). In relation to the mimic NC group and si-NC group, VEGF and MMP-9 expression in the miR-133a-3p mimic group and si-PSAT1 group were declined (all P <0,05). Versus the miR-133a-3p mimic group, VEGF and MMP-9 expression were elevated in the miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 group (all P <0.05) (Fig. 7d, e).

PSAT1 Is a Target Gene of miR-133a-3p

The online prediction software (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) was utilized to forecast and analyze the target site of PSAT1 binding to the miR-133a-3p, and the sequence of 3′UTR region combined by PSAT1 and miR-133a-3p. In order to prove that the predicted binding site of miR-133a-3p resulted in a change in the luciferase activity, the mutation sequence and the wild sequence of PSAT1 3′UTR deleting miR-133a-3p binding site were devised. Luciferase activity was verified by co-transfection of miR-133a-3p mimic and WT (Wt-miR-133a-3p/PSAT1) or MUT (Mut-miR-133a-3p/PSAT1) recombinant plasmids in vascular ECs. The results revealed that miR-133a-3p mimic had no distinct effect on luciferase activity in the Mut-miR-133a-3p/PSAT1 group (P> 0.05), while the luciferase activity in the Wt-miR-133a-3p/PSAT1 group was markedly declined (P <0.05) (Fig. 7f, g).

Discussion

IA is an abnormal dilatation of the intracranial artery, which weakens the arterial wall through continuously pushing outwards the vascular wall, which results in a higher risk of aneurysm rupture [17]. In a study conducted by Liu et al., it has shown that some miRNAs are involved in modulating the cell proliferation of vascular smooth muscle cells, which is closely associated with IA [18]. Also, a recent study has provided a proof that circulating miRNAs can be used as a new biomarker to assess the possibility of IA occurred in high-risk individuals [19]. It is customarily considered that PSAT1 may be involved in schizophrenia spectrum conditions and alters serine metabolism [20]. The current study was designed to explore the regulatory role of miR-133a-3p modulated vascular endothelial injury and triggered IA through modulating the PSAT1/GSK3β/β-catenin signaling pathway.

In this present study, the relationship among miR-133a-3p expression and clinicopathological features of IA was analyzed, and the results demonstrated that the expression of miR-133a-3p was not related to age, gender, shape, and position of aneurysm but associated with the number and size of aneurysm. Some scholars considered that the shear stress of regional blood flow in the arterial wall induced the induction of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and macrophage inflammatory protein 1α (MIP-1α) expression by fibroblasts and vascular ECs within the vascular wall. The highly reactive chemotactic factors MCP-1 and MIP-1α made an aggregation of macrophagocyte in the vascular wall and mediated inflammatory response, then, induced the excitation of nuclear transcription factor c-Jun and then regulated the activation of activated protein 1 (AP-1), then activated MMP-9 promoter in its structural domain to raise MMP-9 mRNA expression, and finally induced the dissolution of extracellular matrix of vascular wall, causing the formation of intracranial aneurysm [21,22,23]. Saito et al. [24] found that MMP-9 positive cells were mainly from the middle and the outer membranes of the artery macrophages, which certified that MMP-9 expressed by macrophages mediated the degeneration of the arterial wall, leading to the formation of arterial aneurysm. The above studies have indicated that MMP-9 was linked to the formation of IA. The results of our study revealed that MMP-9 was upregulated in IA; thus, we speculated that mR-133a-3p might be involved in the occurrence and development of IA by regulating the PSAT1/GSK3β/β-catenin pathway and further regulating MMP-9. In our study, we found that restoring miR-133a-3p reduced the expression of PSAT1, GSK3β, β-catenin, and MMP-9 in intracranial aneurysm tissues. We will carry out relevant research in the future study to verify our findings.

Our study has provided substantial evidence in relation to the notion that miR-133a-3p expression was decreased and the PSAT1, GSK3β, and β-catenin was elevated in IA. Emerging evidence has suggested that miR-133a-3p plays a suppressive role in different kinds of tumors. Recent study has presented that miR-133a-3p expression was dramatically degraded in breast cancer tissues in contrast with that in non-cancer tissues [25]. Another study has purported that miR-133a-3p expression is declined in advanced prostate cancer (PCa) tissues relative to that in the adjacent normal tissues or benign prostate lesion tissues, especially in bone metastatic PCa tissues [26]. The promoting effect of PSAT1 in other types of diseases are found in some literatures. It is reported that PSAT1 expression was remarkably heightened in non-small cell lung cancer (NSCLC) and forecasted poor clinical outcome of NSCLC patients [27]. Furthermore, PSAT1 is considered as the highest upregulated gene in CRC tumors as well as highly expressed in chemoresistant disease patients [28]. It has been manifested that GSK3β activity was elevated in cancerous tissues [29]. Moreover, the phosphorylation level of GSK3β as well as the expression of nuclear β-catenin are also enhanced, suggesting that GSK3β/β-catenin pathway may be participated in osteopontin regulation [30].

Other results emerged from our data suggested that upregulation of miR-133a-3p and downregulation of PSAT1 suppressed apoptosis and advanced proliferation and migration of IA ECs, reduced VEGF, and MMP-9 expression in IA tissues. It has been suggested previously that the over-expression of miR-133a-3p retrains the invasion, growth, and mitosis of oral squamous cell carcinoma cells by targeting collagen type I alpha 1 (COL1A1) [31]. It is reported that highly expressed miR-133a-3p can repress the propagation of ESCC cells, advance cell apoptosis, and decline the migration and invasion of ESCC cells by targeting COL1A1 [32]. Another study has verified that transient upregulation of miR-133a-3p suppresses the migration, invasion, and growth abilities of gallbladder carcinoma cells through directly targeting recombination signal-binding protein Jκ [33]. In like manner, this study suggests that miR-133a-3p exerts its role in IA through targeting PSAT1. It is displayed that PSAT1 overexpression boosts ESCC cell growth and matrigel invasion in vitro, and injection of mice with ESCC cells with high expression of PSAT1 induces tumor formation in vivo [14]. Other study also has reported that PSAT1 is highly expressed and forecasts a poor clinical outcome of patients, as well as enhances cell tumorigenesis and proliferation in vivo and in vitro [13]. Prior research generally confirms that PSAT1 advances cell cycle progression, proliferation, and tumorigenesis through loss- and gain-of-function experiments [27]. It has been indicated that MMPs are composed of a series of enzymes which cleaves protein substrates on the basis of a conserved mechanism referring activation of an active site-bound water molecule through a Zn ²⁺ ion [34]. MMP-9 is a distinct protease which push forward an immense influence on many biological processes [35]. A study has contended that MMP-9 is elevated in the aneurysm groups compared to the control group [36]. Vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) is recognized as the key modulator of endovascular differentiation of trophoblast [37]. A study has revealed that silenced PSAT1 expression suppresses VEGF, β-catenin, and GSK3β phosphorylation expression [10].

Conclusion

To briefly conclude, our study confirms our hypothesis that overexpression of miR-133a-3p or downregulation of PSAT1 restrain endothelial cell damage and advance endothelial cell proliferation via inhibiting the GSK3β/β-catenin pathway in IA. These findings provide a new insight in a novel target therapy for IA. These findings underscore the role of miR-133a-3p in IA in relation the PSAT1/GSK3β/β-catenin pathway. However, a conclusion about the effects of miR-133a-3p and PSAT1 cannot be made clearly due to limited known researches on this. It needs to be monitored rigorously and reported appropriately in the future clinical trials.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Not applicable

Abkürzungen

miR-133a-3p:

MicroRNA-133a-3p

IA:

Intracranial aneurysm

PSAT1:

Phosphoserine aminotransferase 1

GSK3:

β-glycogen synthase kinase 3β

SAH:

Subarachnoid hemorrhage

MiRNAs:

MicroRNAs

CRC:

Colorectal cancer

ESCC:

Esophageal squamous cell carcinoma

HE:

Hematoxylin-eosin

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

MMP:

Matrix metalloprotease

VEGF:

Vaskulöser endothelialer Wachstumsfaktor

NC:

Negative control

DAB:

Diaminobenzidine

FBS:

Fötales Rinderserum

UEAI:

Ulex europaeus agglutinins I

PI:

Propidium iodide

FITC:

V-fluorescein isothiocyanate

DMSO:

Dimethylsulfoxid

OD:

Optische Dichte

SD:

Sprague-Dawley

SPF:

Specific pathogen-free

GAPDH:

Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase

BCA:

Bicinchoninic acid

3′UTR:

3′ Untranslated region

WT:

Wild type

MUT:

Mutant

ANOVA:

Analysis of variance

NSCLC:

Non-small cell lung cancer

VEGF-A:

Vascular endothelial growth factor-A