MicroRNA-326-5p schützt Neuronen beim Schlaganfall: STAT3-Unterdrückung reduziert Apoptose und mitochondriale Schäden

Zusammenfassung

Studien haben die Rolle von MicroRNAs (miRNAs) bei zerebraler Ischämie/Reperfusionsverletzung (CI/RI) ausführlich untersucht. Der spezifische Mechanismus von miR-326-5p bei CI/RI bleibt jedoch unklar. Ziel dieser Studie war es, den Mechanismus der miR-326-5p/Signal Transducer and Activator of Transcription-3 (STAT3)-Achse bei CI/RI aufzudecken. Zwei Modelle (Sauerstoff-Glukose-Entzug [OGD] in primären Ratten-Kortexneuronen und Mittlere-Zerebralarterien-Okklusion [MCAO] bei Sprague-Dawley-Ratten) wurden etabliert, um CI/RI in vitro bzw. in vivo nachzuahmen. Verlust- und Gain-of-Function-Assays wurden mit OGD-behandelten Neuronen und MCAO-Ratten durchgeführt. Anschließend wurden Vitalität, Apoptose, oxidativer Stress und mitochondriales Membranpotenzial in OGD-behandelten Neuronen getestet, sowie pathologische Veränderungen, Apoptose und mitochondriales Membranpotenzial in Hirngeweben von MCAO-Ratten. Die Expression von Mitofusin-2 (Mfn2), miR-326-5p und STAT3 in OGD-behandelten Neuronen und in Hirngeweben von MCAO-Ratten wurde detektiert. Mfn2 und miR-326-5p waren reduziert, und STAT3 war erhöht in OGD-behandelten Neuronen und Hirngeweben von MCAO-Ratten. miR-326-5p zielte auf STAT3 ab und regulierte dessen Expression negativ. Die Wiederherstellung von miR-326-5p oder die Reduktion von STAT3 stärkte die Vitalität, hemmte Apoptose und oxidativen Stress, erhöhte das mitochondriale Membranpotenzial und steigerte die Mfn2-Expression in OGD-behandelten Neuronen. Die Hochregulation von miR-326-5p oder die Herunterregulation von STAT3 linderte pathologische Veränderungen, hemmte Apoptose und erhöhte das mitochondriale Membranpotenzial und die Mfn2-Expression in Hirngeweben von Ratten mit MCAO. Diese Studie zeigt, dass hochreguliertes miR-326-5p oder herunterreguliertes STAT3 vor CI/RI schützt, indem es die Mfn2-Expression erhöht.

Einleitung

Zerebrale Ischämie/Reperfusionsverletzung (CI/RI) ist eine Art von Hirnverletzung, die einem ischämischen Schlaganfall folgt [1]. Das charakteristischste Merkmal der zerebralen I/R ist die initiale transiente zerebrale Ischämie gefolgt von Reperfusion [2]. CI/RI aktiviert neuronale Apoptose und führt zu hippocampalen und kortikalen Schäden [3]. Derzeit ist die häufigste klinische Anwendung Thrombolyse bei CI/RI [4]. Allerdings würde Reperfusion die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) erhöhen, was zu intrazellulären DNS-Schäden, oxidativem Stress-bedingten Schäden, Proteinoxidation und Lipidperoxidation führt, was die Blut-Hirn-Schranke und Ödeme weiter verschlechtert [5]. Daher hat die Suche nach neuen gezielten Optionen für CI/RI oberste Priorität.

MicroRNAs (miRNAs) werden als potenzielle und prognostische Rollen bei CI/RI umfassend betrachtet [6, 7]. Beispielsweise hat ein Artikel gezeigt, dass miR-202-5p neuronale Schäden und neurologische Defizite sowie OGD-induzierte Zellschäden bei MCAO-Modellratten bei ischämischer Verletzung abschwächt [8]. Zudem wurde festgestellt, dass die Hochregulation von miR-98 neurologische Ergebnisse bei Mäusen mit I/R-Schlaganfall verbessert [9] und die Überexpression von miR-451 ischämische zerebrale Apoptose bei Mäusen mit CI/RI lindert [10]. Speziell hat miR-326-5p pro-angiogene Fähigkeit für endotheliale Vorläuferzellen und könnte die Herzfunktion nach akutem Myokardinfarkt verbessern [11]. Die Studie, die sich auf miR-326-5p bei CI/RI konzentriert, steckt jedoch noch in den Kinderschuhen. Signaltransduktoren und Transkriptionsaktivatoren (STAT) sind eine einzigartige Proteinfamilie, die durch CI/RI aktiviert wird [12]. STAT3 wurde auf Bioinformatik-Websites als Ziel von miR-326-5p vorhergesagt; daher untersuchten wir die Rolle von miR-326-5p-vermitteltem STAT3 bei CI/RI. STAT3 verschlechtert ischämische neuroinflammatorische Prozesse und sekundäre Hirnverletzungen durch Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren [13, 14]. Speziell spielt der Janus-aktivierte Kinase 2 (JAK2)/STAT3-Signalweg eine funktionale Rolle bei der Blockierung von Zellapoptose, induziert durch CI/RI [15]. Mitofusin-2 (Mfn2) ist ein mitochondrialer Fusionsfaktor, der vor kardio-zerebrovaskulärer I/R-Verletzung schützen kann [16] und hypoxie-induzierte neuronale Apoptose bei ischämischen Hirnschäden lindert [17]. Es wurde auch aufgezeichnet, dass Mfn2 einen schützenden Effekt auf CI/RI ausübt [18].

Kurz gesagt, weniger tiefgehende Untersuchungen haben die kombinierte Rolle von miR-326-5p und STAT3 bei CI/RI entdeckt. Angesichts dessen wurde diese Studie mit der Hypothese gestartet, dass miR-326-5p CI/RI durch Targeting von STAT3 abschwächt.

Materialien und Methoden

Ethik-Erklärung

Die Experimente wurden vom Tierpflege- und -nutzungsausschuss des Affiliated Hospital of Yangzhou University; Yangzhou University genehmigt und gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchsrissen des Affiliated Hospital of Yangzhou University; Yangzhou University durchgeführt.

Versuchstiere

Adulte männliche Sprague-Dawley-Ratten (6–8 Wochen alt, 250 ± 30 g) vom Zentrum für Vergleichende Medizin, Yangzhou University (Yangzhou, China), wurden in einer spezifisch pathogenfreien Umgebung mit freiem Zugang zu Futter und Wasser, (24 ± 1)°C, (50 ± 5)% Luftfeuchtigkeit und 12-Stunden-Licht/Dunkel-Zyklus gehalten.

Zellisolation und -identifizierung

Die Ratten wurden durch Dekapitation euthanasiert, und ihre Gehirne wurden in 1 mm³ geschnitten, um Zellsuspensionen zu konfigurieren, die mit 0,4% Trypanblau-Lösung im Verhältnis 9:1 gemischt wurden (die Endkonzentration von Trypanblau betrug 0,04%), und die Zelldichte und Überlebensrate wurden mit einem Hämozytometer berechnet. Die Zellen (1 × 10⁶ Zellen/mL) wurden in einer Zellkulturflasche, die mit L-Polylysin (0,1 mg/mL) vorbeschichtet war, bei 5 × 10⁶ Zellen pro Flasche ausgesät. Nachdem die Zellen anhafteten, wurden sie mit erneuertem Medium (NeurobasalA + B27 + L-Glutamin) inkubiert und kontinuierlich 6–7 Tage kultiviert, wobei das Medium alle 2–3 Tage zur Hälfte gewechselt wurde.

Zellidentifizierung: Ratten-Kortexneuronen wurden verwendet, um Neuronen-Slides herzustellen, die mit primärem kaninchen-anti-Ratte-Nestin (NES) polyklonalem Antikörper (1:200) sowie Fluorescein-isothiocyanat (FITC)-markiertem Ziegen-anti-Kaninchen-Immunglobulin G (1:50, beide von Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) inkubiert wurden. Anschließend wurden die Zellen mit einem Anti-Fluoreszenz-Quencher versiegelt und durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet.

OGD-Modell-Etablierung

Neuronen wurden in einer glukosefreien Earle-Lösung kultiviert und einem Gasgemisch aus 95% N₂ und 5% CO₂ ausgesetzt. Nach 30 Min positiver Druckbeatmung wurde eine hypoxische Umgebung gebildet, in der die Zellen inkubiert wurden (Ischämie-Simulation durch OGD in vitro). Nach 90 Min Inkubation wurden die Zellen mit dem Erhaltungszellmedium inkubiert, nachdem die glukosefreie Earle-Lösung entfernt wurde. Die Zellen wurden routinemäßig für nachfolgende Experimente kultiviert (Reperfusions-Simulation durch Sauerstoff-Glukose-Reperfusion in vitro). Das normale Medium unter Normoxie diente als Kontrolle.

Neuronen wurden in die Kontrollgruppe, die OGD-Gruppe, die Negative-Kontrolle (NC)-Gruppe (OGD-behandelte Neuronen, transfiziert mit Scrambled-Oligonukleotiden), die miR-326-5p-Agomir-Gruppe (OGD-behandelte Neuronen, transfiziert mit miR-326-5p-Agomir), die sh-STAT3-Gruppe (OGD-behandelte Neuronen, transfiziert mit STAT3 shRNA) und die miR-326-5p-Agomir + Überexpression (oe)-STAT3-Gruppe (OGD-behandelte Neuronen, transfiziert mit miR-326-5p-Agomir und pcDNA-STAT3-Vektor) eingeteilt. Oligonukleotide und Vektoren wurden alle von GenePharma (Shanghai, China) bereitgestellt.

Mit Lipofectamine 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific) wurden Scrambled-Oligonukleotide, miR-326-5p-Agomir, STAT3 shRNA oder miR-326-5p-Agomir und pcDNA-STAT3 in primäre Ratten-Neuronen transfiziert, und die Transfektionseffizienz wurde nach 48 h durch Reverse-Transkription quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) oder Western Blot getestet.

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Assay

Neuronen wurden zu einer Suspension von 1 × 10⁶ Zellen/mL hergestellt und für 0, 24 und 48 h kultiviert. In steriler Umgebung wurden Neuronen 2–4 h in 10% MTT-Lösung inkubiert und mit 150 µL Formazan-Lösungsmittel (Dimethylsulfoxid) versetzt, bis der Kristall vollständig gelöst war. Der optische Dichtewert (OD) wurde bei 570 nm an einem Mikroplattenleser gemessen.

Flusszytometrie-Apoptose-Assay

Neuronen wurden mit 0,25% Trypsin abgelöst, bei 2000 U/min zentrifugiert und in PBS resuspendiert. Anschließend wurden Neuronen bei 2000 U/min zentrifugiert, und der Pellet wurde mit Bindungspuffer resuspendiert und nacheinander mit 5 µL Annexin V-FITC und 5 µL Propidiumiodid (PI) inkubiert. Ein Flusszytometer wurde zur Detektion der Apoptoserate angewendet.

JC-1 Mitochondriales Membranpotenzial-Detektion

Zellen in der 6-Well-Platte wurden mit PBS gespült, mit 1 mL Zellkulturmedium und 1 mL JC-1-Färbelösung (50 µL JC-1, 8 mL ultrareines Wasser und 2 mL JC-1-Färbepuffer) (SolarbioScience, Beijing, China) versetzt und 15 Min inkubiert. Der 1× JC-1-Färbepuffer wurde aus 4 mL destilliertem Wasser und 1 mL JC-1-Färbepuffer konfiguriert. Nach der Inkubation wurden Zellen trypsinisiert, in JC-1-Puffer resuspendiert und an einem Flusszytometer getestet. Der relative Anteil der grünen Fluoreszenz wurde berechnet.

Oxidativer Stress-Detektion

Intrazelluläre ROS-Werte wurden mit dem 2,7-Dichlorfluorescein-diacetat (DCF-DA) Detektionskit (Abcam) gemessen. Kurz gesagt, Neuronen wurden mit 0,25% Trypsin abgelöst, resuspendiert und 30 Min mit 10 µM DCF-DA inkubiert. Anschließend wurde die DCF-Fluoreszenz mit Anregungs-/Emissionslicht bei 495 nm/529 nm durch Fluoreszenzspektroskopie (BD Biosciences) gemessen.

Der intrazelluläre Malondialdehyd (MDA), Glutathion (GSH) Gehalt und Superoxiddismutase (SOD) Aktivität wurde durch chemische Kolorimetrie mittels kommerzieller Assay-Kits (Beyotime Biotechnology Co., Shanghai, China) detektiert. Der OD-Wert wurde an einem Mikroplattenleser gemessen.

Ratten-Modell-Etablierung

Ratten wurden durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital-Natrium (50 µg/kg) narkotisiert. Ein mittiger Schnitt wurde am Hals gemacht, die äußere Halsschlagader wurde ligaturiert, und die gemeinsame Halsschlagader wurde mit einer Arterienklemme blockiert. Ein 3-0 silikonbeschichteter Monofilament-Nylonfaden wurde vorsichtig in die innere Halsschlagader eingeführt, bis leichter Widerstand spürbar war. Nach 90 Min transitorischer zerebraler Ischämie wurde der Faden zurückgezogen, und Reperfusion wurde für weitere 24 h durchgeführt. Die Sham-Gruppe erhielt dieselbe Behandlung, außer dass der Faden nicht in die innere Halsschlagader eingeführt wurde. Während der Operation wurde ein thermostatisches Bett verwendet, um die Rektaltemperatur bei 37 ± 0,5 °C zu halten [19].

Ratten wurden in 6 Gruppen (n = 6) eingeteilt und mit Plasmid oder miR in den lateralen Zerebelventrikel injiziert, bevor die MCAO-Modelle etabliert wurden, einschließlich der Sham-Gruppe, der MCAO-Gruppe (modellierte Ratten), der NC-Gruppe (modellierte Ratten mit lateraler zerebroventrikulärer Injektion von 5 µL Scrambled-Oligonukleotiden [100 µM]), der miR-326-5p-Agomir-Gruppe (modellierte Ratten mit lateraler zerebroventrikulärer Injektion von 5 µL miR-326-5p-Agomir [100 µM]), der sh-STAT3-Gruppe (modellierte Ratten mit lateraler zerebroventrikulärer Injektion von 5 µL STAT3-Interferenzvektor [100 µM]) und der miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe (modellierte Ratten mit lateraler zerebroventrikulärer Injektion von 5 µL miR-326-5p-Agomir [100 µM] und 5 µL STAT3-Überexpressionsvektor [100 µM]) [20, 21].

Probenentnahme

Ratten wurden durch Narkose euthanasiert, die Herzen wurden perfundiert, und die gesamten Gehirne wurden entnommen. Die verletzten Hirngewebe wurden in 1 × 1 × 1 mm³ Gewebestücke für Paraffinschnitte, RT-qPCR, Western-Blot-Analyse und mitochondriales Membranpotenzial-Detektion geschnitten.

Detektion des Mitochondrialen Membranpotenzials im Kortex

Der Kortex von SD-Ratten wurde separiert und in 1 mm³ geschnitten. Die Gewebeblöcke wurden auf ein 300-Maschen-Nylonnetz gelegt und mit PBS versetzt. Dann wurde die Zellsuspension bei 1000 U/min zentrifugiert, mit 70% Ethanol versetzt und erneut bei 1000 U/min zentrifugiert. Anschließend wurde die Probe in 1 mL PBS resuspendiert, und die Suspension (1 × 10⁶ Zellen, 100 µL) wurde mit Rhodamin123-Farbstofflösung (10 µL, 5 µg/mL) reagiert und an einem Flusszytometer bei 488 nm analysiert.

HE-Färbung

Das Ratten-Hirngewebe wurde 24 h in 4% Paraformaldehyd eingelegt, und Paraffinschnitte wurden hergestellt, in 4 µm geschnitten, in 40 °C Wasser ausgebreitet und bei 60 °C gebacken. Routinemäßig entwachst und hydratisiert, wurden die Paraffinschnitte mit HE-Färbelösung gefärbt. Nach HE-Färbung zeigten die geschädigten Neuronen Kontraktion des Zellkerns, zelluläre Ödeme, Vakuolisierung und verdunkelte Kerne. Das Lichtmikroskop (Nikon, Japan) wurde verwendet, um das Bild zu erhalten, und die Anzahl der überlebenden Neuronen (mm²) des ischämischen Kortex wurde gezählt.

TUNEL-Färbung

Die Paraffinschnitte wurden entwachst und mit 100%, 95%, 80% und 70% Alkohol dehydriert. Dann wurden die Schnitte in 4% Paraformaldehyd getaucht, gefolgt von Inkubation mit 0,1% Triton X-100 Natriumzitrat-Puffer für 20 Min und TUNEL-Reaktionsgemisch für 1–1,5 h. Anschließend wurden die Schnitte mit Peroxidaselösung und Diaminobenzidin (DAB) entwickelt, mit Hämatoxylin gegengefärbt, durch Gradientalkohol dehydriert, permeabilisiert und in neutralem Gummi versiegelt. Die Schnitte wurden unter einem Lichtmikroskop beobachtet, um TUNEL-positive Zellen zu zählen. Bräunlich-gelbe Partikel im Zellkern wurden als TUNEL-positive Zellen (apoptotische Zellen) definiert.

Immunhistochemie

Die Schnitte wurden entwachst, hydratisiert und durch Zitrat-Antigen-Retrieval behandelt, und die endogene Katalase wurde durch 3% H₂O₂ blockiert. Jeder Schnitt wurde mit Ziegenserum (50 µL) versetzt, mit dem primären Antikörper (50 µL) inkubiert und mit dem sekundären Antikörper (50 µL) und Horseradish-Peroxidase-markiertem Streptavidin (50 µL) reagiert. Die Schnitte wurden mit DAB entwickelt und mit Hämatoxylin gegengefärbt, worauf Gradientalkohol-Dehydrierung, Xylol-Permeabilisierung und neutrales Gummi-Versiegelung folgten. Die Schnitte wurden mit einem Mikroskop beobachtet (Zytoplasma oder Zellkern des ischämischen Hirngewebes zeigte gelbe oder bräunlich-gelbe Partikel). OD-Werte wurden gemittelt.

RT-qPCR

Totale RNA-Extraktion aus Geweben und Zellen wurde mit Trizol (Invitrogen) durchgeführt. Die mRNA-Expression wurde durch qPCR mit SYBR Green PCR Mix (Applied Biosystems, CA, USA) und QuantStudio TM 6Flex Echtzeit-PCR-System (Applied Biosystems) analysiert. Spezifische Stem-Loop-Reverse-Transkriptionsprimer und Forward/Reverse-Primer (BioTNT, Shanghai, China) wurden entworfen, um miRNA-Level zu analysieren. Tabelle 1 listete alle Primer auf. Die 2⁻ΔΔCT-Methode wurde zur Berechnung von miRNA- oder mRNA-Leveln angewendet.

Western-Blot-Analyse

Die Proteinproben wurden durch 10% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt und auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran elektroblottiert. Danach wurde die PVDF-Membran mit 5% Magermilchpulver in Tris-haltiger Salzlösung blockiert, mit den primären Antikörpern inkubiert und 2 h mit dem sekundären Antikörper nachinkubiert. Dann wurden die Proteinbänder mit alkalischer Phosphatase-Pufferlösung, die Nitroblau-Tetrazoliumchlorid und 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat enthielt, analysiert und mit ImageJ-Software (NIH, Bethesda, MD, USA) quantifiziert. Die Hauptantikörper waren STAT3 (1:1000), Mfn2 (1:1000, Abcam, MA, USA) und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) (1:1000, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA).

Dual-Luciferase-Reporter-Gen-Assay

Der STAT3 3'UTR, der die miR-326-5p Wildtyp (WT) oder Mutant (Mut) Bindungsstellen enthielt, wurde in den pmirGLO-Vektor (Promega, WI, USA) kloniert, benannt als STAT3-WT und STAT3-Mut. Zellen wurden in einer 24-Well-Platte bei 2 × 10⁴ Zellen/Well ausgesät und ko-transfiziert mit 100 ng STAT3-WT oder STAT3-Mut Luciferase-Vektor und 50 nM miR-326-5p-Agomir oder dessen Agomir NC bei 70% Konfluenz. Die Luciferase-Aktivität wurde mit dem Dual-Luciferase-Reporter-Assay-System (Promega Corporation, WI, USA) gemessen.

Statistische Analyse

SPSS 21.0 (IBM, NY, USA) statistische Software wurde für die Datenanalyse verwendet. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Der Unterschied zwischen zwei Gruppen wurde mit dem Student's t-Test analysiert, während Mehrfachvergleiche mit einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Tukey's Post-hoc-Test analysiert wurden. P stellte einen zweiseitigen Test dar, und P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Hochregulation von miR-326-5p oder Herunterregulation von STAT3 schwächt Apoptose von OGD-behandelten Kortexneuronen ab

Nach einer Woche Kultur waren die Ratten-Kortexneuronen differenziert und ausgereift. Mikroskopisch zeigten die Neuronen größere Zellkörper, transparenteres Zytoplasma, große Kerne mit niedriger Dichte und starken Brechungsindex. Die Zellkörper waren kegelförmig oder rund, und die Dendriten waren gestaffelt und hafteten an den Wänden (Abb. 1a, b). NES war ein spezifischer chemischer Marker für zerebrale Neuronen, um Neuronen mit hoher Spezifität durch Immunfluoreszenzassay zu lokalisieren. Neuronen banden spezifisch an NES und zeigten grüne Fluoreszenz (Abb. 1c).

Der MTT-Assay wurde angewendet, um die Kortexneuronen-Vitalität zu detektieren (Abb. 1d). Die Ergebnisse zeigten, dass die Vitalität der Ratten-Kortexneuronen in der OGD-Gruppe und der miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe und der miR-326-5p-Agomir-Gruppe beeinträchtigt war, aber in der miR-326-5p-Agomir-Gruppe und der sh-STAT3-Gruppe im Vergleich zur NC-Gruppe erhöht war (alle P < 0,05).

Die Apoptose der Ratten-Kortexneuronen wurde durch Flusszytometrie bestimmt, während die Bcl-2 und Bax mRNA-Expression durch RT-qPCR gemessen wurde (Abb. 1e–g). Die Ergebnisse erklärten, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe und der miR-326-5p-Agomir-Gruppe die OGD-Gruppe und die miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe erhöhte Apoptoserate, reduzierte Bcl-2-Expression und erhöhte Bax-Expression aufwiesen (alle P < 0,05). Im Gegensatz zu den NC-Gruppen wurde die Apoptoserate gesenkt, der Bcl-2-Spiegel erhöht und der Bax-Spiegel in der miR-326-5p-Agomir-Gruppe und der sh-STAT3-Gruppe unterdrückt (alle P < 0,05).

Hochregulation von miR-326-5p oder Herunterregulation von STAT3 erhöht Mfn2 und Mitochondriales Membranpotenzial in Kortexneuronen nach OGD-Verletzung

Die Mfn2-Expression in OGD-behandelten Kortexneuronen wurde durch Western-Blot-Analyse detektiert (Abb. 2a, b). Bezüglich der Kontrollgruppe und der miR-326-5p-Agomir-Gruppe war die Mfn2-Protein-Expression in der OGD-Gruppe und der miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe reduziert, während sie in der miR-326-5p-Agomir-Gruppe und der sh-STAT3-Gruppe im Vergleich zur NC-Gruppe erhöht war (alle P < 0,05).

Das mitochondriale Membranpotenzial, detektiert durch JC-1, zeigte (Abb. 2c, d), dass bezüglich der Kontrollgruppe und der miR-326-5p-Agomir-Gruppe das mitochondriale Membranpotenzial in der OGD-Gruppe und der miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe abnahm (alle P < 0,05). Relativ zu den NC-Gruppen stieg das mitochondriale Membranpotenzial in der miR-326-5p-Agomir-Gruppe und der sh-STAT3-Gruppe (alle P < 0,05).

ROS- und MDA-Gehalte sowie GSH- und SOD-Aktivitäten in OGD-behandelten Kortexneuronen wurden bestimmt, und die Ergebnisse zeigten, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe und der miR-326-5p-Agomir-Gruppe die OGD-Gruppe und die miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe erhöhte ROS- und MDA-Gehalte und beeinträchtigte GSH- und SOD-Aktivitäten aufwiesen (alle P < 0,05). Im Vergleich zu den NC-Gruppen zeigten die miR-326-5p-Agomir-Gruppe und die sh-STAT3-Gruppe reduzierte ROS- und MDA-Gehalte und verstärkte GSH- und SOD-Aktivitäten (alle P < 0,05) (Abb. 2e–g).

Hochregulation von miR-326-5p oder Herunterregulation von STAT3 hindert pathologische Schäden an Kortexneuronen und hemmt Apoptose bei Ratten mit CI/RI

HE-Färbung wurde angewendet, um die pathologischen Schäden des Hirngewebes zu beobachten (Abb. 3a, b), wobei in der Sham-Gruppe die Neuronen normal strukturiert und ordentlich angeordnet waren mit blassrotem Zytoplasma, blauem Kern und klarem Nukleolus. In der MCAO-Gruppe, der NC-Gruppe und der miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe, abgesehen von Nekrose, wurde beobachtet, dass Neuronen unordentlich angeordnet und dunkler gefärbt waren, mit Kernmembranruptur, Verschwinden der Zellstruktur, Karyopyknose, tief gefärbtem Kern und Lyse in großem Ausmaß. In der miR-326-5p-Agomir-Gruppe und der sh-STAT3-Gruppe wurde die Neuronen-Schwellung gelindert und die Neuronen waren ordentlich angeordnet, und die nekrotischen Zellen waren reduziert, was einen besseren Status im Vergleich zur MCAO-Gruppe und der NC-Gruppe anzeigte.

TUNEL-Färbung wurde zur Detektion neuronaler Apoptose und RT-qPCR für Bcl-2 und Bax mRNA-Expression in Hirngeweben genutzt. Die Ergebnisse zeigten (Abb. 3c–e), dass im Vergleich zur Sham-Gruppe und der miR-326-5p-Agomir-Gruppe die TUNEL-positive Rate stieg, die Bcl-2 mRNA-Expression abnahm und die Bax mRNA-Expression in der MCAO-Gruppe und der miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe zunahm (alle P < 0,05). Niedrigere TUNEL-positive Rate und Bax mRNA-Expression, und höhere Bcl-2 mRNA-Expression zeigten sich in der miR-326-5p-Agomir- und der sh-STAT3-Gruppe im Vergleich zur NC-Gruppe (alle P < 0,05).

Hochregulation von miR-326-5p oder Herunterregulation von STAT3 erhöht Mitochondriales Membranpotenzial in Hirngeweben bei Ratten mit CI/RI

Die Mfn2-Protein-Expression in Ratten-Hirngewebe wurde durch Immunhistochemie durchgeführt, und die Ergebnisse zeigten (Abb. 4a, b), dass niedrigere Mfn2-Protein-Expression in der Sham-Gruppe und der miR-326-5p-Agomir-Gruppe im Vergleich zur MCAO-Gruppe und der miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe getestet wurde, während höhere Mfn2-Protein-Expression in der miR-326-5p-Agomir-Gruppe und der sh-STAT3-Gruppe anstelle der NC-Gruppe gemessen wurde (alle P < 0,05).

Die Detektion des mitochondrialen Membranpotenzials zeigte (Abb. 4c), dass im Vergleich zur Sham-Gruppe und der miR-326-5p-Agomir-Gruppe das mitochondriale Membranpotenzial in der MCAO-Gruppe und der miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe abnahm, während es in der miR-326-5p-Agomir-Gruppe und der sh-STAT3-Gruppe im Gegensatz zur NC-Gruppe zunahm (alle P < 0,05).

miR-326-5p targetiert STAT3

Die miR-326-5p und STAT3 Expression in Kortexneuronen und Hirngeweben wurde durch RT-qPCR und Western-Blot-Analyse detektiert. In Kortexneuronen in vitro zeigte sich ein Rückgang der miR-326-5p-Expression und ein Anstieg der STAT3-Expression in der OGD-Gruppe relativ zur Kontrollgruppe (beide P < 0,05). Bezüglich der NC-Gruppe war die miR-326-5p-Expression erhöht und die STAT3-Expression in der miR-326-5p-Agomir-Gruppe reduziert (beide P < 0,05); die STAT3-Expression nahm in der sh-STAT3-Gruppe ab (P < 0,05). Im Gegensatz zur miR-326-5p-Agomir-Gruppe war die STAT3-Expression in der miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe erhöht (P < 0,05) (Abb. 5a–c).

In Hirngeweben in vivo zeigte sich im Verhältnis zur Sham-Gruppe niedrigere miR-326-5p und höhere STAT3 in der MCAO-Gruppe (beide P < 0,05). Relativ zur NC-Gruppe stieg die miR-326-5p-Expression, während die STAT3-Expression in der miR-326-5p-Agomir-Gruppe abnahm (beide P < 0,05). Die STAT3-Expression nahm in der sh-STAT3-Gruppe ab (P < 0,05). Im Vergleich zur miR-326-5p-Agomir-Gruppe war die STAT3-Expression in der miR-326-5p-Agomir + oe-STAT3-Gruppe erhöht (P < 0,05) (Abb. 5d–f).

Die potenziellen miR-326-5p-Targeting-Stellen auf STAT3 3'UTR wurden durch DIANA und miRDB Software gefunden (Abb. 5g). STAT3 3'UTR, die die WT miR-326-5p-Bindungsstelle und Mut-Bindungsstelle enthielten, wurden konstruiert und in das pmirGLO-Plasmid eingefügt. Die Bindung von miR-326-5p an STAT3 3'UTR wurde weiter durch Luciferase-Reporter-Assay validiert. Der Luciferase-Reporter-Assay zeigte, dass miR-326-5p-Agomir die relative Luciferase-Aktivität von STAT3-WT reduzierte, aber nicht von STAT3-Mut (Abb. 5h), was impliziert, dass STAT3 ein direktes Zielgen von miR-326-5p war.

Diskussion

CI/RI ist die führende Ursache für zerebrovaskuläre Todesfälle [22]. miRNAs sind an CI/RI beteiligt [23]. Allerdings ist das umfassende Verständnis des miR-326-5p-bezogenen Mechanismus bei CI/RI noch unzureichend. Daher zielte diese Studie darauf ab, die konkreten Rollen von miR-326-5p bei CI/RI mit Schwerpunkt auf der kombinierten Wechselwirkung von miR-326-5p und STAT3 zu erforschen. Produktiv hat diese Studie erklärt, dass die Hochregulation von miR-326-5p CI/RI abschwächte und die Mfn2-Expression über STAT3-Inhibition erhöhte.

Zunächst wurde die miR-326-5p-Expression bestimmt, die in CI/RI in vivo und in vitro reduziert war. Anschließend ordneten wir eine Reihe von Assays an und fanden, dass die Hochregulation von miR-326-5p die Neuronen-Vitalität und mitochondriale Funktion verbesserte, die Mfn2-Expression erhöhte und oxidativen Stress und Apoptose hemmte. Darüber hinaus verifizierten in vivo-Experimente an Ratten die funktionellen Rollen der wiederhergestellten miR-326-5p bei CI/RI. Tatsächlich korreliert hohes miR-326 mit langem Gesamtüberleben von Patienten mit Glioblastom, dem häufigsten Hirntumor [24]. Auch wurde der miR-326-Expression weiter nachgewiesen, dass sie bei Parkinson-Krankheit reduziert ist und miR-326 Apoptose dopaminerger Neuronen unterdrücken und entzündliche Reaktion reduzieren konnte [25]. Außer dass die Reduktion von miR-326-5p in endothelialen Vorläuferzellen im Verlauf von Myokardinfarkt manifestiert ist, und die Einführung von endothelialen Vorläuferzellen mit Überexpression die Erholung der Herzfunktion fördern konnte [11]. Es gab eine Studie, die illustrierte, dass die Hochregulation von miR-326 die Verhaltensfunktion verbessert, die neuronale Vitalität erhöht und die neuronale Apoptose bei Mäusen mit Alzheimer-Krankheit unterdrückt [26]. Darüber hinaus ist dokumentiert, dass die Hochregulation von miR-326 durch miR-326-Mimik die induzierbare Stickoxid-Synthase in dopaminergen Neuronen bei Parkinson-Krankheit unterdrücken konnte [27].

In dieser Studie fanden wir, dass STAT3 ein Zielgen von miR-326-5p war. Unterstützt durch eine fortgeschrittene Studie wird angezeigt, dass die STAT3-Expression durch miR-326 in menschlichen Endometriumkarzinom-Stammzellen negativ reguliert wird [28]. In der vorliegenden Studie maßen wir, dass die STAT3-Expression in CI/RI erhöht war. Derzeit wurde gefunden, dass I/R-Verletzung und OGD die STAT3-Expression induzieren würden [29]. Interessanterweise tendiert die STAT3-mRNA-Expression zu einem Anstieg bei I/R-Tieren [30]. Zusätzlich wird berichtet, dass die STAT3-Protein-Expression in CI/RI hochreguliert ist [31]. Als Nächstes enthüllte unsere Studie, dass die Herunterregulation von STAT3 therapeutische Effekte auf CI/RI-Ratten und OGD-behandelte Neuronen hatte. Wie durch eine Studie unterstützt, wird geschlossen, dass die miR-31-Induktion oxidativen Stress durch Inaktivierung des JAK/STAT3-Signalwegs bei ischämischem Schlaganfall abschreckt [32]. Auch ist die Inhibition des JAK2/STAT3-Signalwegs vorteilhaft für oxidativen Stress-Schaden bei CI/RI [31]. Darüber hinaus wurde identifiziert, dass der Knockdown des JAK/STAT3-Signalwegs die Zellvitalität erhöht und oxidativen Stress und Neuronenapoptose bei ischämischer Hirnverletzung reduziert [33]. Kürzlich wurde beobachtet, dass der inhibierte JAK/STAT3-Signalweg Myokardinfarkt bei myokardialer I/R-Verletzung lindert [34]. Wie demonstriert, untergräbt erschöpftes STAT3 neuronale Apoptose bei Ratten mit Weißsubstanzverletzung [35]. Zudem werden die Unterdrückung neuronaler Apoptose und die Linderung der zerebralen Infarktgröße der JAK2/STAT3-Inhibition bei Ratten mit CI/RI zugeschrieben [36].

Schließlich konzentrierten wir uns auf die Effekte von miR-326-5p und STAT3 auf die Mfn2-Expression und entdeckten, dass der reduzierte Mfn2-Spiegel bei Ratten mit CI/RI und OGD-behandelten Neuronen entweder durch Wiederherstellung von miR-326-5p oder Stilllegung von STAT3 erhöht werden konnte. Wie durch eine frühere Studie impliziert, ist dokumentiert, dass Mfn2 in der späten Phase der Reperfusion abnimmt und schlecht exprimiertes Mfn2 CI/RI durch gehemmte Autophagosomenbildung und Autophagosomen-Lysosomen-Fusion verschlimmert [18]. Zusätzlich wird impliziert, dass Mfn2 in I/R-Verletzung in alten Hepatozyten reduziert oder sogar verschwindet [37]. Allerdings haben wenige Forschungen den regulatorischen Mechanismus von miR-326-5p und STAT3 für Mfn2 diskutiert.

Fazit

Im Allgemeinen hat diese Studie die Mechanismen aufgeklärt, dass erhöhtes miR-326-5p neuronale Apoptose hemmt, pathologische Schäden an Neuronen abschwächt und die Expression von Mfn2 über STAT3-Downregulation in CI/RI erhöht. Die Studie kann den potenziellen Mechanismus von miR-326-5p und STAT3 in CI/RI aktualisieren. Allerdings sind weitere Studien noch notwendig für die weitere Entwicklung des molekularen Mechanismus bei CI/RI.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Nicht anwendbar.

Abkürzungen

miRNAs:

MicroRNAs

STAT3:

Signal Transducer and Activator of Transcription-3

OGD:

Sauerstoff- und Glukoseentzug

MCAO:

Mittlere-Zerebralarterien-Okklusion

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

STAT:

Signaltransduktoren und Transkriptionsaktivatoren

Mfn2:

Mitofusin-2

FITC:

Fluorescein-isothiocyanat

NES:

Nestin

NC:

Negative Kontrolle

Oe:

Überexpression

RT-qPCR:

Reverse-Transkription quantitative Polymerase-Kettenreaktion

OD:

Optische Dichte

PI:

Propidiumiodid

MDA:

Malondialdehyd

GSH:

Glutathion

SOD:

Superoxiddismutase

DAB:

Diaminobenzidin

PVDF:

Polyvinylidenfluorid

WT:

Wildtyp

Mut:

Mutant

SD:

Standardabweichung

ANOVA:

Einseitige Varianzanalyse