hGC33-modifizierte und mit Sorafenib beladene Nanopartikel haben eine synergistische Anti-Hepatom-Wirkung durch Hemmung des Wnt-Signalwegs

Einführung

Glypican3 (GPC3) ist ein Heparansulfat-Proteoglycan, das auf Zelloberflächen durch einen Mechanismus exprimiert wird, der Glycerophosphatidylinositol-Anker beinhaltet [1]. Obwohl GPC3 während der Entwicklung in einer Vielzahl von Geweben exprimiert wird, wird seine Expression in den meisten adulten Geweben durch DNA-Methylierung in der Promotorregion zumindest teilweise gehemmt [2]. Das GPC3-Protein wird jedoch bei etwa 70 % der Patienten mit hepatozellulärem Karzinom (HCC) überexprimiert [3, 4] und stimuliert die klassische Wnt-Signaltransduktion [5] durch Interaktion mit dem Wnt-Liganden, der die Wnt/Frizzled-Bindung fördert, um das HCC-Wachstum zu fördern [6] . Die Aktivierung des klassischen Wnt-Signalwegs ist eines der häufigsten Ereignisse im Zusammenhang mit der malignen Transformation des HCC [7, 8]. Basierend auf der Fähigkeit von GPC3, die Wnt-Signalübertragung zu erhöhen, stellten wir die Hypothese auf, dass eine Überexpression von GPC3 das HCC-Wachstum durch Stimulierung des klassischen Wnt-Signalwegs fördert.

Therapeutischer monoklonaler Antikörper, der ein Epitop im C-terminalen Teil von GPC3 erkennt (524–563) (hGC33), der das C-terminale Epitop von GPC3 (524–563) erkennt, hemmt das Tumorwachstum in subkutanen Xenotransplantaten von HepG2 und Huh- 7 bei Mäusen [9, 10]. hGC33 wurde durch komplementäre Decision-Region-Transplantation humanisiert und seine Antikrebswirkung ist für die HepG2-Xenotransplantation genauso wirksam wie hGC33, und hGC33 wurde in klinischen Studien verwendet [11]. Diese Ergebnisse legen nahe, dass hGC33 eine wichtige Antitumoraktivität besitzt und eine Anti-GPC3-Behandlung direkt die Proliferation und/oder das Überleben von HCC-Zellen hemmt, indem sie Wnt und/oder andere Signalwege blockiert.

Aufgrund der komplexen Pathogenese des HCC ist die Wirksamkeit der alleinigen Blockierung von GPC3 jedoch begrenzt [12]. Daher kann die Erforschung des detaillierten Mechanismus der HCC-Pathogenese und die Identifizierung vielversprechender Biomarker für die Diagnose und Prognose von HCC helfen, wirksame therapeutische Ziele bereitzustellen und die Prognose von Patienten zu verbessern. Anti-GPC3-Antikörper wurden vorgeschlagen, um die Empfindlichkeit von HCC gegenüber Chemotherapeutika zu erhöhen [13]. Die Antitumoraktivität von hGC33 in Kombination mit Standardchemotherapeutika wurde kürzlich untersucht [14]. Sorafenib ist ein neues orales zielgerichtetes HCC-Medikament, das die Proliferation von Tumorzellen direkt hemmen kann, indem es den durch RAF/MEK/ERK vermittelten Zellsignalweg blockiert, um das Tumorwachstum einzudämmen [15, 16]. Die nicht zielgerichtete Verteilung von Sorafenib in vivo und abnormal aktivierte Wnt-Signale bei HCC begrenzen jedoch die Wirksamkeit des Arzneimittels und verstärken seine Nebenwirkungen [14,15,16]. Wnt bindet an Rezeptoren der Frizzled-Familie, um die intrazelluläre Signaltransduktion zu aktivieren, die die Zellproliferation, Apoptose und Zellmigration reguliert und bei vielen Tumoren wie HCC Arzneimittelresistenzen verursacht [17,18,19].

In HepG2-Xenotransplantationsmodellen ist die Kombination von hGC33 und Sorafenib bei der Hemmung des Tumorwachstums wirksamer als Sorafenib allein [15], und die Wirkstoffabgabe mit Polymer-Nanocarriern hat in der Krebsbehandlung viel Aufmerksamkeit erfahren. Mit Krebsmedikamenten beladene Nanocarrier können die unspezifische Verteilung und den unspezifischen Abbau in vivo verhindern, die Bioverfügbarkeit von Medikamenten und das Antitumor-Targeting verbessern und die Bewertung der Pharmakokinetik und Behandlung vereinfachen [15, 16]. In einer Vielzahl von polymerbasierten Nanopartikeln gelten Formulierungen auf Basis von Poly(milchsäure-co-glykolsäure) (PLGA) als ideale und sichere Wirkstoffträger [17, 18]. Diesbezüglich ist das Poly(ethylenglycol)-b -poly(d,l-lactid-co-glycolid) (PEG-b -PLGA) basieren auf Polyethylenglycol und PLGA-Copolymeren, die nach Hydrolyse sicher und ungiftig sind und von der US-amerikanischen Food and Drug Administration zugelassen wurden [19,20,21,22]. Daher intravenöse Injektion mit Nanoträger von PEG-b -PLGA-Copolymer ist eine vielversprechende Strategie, um eine gezielte Verabreichung zu erreichen und die Wirksamkeit zu verbessern. Darüber hinaus kann die Anwendung des spezifischen Antikörpers hGC33 gegen GPC3-Moleküle auf der HCC-Zellmembran nicht nur die Freisetzung von Nanodrug-Targeting in vitro und in vivo verbessern [18, 19], sondern auch Wnt und/oder andere mit GPC3 verbundene Signalwege blockieren, hemmen die Proliferation und/oder das Überleben von Krebszellen und können eine synergistische Anti-Tumor-Aktivität erreichen.

In dieser Studie haben wir untersucht, ob hGC33-Antikörper-modifiziertes Copolymer PEG-b -PLGA-Nanopartikel können die Abgabe von Sorafenib (hGC33-SFB-NP) an HCC in vivo und in vitro erleichtern und die Effizienz der HCC-Behandlung durch HCC-aktives Targeting verbessern, um die Pharmakokinetik des Arzneimittels zu verändern. Entsprechend der Partikelgröße, des Zetapotentials, der Partikelmorphologie, der Wirkstoffeinschlusseffizienz, der Wirkstoffbeladungskapazität und der in vitro Wirkstofffreisetzung wurde der gezielte NP umfassend charakterisiert. Die In-vitro-Targeting-Fähigkeit ist durch die Zellaufnahme von HepG2-Hepatomzellen gekennzeichnet. Die Bioverteilung und die synergistische therapeutische Wirkung von hGC33-SFB-NP auf HCC wurden durch Vergleich von Sorafenib und SFB-NP bewertet. Unsere Ergebnisse zeigten, dass hGC33-SFB-NP auf GPC3 ⁺ . abzielen kann HCC. Es kann das Fortschreiten des Zellzyklus, die Zellproliferation und die Tumorinvasion hemmen, indem es die Wnt- und Ras/Raf/MAPK-Signalwege hemmt und das Fortschreiten von Leberkrebs synergistisch hemmt.

Materialien und Methoden

Materialien

Der hGC33-Antikörper, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT), 4′,6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochlorid (DAPI), 5,5′,6 ,6'-Tetrachlor-1,1',3,3'-tetraethyl-benzimidazolyl-carbocyanin-iodid (JC-1) und Dimethylsulfoxid (DMSO) wurden von Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO) bezogen. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethyl-carbodiimid-hydrochlorid und N -Hydroxysuccinimid wurden von Qiyun Biotech (Guangzhou, China) bezogen. Das Bicinchoninsäure (BCA)-Proteinquantifizierungskit, Cumarin-6, und das Annexin V-FITC/PI-Apoptose-Nachweiskit wurden von Beyotime Biotechnology (Shanghai, China) bezogen. PEG-b -PLGA-Maleimid-Diblock-Copolymer (mal-PEG-b -PLGA; 25.000–30.000 Da, PLGA, LA:GA, w/w; PEG, 13–15%) wurde von Polyscitech (West Lafayette, IN, USA) bezogen. PI3K-Antikörper-Kit (9655#), p-Akt-Antikörper-Kit (9916#), mTOR-Antikörper-Kit (9964#), Bcl-2-Familie-Antikörper-Kit (9942#), Apoptose-Antikörper-Kit (9915#) und sekundäres Ziegen-Antikörper-Kit Kaninchen- und Anti-Maus-Antikörper wurden von Cell Signal Technology (Danvers, MA, USA) bezogen; Cyclin B1 und cyclinabhängige Kinase wurden von Abcam Biological Technology (USA) bezogen. Antikörper gegen Phospho-Rb, Cyclin D1, Checkpoint-Kinase 1 (CHK1), P53, phosphoryliertes Brustkrebs-Anfälligkeitsgen 1 (p-BRCA1), RAD51, Cytochrom C und Matrix-Metalloproteinase (MMP2 und MMP9) wurden von Abcam (USA) bezogen. . Alle anderen Chemikalien, Reagenzien und Lösungsmittel in analytischer Qualität werden von Standardlieferanten bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet.

Zellen und Tiere

Die HCC-Zelllinie HepG2 (erhalten aus der Kultursammlung vom amerikanischen Typ (Manassas, VA, USA) wurde in DMEM-Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ergänzt mit 10 % FBS (HyClone, Logan, UT, USA) und 80 kultiviert U/ml Penicillin und 80 μg/ml Streptomycin in einer befeuchteten Atmosphäre von 5 % CO₂ bei 37 °C. BALB/C-Nacktmäuse mit einem Gewicht von 20–22 g (5–6 Wochen) wurden von Nanjing Junke Biotechnology Co., Ltd. (China) bereitgestellt. BALB/C-Nacktmäuse wurden in einem SPF-Raum aufgezogen. Alle Tierpflege und -behandlungen wurden gemäß den Tierpflegeanforderungen der Anhui University of Science and Technology durchgeführt. Alle Versuchsprotokolle wurden von der Ethikkommission für Tierversuche der Anhui University of Science and Technology (Genehmigungs-Nr.:2019dw013) überprüft und genehmigt.

Vorbereitung von NPs

Um NPs vorzubereiten, mal-PEG-b -PLGA und SFB oder Cumarin-6 wurden gewogen und in der organischen Phase (3:2 v/v Dichlormethan/Aceton) gelöst. Die Lösung wurde tropfenweise unter kontinuierlichem Vortexen zu einer Polyvinylalkohol (PVA)-Lösung (5% w/v) gegeben. Die Mischung wurde intermittierend mit einem Sondenbeschallungsgerät (Ausgangsleistung von 550 W, 8-mal) auf Eis beschallt, um eine Öl-Wasser-Emulsion zu erzeugen. Die Emulsion wurde unter magnetischem Rühren zu einer PVA-Lösung (1% w/v) gegeben. SFB- und Cumarin-6-NPs wurden durch Zentrifugation bei 8000 U/min für 30 Minuten gesammelt und dreimal in Milli-Q-Wasser gewaschen.

Um hGC33-NP durch Thioetherbindungen zu erzeugen, die durch die Reaktion von Maleinimid mit freien Sulfhydrylresten im Antikörper hGC33 gebildet wurden, wurde der hGC33-Antikörper mit Maleinimid-funktionalisierten NPs in einem Molverhältnis von 5:1 gemischt (hGC33:mal-PEG-b -PLGA) und inkubiert bei 4 °C für 16 h unter ständigem Rühren. hGC33 wurde durch die Reaktion von Sulfhydrylgruppen des Antikörpers hGC33 mit den Maleinimidgruppen der PEG-Ketten an die NPs konjugiert. Unkonjugierte Antikörper wurden durch Passage durch Sepharose CL-4B-Säulen entfernt. Die effiziente Proteinkonjugation wurde mit einem BCA-Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bestätigt.

Charakterisierung von Nanopartikeln (NPs)

Morphologie, Partikelgröße, Verkapselungseffizienz (EE) und Stabilität von NPs

Die Morphologie der NPs wurde mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, H-600; Hitachi, Tokio, Japan) bewertet. Wirkstofffreie hGC33-NPs und wirkstofffreie NPs wurden mit einem FTIR-Spektrophotometer (Thermo Nicolet, Madison, WI, USA) unter Verwendung von Kaliumbromid aufgezeichnet. Die mittlere Partikelgröße und das Zetapotential von NPs wurden mit einem Malvern Zetasizer ZEN3600 Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) bei 20 °C charakterisiert. Die Wirksamkeit der Wirkstoffverkapselung (EE) und des Wirkstoffbeladungsgehalts (LC) wurde durch Ultrafiltration bestimmt. Die Proben wurden in eine Ultrafiltrationsvorrichtung (100 kMWCO; Sartorius, Göttingen, Deutschland) geladen und bei 8000 U/min für 25 Minuten bei 4 °C zentrifugiert, um den freien Wirkstoff zu entfernen. Das gleiche Volumen jeder Probe wurde in Acetonitril gelöst, um die Gesamtmenge des Arzneimittels zu bestätigen. Die Konzentration wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen. Die Absorptionswellenlänge betrug 266 nm. Die folgende Formel wurde verwendet, um den Wirkstoff-EE (%) der NPs zu berechnen:(Gewicht des eingeschlossenen Wirkstoffs/Gesamtgewicht des Wirkstoffs) ×   100 %. LC (%) wurde berechnet als (Gewicht des eingekapselten Arzneimittels/Gewicht der NPs) × 100 %. Um die Stabilität von NPs bei Raumtemperatur zu verstehen, wurde die Änderung der NP-Größe durch dynamische Lichtstreuung (DLS) zu vorbestimmten Zeitpunkten (0,5, 1, 2, 4, 8, 12 h, 16 h, 20 h und 24 ) bewertet h) bei 25 °C.

In-vitro-Wirkstofffreisetzung von Arzneimitteln und zellulärer Aufnahmetest

Das Medikament aus NPs wurde mit Dialysebeuteln mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 10 kDa untersucht. Kurz gesagt wurde 1 ml NPs in einen Dialysebeutel geladen (MWCO 8.000–10.000 Da; Spectrum Labs Inc., CA, USA). Die Dialysebeutel wurden in PBS eingetaucht und mit einem Magnetrührer bei 25 °C gerührt. Die Wirkstofffreisetzungsprofile von NPs wurden in 100 ml 0,2 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; pH = 7.4) 7 Tage lang gemessen. Die Konzentration des Arzneimittels in den Proben wurde mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen. In nachfolgenden Studien wurde hGC33-Cumarin 6-NP mit der gleichen Partikelgröße wie hGC33-SFB-NP verwendet, um das Targeting von hGC33-SFB-NP zu bewerten. HepG2 (GPC3 ⁺ ) und Li-7 (GPC3 ⁻ ) wurden mit hGC33-Cumarin 6-NP für 0,5, 2 oder 4 h bei 37 °C in 5 % CO₂ inkubiert bzw. Die cokultivierten Zellen wurden gewaschen und mit 4% Formaldehyd für 10 Minuten fixiert; die Zellkerne wurden mit 5 μg/ml Hoechst 33.342 für 15 Minuten gefärbt, um intrazelluläre NPs zu lokalisieren. Konfokale Mikroskopie zur Analyse intrazellulärer Nanopartikelbilder wurde mit konfokaler Mikroskopie (Olympus FV1000; Olympus Corporation, Tokio, Japan) analysiert.

In-vitro-zellulärer Effekt

Die Zytotoxizität von freiem hGC33(Ab), freiem SFB, hGC33-null-NP oder hGC33-SFB-NP wurde mit einem MTT-Assay bestimmt. HepG2(GPC3 ⁺ ) Zellen und Li-7 (GPC3 ⁻ ) Zellen in logarithmischer Phase wurden in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 4000 Zellen pro Well ausgesät, gefolgt von einer Inkubation für 48 Stunden bei 37 °C in 5 % CO₂ . Die Zellen wurden mit hGC33, freiem SFB, hGC33-null-NP oder hGC33-SFB-NP für 48 h bei 37 °C in 5 % CO₂ . behandelt . Nach Co-Kultivierung für eine bestimmte Zeit wurde die Anti-Zell-Proliferationsaktivität durch den MTT-Assay wie beschrieben bestimmt [20]. Die Absorption jeder Vertiefung wurde bei 490 nm gemessen und mit SPSS 17.0 die Hälfte des maximalen Hemmkonzentrationswerts (IC 50) berechnet.

Messung der Zellinvasionsfähigkeit

Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden auf 6-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen/Vertiefung, mit einem Saugkopf angekratzt und durch serumfreies Kulturmedium ersetzt. Die Wundheilung wurde bei 0 h, 24 h und 48 h in der Kontroll- und Versuchsgruppe aufgezeichnet. Gleichzeitig wurde die gleiche Anzahl von Zellen in Transwell-Kammern geimpft und mit freiem hGC33, freiem SFB, hGC33-null-NP oder hGC33-SFB-NP behandelt. 500 Mikroliter 10 % FBS-Medium wurden in die untere Kammer gegeben. Nach 24 Stunden Inkubation wurde die Transwell-Kammer herausgenommen und die Zellen wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit 0,1 % Kristallviolett gefärbt. Die Größe der Wundheilung und die Anzahl der Migrationszellen wurden berechnet, um die Migrationsfähigkeit zu bewerten.

Zellzyklusbestimmung

Nach Inkubation über Nacht in 6-Well-Platten wurden die Zellen mit freiem hGC33 (Ab), freiem SFB, hGC33-null-NP oder hGC33-SFB-NP für 24 h behandelt, dann gesammelt und mit Ethanol fixiert. Nach der Färbung mit Propidiumiodid wurde eine Durchflusszytometrie durchgeführt und der Zellzyklus wurde mit Modifit 3.0 (Verity Software House, Topsham, ME) analysiert.

Western Blotting

Um den Aktivierungsstatus des Signalwegs und die Expression von Zielmolekülen zu bewerten, wurden die Zellen über Nacht in 6-Well-Platten inkubiert und freies hGC33, freier SFB, hGC33-null-NP oder hGC33-SFB-NP für 24 h aufgetragen . Die Zellen jeder Behandlungsgruppe wurden gesammelt und das Protein wurde extrahiert und gemessen. Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA Protein Kit (Biosharp, Hefei, China) gemessen und kalibriert. Das Protein der Proben wurde durch 12-Alkylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt, auf eine PVDF-Membran übertragen und mit fettfreier Milch versiegelt. Der erste Antikörper (verdünnt 1:1000) wurde über Nacht bei 4 °C inkubiert, und die zweiten Antikörper (1:2000) wurden 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Banden wurden mit ECL-Substraten (Thermo Fisher Scientific Waltham, MA, USA) sichtbar gemacht und die Bilder wurden durch ein Gelbildanalysesystem angezeigt, und β-Aktin wurde als Kontrolle verwendet.

In Vivo Anti-Tumor-Aktivität

Die Hemmung von freiem hGC33, freiem SFB, hGC33-null-NP, SFB-NP und hGC33-SFB-NP auf das Wachstum von HCC in vivo wurde bestimmt. Gemäß den Vorschriften und Richtlinien zur Tiergesundheit der Ethikkommission der Anhui University of Technology wurden alle Versuche an BALB/c-Mäusen in Käfigen in einem Temperaturkontrollraum (23 ± 2 °C) mit 12 h/12 h Licht/ dunkler Zyklus. Eine 50-μl-Suspension mit 5 × 10 ⁶ 5 Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäusen (20–22 g) wurden lebende HepG2-Zellen subkutan in das rechte Abdomen injiziert. Wenn das Tumorvolumen etwa 50 mm ³ . erreichte , wurden die Mäuse zufällig in 6 Gruppen eingeteilt (10 Mäuse in jeder Gruppe). Kontrolle mit normaler Kochsalzlösung NS (200 mg/kg null NP in 200 μl PBS), hGC33-null-NP (hGC33-null-NP in 200 μl PBS,entspricht hgc33 = 100 μg/kg/Zeit), freies hGC33 (hGC33 in 200 μl PBS, 100 μg/kg/Zeit), freier SFB (SFB-Dosis:8 mg/kg/Zeit), SFB-NP (SFB-Dosis:8 mg/kg/Zeit) und hGC33-SFB-NP (entspricht SFB = 8 mg/kg/Zeit, hGC33 = 100 μg/kg/Zeit) wurden alle 2 Tage 10 Mal über die Schwanzvene injiziert. Das Gewicht und die Tumorgröße der Mäuse wurden alle vier Tage gemessen. Die Berechnungsformel für das Tumorvolumen lautete volume = 0.5 × L × W ² , wobei L und W die Länge bzw. die Breite des Tumors darstellen. Vier Wochen nach Verabreichung wurden die Tiere mit Diethylether anästhesiert und die Tumorgröße und das Gewicht gemessen. Darüber hinaus wurden Tumor, Herz, Leber, Niere, Lunge und Milz entfernt, mit 4 % Paraformaldehydlösung fixiert, in Paraffin eingebettet, geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt, um die histologischen Veränderungen durch Digitalmikroskopie zu beurteilen.

Statistische Analyse

Die Daten sind als mittlere ± ± Standardabweichung (SD) dargestellt und wurden durch Varianzanalyse mit SPSS 18.0 ausgewertet. Paarweise statistische Vergleiche wurden mit einem zweiseitigen Student-t-Test durchgeführt. Unterschiede wurden als statistisch signifikant für P . angesehen < 0.05.

Ergebnisse

Charakterisierung von NPs und Wirkstofffreisetzung In vitro

Da der Durchmesser und die Oberflächeneigenschaften von NP die Zellaufnahme, Wirkstofffreisetzung und NP-Verteilung in vivo beeinflussen, haben wir die präparierten NP mit entsprechenden Parametern charakterisiert. Die Morphologie, Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung von SFB-NP-, hGC33-null-NP- und hGC33-SFB-NP-Polymeren sind in Abb. 1 zusammengefasst. Die Morphologie von hGC33-SFB-NP, beobachtet mit dem Transmissionselektronenmikroskop (Abb . 1a) zeigt starre Kerne mit unscharfen Kanten, was darauf hindeutet, dass hGC33 auf der Oberfläche von NPs vorhanden ist. Die Partikelgrößen von SFB NP, hGC33-null-NP und hGC33-SFB-NP reichten von 100 bis 150 nm und hatten eine typische unimodale Partikelgrößenverteilung. Der durchschnittliche Durchmesser von hGC33-SFB-NP (120.2 ± 10.2 nm) war etwas größer als der von hGC33-null-NP, SFB-NP und null-NP (Abb. 1a, Tabelle 1). Auf der Oberfläche von hGC33-SFB-NP und hGC33-null-NP waren dünne kugelförmige, unklare Filme mit einer einzigen Oberfläche vorhanden, was darauf hinwies, dass der Antikörper hGC33 auf der Oberfläche von NPs vorhanden war. Die erhöhte Größe für hGC33-SFB-NP und hGC33-null-NP bestätigte die Existenz des hGC33-Films. Die Synthese von hGC33-SFB-NP wurde mit ¹ . bestätigt H-NMR (Abb. 1b) vor der NP-Präparation. Die Peaks bei 5,2 ppm und 1,58 ppm wurden -CH3-Protonen von Milchsäure zugeordnet; der Peak bei 4,8 ppm wurde -OCH2- von Glykolsäure zugeordnet; und der Peak bei 3,6–3,8 ppm wurde den -CH2CH2O-Protonen der PEG-Wiederholungseinheiten zugeordnet. Oberflächenchemie von PEG-b -PLGA und Ab-PEG-b -PLGA-NPs wurden auch durch FTIR-Spektroskopie untersucht (Abb. 2c). Im Spektrum von PEG-b -PLGA-Polymer, eine starke Bande bei etwa 1750 cm ⁻¹ stammten aus der Strecke der Carbonylgruppen (C = O) in der PLGA-Kette. Ein Band bei 2880 cm ⁻¹ war auf die Dehnung einer a-CH-Gruppe in der PEG-Kette zurückzuführen. Gleichzeitig trat ein Peak bei 2520 cm ⁻¹ . auf die wir dem -SH-Streckungspeak des hGC33-Antikörpers zugeschrieben haben. Die  ¹ H-NMR- und FTIR-Ergebnisse zeigten, dass der Antikörper auf das Rückgrat des PEG-b . gepfropft wurde -PLGA-Polymere.

Charakterisierung von NPs. a TEM-Charakterisierung von NPs, der Maßstabsbalken zeigt 100 nM an; b die  ¹ H-NMR-Spektren von synthetischem hGC33-PLGA-b -PEG in CDCl3; c FTIR-Spektren von hGC33-PEG-b -PLGA und PEG-b - PLGA; d kumulative Freisetzungsprofile von SFB-NP und hGC33-SFB-NP in PBS (pH = 7.4) bei 37 °C; e Größenänderungen von NPs, die in DMEM-Medium mit 10 % FBS über 14 Tage inkubiert wurden; f Größenänderungen von NPs, die über 14 d in PBS inkubiert wurden. SFB, Sorafenib; TEM, Transmissionselektronenmikroskopie; Nanopartikel, Nanopartikel; ¹ H-NMR, ¹ H-Kern-Magnetresonanzspektroskopie; FTIR, Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

Expression von GPC3 und Aufnahme von hGC33-Cumarin6-NP in Li-7- und HepG2-Zellen. Die in die Kulturplatte geimpften Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit 100 µg/ml hGC33-cumarin6-NP in DMEM 2, 4 und 8 h inkubiert. Kerne wurden mit DAPI gefärbt und die Zellen wurden fixiert und durch konfokale Laserscanningmikroskopie nachgewiesen. GPC3 wurde in Li-7-Zellen nicht nachgewiesen, wurde jedoch in HepG2-Zellen stark exprimiert, wie durch Immunzytochemie nachgewiesen. Der Maßstabsbalken zeigt 50 μM an

Interessanterweise hatten hGC33-SFB-NP- und SFB-NP-Nanopartikel in DMEM-Medium mit 10 % FBS (pH = 7,4) eine schnelle Wirkstofffreisetzung bis etwa 4 Tage, dann eine relativ langsame und stabile Wirkstofffreisetzung; die kumulative SFB-Freisetzung von hGC33-SFB-NP und SFB-NP über 20 Tage betrug etwa 77 % bzw. 65 % (Abb. 1d). Der Unterschied kann auf das hydrophile Molekül auf der Oberfläche des PEG-b . zurückzuführen sein -PLGA-Matrix, die den Abbau der Nanopartikel beschleunigen kann, indem sie die Hydratation erhöht und dadurch die Hydrolyse fördert. Um die Stabilität der präparierten NPs zu bestimmen, wurden hGC33-SFB-NP, hGC33-null NP, null-NP und SFB-NP in DMEM-Medium mit 10 % FBS (pH = 7.4) und in PBS (pH = 7.4 .) gegeben ). Die Größen der verschiedenen NPs blieben mehr als 2 Wochen lang stabil. SFB wurde 14 Tage lang anhaltend und stabil aus hGC33-SFB-NP freigesetzt, aber die Partikelgröße in DMEM-Medium änderte sich im Vergleich zu 10 % FBS geringfügig (Abb. 1e, f). Die Stabilität von hGC33-SFB-NP wäre für SFB mit einer nachhaltigen biologischen Rolle angemessen.

Ein großes Zetapotential kann eine starke elektrostatische abstoßende Wechselwirkung zwischen NP verursachen und die Stabilität des NP-Dispersionssystems aufrechterhalten [23, 24]. Wie in Tabelle 1 gezeigt, betragen die Zetapotentiale von hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP und SFB-NP  − 18,2 ± 2,2 mv, − 18,5 ± 1,8 mv bzw.  − 15,9 ± 2,1 mv, was durch die negativen Ladungen verursacht werden, die durch die Aldehydgruppe, Carboxylgruppe und Phosphatgruppe im Antikörper hGC33 Glykoprotein erzeugt werden. Die negativ geladenen NPs können zu einer hohen Stabilität der NP-Suspension führen. Da die Zelloberfläche in normalen physiologischen Umgebungen negativ geladen ist, stoßen die präparierten NPs außerdem Zellen mit geringer Ladung ab und sind für Gewebe und Zellen weniger toxisch. Außerdem war die Größenverteilung von null-NP und SFB-NP (Polydispersitätsindex [PDI] 0,18 bzw. 0,19) geringfügig, aber nicht signifikant kleiner als die von hGC33-null-NP (PDI = 0,21) und hGC33-SFB- NP (PDI = 0.23). Somit weist die Größe der Nanopartikel eine gute Einheitlichkeit auf. Die Partikelgröße, Partikelgrößenverteilung und das Zetapotential von NP sind in Tabelle 1 gemäß den Ergebnissen der SFB-Einkapselungseffizienz und des Beladungsgehalts gezeigt. Der unkonjugierte GPC3-Antikörper hGC33 wurde durch Ultrazentrifugation entfernt und die Bindungseffizienz des hGC33-Antikörpers an NPs wurde bewertet. Die BCA-Proteinanalyse zeigte, dass die Bindungseffizienz des hGC33-Antikörpers an NPs 79,5% ± 2,9% betrug.

hGC33-Coumarin 6-NP zielt effektiv auf GPC3 ab ⁺ HCC-Zelllinie HepG2-Zellen

Um herauszufinden, ob der hGC33-Antikörper von Nanopartikeln immer noch die Fähigkeit besitzt, spezifisch auf GPC3 abzuzielen, haben wir GPC3 ⁺ . verwendet HepG2 und GPC3 ⁻ Li-7-Zellen als Zielzellen und hGC33-Cumarin 6-NP als Tracer-Nanopartikel und inkubierte die verschiedenen Zellen für 2 h, 4 h und 8 h. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit DAPI umgesetzt, um den Kern zu färben. Die Zellen wurden fixiert und mit einem Leica Fluoreszenzmikroskop (DMi8, Deutschland) fotografiert. Es wurde festgestellt, dass die grüne Fluoreszenz in HepG2-Zellen zur gleichen Inkubationszeit signifikant höher war als die in Li-7-Zellen (Abb. 2), was darauf hindeutet, dass die Menge an hGC33-Cumarin 6-NP, die in die HepG2-Zellen eindrang, signifikant höher war. in Li-7-Zellen. Die Ergebnisse dokumentierten, dass der hGC33-Antikörper auf hGC33-Coumarin6-NP immer noch die Fähigkeit hatte, auf GPC3 abzuzielen und die Internalisierung von Nanopartikeln zu vermitteln. Die Expression von GPC3 in HepG2-Zellen und Li-7-Zellen wurde mit indirekter Fluoreszenz und zytochemischer Färbung untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass HepG2-Zellen GPC3 überexprimierten, während Li-7-Zellen GPC3 nicht exprimierten (Abb. 2).

hGC33-Null-NP hemmt die Proliferation von HepG2-Zellen

Um zu bestimmen, ob hGC33-modifiziertes NP (hGC33-null-NP) das Wachstum von HCC hemmen könnte, haben wir die Zellwachstumshemmung der GPC3-positiven HCC-Zelllinie HepG2 und der GPC3-negativen Zelllinie Li-7 gemessen. Wir fanden, dass sowohl hGC33-null-NP als auch hGC33 das Wachstum der GPC3-positiven HCC-Zelllinie HepG2 nach 24 Stunden Behandlung hemmten, aber hGC33 hatte eine signifikantere hemmende Wirkung auf HepG2-Zellen als hGC33-null-NP (Abb. 3a).; im Gegensatz dazu beeinflussten hGC33-null-NP und hGC33 das Wachstum der GPC3-negativen Li-7-Zelllinie nicht (Abb. 3b). Der repräsentative Zeitverlauf von hGC33-null-NP (entspricht 0,1 µm hgc33) und hGC33 (0,1 µm) der HepG2-Zellproliferation ist in Abb. 3c dargestellt. Da hGC33 ein C-terminales Peptid ist, das GPC3 erkennt, ist hGC33 hGC33-null-NP bei der Hemmung von HepG2 überlegen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das hGC33-Molekül in hGC33-null-NP eine raumblockierende Wirkung haben könnte, was die Bindungsfähigkeit von hGC33 an Epitope beeinträchtigen könnte.

Die Proliferation von HepG2- und Li-7-Zellen wurde durch hGC33, null-NP und hGC33-null-NP gehemmt. a Der Zellproliferationstest wurde an GPC3-positiven HepG2-Zellen durchgeführt, die mit hGC33, null-NP oder hGC33-null-NP behandelt wurden; b Zellproliferationstests wurden an GPC3-negativen Li-7-Zellen durchgeführt, die mit hGC33, Null-NP und hGC33-Null-NP behandelt wurden. Die Zellen wurden 1 Tag lang mit 0–2,5 μM hGC33, Null-NP oder hGC33-Null-NP inkubiert. Die Proliferation der Zellen wurde mit der MTT-Methode gemessen und als unbehandelte Zellen standardisiert. Alle Werte repräsentieren den Mittelwert  ± SD. Verglichen mit der Kontrollgruppe (0 μM) ohne Antikörperbehandlung, *P <0,01; c die repräsentativen Ergebnisse des Ansprechens von HepG2 auf hGC33, null-NP und hGC33-null-NP bei einer hGC33-Behandlung (1,0 μM)

hGC33-Null-NP hemmt den Zellzyklus von HepG2-Zellen

Um den Mechanismus der molekularen Aktivität des hGC33-Antikörpers zu verstehen, der auf hGC33-null-NP-Nanopartikeln modifiziert wurde, untersuchten wir die Zellzyklus-Progression von HepG2, das mit hGC33-null-NP behandelt wurde. In der HepG2-Zelllinie erhöhten hGC33-null-NP und hGC33 den Anteil der Zellen in G1 signifikant (Abb. 4a, b), was darauf hindeutet, dass sowohl hGC33-null-NP als auch hGC33 den Zellzyklusarrest in der G1-Phase induzieren könnten. Darüber hinaus könnten hGC33-null-NP und hGC33 die CyclinD1-Expression in HepG2-Zellen signifikant herunterregulieren (Abb. 4c, d).

hGC33-null-NP und hGC33-induzierter Zellzyklusarrest in der G1-Phase und inhibierte die CyclinD1-Expression in HepG2-Zellen. a Repräsentatives Zell-Zyklus-Diagramm verschiedener Gruppen, die mit hGC33-null-NP und hGC33 behandelt wurden. b Zellzyklusanalyse verschiedener Gruppen, die mit hGC33-null-NP und hGC33 behandelt wurden. Die HCC-Zellen wurden mit 0,5 μm hGC33 oder hGC33-null-NP (mit der molaren Konzentration von hGC33 als Referenz) inkubiert. *P <  0,05, die G1-Phase von hGC33-null-NP- oder hGC33-Zellen wurde mit der von 0 h-Zellen verglichen. c , d Nach Behandlung mit hGC33-null-NP oder hGC33 wurde CyclinD1 in HepG2-Zellen im Vergleich zu der Kontrollgruppe signifikant herunterreguliert

Wnt-Aktivierung in HepG2-, Huh-7- und Li-7-Zellen

Um die Aktivierung des klassischen Wnt/β-Catenin-Signals in HCC-Zellen zu verstehen, haben wir zunächst die Expression des Wnt-Liganden und des Rezeptor-Crimp-Proteins (frizzled, FZD oder Frz) in verschiedenen HCC-Zelllinien nachgewiesen:HepG2 (GPC3 ⁺⁺ ), Huh-7 (GPC ⁺ ) und Li-7 (GPC3 ⁻ ). Die Ergebnisse zeigten, dass Wnt3a und der FZD-Rezeptor, der den β-Catenin-Weg transduziert, in allen Zelllinien exprimiert wurden, insbesondere in HepG2- und Huh-7-Zellen (Abb. 5).

Expression von Wnt3a, FZD1 und FZD3 in HCC-Zelllinien

hGC33-Null-NP hemmt die Wnt-Signaltransduktions-abhängige Zellproliferation durch Wnt3a

Einige Studien haben gezeigt, dass der extrazelluläre Teil von GPC3 ein Co-Rezeptor von Wnt sein könnte, der die Wnt/β-Catenin-Signalaktivierung und -transduktion fördert. Therefore, when HepG2 (GPC3 ⁺ ), Huh-7 (GPC3 ⁺ ), and Li-7 (GPC3 ⁻ ) cells were co-incubated with hGC33 and hGC33-null-NP, the activation of Wnt/β-catenin signal was blocked by hGC33 and hGC33-null-NP, and proliferation of HepG2 and Huh-7, but not Li-7, in Wnt3a-conditioned medium was inhibited. That proliferation of Li-7 cells most likely is due to the absence of GPC3 on the surface of Li-7 cells (Fig. 6). Our results indicate hGC33 and hGC33-null-NP nanoparticles specifically bind to GPC3 molecules on cell membrane. hGC33 and hGC33-null-NP partially neutralize the mitogenic activity of Wnt3a and inhibit the Wnt/β-catenin signaling pathway. However, the inhibition of proliferation by hGC33-null-NP nanoparticles was less than that of hGC33. Perhaps the spatial structure of the nanoparticles interferes with hGC33-null-NP and limits the function of the hGC33 molecule on the nanoparticles so they cannot completely block the interaction between GPC3 and Wnt3a.

GPC3-activated Wnt signal transduction in HCC. Fifty percent Wnt3a DMEM medium was added with anti-wnt3a antibody, hGC33, or hGC33-null-NP. HepG2 (GPC3 ⁺⁺ ), Huh-7 (GPC3 ⁺ ) and Li-7 (GPC3 ⁻ ) cells were co-incubated for 48 h, and cell proliferation was measured by MTT assay. The data were expressed as mean ± SD (*P  < 0.01)

hGC33-Null-NP Inhibits Wnt3a-Induced Signal Transduction in HepG2 and Huh-7 Cells

To understand the effect of hGC33-null-NP on Wnt/β-catenin signaling in HCC cells, we extracted the proteins of HepG2 and Huh-7 cells treated with hGC33 or hGC33-null-NP. The results of western blot showed that after hGC33-null-NP treatment, the levels of pYAP and pβ-catenin were increased, but the levels of YAP and β-catenin were decreased. Furthermore, the levels of cyclinD1, CD44, VEGF, and c-MYC in the hGC33-null-NP group were lower than those in the control group, but the level was less than with hGC33 treatment. Similar effects were observed in HepG2 and Huh-7 cells, as shown in Fig. 7.

Inhibition of Wnt3a-induced β-catenin signaling by hGC33-null-NP or hGC33. a Compared with the control group, Wnt/β-catenin signaling pathway in HepG2 and Huh-7 cells treated with hGC33-null-NP or hGC33 was inhibited, and the levels of β-catenin and YAP were decreased, while the increased phosphorylated β-catenin and phosphorylated YAP molecules were unstable, and degraded in cytoplasm. The decreased β-catenin was difficult to maintain in the nucleus and drive the expression of CyclinD1, CD44, VEGF, and c-MYC, which resulted in the decrease of cyclinD1, CD44, VEGF, and c-myc protein levels. b The mechanism pattern of Wnt/β-catenin signaling pathway inhibited by hGC33-null-NP or hGC33

hGC33-SFB-NP or hGC33 Attenuates HCC Cell Migration by Inhibiting Epithelial Mesenchymal Transition (EMT)

HCC is one of the deadliest cancers in the world, and its incidence is steadily increasing. Sorafenib is the only approved standard treatment for patients with advanced HCC, as it has been shown to improve the survival rate of these patients. However, clinical and preclinical observations suggest that sorafenib therapy has limited efficacy due to the rapid development of drug resistance. Therefore, elucidating the mechanism of escape resistance to sorafenib is a major emphasis in HCC research. In recent years, more and more attention has been paid to the role of epithelial mesenchymal transition (EMT) in the progress of HCC and the development of drug resistance. EMT refers to the transformation of epithelial to mesenchymal cells, which endows cells with the ability metastasize and invade, including acquisition of stem cell characteristics, reducing apoptosis and aging, promoting immunosuppression, and participating in the occurrence and development of cancer. The loss of E-cadherin expression is considered a key step in the carcinogenesis and EMT. EMT is a developmental multi-step molecular and cellular reprogramming process that cancer cells use to achieve aggression. This is mainly through down regulating the expression of E-cadherin, keratin, mucin, ZO-1 (tight junction protein); up regulating the expression of vimentin, alpha-smooth muscle actin (α-SMA), FN fibronectin, MMPs (degradation matrix), N-cadherin, snail, slug, twist, Rho, TGF-β, FGF, type I collagen, and type II collagen to achieve the invasion, metastasis, and anti-apoptosis of EMT characteristic tumor. The changes of these protein expressions mainly involve the activation of Wnt/β-catenin and Ras/Raf/MAPK signaling pathways.

Our experiments have shown that hGC33 antibody on the surface of NP vector can inhibit Wnt3a-induced β-catenin signal transduction, and then down regulate the expression of β—catenin, CD44, vascular endothelial growth factor (VEGF), cyclin D1, and c-MYC. Furthermore, hGC33-SFB-NP inhibits the activation of Ras/Raf/MAPK signal pathway and inhibits proliferation and apoptosis of HCC cells. hGC33 and SFB have a synergistic effect, inhibiting EMT and decreasing the migration of HCC cells (Fig. 8).

Effect of hGC33-SFB-NP on EMT inhibition. a Compared with the control group, the hGC33-SFB-NP treatment group had less cell migration. Photographs were taken under an optical microscope (magnification, × 200). The error value represents the standard deviation of three independent experiments. *Compared with the control group, p < 0.01. b Compared with the control group, the EMT-related proteins snail, vimentin, and MMP-2 in HCCs treated with hGC33-SFB-NP decreased, whereas E-cadherin increased. c Molecular mechanism of EMT. EMT, epithelial–mesenchymal transition; MMP-2, matrix metalloproteinase-2; SFB, sorafenib; NP, nanoparticle

hGC33-SFB-NP Inhibits the Growth of Hepatocellular Carcinoma In Vivo and Improves the Survival Rate of Tumor-Bearing Mice

To evaluate the anti-tumor activity of hGC33-SFB-NP in vivo, HepG2 and Huh-7 cells were inoculated subcutaneously into the right abdomen and dorsal side of female BALB/c nude mice, respectively. When the tumor xenograft growth reached about 30 mm ³ , the mice were randomly divided into groups to further evaluate the inhibition of each group (hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, SFB-NP, free hGC33, free SFB, and control group) HCC effect (n  = 5 per group). It can be seen from Fig. 9a, b that hGC33-SFB-NP significantly slowed tumor growth in mice compared with the PBS control and other treatments. Compared with the PBS control, hGC33-null-NP, SFB-NP, free hGC33, and free SFB also had some inhibition of HCC, which is because free hGC33 and free SFB directly inhibit Wnt signal and Ras/Raf/MAPK, respectively. Such pathways can inhibit the proliferation of HCC cells to a certain extent. Although the nanoparticle-modified hGC33 (hGC33-null-NP) is connected to the nanosurface through chemical bonds, it did not affect hGC33′s targeting of GPC3 molecules and inhibition of Wnt activity. Nanoparticle-loaded SFB (SFB-NP), after being endocytosed by cells, was degraded to release SFB from the copolymer to inhibit the growth of HCC. In all, the inhibitory effect of hGC33-SFB-NP on HepG2 cell grafts was, as expected, more than on Huh-7 cell grafts, probably because HepG2 expresses GPC3 molecules.

The effect of hGC33-SFB-NP on xenotransplantation of HCC in nude mice and the changes of mice weight. Liver cancer cells were inoculated subcutaneously on the back of each nude mouse (n  = 10). After 10 days, the tumor bearing mice were treated with PBS (control), free hGC33, free SFB, hGC33-null-NP, SFB-NP, and hGC33-SFB-NP. Tumor size (a , b ) and body weight (c , d ) of mice were monitored at designated time points

The body weight of nude mice in each treatment group also was measured, as shown in Fig. 9c, d. The body weight of the control group decreased gradually. The weight of mice in free hGC33, free SFB, SFB-NP, and hGC33-null-NP treatment groups also decreased progressively and not significantly less than in the control group. However, the weight of nude mice bearing HepG2 and Huh-7 treated with hGC33-SFB-NP only slightly decreased, and the weight remained relatively stable during the treatment cycle. These results support that the novel hGC33-SFB-NP nanodrug has no significant toxicity in nude mice, and the SFB loaded on the nanocarrier and the surface modified hGC33 can produce additive or even synergistic anti-tumor effect.

Discussion

To examine the suitability of hGC33-SFB-NP for targeted HCC therapy, we tested the model conjugates for their ability to bind to human glypican-3 on HCC cells in vitro; to inhibit glypican-3-positive HCC cell proliferation, migration, and Wnt/β-catenin signal transduction; and inhibit HCC that overexpress glypican-3 in vivo.

To covalently bind GPC3-specific antibody hGC33 with mal-PEG-b -PLGA nanoparticles, we cross-linked the free sulfhydryl group in the Fc segment of hGC33 with maleimide functionalized PEG-b -PLGA (mal-PEG-b -PLGA) by forming stable thioether bonds. Conjugation is a prerequisite for targeting of GPC3-positive HCC. A series of experiments, including the changes of nanoparticle diameter and zeta potential detected by lens and the intracellular uptake of hGC33-SFB-NP, verified the targeting of hGC33-SFB-NP to HepG2 (GPC3 ⁺ ) cells. These results indicated that the binding activity of antibody hGC33 was not altered by the conjugation.

We directly detected the phagocytic effect of GPC3 ⁺ HepG2 and GPC3 ⁻ Li-7 cells on PEG-b -PLGA NP surface-modified hGC33 by confocal microscopy. After HepG2 and Li-7 cells were co-cultured with hGC33-coumarin 6-NP, the green signal intensity in HepG2 cells was significantly higher than in Li-7 cells, indicating that there were more nanoparticles in the HepG2 cells. This finding is consistent with the hGC33 antibody modified on the surface of PEG-b -PLGA NP specifically binding to glypican-3 on the surface of HCC cells and being internalized. The efficiency of hGC33-modified NP internalization depends on the expression level of GPC3 antigen on the cell surface.

We used the standard MTT assay to measure the efficiency of inhibiting the proliferation of hepatoma cells. Both hGC33-null-NP and hGC33 inhibited the growth of the GPC3-positive HCC cell line HepG2, but hGC33-null-NP and hGC33 did not affect the proliferation of GPC3-negative Li-7 cells (Fig. 3b). At the animal level, hGC33-null-NP or hGC33 alone inhibited the growth of Huh-7 and HepG2 xenografts to a certain extent, while hGC33-SFB-NP caused growth arrest of Huh-7 and HepG2 hepatoma xenografts in mice. The finding that hGC33-null-NP significantly inhibited GPC3-positive hepatoma cells showed that the inhibitory effect of PEG-b -PLGA NP surface-modified hGC33 on HCC cell proliferation depends on the expression of GPC3 antigen on the cell surface.

GPC3 regulates many pathways in HCC pathogenesis, including Wnt and YAP signaling [25,26,27]. GPC3 interacts with Wnt ligand and may be a coreceptor for Wnt and facilitate Wnt/Frizzled binding for HCC growth [28, 29]. We further examined the effect of nanodrug surface-modified hGC33 on Wnt signaling pathway in hepatoma cells. Like free hGC33, nanodrug surface-modified hGC33 inhibited the proliferation of hepatoma cells not only by blocking Wnt-induced signal transduction in HepG2 and Huh-7 cells of expressing GPC3, but also by inhibiting Wnt3a-induced β-catenin and YAP signal transduction. Previous studies have shown that YAP expression is regulated by β-catenin at the transcriptional level of HCC [30, 31]. In this study, free hGC33 and nanodrug surface-modified hGC33 inhibited Wnt3a-induced YAP activity, indicating that Yap/TAZ released from β-catenin complex can also initiate classic Wnt signaling transduction [32, 2]. These results indicate that typical Wnt and YAP cross talk through a variety of mechanisms. Compared with hGC33-null-NP and hGC33, hGC33-SFB-NP had stronger anti-proliferation and anti-migration ability in vitro and in vivo. Thus, hGC33 not only determines the specificity of HCC cells, but also increases the inhibitory effect of SFB on the proliferation and migration of HCC cells by blocking the key signals related to tumor growth, such as Wnt/β-catenin and Wnt/YAP signaling pathway.

Conclusion

Antibody hGC33 to glypican-3, a membrane protein that is overexpressed on hepatocellular carcinoma cells, increased binding of sorafenib-loaded polyethylene glycol-b-PLGA polymer nanoparticles (hGC33-SFB-NP) to glypican-3 on the cancer cells. Administration of the antibody-modified nanoparticles synergistically inhibited Wnt-induced signal transduction and Ras/Raf/MAPK signaling pathway; hepatocellular carcinoma cells were arrested in G0/1 phase by down-regulation of cyclin D1 expression, thus attenuating cancer cell migration by inhibiting epithelial–mesenchymal transition. hGC33-SFB-NP inhibited the growth of liver cancer in vivo and improved the survival rate of tumor-bearing mice.

Availability of data and material

Yes, all data have presented in the manuscript.

Abkürzungen

AKT/PKB:

Protein kinase B

c-MET:

HGFR:Hepatocyte growth factor receptor

EE%:

Encapsulation efficiency %

EMT:

Epithelial mesenchymal transition

FTIR:

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

¹ H-NMR:

¹ H-nuclear magnetic resonance spectroscopy

HCC:

Hepatozelluläres Karzinom

LC%:

Drug loading %

MAPK:

Mitogen-activated protein kinases

PDI:

Polydispersitätsindex

PI3K:

Phosphoinositide 3-kinase

pRAD51:

Phospho-RAD51

SFB:

Sorafenib

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

YAP:

Yes-associated protein-1