Fe(II)- und Tanninsäure-umhülltes MOF als Träger von Artemisinin zur Versorgung mit Eisenionen zur Verbesserung der Behandlung von dreifach negativem Brustkrebs

Einführung

Ferroptose, ein neu entdeckter Subtyp des Zelltods, könnte zur Akkumulation von eisenabhängigen Lipidhydroperoxiden (LPO) führen, was zu einer Schädigung der Zellstruktur und -integrität führt [1,2,3]. Neuere Beweise deuten darauf hin, dass die Aktivierung der Ferroptose durch mehrere kleine Moleküle ein wirksamer Ansatz zur Tumorsuppression in verschiedenen experimentellen Krebsmodellen ist, und wecken hohe Erwartungen an das Potenzial der Ferroptose als neue Krebstherapie [4,5,6]. Triple-negativer Brustkrebs (TNBC) ist der aggressivste Subtyp von Brustkrebs ohne zielgerichtete Therapien und wird häufig mit Tumorrezidiven, Fernmetastasen und Therapieresistenz in Verbindung gebracht [7]. Frühere Studien haben darauf hingewiesen, dass xCT-Cystin/Glutamat-Antiporter in zahlreichen TNBC-Zellen stark exprimiert wird und eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des Glutathion (GSH)-Spiegels und des Redox-Gleichgewichts spielt [8]. Eine Verringerung des intrazellulären GSH-Gehalts kann TNBC-Zellen empfindlich gegenüber Ferroptose machen, wodurch Tumorzellen abgetötet werden [8]. Insbesondere kann Ferroptose auch die Resistenz von TNBC gegen die routinemäßige programmierte Apoptose umgehen [9]. Daher können Strategien oder Medikamente, die auf der Induktion von Ferroptose basieren, ein therapeutisches Potenzial für die klinische Behandlung von refraktärem TNBC haben.

Artemisinin (ART), ein Sesquiterpenlacton, das eine Peroxidgruppe enthält, wurde aus der traditionellen chinesischen Pflanze Artemisia annua . isoliert und hat eine wünschenswerte Antitumoraktivität in mehreren Krebszelllinien gezeigt [10, 11]. Zunehmende Beweise zeigten, dass Krebszellen signifikant mehr intrazellulären Eisenpool enthalten als normale Zellen, während die eisenvermittelte Spaltung der Endoperoxidbrücke es ART ermöglicht, selektiv den Zelltod in mehreren Krebszelllinien zu verursachen [12, 13]. Die eisenionenabhängige Antitumoraktivität hat bei der ART-regulierten Ferroptose zunehmende Aufmerksamkeit auf sich gezogen [13]. Mechanistisch kann ART den lysosomalen Abbau von Ferritin autophagieunabhängig induzieren, den zellulären Eisen(II)-Spiegel erhöhen und die Zellen für Ferroptose sensibilisieren [11].

Es bleibt jedoch unklar, ob ART Ferroptose bei TNBC induziert. Darüber hinaus schränken eine Reihe von Faktoren, wie eine schlechte Wasserlöslichkeit und eine unzureichende Verfügbarkeit von intrazellulären Eisen(II)-Ionen die weitere Anwendung der ART in der Antitumortherapie ein [13]. Es wird erwartet, dass ART-Nanokomplexe erfolgreich als prospektives Nanowirkstoff-Abgabesystem für ART-basierte Antitumor-Medikamente eingesetzt werden [14,15,16]. In den letzten Jahren haben Metall-organische Gerüste (MOFs), eine Klasse poröser Polymermaterialien, aufgrund von Demonstrationen ihrer großen Porengrößen, hohen scheinbaren Oberflächen und selektiven Aufnahme kleiner Moleküle Aufmerksamkeit auf sich gezogen [17,18,19]. Als Vertreter von MOF-artigen Materialien wird das zeolithische Imidazolatgerüst (ZIF-8) häufig bei der Entwicklung von Nanoarzneimitteln mit den Eigenschaften pH-Reaktionsfähigkeit, hoher Wirkstoffbeladung und guter Biokompatibilität verwendet [20,21,22,23 ]. Darüber hinaus ermöglicht die Möglichkeit, auf MOF eine einstellbare Oberfläche einzubauen, die Kontrolle der Oberflächeneigenschaften und deren Ausstattung mit Multifunktionalitäten [24, 25]. Der supramolekulare Aufbau einer Metall-Phenol-Koordinationsschicht auf der MOF-Oberfläche hat aufgrund der wünschenswerten Eigenschaften wie stimuliresponsiver Zerlegung, kolloidaler Stabilität und Biokompatibilität in letzter Zeit Interesse geweckt [26, 27]. Die Metall-Phenol-Koordinationsmaterialien auf dem MOF könnten ein ideales Vehikel für die Bereitstellung der hydrophoben ART sein.

Inspiriert davon haben wir ein Eisen(II)-Ion-Gerbsäure-Koordination-getarntes ZIF-8-Nanosystem entwickelt, das ART (TA-Fe/ART@ZIF) zur Regulierung der Ferroptose in TNBC-Zellen einkapselt, wie in Abb. 1 gezeigt. ZIF-8 war aufgrund seiner guten Biokompatibilität und pH-responsiven Freisetzung als Nano-Carrier zum Einkapseln von ART ausgewählt. Die Eisen(II)-Ion-TA-Koordinationsschicht wurde auf der Oberfläche von ART@ZIF zum Zweck der Dispersionsstabilität und der Bereitstellung von Eisen(II)-Ionen (Fe(II)) immobilisiert. Nach der Internalisierung des so hergestellten Nanosystems in Zellen würde ein saurer Abbau der Vehikel die Freisetzung von ART und die Akkumulation von Fe(II) erleichtern. Die Hochregulierung des Fe(II)-Spiegels in Zellen würde ART durch Spaltung der eisenvermittelten Endoperoxidbrücke in Radikale zerlegen, was die Wirkungen der Ferroptose deutlich verstärkt. Zusammenfassend kann die Entdeckung der TA-Fe/ART@ZIF-vermittelten Ferroptose neue Perspektiven für die Entwicklung neuartiger Behandlungen gegen TNBC bieten.

Schematische Darstellung der Herstellung von TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln und der synergistischen Induktion von Apoptose/Ferroptose in Tumorzellen

Material und Methoden

Reagenzien

Artemisinin (99%), 2-Methylimidazol (98%), Zinknitrat (ZnNO₃; 98%), Ta (98%), Eisensulfat (FeSO₄ .); 98% und wasserfreies Methanol wurden von Aladdin-Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China) bereitgestellt.

Herstellung von TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln

Zur Herstellung von ART@ZIF-Nanopartikeln wurden 200 mg ART in 1 ml wasserfreiem Methanol gelöst und 2 g 2-Methylimidazol (das Lösungsmittel war 8 ml absolutes Methanol) wurde langsam zu der erhaltenen ART-Lösung gegeben. Unter magnetischem Rühren wurden 0,2 g Zinknitrat (das Lösungsmittel war 1 ml absolutes Methanol) langsam zugegeben. Schließlich wurde das Volumen der Lösung auf 15 ml eingestellt und 10 Minuten gerührt, um eine hellweiße Lösung zu erhalten. Nach Zentrifugation bei 10.000 U/min wurde die Probe dreimal mit Methanol gewaschen. Der Überstand diente zur Messung des ART-Gehalts, während das Fällungsmittel gefriergetrocknet wurde, um den festen Zustand für die weitere Verwendung zu erhalten.

Zur Herstellung von TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln wurde TA-Lösung (40 mg/ml in entionisiertem Wasser, 2 ml) langsam zu der ART@ZIF-Lösung (10 mg/ml, 4 ml) gegeben. Nach 20 Minuten Rühren 5 mg/ml FeSO₄ wurde langsam zu der obigen Lösung gegeben. Nach wiederholtem Rühren für 30 Minuten wurde eine dunkelviolette Lösung erhalten. Schließlich wurde das Präzipitat durch Zentrifugation bei 10.000 U/min gesammelt. Der Niederschlag wurde dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen und gefriergetrocknet, um das TA-Fe/ART@ZIF zur weiteren Verwendung zu erhalten.

Charakterisierung

TEM (JEM-1230; JEOL, Tokyo, Japan) wurde verwendet, um die morphologische und elementare Zusammensetzung jedes Teils des Nanopartikels zu bestimmen. Dynamische Lichtstreuung und Zetapotential (DLS; Zetasizer Nano System Malvern Instruments, Malvern, UK) wurden verwendet, um die Partikelgröße und elektrische Stabilität der Nanopartikel zu bewerten. Zur Analyse der Zusammensetzung der Bestandteile der Nanopartikel wurden Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (VERTEX 70; Bruker, Bremen, Deutschland) und thermogravimetrische Analyse verwendet. Röntgenphotoelektronenspektroskopische (XPS)-Messungen wurden unter Verwendung einer PHI 5000 Versa Probe III (Physical Electronics) durchgeführt. Die elementare Zusammensetzung des TA-Fe/ART@ZIF-Materials wurde unter Verwendung von EDX (Carl Zeiss Model:Neon-40) durchgeführt.

Messung der Verkapselungseffizienz und Belastbarkeit

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) (Agilent 1200; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) wurde verwendet, um die ART-Menge im Überstand zu messen. Die Wirkstoffbeladungs- und Verkapselungsraten von ART können wie folgt berechnet werden:

In-vitro-Freisetzung und pH-Antwort von TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln

Die behandelte Dialysemembran, die mit 2 mg Nanopartikeln umhüllt war, wurde in 50 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einem pH-Wert von 7,4 bzw. 5,0 gelegt und kontinuierlich bei 37 °C geschüttelt. Die Lösung außerhalb der Dialysemembran wurde 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h und 10 h nach Beginn des Experiments entnommen. Der Gehalt an ART in der Pufferlösung wurde mittels HPLC gemessen.

Zellkultur

Die Zelllinien MDA‐MB‐231 und L929 wurden von der American Type Culture Collection (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) erworben. Die Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO₂ . kultiviert Feuchtigkeit in RPMI-1640-Medium (Solarbio, Peking, China), das mit 10 % fötalem Rinderserum (Cyclone, Utah, USA), 100 µg/ml Natriumpyruvat, Penicillin und Streptomycin (Solarbio Peking, China) ergänzt wurde.

Zellulärer Toxizitätstest in vitro

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung des 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-(MTT)-Assays gemäß Literaturverfahren bestimmt [28, 29].

MDA-MB-231-Zellen und L929-Zellen wurden in Standardzellmedien in 96-Well-Platten (5.000 Zellen pro Well) kultiviert und in 5 % CO₂ . inkubiert bei 37 °C für 24 h. Die Flüssigkeit in der Vertiefung wurde verworfen und 100 μl pro Vertiefung des serumfreien Mediums mit PBS und verschiedenen Konzentrationen von ART, TA-Fe/ZIF, TA-Fe/ART@ZIF, Deferoxamin (DFO, MedChemExpress, Shanghai, China) ), N-Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(O-Me)-Fluormethylketon (Z-VAD-FMK, MedChemExpress, Shanghai, China) und Ferrostatin-1 (Fer1, MedChemExpress, Shanghai, China) wurden dem 96 -Well Platten. Nach 48 h wurden 10 μL MTT (5 mg/ml) zugegeben und weitere 4 h inkubiert. Schließlich wurde ein automatischer Enzymmarker (BioTek Instruments Inc., USA) verwendet, um die Extinktion in jedem Well zu messen. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der Zelllebensfähigkeit ausgedrückt.

Calcein-Acetoxymethyl (Calcein-AM)-Färbungsassay

MDA-MB-231-Zellen wurden in 24-Well-Platten kultiviert (2 × 10 ⁴ Zellen pro Vertiefung) und 24 h inkubiert. Anschließend wurden die Zellen für 24 h mit unterschiedlichen Konzentrationen von TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln behandelt. Nach dem Verwerfen des Mediums wurden die Zellen mit Calcein-AM (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) im Dunkeln bei 4 °C für 20 Minuten gefärbt und unter einem Fluoreszenz-invertierten Mikroskop (Olympus, Tokio, Japan) beobachtet.

Durchflusszytometrie für Apoptose

MDA-MB-231-Zellen wurden in einer Sechs-Well-Platte mit einer Dichte von 2,5 × 10 ⁵ . platziert Zellen pro Vertiefung unter den gleichen Bedingungen. Nach der Behandlung mit PBS wurden 24 h lang ART, TA-Fe/ZIF und TA-Fe/ART@ZIF appliziert. Anschließend wurden die Zellen zentrifugiert und von der Sechs-Well-Platte gesammelt. Nach Propidiumiodid und Annexin-V-Doppelfärbung (Annexin V‐FITC Kit; Beckman Coulter, Marseille, Frankreich) wurde die Durchflusszytometrie zum Nachweis verwendet.

In-vitro-Assay zur Bestimmung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)

Der ROS-Gehalt in Zellen wurde unter Verwendung einer ROS-Fluoreszenzsonde (Dichlor-dihydro-fluorescein-diacetat (DCFH-DA, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) bestimmt. MDA-MB-231-Zellen wurden in Sechs-Well-Platten (2,5 × 10<.) kultiviert sup> 5 Zellen pro Well) und in 5 % CO₂ . inkubiert bei 37 °C für 24 h. Die Flüssigkeit aus den Wells wurde verworfen und die Zellen wurden wie folgt behandelt:Blindkontrollgruppe (serumfreies Medium), positive Kontrollgruppe und experimentelle Gruppe (unterschiedliche Konzentrationen von Nanopartikeln). Nach der Inkubation für 8 h bei 37 °C wurden 0,1 % DCFH-DA in jede Vertiefung gegeben und die Zellen wurden 30 Minuten lang inkubiert. Zellen, die nicht auf DCFH-DA ansprachen, wurden mit PBS entfernt und unter einem Fluoreszenz-invertierten Mikroskop (Olympus, Tokio, Japan) beobachtet.

Malondialdehyd (MDA) und GSH-Inhaltsbestimmung

Zur Messung der intrazellulären Spiegel von MDA und GSH wurden das MDA-Assay-Kit (TBA-Methode; Jiancheng Bioengineering, Nanjing, China) und das GSH-Assay-Kit (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) verwendet. Nach der Behandlung mit PBS, ART, TA-Fe/ZIF und TA-Fe/ART@ZIF wurden MDA-MB-231-Zellen gesammelt und gezählt. Der intrazelluläre Gehalt an MDA und GSH wurde gemäß den Anweisungen in den Kits bestimmt.

Western Blot-Analyse

Die mit verschiedenen Nanopartikeln behandelten MDA-MB-231-Zellen wurden mit RIPA-Lysepuffer lysiert. Nachdem die Proteinkonzentration bestimmt wurde, wurden die Proteine ​​verschiedener Proben unter Verwendung eines 10 % SDS-PAGE-Gels getrennt und auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Die mit Probenproteinen beladene Nitrozellulosemembran wurde 1 h durch 0,5 %ige BSA-Proteinlösung blockiert, und die Nitrozellulosemembran und die primären Antikörper wurden 24 h bei 4 °C inkubiert. Wir spülten die Primärantikörper mit TBST von der Nitrozellulosemembran und setzten sie 2 h lang mit den entsprechenden Sekundärantikörpern bei normaler Temperatur fort. Nach dem Abwaschen der sekundären Antikörper auf der Zellulosemembran wurde die Nitrozellulosemembran als Chemilumineszenzlösung verwendet und unter dem Gelbildgebungssystem beobachtet.

In-vivo-Antitumor-Experiment

Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission der Medizinischen Universität Weifang genehmigt. Gesunden weiblichen Nacktmäusen (Alter:4 Wochen; Gewicht:13–17 g; Vital River, Peking, China) wurde 5 × 10 ⁶ . verabreicht MDA-MB-231-Zellen in 150 µl phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Wenn das Tumorvolumen auf 70–120 mm ³ angestiegen ist , wurden die Mäuse zufällig in vier Gruppen eingeteilt. Jede Mäusegruppe wurde separat mit PBS, ART (20 mg/kg), TA-Fe/ZIF (80 mg/kg) und TA-Fe/ART@ZIF (100 mg/kg) behandelt. Jede Maus wurde alle drei Tage durch intraperitoneale Injektion behandelt. Nach 14 Tagen wurden alle Mäuse getötet. Die Tumorgewebe und wichtigen Organe wurden für die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung gesammelt.

Statistische Analyse

Alle Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt. Alle Daten wurden statistisch unter Verwendung der Software SPSS Version 22.0 (IBM Corp., Armonk, USA) analysiert. Die Ergebnisse wurden als mittlere ± Standardabweichung ausgedrückt. P Werte < 0.05 bezeichnet statistische Signifikanz.

Ergebnisse und Diskussion

Charakterisierungen von TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln

Zunächst wurden die ART@ZIF-Nanopartikel bei Raumtemperatur aus Methanol, Zinkacetat, 2-Methylimidazol und ART nach Literaturverfahren synthetisiert [30]. Stabile supramolekulare Metall-Polyphenol-Filme wurden dann schnell um die ART@ZIF-Template durch Vortexen von TA und Eisen(II)-Ionen gebildet. Im Vergleich zu den berichteten magnetischen Nanopartikeln [31,32,33] wurde TA-Fe/ART@ZIF über die Selbstorganisationsmethode hergestellt, die eine TA-Fe-Membran auf der Oberfläche von MOF ohne aggressive chemische oder hydrothermale Reaktion formatierte. Noch wichtiger ist, dass der TA-Fe/ART@ZIF-Nanoträger durch einen niedrigen pH-Wert ausgelöst werden kann, um ART und Fe(II) freizusetzen, das weiter durch das Endoperoxid von ART katalysiert wird, um C-zentrierte freie Radikale zu erzeugen, was die Ferroptose deutlich verstärkt . Die Verkapselungseffizienz, die mittels HPLC mit dem Überstand der ersten Zentrifugation gemessen wurde, betrug 66,7 %. Der Überstand wurde mit den TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln erhalten und die berechnete Wirkstoffbeladung von ART betrug 11,4 %. Laut FTIR-Spektroskopie (Abb. 2a) charakteristische Absorptionspeaks von ART, nämlich die Carbonylbindung bei 1.738 cm ⁻¹ und die Peroxybrücke bei 724 cm ⁻¹ [34], wurden in TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln beobachtet, was darauf hindeutet, dass ART erfolgreich in die Nanopartikel eingekapselt wurde. Als nächstes zeigten die Ergebnisse der thermogravimetrischen Analyse, dass die ART vollständig abgeschafft wurde, wenn die Temperatur auf etwa 400 °C erhöht wurde (Abb. 2b). Im Vergleich zu den TA-Fe/ZIF-Nanopartikeln wurde festgestellt, dass ART 7,1 % des Gesamtgewichts der TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel ausmacht, was im Wesentlichen mit den Ergebnissen der HPLC-Analyse übereinstimmt.

a FTIR von ART, ZIF-8 und TA-Fe/ART@ZIF; b Thermogravimetrische Analyse (TGA) von ART, TA-Fe/ZIF und TA-Fe/ART@ZIF

Die Ergebnisse von TEM zeigten, dass ZIF-8 und ART@ZIF eine ähnliche einheitliche Hexagonkonfiguration aufwiesen und die Partikelgrößenverteilung wurde bei ungefähr 100 nm bestimmt (Abb. 3a, b). TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel wiesen eine kugelförmige Konfiguration auf und die Partikelgrößenverteilung betrug 150 nm. Verglichen mit vollständigem ART@ZIF zeigte mit Fe(II) und TA beschichtetes TA-Fe/ART@ZIF eine offensichtlich konventionelle Kern-Schale-Struktur, und die Größe der TA-Fe-Membran betrug ungefähr 30 nm (Abb. 3a). Darüber hinaus führten wir eine Flächenelement-Mapping-Analyse der gebildeten Nanopartikel durch. Die Flächenelementkartierung bestätigte, dass die Peripherie der TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel vom Fe-Element umgeben war, was darauf hindeutet, dass Fe(II) und TA erfolgreich umhüllt wurden (Abb. 3b). XPS-Messungen wurden durchgeführt, um die elementare Oberflächenzusammensetzung und Wechselwirkung im TA-Fe/ART@ZIF-Verbundwerkstoff zu untersuchen. Das Wide-Scan-XPS-Spektrum von TA-Fe/ART@ZIF ist in Additional file 1:Abb. 1s abgebildet. Die Hauptpeaks, die bei etwa 285, 408, 531, 737 und 1036 eV auftraten, waren mit C 1s, N 1s, O 1s, Fe 2p bzw. Zn 2p verbunden, was die Bildung des TA-Fe/ART@ZIF-Nanokomposits demonstriert . Darüber hinaus werden EDS-Mapping-Bilder des TA-Fe/ART@ZIF in Additional file 1:Abb. 2s gezeigt. Es zeigt sich deutlich, dass die Peaks, die Elementen wie Kohlenstoff (C), Stickstoff (N), Sauerstoff (O), Eisen (Fe) und Zink (Zn) entsprechen, gut mit dem XPS-Spektrum übereinstimmen. Durch Erhöhung der Menge an Fe(II) fanden wir, dass der hydrodynamische Durchmesser von TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln erhöht wurde (Zusatzdatei 1:Abb. 3s). Um die Beschichtung weiter zu bestätigen, haben wir das Zetapotential verschiedener Nanopartikel gemessen. Die TA-Fe(II)-Schicht der Formation auf ART@ZIF-Partikeln verschiebt das Oberflächenzeta von  + 21 mV-Potential auf − 19,5 mV aufgrund der sauren Natur von TA (Zusatzdatei 1:Abb. 4s). Wie frühere Literatur berichtet [30], verleihen die zahlreichen Polyphenolgruppen in der TA-Struktur nicht nur die Fähigkeit zur Substratbeschichtung, sondern können auch mit Übergangsmetallionen (Fe, Zn) koordinieren, um einen Metall-Phenol-Komplex zu bilden. Wenn Zn ²⁺ und Hmim werden gemischt, um eine Lösung zu bilden, eine Masse von Zn ²⁺ Ionen würden sich an der Oberfläche von ART@ZIF-Partikeln koordinieren; somit beträgt das Zetapotential von ART@ZIF + 21 mV. Die phenolischen Gruppen von TA (pKa 8,5) wurden negativ deprotoniert und könnten daher mit dem positiv geladenen Zn ²⁺ . interagieren , die das Wachstum des TA-Fe-Films auf der ART@ZIF-Oberfläche fördert. Da die Wirkstoffabgabe Träger bevorzugt, ist die Stabilität ein wichtiger Faktor für ihre medizinische Anwendung. Die Stabilität der Nanopartikel wurde durch einwöchiges Dispergieren in PBS nachgewiesen. Wie in Zusätzliche Datei 1 gezeigt:Abb. 5s zeigt die Partikelgröße die gewünschte Größe und Stabilität aus dem Studienverlauf.

a TEM-Bilder und Größenverteilung von ZIF-8-, ART@ZIF- und TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln. Maßstabsleiste:100 nm; b Verteilung des Kohlenstoff- und Eisenelements in TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln. Maßstabsleiste:100 nm

a In-vitro-Freisetzung von ART aus TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln bei pH 7,4 und 5,0. b Die Zytotoxizität von ART-, TA-Fe/ZIF- und TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln in MDA-MB-231-Zellen bei 0, 12,5, 25, 50 und 100 μg/ml. c Lebensfähigkeit von L929-Zellen, die mit TA-Fe/ART@ZIF in verschiedenen Konzentrationen behandelt wurden. d Calcein-AM-Färbung von MDA-MB-231-Zellen, die mit TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln in Konzentrationen von 0, 25, 50 und 100 μg/ml behandelt wurden

ROS-Produktion nachgewiesen durch Fluoreszenz von DCFH-DA in MDA-MB-231-Zellen, die mit ART-, TA-Fe/ZIF- und TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln behandelt wurden

Freisetzung und Zytotoxizität von TA-Fe/ART@ZIF in vitro

Um zu untersuchen, ob TA-Fe/ART@ZIF ein pH-responsives Zersetzungsverhalten aufweist, untersuchten wir als nächstes die Freisetzung von ART aus Nanopartikeln unter neutralen und sauren Bedingungen. Wie in Abb. 4a gezeigt, können die Nanopartikel unter sauren Bedingungen innerhalb von 1 h schnell etwa 58 % der ART freisetzen. Unter neutralen Bedingungen können die Nanopartikel jedoch nur langsam eine winzige Menge ART freisetzen. Außerdem wurde während der Behandlung der externen Lösung der Dialysemembran mit Natriumhydroxid die Lösung der Gruppe pH =  5,0 mit Natriumhydroxid umgesetzt, um einen beträchtlichen weißen Niederschlag zu erzeugen. Dieses Phänomen wurde jedoch in der Gruppe mit pH = 7.4 nicht beobachtet.

Nach unserer Hypothese ist der weiße Niederschlag ein Zinkhydroxid-Niederschlag, der durch die Dissoziation von Zinkionen und Alkali von den Nanopartikeln unter sauren Bedingungen gebildet wird. Zusammenfassend zeigen diese Beweise erfolgreich, dass unsere Nanopartikel die Fähigkeit haben, unter sauren Bedingungen zu dissoziieren.

Beim Design des TA-Fe/ART@ZIF-Nanosystems werden die TA-Fe(II)- und ZIF-Strukturen ablatiert, um das umhüllte ART und Fe(II) unter den sauren Bedingungen der Tumormikroumgebung freizusetzen. Die Hochregulierung des Fe(II)-Spiegels in Zellen würde ART durch Spaltung der eisenvermittelten Endoperoxidbrücke in Radikale zerlegen, was die Wirkungen der Ferroptose deutlich verstärkt. Dementsprechend wurden MTT-Assays durchgeführt, um die Zytotoxizität des Nanosystems gegenüber MDA-MB-231-Zellen und L929-Zellen zu untersuchen. Im Vergleich zu ART zeigten TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel eine höhere Zytotoxizität gegenüber MDA-MB-231-Zellen (Abb. 4b) und eine geringe Zytotoxizität gegenüber normalen Zellen (Abb. 4c). TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel hemmten die Aktivität von MDA-MB-231-Zellen um 53,9 %, während ART bei gleicher Konzentration nur 24,1 % der gesamten Zellen hemmte. Die experimentellen Ergebnisse der Calcein-AM-Färbung bestätigten, dass die Menge lebensfähiger MDA-MB-231-Zellen mit steigender Konzentration von TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln allmählich abnahm (Abb. 4d).

TA-Fe/ART@ZIF verbesserte ROS-Generierung in MDA-MB-231-Zellen

Es ist bekannt, dass ART seine Antikrebsaktivität über die Bildung von ROS ausübt, die durch eisenvermittelte Spaltung der Endoperoxidbrücke produziert werden [35, 36]. Daher haben wir die Effizienz von TA-Fe/ART@ZIF untersucht, um die ROS-Erzeugung durch die 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCHF-DA)-Sonde zu induzieren [37]. Wie in Abb. 5 gezeigt, wurde das etwas stärkere Fluoreszenzsignal bei mit ART und TA-Fe/ZIF behandelten Zellen im Vergleich zu unbehandelten Gruppen beobachtet, was darauf hinweist, dass die ART- und Fe(II)-Ionen die ROS-Erzeugung induzieren könnten. Im Gegensatz dazu wird eine starke Fluoreszenzsignal-Exposition gegenüber TA-Fe/ART@ZIF-Nanowirkstoff in Zellen als Beweis für die gewünschte ROS-Ausbeute gefunden, die durch die Spaltung des Fe(II)-vermittelten Endoperoxids von ART erzeugt wird. Das so hergestellte Nanosystem in Zellen würde abgebaut werden und eine Ansammlung von Fe(II) bewirken, was die ROS-Erzeugung bemerkenswert verstärkt. Die krebshemmende Wirkung von ART und ihren Derivaten wurde ihrer Fähigkeit zugeschrieben, Apoptose durch verschiedene zelluläre Prozesse zu induzieren, die von der Reaktion auf DNA-Schäden, dem lysosomvermittelten katabolen Prozess der Makroautophagie bis hin zu oxidativem Stress reichen [13, 35, 38]. Und es wurde auch berichtet, dass die eisenvermittelte Spaltung der Endoperoxidbrücke bei ART das intrazelluläre oxidative Gleichgewicht bis zur Ferroptose in vielen Arten von Krebszellen beeinflussen könnte [11]. Diese auf einem oxidativen Ungleichgewicht basierende Induktion von Ferroptose kann durch Zugabe von Fe(II) weiter verstärkt werden. Während Fe(II) ART aktiviert, kann es auch mit intrazellulärem Wasserstoffperoxid reagieren, um durch die Fenton-Reaktion freie Hydroxylradikale zu erzeugen, was die Apoptose-induzierende Wirkung von ART in Tumorzellen verstärkt.

TA-Fe/ART@ZIF induzierte Apoptose und Ferroptose in MDA-MB-231-Zellen

Um den Zelltod und die Rolle von Fe(II) zu untersuchen, verwendeten wir den Eisenchelator Deferoxamin, den Apoptose-Inhibitor Z-VAD-FMK und den Ferroptose-Inhibitor Ferrostatin-1, um diese Zellen zu retten. Wie vorhergesagt, könnte Deferoxamin, ein Fänger von Fe(II), offensichtlich den Zelltod blockieren, was auf die wichtige Rolle von Fe(II) schließen lässt. Darüber hinaus wurde die Überlebensrate von MDA-MB-231-Zellen durch Apoptose und Ferroptose-Inhibitor signifikant von 31,4 % auf 56,3 % bzw. 76,0 % verbessert (Abb. 6a), was die Bedeutung von Apoptose und Ferroptose bei TA-Fe/ART . unterstreicht @ZIF-Nanopartikel vermittelten den Zelltod. Darüber hinaus verwendeten wir einen Annexin V-FITC-basierten Assay mittels Durchflusszytometrie, um den Grad der Apoptose quantitativ zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigen, dass TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel in 21,8% der MDA-MB-231-Zellen Apoptose induzieren können (Zusatzdatei 1:Abb. 6s). Dieser Prozentsatz war höher als der für ART aufgezeichnete, was darauf hindeutet, dass die Apoptose an den TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln beteiligt ist, die jedoch nicht die Hauptursache ist.

a Die Inhibitoren DFO (Deferoxamin), Fer-1 (Ferrostatin-1) und Z-VAD-FMK retteten die Lebensfähigkeit von MDA-MB-231-Zellen unter Behandlung mit 100 μg/ml TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln. b ART-, TA-Fe/ZIF- und TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel trugen zu übermäßigem MDA in MDA-MB-231-Zellen bei. c ART-, TA-Fe/ZIF- und TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel verbrauchten intrazelluläres GSH. d Die Expressionsspiegel von GPX4-Proteinen in MDA‐MB‐231‐Zellen, die mit ART‐, TA‐Fe/ZIF‐ und TA‐Fe/ART@ZIF‐Nanopartikeln behandelt wurden

Ein gemeinsames Merkmal der Ferroptose ist die endogene Lipidperoxidation [39]. MDA, ein Produkt der Lipidperoxidation [40], wurde untersucht, um den Grad der Ferroptose zu bestimmen. Die Ergebnisse zeigten, dass TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel etwa 2,5-mal höhere MDA-Spiegel aufwiesen als die Kontrollgruppe (Abb. 6b). Dies wurde aufgrund des Vorhandenseins von mit Nanoträgern angereichertem Fe(II) und der entsprechenden Erhöhung der Lipidradikalspiegel vermutet. Als eine der wichtigsten antioxidativen Komponenten in den Zellen wird intrazelluläres GSH verringert, begleitet von Ferroptose [41]. In Anbetracht der wichtigen Rolle von GSH bei der Ferroptose untersuchten wir den intrazellulären GSH-Spiegel nach Behandlung mit TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln. GSH war im Vergleich zu mit Vehikel behandelten Zellen signifikant verringert (Abb. 6c). Dies lieferte starke Beweise für den Abbau von GSH und ein Oxidationsungleichgewicht, das auf die Fe(II)-vermittelte Aktivierung von ART durch TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel konzentriert war. Als nächstes wurde Western Blotting durchgeführt, um den Einfluss von TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikeln auf die GPX4-Aktivität zu verstehen [42]. Wir beobachteten, dass TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel eine signifikantere Hemmung der GPX4-Aktivität verursachten als ART (Abb. 6d). Diese Daten stimmen auch gut mit dem höchsten Ausmaß der GSH-Erschöpfung überein.

In-vivo-Antitumor-Experiment

Wir bewerteten die Antitumor-Wirksamkeit unserer Nanopartikel gegen MDA-MB-231-Zellen in vivo durch die Hemmung von subkutanen Xenotransplantat-Tumoren in tumortragenden Nacktmäusen. Während der 14-tägigen Behandlung können TA-Fe/ART@ZIF-Nanopartikel im Vergleich zu anderen Gruppen das Wachstum von MDA-MB-231-Xenotransplantat-Tumoren als Ergebnis der reichlichen ROS-Erzeugung durch die Fe(II)-ART-Reaktion signifikant hemmen (Abb . 7a). Darüber hinaus gab es in allen Versuchsgruppen keine signifikante Diversität des Körpergewichts (Abb. 7b), was darauf hindeutet, dass TA-Fe/ART@ZIF vernachlässigbare Nebenwirkungen hatte. Um die therapeutische Wirkung weiter zu untersuchen, wurden der Tumor und andere normale Gewebe nach 14 d langer Behandlung durch H&E-Färbung untersucht. As shown in Fig. 8, TA-Fe/ART@ZIF caused the largest region of cell death in the tumor tissue, while there was no obvious damage and apoptosis in the normal tissues. Overall, these results demonstrated that the TA-Fe/ART@ZIF-mediated therapy not only led to anticancer efficacy, but also have a low level of acute systematic toxicity in the SFT-MB-mediated therapy.

a Relative tumor volume after treated with treated with PBS, ART, TA-Fe/ZIF, and TA-Fe/ART@ZIF nanoparticles. b Relative mice body weight of various groups

H&E stains of organs and tumors from various mice groups. Scale bar:50 μm

Conclusion

In summary, ferroptosis provides a potential remedy for TNBC treatments, since it has exclusive advantages to overcome inevitable barriers of the currently prevalent therapy. Here, we designed a ferrous-supply nanocarrier for ART based on TA–Fe(II) coated on the ZIF nanoparticles with ART encapsulated via coordination-driven self-assembly for enhanced ferroptosis. The nano-carrier could be dissolved in the weak acidic microenvironment to release ART and Fe(II), which is further caused a high level of intracellular ROS and MDA, accompanied with decreasing of GSH and GPX4, leading to potent tumor growth inhibition and anticancer efficacy in vitro and in vivo. This work provides a novel approach to enhance the potency of ferroptotic nano-medicine and new directions for TBNC therapy. Biocompatibility and comprehensive mechanisms of TA-Fe/ART@ZIF-induced ferroptosis should be ensured for further investigation.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten sind uneingeschränkt verfügbar.

Abkürzungen

MOF:

Metal–organic frameworks

TNBC:

Triple-negative breast cancer

ART:

Artemisinin

TA:

Tannic acid

ZIF:

Zeolitic imidazolate framework-8

TA-Fe/ART@ZIF:

Tannic acid and ferrous ion coated on the zeolitic imidazolate framework-8 with artemisinin encapsulated

ROS:

Reactive oxygen species

LPO:

Lipid hydroperoxides

GSH:

Glutathion

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

FTIR:

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

HPLC:

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

PBS:

Phosphate-buffered saline

MTT:

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

DFO:

Deferoxamine

Fer-1:

Ferrostatin-1

Z-VAD-FMK:

N-Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(O-Me) fluoromethyl ketone

Calcein-AM:

Calcein-acetoxymethyl

DCFH-DA:

Dichloro-dihydro-fluorescein diacetate

MDA:

Malondialdehyde

BSA:

Rinderserumalbumin

TBST:

Tris-buffered saline Tween

SDS-PAGE:

Polyacrylamide gel electrophoresis

GPX4:

Glutathione peroxidase 4