Ultrasensitiver, markierungsfreier Immunoassay mit Goldnanopartikel-Graphenoxid-Hybrid-Plasmonischen Biosensoren

Hintergrund

Kohlenstoffbasierte Nanomaterialien – Graphen, Kohlenstoffnanoröhren und Graphenoxid (GO) – sind zu Grundpfeilern in der Biosensorik geworden aufgrund ihrer außergewöhnlichen elektrischen, optischen und Oberflächenchemie-Eigenschaften. GO's zweidimensionale Struktur und sauerstoffreiche Funktionsgruppen (Epoxide, Hydroxyle, Carboxyle) verleihen hohe Proteinaffinität und ermöglichen kovalente Kopplung, was es zu einem attraktiven Substrat für elektrochemische, Fluoreszenz-, SPR- und LSPR-Sensoren macht. Goldnanopartikel (AuNPs) bringen einstellbare plasmonische Absorption, Biokompatibilität und einfache Oberflächenchemie mit, wodurch sie als Signalverstärker oder optische Tags fungieren können. Wenn AuNPs auf GO dekoriert sind, erbt das Hybrid die schnelle Bindung von GO und die intensive LSPR von AuNPs, was zu erhöhter Empfindlichkeit in Immunoassays, DNA-Detektion und Enzymassays führt. Trotz umfangreicher elektrochemischer und SERS-Studien wurden bisher keine schnellen, farbmetrischen oder markierungsfreien Immunoassays basierend auf nackten-augen AuNP-GO-Hybriden berichtet. Diese Studie schließt diese Lücke durch Entwicklung eines chemisorptionsbasierten, LSPR-verstärkten Immunoassays, der in wässrigem Puffer operiert und gängige Interferenzen toleriert.

Methoden/Experimentell

Materialien

Graphit (Graphene Supermarket), GO (modifizierte Hummer-Methode, 0,1–1 µm Flocken, 1,1 nm dick), Cystamin-Dihydrochlorid (Cys, 96 %), HAuCl₄·3H₂O (99,99 %), Natriumcitrat, BSA, Anti-BSA (Kaninchen IgG), NHS und EDC wurden alle von Sigma-Aldrich oder Alfa Aesar bezogen. Alle Reagenzien wurden ohne weitere Reinigung verwendet.

Synthese der AuNPs

AuNPs wurden durch Citratreduktion synthetisiert: 15 ml 1 mM HAuCl₄ wurde bei 550 °C, 1100 min⁻¹ im Reflux erhitzt; 1,8 ml 38,8 mM Natriumcitrat wurde zugegeben. Nach 5 min wurde die Mischung bei 400 °C, 900 min⁻¹ für 30 min gekocht und auf Raumtemperatur abgekühlt. Dieses Verfahren liefert ~15 nm sphärische AuNPs; Verwendung von 0,8 ml Citrat produziert ~60 nm Partikel. Die Reaktion: HAuCl₄ + C₆H₅O₇Na₃ → Au(s) + CO₂ + HCOOH.

Präparation des GO-BSA-Antigenziels

GO-Blätter (0,1 g L⁻¹) wurden mit EDC (400 µM) und NHS (100 µM) (1:1 Volumenverhältnis) aktiviert. BSA (20 µl, 100 µg ml⁻¹) wurde kovalent über Amidbindung gekoppelt und durch wiederholte Zentrifugation gereinigt. Abbildung 1 illustriert den GO-BSA-Konjugations-Workflow.

GO-BSA-Interaktion. Die Carboxylgruppe von GO-Blättern kann mittels EDC/NHS-Reaktion aktiviert werden und Präparation des GO-basierten Antigenziels für GO-BSA

Präparation der AuNP-antiBSA-Sonde

AuNPs wurden mit Cys (10 mM, 2 h, RT) funktionalisiert, um exponierte –NH₂-Gruppen einzuführen. Anti-BSA (20 µl, 100 µg ml⁻¹) wurde dann über Amidbindungen ohne zusätzliche Aktivierung gekoppelt, gefolgt von Zentrifugation zur Entfernung ungebundener Antikörper. Serielle Verdünnungen von 100 µg ml⁻¹ bis 1 pg ml⁻¹ erzeugten einen Bereich von AuNP-antiBSA-Sonden (Abb. 2a). AuNP-GO-antiBSA-Komposite wurden durch EDC/NHS-Aktivierung von GO-Carboxylen und kovalente Anbindung von Cys-modifizierten AuNPs, dann Antikörperkopplung zusammengebaut (Abb. 2b).

AuNP-antiBSA und AuNP-GO-antiBSA Interaktionen. Präparation der a AuNPs und b AuNP-GO basierten Antikörpersonden

Charakterisierungstechniken

Strukturelle und optische Charakterisierung setzte FE-TEM, HR-TEM, SEM (JEOL JSM-7800F), UV-Vis-Spektroskopie (U-2900, Hitachi), Raman-Mikroskopie (MRI, Protrustech), FTIR (Bruker Vertex 80v ATR) und XPS (National Synchrotron Radiation Research Center) ein. AuNP-Größe, -Verteilung und Oberflächenchemie wurden über alle Proben bestätigt.

Ergebnisse und Diskussion

Morphologie und Zusammensetzung

SEM und TEM zeigten einheitliche 60-nm-AuNPs gleichmäßig verteilt auf gefalteten GO-Blättern (Abb. 3). XPS bestätigte das Vorhandensein von C-C (sp²), C-C (sp³), C-O, C=O und O-C=O Funktionsgruppen auf GO, während Au-4f-Peaks die AuNP-Integration verifizierten.

Oberflächenmorphologie-Analyse des Nanokomposits. a SEM-Bilder eines GO-Blatts und b TEM-Bild des AuNP-GO-Komposits. c TEM-Bild des ERGO AuNP-GO-Films

Spektroskopische Charakterisierung von GO

Hochauflösende C-1s-XPS, Raman und ATR-FTIR-Spektren bestätigen die charakteristischen sauerstoffhaltigen Funktionsgruppen von GO (sp² C, Epoxide, Hydroxyle, Carbonyle, Carboxyle). Raman-Peaks bei 1355 cm⁻¹ (D), 1614 cm⁻¹ (G) und 2714 cm⁻¹ (2D) corroborieren die geschichtete Struktur (Abb. 4).

Spektralanalyse von GO-Blättern. a XPS-Hochauflösungs-Scan im C1s-Bereich, b Raman, und c FTIR

Proteininteraktion und LSPR-Antwort

UV-Vis-Spektren von AuNPs (15 nm und 60 nm) zeigen LSPR-Peaks bei 520 nm und 540 nm. GO allein zeigt π-π*-Absorption bei 230 nm und n-π* bei 300 nm. Nach Funktionalisierung zeigen AuNP-Cys-antiBSA-Konjugate duale Peaks bei 540 nm (AuNP) und 755 nm (AuNP-Cys-antiBSA) mit konzentrationsabhängiger Verschiebung (Abb. 5). Kalibrierkurven (y = 2,43 + 0,25 x, R² = 0,91 für 540 nm; y = 2,56 + 0,31 x, R² = 0,96 für 760 nm) bestätigen Linearität über 1,45 nM bis 145 fM Anti-BSA.

Analyse der UV-Vis-Absorptionsspektren für AuNP mit AntiBSA-Interaktionsantwort. a SP-Absorptionsspektren von AuNPs, b GO-gebundenes BSA, c AuNP-Anti-BSA-Sonde, und d Kalibrierkurven für AuNP mit AntiBSA-Interaktionsantwort bei Verdünnung verschiedener AntiBSA-Proteinkonzentrationen von 1,45 nM ~ 145 fM

AuNP-GO-antiBSA-Hybride verstärken das LSPR-Signal weiter. Bei Zugabe von GO-BSA-Zielen verschiebt sich der 540-nm-Peak linear mit Anti-BSA-Konzentration (1,45 nM–145 fM), was eine LOD von 145 fM ergibt (Abb. 6). Kalibrierung für die AuNP-GO-Sonde (f(x) = 0,918 + 0,124 x, R² = 0,94) und für GO allein (f(x) = 0,791 + 0,057 x, R² = 0,954) demonstrieren überlegene Empfindlichkeit des Hybridsystems.

Analyse der UV-Vis-Absorptionsspektren für Immunantwort. a AuNP-gebundenes GO und GO-gebundenes BSA, b AuNPs und GO-gebundenes Anti-BSA, c AuNP-GO-AntiBSA-Sonde, und d AuNP-GO-AntiBSA-Sonde und GO-BSA-Ziel für Immunantwort

Interferenzstudien mit 10 ng ml⁻¹ hCG zeigten minimale Kreuzreaktivität (R² = 0,89 für AuNP-GO; 0,73 für GO allein), was Assay-Robustheit bestätigt. Der Sensor behielt Leistung nach vier Regenerationszyklen, was hohe Oberflächenstabilität anzeigt.

Schlussfolgerungen

Wir haben ein biokompatibles AuNP-GO-Hybrid entwickelt, das LSPR nutzt, um markierungsfreie Detektion von Anti-BSA bei 145 fM zu erreichen. Das Nanokomposit zeigt hohe Bioaffinität, schnelle Ansprechzeit und Resilienz gegen gängige Interferenzen, was es zu einer überzeugenden Plattform für Point-of-Care-Immunoassays macht. Zukünftige Arbeiten werden multiplexe Detektion, Integration in mikrofluidische Geräte und Anpassung an klinisch relevante Biomarker erforschen.

Abkürzungen

Ag:

Silber

AntiBSA:

Rinderalbumin-Antikörper

Au:

Gold

AuNP:

Goldnanopartikel

BSA:

Rinderserumalbumin

Cys:

Cystamin

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid

FEG-TEM:

Feldemissionsgun-Transmissionselektronenmikroskop

FTIR:

Fourier-Transform-Infrarotspektrometer

GO:

Graphenoxid-Blatt

HR-TEM:

Hochauflösendes Transmissionselektronenmikroskop

LOD:

Nachweisgrenze

LSPR:

Lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz

MOA:

8-Mercaptooctansäure

NHS:

N-Hydroxysuccinimid

Pd:

Palladium

POCT:

Point-of-Care-Testing

Pt:

Platin

RGO:

Reduziertes Graphenoxid

SAMs:

Selbstassemblierte Monolagen

SERS:

Oberflächenverstärkte Raman-Streuung

UV-Vis:

Ultraviolett-sichtbar

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie

ZnO:

Zinkoxid