Bufalin-beladene PEGylierte Liposomen:Antitumorwirksamkeit, akute Toxizität und Gewebeverteilung

Einführung

Bufalin (BF; 3β,14-Dihydroxy-5β,20(22)-bufadienolid, 5β,20(22)-bufadienolid-3β,14-diol), extrahiert aus Venenum Bufonis , hat entzündungshemmende, kardiotonische, antivirale, acesodyne und antitumorale Aktivitäten [1, 2]. Unsere Gruppe zeigte auch, dass BF therapeutische Wirkungen auf Hepatom, Melanom, Kolonkarzinom, Gliom und epitheliales Ovarialkarzinom hat, was auf seine Hemmung der Zellproliferation und Induktion der Zellapoptose zurückgeführt werden könnte [3,4,5,6,7] .

Lanet al. [8] etablierte zuvor ein Gliom-Xenotransplantat-Modell in Nacktmäusen, denen BF täglich intraperitoneal verabreicht wurde (i.p. ) Injektion. In der mit BF behandelten Gruppe wurden fast keine zweikernigen Kerne und keine Mitose beobachtet; außerdem waren die Nukleolen kleiner und die Zellmorphologie war regelmäßiger als in der Kontrollgruppe. Obwohl BF viele potenzielle pharmakologische Wirkungen hat und die bisher erzielten Ergebnisse vielversprechend sind, ist BF als Einzelwirkstoff noch weit von einer klinischen Anwendung entfernt. Darüber hinaus ist die BF-Behandlung mit unerwünschten Nebenwirkungen und Nebenwirkungen wie Immunreaktion, Verletzung des normalen Gewebes und hoher Toxizität verbunden [9].

Zur Förderung der Löslichkeit, pharmakologischen Aktivität und Bioverfügbarkeit von BF wurden mehrere Wirkstoffabgabesysteme wie Lipidemulsionen, Nanopartikel und Liposomen eingesetzt [10, 11]. Darüber hinaus haben die aggregationsinduzierten Emission (AIE) aktiven funktionellen polymeren Selbstorganisation ein großes Potenzial für verschiedene biomedizinische Anwendungen gezeigt, einschließlich der biologischen Bildgebung und der intrazellulären Wirkstoffabgabe [12, 13]. Unter diesen Arzneimittelabgabesystemen haben liposomale Zubereitungen mehrere Vorteile zur Verwendung als intravenöse (i.v.) Abgabesysteme. Liposomale Präparate können nicht nur die Wasserlöslichkeit verbessern und die Nebenwirkungen der beladenen Wirkstoffe reduzieren [14], sondern die Wirkstoffe auch über die Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​transportieren, um den Hirntumor effektiver und effizienter zu behandeln [15] . Die BHS besteht aus kapillaren Endothelzellen des Gehirns und den Tight Junctions zwischen ihnen, sternförmigen Zellen, Gliazellen und der Basalmembran, die es nur hochfettlöslichen Arzneimitteln ermöglichen, im Hirngewebe zu passieren und sich zu verteilen [16]. Nichtsdestotrotz weisen Liposomenpräparate einige Mängel auf. Absorption durch Plasmaproteine ​​und Erkennung durch das mononukleäre phagozytäre System bewirken eine schnelle Clearance des beladenen Arzneimittels aus dem Blut. Allerdings könnte eine Oberflächenmodifikation von Liposomen mit PEG diese Probleme lösen [17].

In früheren Forschungen haben wir mit Bufalin (BF/PEG-LP) beladene PEGylierte Liposomen hergestellt und diese, einschließlich ihrer Zytotoxizität und pharmakokinetischen Profile, charakterisiert, um die oben genannten Herausforderungen zu überwinden, die Wirksamkeit der Wirkstoffabgabe zu erhöhen und die Toxizität zu verringern. Um diese Forschung zu erweitern, haben wir die physikalischen und chemischen Eigenschaften, die Antitumorwirkung, die akute Toxizität und die Gewebeverteilungsprofile von BF/PEG-LP weiter untersucht.

Materialien und Methoden

Chemikalien und Reagenzien

BF und Cinobufagin (CBG) wurden von BaoJi Chenguang Technology Development Co., Ltd. (BaoJi, China; 98% Reinheit, identifiziert durch HPLC) bezogen und in DMSO zur Lagerung bei –20 °C als Stammlösungen gelöst. Als interner Standard (IS) wurde CBG verwendet. Doxorubicin (DOX) wurde von Beijing Solarbio Science &Technology Co., Ltd. (Beijing, China; 98% Reinheit, identifiziert durch HPLC) bezogen und in DMSO zur Lagerung bei –20 °C als Stammlösungen gelöst. BF/PEG-LP wurden in unserem Labor hergestellt (Partikelgröße 155,0 ± 8,46 nm; Zetapotential – 18,5 ± 4,49 mV; Einschlusseffizienz 76,31 % ± 4,23%, nachgewiesen durch HPLC) [6]. Ameisensäure von HPLC-Qualität wurde von Tedia Company Inc. (Fairfield, OH, USA) bezogen. Das Zellzählkit-8 (CCK-8) wurde von Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan) erworben. Ethylacetat von HPLC-Qualität wurde vom Tianjin Kermel Chemical Reagents Development Center (Tianjin, China) bezogen. Acetonitril von HPLC-Qualität wurde von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Alle anderen Reagenzien waren von analytischer Qualität.

Tiere

Männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von ungefähr 230–250 g; Kunming-Mäuse mit einem Gewicht von 18–22 g; und 6 Wochen alte nackte Balb/c-Mäuse wurden vom Experimental Animal Research Center, Fourth Military Medical University (Xi'an, China) geliefert. Die Tiere wurden getrennt in einem individuell belüfteten Käfigsystem (IVC) gehalten und 5 Tage lang mit Standard-Laborfutter und Wasser ad libitum gefüttert. Alle Tiere wurden (außer Wasser) über Nacht vor den Experimenten gefastet. Experimentelle Verfahren mit Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Fourth Military Medical University überprüft und genehmigt (Genehmigung 2017-0603-R).

Vorbereitung von Standardproben

Kalibrierungskurven wurden erstellt, indem 100 µl Gewebehomogenat mit jeweils 20 µl der Arbeitslösungen versetzt wurden, um Proben mit 20, 50, 200, 500 und 2000 µg/ml BF herzustellen. Die dotierten Standardhomogenatproben wurden im Voraus vorbereitet und mit jeder analytischen Charge unbekannter Proben bewertet.

Sicherheit der Liposomen

RBC-Hämolysetest

Acht Milliliter Blut wurden Ratten entnommen und anschließend heparinisiert und mit 10&supmin;&sup4; ml 0,9% normaler Kochsalzlösung verdünnt. Die Vollblutproben wurden dann mit 100 µl BF-Lösung oder 1 µl BF/PEG-LP-Suspension gemischt. Nach 40 minütigem Eintauchen in ein bei 37 °C gehaltenes Wasserbad wurden die Proben bei 750g . zentrifugiert 5 Minuten lang, um die RBCs und Fragmente davon zu entfernen. Der Überstand wurde in 2 ml Ethanol/Salzsäurelösung (39:1; 99% Ethanol (v/v ):37% Salzsäure (w/v )). Der Überstand wurde bei 750g . zentrifugiert für 5 min, wonach die Extinktion bei 398 nm mit einem UV-Spektrophotometer gemessen wurde. Eine Positivkontrolle bestehend aus destilliertem Wasser und eine Negativkontrolle bestehend aus 0,9% Kochsalzlösung wurden hergestellt und auf die gleiche Weise gemessen.

Die Hämolyserate (HR%) der Nanopartikelsuspension wurde wie folgt berechnet:

wo A _Beispiel ist die Extinktion der Probe, A _negativ die Extinktion der Negativkontrolle ist und A _positiv ist die Extinktion der Positivkontrolle.

Zytotoxizität der leeren Liposomen

CCK-8 wurde verwendet, um die Zytotoxizität von leeren Liposomen in humanen hepatozellulären Karzinom-HepG2-Zellen und humanen Dickdarmkrebs-HCT116-Zellen nachzuweisen. Suspendierte HepG2-Zellen und HCT116-Zellen (1 × 10 ⁴ Zellen/Well) wurden in eine 96-Well-Platte geimpft und mit RPMI-1640-Kulturmedium bis zur logarithmischen Phase kultiviert. Dem Kulturmedium wurden verschiedene Konzentrationen von leeren Liposomen zugesetzt. Für jede Konzentration wurden sechs Replikat-Wells hergestellt. Nach 24 h Inkubation wurde das Medium verworfen und 100 ul CCK-8 Arbeitslösung (CCK-8:RPMI-1640 Kulturmedium, 10:100) zugegeben. Nach 2 h Inkubation wurde die Extinktion mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Bio-Rad 680, Hercules, CA, USA) bei 450 nm nachgewiesen und quantifiziert.

Auswirkung des Umgebungs-pH-Werts auf die Stabilität von Liposomen

BF/PEG-LP wurden durch Hydratation mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7,4 bzw. pH 5,0 hergestellt. Die Liposomen wurden bei 4°C unter dunklen Bedingungen gelagert. Die Extinktion der Proben bei 296 nm wurde bei 0, 5, 15, 30, 60 und 120 min gemessen.

In-vitro-Experiment

Die Zellproliferation wurde durch den CCK-8-Proliferationsassay bewertet. HepG2-, HCT116-, A549- und U251-Zellen wurden einzeln mit einer Dichte von 1 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen/Well in 96-Well-Platten bei 37°C mit 5% (v/v ) CO₂ . Nach 24 h wurden unterschiedliche Konzentrationen von BF/PEG-LP in die Wells gegeben. Nach weiteren 24 h Inkubation wurde das Zellmedium verworfen und 100 ul CCK-8 Arbeitslösung zugegeben. Nach 2 h Inkubation wurde die Extinktion nachgewiesen und bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Bio-Rad 680) quantifiziert. Der Prozentsatz lebensfähiger Zellen und IC₅₀ Werte wurden aus einer Dosis-Wirkungs-Kurve geschätzt. Die Werte jeder Probe und Kontrolle wurden durch den Durchschnitt von sechs Replikat-Wells bestimmt.

Tumor-Xenotransplantat-Experiment

U251-Zellen (1 × 10 ⁷ ) in 0,15 ml PBS wurden subkutan in Nacktmäuse geimpft und 7 Tage lang wachsen gelassen, um eine Tumorgröße von mehr als 50 mm ³ . zu erreichen . Dann wurden die Mäuse zufällig in zwei Gruppen mit jeweils sechs Mäusen eingeteilt. In der Behandlungsgruppe wurden 0,5, 1,0 oder 2,0 mg/kg/Tag BF oder BF/PEG-LP i.p. an 21 aufeinanderfolgenden Tagen injiziert. PBS mit 0,1% DMSO wurde in die Vehikelkontrollgruppe injiziert, während 2 mg/kg Cisplatin (DPP) in die Positivkontrollgruppe injiziert wurden

Das Körpergewicht der Mäuse wurde alle 2 Tage gemessen. Alle mit BF und BF/PEG-LP behandelten Mäuse wurden sorgfältig auf Haut- und Haarzustand, Nahrungs- und Wasseraufnahmevolumen, Fäkalieneigenschaften und Verhaltensänderungen untersucht. Am Ende der Experimente wurden die Mäuse getötet und die Tumor-Xenotransplantate wurden entfernt und gewogen. Die transplantierten Tumoren wurden dann in 4% Paraformaldehydlösung fixiert und in Paraffin eingebettet. Fünf Mikrometer dicke Schnitte wurden hergestellt und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Das Wachstum und die Nekrose von Tumorzellen und die Infiltration von umgebendem Gewebe wurden unter dem Lichtmikroskop beobachtet.

pharmakologische Bewertung

Allgemeines Verhalten und unabhängige Aktivitäten

Fünfzig Kunming-Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen (n = 10 pro Gruppe), die i.p. als Einzeldosis verabreicht:Kochsalzlösung in der der Kontrollgruppe verabreichten Menge, 20 mg/kg Pentobarbital-Natrium als positive Kontrollgruppe und 1,0, 1,5 und 2,0 mg/kg als niedrig-, mittel- und hoch -Dosis BF/PEG-LP-Gruppen. Das allgemeine Verhalten, Haltung, Gang, Speichelfluss, Myofibrillation, Nystagmus und Sekretion von Mäusen wurden dann beobachtet. Nach 1 h Verabreichung wurden die Mäuse in eine Freilandbox gegeben. Die Anzahl der Mäuse, die sich in der Box bewegten, wurde 10 Minuten lang gezählt, nachdem sich die Mäuse 1 Minuten lang anpassen durften.

Koordinierte Übungstests

Die Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in fünf Gruppen (n = 10 pro Gruppe, halb männlich und halb weiblich), die i.p. folgendes verabreicht:Kochsalzlösung in dem Volumen, das der Blindkontrollgruppe verabreicht wurde, 2,5 mg/kg Chlorpromazinhydrochlorid als Positivkontrollgruppe; und 1,0, 1,5 bzw. 2,0 mg/kg BF/PEG-LP als Niedrig-, Mittel- bzw. Hochdosis-BF/PEG-LP-Gruppe.

Ein glatter Metallstab (Durchmesser 1,27 cm, Länge 80 cm) wurde senkrecht zum Boden gestellt und am Boden befestigt, um aufrecht zu bleiben. Nach 1 wöchiger Behandlung wurde der Klettertest für 30, 60 bzw. 120 min durchgeführt. Die Mäuse wurden oben auf den Metallstab gelegt und konnten auf natürliche Weise nach unten kriechen. Die Koordination der Mäuse beim Herunterklettern der Metallstange wurde beobachtet und bewertet. Die Bewertungskriterien waren wie folgt:0 Punkte, schrittweiser Abstieg; 1 Punkt, gleitender Abstieg; 2 Punkte, Abstiegsunfähigkeit; und 3 Punkte, kein Reflex beobachtet.

Akute Toxizität

Die mittlere tödliche Konzentration (LD₅₀ ) von BF und BF/PEG-LP wurde berechnet, um die akute Toxizität zu bewerten. Insgesamt 110 Kunming-Mäuse (halb männlich und halb weiblich) wurden zufällig in 11 Gruppen (n = 10). Fünf Gruppen erhielten eine einzelne i.v. BF-Dosis von 1,0, 0,37, 0,14, 0,05 oder 0,02 mg/kg, und fünf Gruppen erhielten eine einzelne i.v.. Dosis von BF/PEG-LP mit 4,0, 2,83, 2,0, 1,41 oder 1,0 µg/kg. Das Injektionsvolumen betrug 0,2 µl. BF wurde zuerst in normaler Kochsalzlösung mit 1% DMSO gelöst; BF und BF/PEG-LP wurden dann mit normaler Kochsalzlösung verdünnt, um die gewünschte Konzentration zu erhalten. Der Kontrollgruppe wurde normale Kochsalzlösung mit 1% DMSO verabreicht. Nach der Behandlung wurde das allgemeine Verhalten der Mäuse 14 Tage lang beobachtet und die Sterblichkeitsrate aufgezeichnet. Die pathologischen Veränderungen bei den Mäusen nach i.v.. Verabreichung wurden durch optische Mikroskopie (NIKON Eclipse ci, Tokio, Japan) beobachtet.

Gewebeverteilungsstudie mit HPLC

Sprague-Dawley-Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip zwei Abschnitten zugewiesen (vier Gruppen in jedem Abschnitt, n = 6 pro Gruppe). Diese beiden Abschnitte waren i.p. 0,5 mg/kg BF bzw. BF/PEG-LP verabreicht. Proben von Hauptgeweben, einschließlich Herz, Leber, Milz, Lunge, Niere und Gehirn, wurden 5, 15, 45 und 90 min nach der Verabreichung entnommen. Gewebeproben wurden schnell mit Kochsalzlösung (0,9%) gespült, wobei das Blut und der Inhalt nach Bedarf entfernt wurden. Nach der Reinigung wurden die Proben mit Filterpapier abgetupft. Die Proben wurden gewogen und dann in 0,9% Kochsalzlösung homogenisiert (Gewebeprobe zu Kochsalzlösung, 1:2, w/w ). Die erhaltenen Homogenate wurden bis zur Analyse bei – 80°C gelagert.

Die Zielverbindungen wurden extrahiert und die Störung des endogenen Proteins wurde durch eine Flüssig-Flüssig-Herstellungsmethode eliminiert [18]. Wir fanden, dass Ethylacetat die Extraktionsrückgewinnung verbessert und endogene Störungen minimiert, was zu einer erhöhten Empfindlichkeit und Selektivität des Nachweises von BF führt. Folglich wurde Ethylacetat als optimales Lösungsmittel für die Probenvorbereitung verwendet. Zwanzig Mikroliter der IS-Arbeitslösung wurden zu einem 100-μl-Aliquot des Gewebehomogenats gegeben. Dann wurden die Proben 30 Sekunden lang mit dem Vortex gemischt und 2 Minuten lang mit 2,5 ml Ethylacetat extrahiert. Nach Zentrifugation bei 3500 g für 10 min wurde die obere organische Schicht in ein anderes Röhrchen überführt und bei 45 °C unter einem leichten Stickstoffstrom eingedampft. Der Rückstand wurde in 100 µl mobiler Phase rekonstituiert (Acetonitril:0,1 % Ameisensäure/Wasser-Lösung, 65:35, v/v ) durch Vortex-Mischen für 5 min und Zentrifugation bei 12000 g für 10 min. Dann wurde ein 10-μl-Aliquot des Überstands in das HPLC-System (Waters 2995/2996, Waters Corporation, Milford, MA, USA) injiziert. Die optimierten Chromatographiebedingungen für die Detektion von BF und IS wurden zuvor vorgestellt [6].

Statistische Analyse

Alle Ergebnisse wurden als Mittelwert  ± SD (n = 3), und Unterschiede zwischen den Formulierungen wurden durch Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung der GraphPad Prism 5-Software verglichen. P < 0.05 bedeutet in allen Fällen Signifikanz.

Ergebnisse und Diskussion

Physikalische und chemische Eigenschaften von BF/PEG-LP

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ergab, dass BF/PEG-LP eine einheitliche Kugelform aufwies, wie in Zusatzdatei 1:Abbildung S1A gezeigt. Die Struktur von BF/PEG-LP wurde durch FT-IR identifiziert. Wie in Zusatzdatei 1 gezeigt:Abbildung S1B, die charakteristischen Peaks bei 3495 cm ⁻¹ und 3436 cm ⁻¹ repräsentiert die N-H-Streckschwingung der Amidbindung, während der Peak bei 1079 cm ⁻¹ repräsentiert die C–O–C-Streckschwingung der Etherbindung in BF/PEG-LP. Um die Sicherheit der Formulierungen in vitro zu bewerten, wurde die Hämolyserate von leeren Liposomen, BF und BF/PEG-LP durch einen RBC-Hämolysetest bestimmt, und die Zelllebensfähigkeit von HepG2- und HCT116-Zellen, die mit leeren Liposomen behandelt wurden, wurde durch CCK . gemessen -8 Assay. Die BF-Gruppe zeigte eine deutliche Hämolyse; jedoch war die Hämolyserate der BF/PEG-LP-Gruppe bei gleicher Konzentration signifikant niedriger (P < 0,01). Wenn die Konzentration von BF/PEG-LP auf 200 µg/ml erhöht wurde, war die Hämolyserate offensichtlich höher als die von leeren Liposomen (P < 0,01, Abb. 1a). Die Ergebnisse des CCK-8-Tests zeigten, dass die leeren Liposomen für HepG2- und HCT116-Zellen nicht toxisch waren (Abb. 1b).

Physikalische und chemische Eigenschaften von BF/PEG-LP. a Hämolyserate der roten Blutkörperchen von leeren Liposomen, BF und BF/PEG-LP. Daten werden als \( \overline{x} \)± s (n = 3). **P < 0.01 vs. BF/PEG-LP-Gruppe bei gleicher Konzentration. b Zytotoxizität von leeren Liposomen in HepG2- und HCT116-Zellen. Daten werden als \( \overline{x} \) ± s (n = 6). c Stabilität von BF/PEG-LP bei verschiedenen pH-Bedingungen. Daten werden als \( \overline{x} \) ± s (n = 6). **P < 0.01 vs. Gruppe mit pH 7,4 zum gleichen Zeitpunkt. Abkürzungen:BF, Bufalin; BF/PEG-LP, Bufalin-beladene PEGylierte Liposomen

Die Wirkung des Umgebungs-pH-Werts auf die Stabilität von BF/PEG-LP wurde durch UV-Spektrophotometrie bewertet. Abbildung 1c zeigt, dass die Extinktion der Probe aus der Gruppe mit pH   5,0 mit der Lagerzeit zunahm, was darauf hindeutet, dass BF/PEG-LP in PBS bei pH 7,4 (P < 0.01).

In-vitro-Tumorzell-Apoptose

Die durch BF/PEG-LP induzierte Apoptose in HepG2-, HCT116-, A549- und U251-Zellen wurde durch den CCK-8-Assay bestimmt. Der IC₅₀ Werte von BF/PEG-LP für alle getesteten Zellen sind in Tabelle 1 dargestellt. BF/PEG-LP verringerte die Lebensfähigkeit aller Zelltypen in einer dosisabhängigen Weise signifikant (Abb. 2). Die hemmende Wirkung von BF/PEG-LP war ähnlich der von DOX (Positivkontrolle, 50 µg/ml) bei Konzentrationen über 40 µg/ml. Darüber hinaus basierend auf dem IC₅₀ -Werten wurde die Empfindlichkeit der Zellen gegenüber BF/PEG-LP wie folgt eingestuft:HCT116 > HepG2 > U251 > A549.

Zytotoxizität von BF/PEG-LP in HepG2 (a ), HCT116 (b ), A549 (c ) und U251 (d ) Zellen. Daten werden als\( \overline{x} \) ± s (n = 6). *P < 0,05, **P < 0.01 vs. Kontrollgruppe für jede Zelllinie. Abkürzungen:BF/PEG-LP, Bufalin-beladene PEGylierte Liposomen; DOX, Doxorubicin

Allgemeine pharmakologische Bewertung

Nach Verabreichung von BF/PEG-LP unterschied sich das allgemeine Verhalten der Mäuse von dem der Blindgruppe. Insbesondere die Mäuse in der hochdosierten BF/PEG-LP-Gruppe zeigten Zittern und Speichelfluss. Nach der Verabreichung verblieben die Mäuse 10&supmin; in der Open-Field-Box und die Anzahl der aktiven Gitter wurde aufgezeichnet. In der Positivkontrollgruppe (Pentobarbital) betrug die Anzahl der aktiven Gitter nur 342 ± 35, was signifikant niedriger war als in der Kontrollgruppe (725 ± 127, P .). < 0,05). Wie in Abb. 3a gezeigt, unterschied sich die Anzahl der aktiven Gitter in der BF/PEG-LP-Gruppe mit mittlerer und hoher Dosis signifikant von der Kontrollgruppe. Der Rod-Climbing-Test zeigte, dass BF/PEG-LP nach einer Woche Verabreichung im Vergleich zur Kontrollgruppe (P < 0,01), während Chlorpromazin eine signifikante fördernde Wirkung auf die positive Kontrollgruppe hatte (P < 0,05), wie in Abb. 3b gezeigt.

Pharmakologische Wirkung von BF/PEG-LP auf die Bewegungsaktivität (a ) und koordinierte Übungen (b ) in Mäusen. Daten werden als \( \overline{x} \) ± s (n = 10). *P < 0.05, * ^* P < 0.01 vs. Kontrollgruppe zu jedem Zeitpunkt; ^# P <  0,05 vs. niedrig dosierte BF/PEG-LP-Gruppe. Abkürzungen:BF/PEG-LP, Bufalin-beladene PEGylierte Liposomen

Tumor-Xenotransplantat-Experiment

Bei längerer Verabreichung zeigten Mäuse in den Positivkontroll-, BF- und BF/PEG-LP-Gruppen geistige Behinderung, reduzierte Nahrungsaufnahme, langsame Reaktion und stumpfes Fell. Der Maustod trat sowohl in der BF- als auch in der BF/PEG-LP-Gruppe auf. Die Antitumorrate der Positivkontrollgruppe betrug 36,5 %; die der hochdosierten BF-Gruppe betrug 27,6 %; und die der BF/PEG-LP-Gruppen mit niedriger, mittlerer und hoher Dosis betrug 11,4 %, 28,9 % bzw. 38,7 %. Mit Ausnahme der Gruppe mit niedrig dosiertem BF gab es einen signifikanten Unterschied zwischen den Antitumorraten der arzneimittelbehandelten Gruppen und der negativen Kontrollgruppe (P < 0,05), wie in Abb. 4a gezeigt. Im Vergleich zu der Gruppe mit niedrig dosiertem BF war die Tumorhemmungsrate der hochdosierten BF/PEG-LP-Gruppe signifikant höher (P < 0.01), wie in Abb. 4b gezeigt.

Hemmwirkung von BF und BF/PEG-LP auf das Wachstum von Gliom-Xenotransplantaten bei Nacktmäusen. Vergleich des Tumorgewichts (a ) und Tumorhemmungsrate (b ) in jeder Gruppe. Daten werden als \( \overline{x} \) ± s (n = 10). *P < 0,05, **P < 0.01 gegen Kontrollgruppe; ^# P < 0.05, ^## P < 0.01 vs. hochdosierte BF/PEG-LP-Gruppe. c H&E-Färbung von Tumorgeweben von tumortragenden Mäusen. Abkürzungen:BF, Bufalin; BF/PEG-LP, mit Bufalin beladene PEGylierte Liposomen; DPP, Cisplatin; H&E, Hämatoxylin und Eosin

Die Xenotransplantate in den tumortragenden Mäusen hatten eine knötchenförmige Gestalt. Die H&E-Färbung zeigte, dass in der Kontrollgruppe die Kerne der Tumorzellen groß, das Zytoplasma klein und das Zellwachstum kräftig war; in der hochdosierten BF/PEG-LP-Gruppe wurde ein großer Bereich von nekrotischem Tumorgewebe beobachtet, und der Grad der Nekrose war dosisabhängig, wie in Abb. 4c gezeigt.

Akute Toxizität

Die akute Toxizität einer einzelnen i.v. Dosis der Formulierungen in Kunming-Mäusen wurde bestimmt. Die LD₅₀ die Werte von BF und BF/PEG-LP betrugen 0,156 bzw. 3,03 mg/kg. Im Vergleich zu BF war die akute Toxizität von BF/PEG-LP signifikant geringer (P < 0,01); dieser Effekt wurde der liposomalen Formulierung zugeschrieben, die die BF-Freisetzung in das Blut kontrollierte.

Die pathologischen Veränderungen bei den Mäusen nach i.v.. Verabreichung wurden durch optische Mikroskopie beobachtet (Abb. 5). Pathologische Veränderungen wurden in mehreren Organen wie Herz, Leber und Niere beobachtet. Eine Auflösung der Herzmyokardfasern und eine Fraktur mit Blutung waren offensichtlich. Nekrose wurde in Hepatozyten und pulmonalen Endotheliozyten beobachtet.

Pathologische Veränderungen, die bei toten Mäusen nach intravenöser Verabreichung von 1,0 mg/kg BF und 4,0 mg/kg BF/PEG-LP beobachtet wurden. Gewebeschnitte wurden mit H&E gefärbt und durch optische Mikroskopie beobachtet. Hinweise:Optisches Mikroskop:NIKON Eclipse ci; Bildgebungssystem:NIKON Digital Sight DS-FI2 (Tokio, Japan); Vergrößerung:×200. Abkürzungen:BF, Bufalin; BF/PEG-LP, mit Bufalin beladene PEGylierte Liposomen; H&E, Hämatoxylin und Eosin

Studie zur Gewebeverteilung

Ein Vergleich der Chromatogramme des leeren Gewebehomogenats und des dotierten Homogenats, der darauf hinwies, dass bei den Retentionszeiten von BF und CBG (IS) keine signifikante Interferenz auftrat, wurde verwendet, um die Selektivität der Methode zu testen, wie in Zusatzdatei 1 gezeigt:Abbildung S2. Kalibrierkurven wurden aus den Peak-Flächen-Verhältnissen von BF zu IS (Y) gegenüber Gewebehomogenatkonzentrationen im Bereich von 20 bis 2000  ng/ml mit einem Korrelationskoeffizienten R . erstellt ² > 0,9977 (Tabelle 2). Die Präzisions-, Genauigkeits- und Wiederfindungsexperimente von BF in biologischen Proben wurden in Zusatzdatei 1:Tabelle S1 gezeigt, während die Ergebnisse der Stabilitätsexperimente in Zusatzdatei 1:Tabelle S2 gezeigt wurden.

Die Rohdaten der Gewebeverteilungsexperimente sind in Zusatzdatei 1:Tabelle S3 dargestellt. Nach i.v.. Injektion von BF/PEG-LP wird deren Gewebeverteilung durch mehrere Variablen beeinflusst, wie Zusammensetzung, Partikelgröße und Zetapotential [19]. Die Konzentration von BF in verschiedenen Geweben, einschließlich Herz, Leber, Milz, Lunge, Niere und Gehirn, wurde nach 5, 15, 45 und 90 min quantifiziert, wie in Abb. 6 gezeigt. Bei 45 min nach iv. Verabreichung war die Konzentration von BF in beiden Gruppen in einigen Geweben, wie Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere, sehr niedrig, was darauf hindeutet, dass die Verteilung und Elimination von BF schnell erfolgte. Die Konzentration von BF im Gehirn, jedoch nicht in anderen Geweben, konnte 90 min nach i.v. noch nachgewiesen werden Verabreichung in beiden Gruppen, was darauf hindeutet, dass die Verteilung und Elimination von BF im Gehirn relativ langsamer war als in anderen Geweben.

Gewebeverteilung von BF in Rattenorganen. A Molekülformeln von Bufalin (a ) und Cinobufagin (b , IST). B Gewebeverteilungsprofile von BF bei Ratten nach einer einzelnen intravenösen Dosis von BF/PEG-LP oder BF von 0,5 mg/kg. Daten werden als \( \overline{x} \) ± s (n = 6). Abkürzungen:BF, Bufalin; BF/PEG-LP, mit Bufalin beladene PEGylierte Liposomen; IS, interner Standard

Unterdessen wurde im Gehirngewebe der BF/PEG-LP-Gruppe ein 1,20-fach höherer BF (333 ±   92,5 ng/g bei 5 min) im Vergleich zu dem in der BF-Gruppe nachgewiesen. Darüber hinaus wurde in der BF/PEG-LP-Gruppe eine höhere Konzentration von BF in Leber, Milz und Hirngewebe gefunden. In der Leber wurde eine signifikante Akkumulation von BF mit Konzentrationen von 187 ± 31,0 ng/g in der BF/PEG-LP-Gruppe und 163 ± 35,0 ng/g in der BF-Gruppe (P < 0,01). Ein ähnliches Phänomen, das hauptsächlich durch einen dramatischen Anstieg des BF im Blut vor der Metabolisierung und Ausscheidung verursacht wird, wurde in früheren Studien beobachtet [20, 21].

Nach den Ergebnissen der Gewebeverteilungsexperimente könnte BF selbst die BHS passieren, möglicherweise aufgrund seiner hohen Lipidlöslichkeit, seines niedrigen Molekulargewichts (386,52 µg/mol) und seiner chemischen Struktur, die der von Cholesterin ähnlich ist, mit der es teilt die gleiche Mutterkernstruktur. Die klinische Anwendung von BF ist jedoch aufgrund seiner hohen Lipidlöslichkeit und schlechten Wasserlöslichkeit begrenzt. Die Bioverfügbarkeit von BF ist gering, wenn es nicht in einer alternativen Form verabreicht wird. In einer früheren Studie [6] haben wir gezeigt, dass die BF/PEG-LP-Formulierung die Wasserlöslichkeit verbessern, die Dauer der Blutzirkulation verlängern, die Halbwertszeit verlängern und den Anwendungsbereich von BF erweitern kann, auch für i.v. Chemotherapie. In der aktuellen Studie führte die Verabreichung von BF/PEG-LP zu einer erhöhten Konzentration von BF im Gehirn, die über einen längeren Zeitraum (90 min) aufrechterhalten wurde. Darüber hinaus gab es einen signifikanten Unterschied in der BF-Konzentration zwischen den BF- und BF/PEG-LP-Gruppen bei 45 min (167,59 ± 54,52 vs. 71,52 ± 48,35 ng/g, P < 0.01).

In einer früheren Studie wurde gezeigt, dass BF eine Digitalis-ähnliche Wirkung auf das Herz ausübt und die Herzfrequenz und die myokardiale Kontraktionskraft bei Ratten erhöht [22]. Daher kann die Kardiotoxizität von BF bei hohen Dosen durch seine Akkumulation im Herzen verursacht werden. Das Bioverteilungsexperiment in dieser Studie zeigte, dass die Akkumulation von BF im Herzen in der BF/PEG-LP-Gruppe geringer war als in der BF-Gruppe (95,0 ± 18,5 vs . 134 ± 17,8 ng/g bei 5 min, P <0,01; 15.32 ± 5.56 gegen 63,79 ± 28,21 ng/g bei 15 min, P < 0,01). Whether cardiac toxicity can be attenuated with a lower dose of BF requires further verification. Nevertheless, the antitumor effect of BF was sufficiently strong in this study (the IC₅₀ values for glioma cells were nanomolar). For in vivo application, it is critical to decrease the toxicity (especially heart toxicity) and increase the water solubility of BF, which was our focus in this study.

In general, PEGylated liposomes are considered to have no or low immunogenicity. However, according to recent studies, when PEGylated liposomes were repeatedly injected into the same animal, an immune response was triggered [23]. In fact, a second injection of PEGylated liposomes resulted in reduced blood circulation time and increased hepatic and splenic accumulation, which is known as the accelerated blood clearance (ABC) phenomenon. Such immunogenicity of PEGylated liposomes presents major challenges in the research of liposomal formulations and their clinical application. However, liposomal formulations that do not display the ABC phenomenon have been reported, such as a long-circulating DOX-loaded liposomal formulation (Doxil, Sequus pharmaceuticals, Inc., San Francisco, CA, USA), which has been commercialized. DOX was released from the liposomes and entered the spleen, damaging spleen cells and thereby reducing the production of anti-PEG IgM, which could selectively bind with PEG on the surface of the liposomes administered at the second injection. Whether BF/PEG-LP exhibits the ABC phenomenon remains unknown and requires further study. If so, mitigating the ABC phenomenon will require in-depth investigation.

Conclusion

In the present study, we evaluated hemolysis induced by BF/PEG-LP and the cytotoxicity of blank liposomes to verify the safety thereof. Moreover, the effect of environmental pH on the release of BF from liposomes was investigated to assess the stability of BF/PEG-LP. BF encapsulation in a liposomal suspension might affect its antitumor activity in vitro and in vivo and general behavior, acute toxicity, and tissue distribution in vivo. Nonetheless, we believe that the development of the liposomal formulation described in this study has laid a foundation for the future clinical application of BF. Intensive investigation of the relevance of the ABC phenomenon to BF/PEG-LP is warranted in the future.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

All data generated or analyzed during this study are included in this published article and its supplementary information files.

Abkürzungen

ABC:

Accelerated blood clearance

AIE:

The aggregation-induced emission

BBB:

Blood-brain barrier

BF:

Bufalin

BF/PEG-LP:

Bufalin-loaded PEGylated liposomes

CBG:

Cinobufagin

CCK-8:

Zellzähl-Kit-8

IC₅₀ :

Half-maximal inhibitory concentration

i.p.:

Intraperitoneally

IS:

Internal standard

i.v. :

Intravenously

LD₅₀ :

Median lethal concentration

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

RBC:

Red blood cell