Mesoporöse Silica-Nanopartikel liefern NQO1-Inhibitor und 5-Fluorouracil gemeinsam, verstärken Antitumor-Aktivität bei Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom

Zusammenfassung

Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinome (HNSCC) gehören zu den tödlichsten Krebsformen, und 90 % davon gehen auf Plattenepithelzellen zurück. NAD(P)H:Chinon-Oxidoreduktase 1 (NQO1), ein Enzym, das in Plattenepithelkarzinomen überexprimiert ist, spielt eine wichtige Rolle bei Proliferation und Chemoresistenz. Die Hauptziele waren, die hemmende Wirkung von ß-Lapachon (klinische Form ARQ761) in HNSCC zu untersuchen und den kombinatorischen Effekt von 5-FU und ß-Lap zur Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit in HNSCC zu studieren. Lipiddoppelschicht-assemblierte mesoporöse Silica-Nanopartikel, beladen mit 5-FU/ß-Lap, wurden hergestellt und auf ihre physikochemischen und biologischen Eigenschaften hin untersucht. ß-Lap zeigte eine konzentrationsabhängige Hemmung der NQO1-Enzymaktivität in Cal33-Zellen. Besonders hervorzuheben ist, dass ein signifikanter hemmender Effekt bei einer Dosis von 20–50 μg/ml ß-Lap beobachtet wurde. Die Kombination von 5-FU + ß-Lap führte zu geringerer Zelllebensfähigkeit; am bemerkenswertesten wiesen 5-FU/ß-Lap-beladene mesoporöse Silica-Nanopartikel (FNQ-MSN) signifikant geringere Zelllebensfähigkeit im Vergleich zu jedem einzelnen Medikament oder physikalischen Kombinationen auf. ß-Lap führte zu einer Abnahme des NQO1-Proteinbands im Vergleich zur Kontrolle; jedoch wurde der stärkste Rückgang des NQO1-Spiegels in der FNQ-MSN-behandelten Zellgruppe beobachtet. FNQ-MSN bewirkte mehr als 60 % Zellapoptose (frühe und späte Apoptose) und vorherrschende Kernfragmentierung der Krebszellen, was die überlegene antikrebswirksame Wirkung eines trägerbasierten Kombinationsregimes anzeigt. Ein bemerkenswerter Rückgang des Tumorvolumens wurde mit der physikalischen Mischung von 5-FU + ß-Lap beobachtet; die kombinierte Behandlung mit trägerbasiertem 5-FU und ß-Lap (FNQ-MSN) verzögerte jedoch das Tumorwachstum signifikant und verlängerte das Überleben von tumorbeladenen Xenotransplantat-Mäusen. Diese Ergebnisse deuten auf das Potenzial von NQO1-Inhibitoren hin, das chemotherapeutische Potenzial von 5-FU in der Behandlung von HNSCC zu verstärken.

Einleitung

Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinome (HNSCC) gehören zu den tödlichsten Krebsformen, und 90 % davon stammen von Plattenepithelzellen [1]. HNSCC ist stark angiogen und seine Vaskulatur exprimiert verschiedene Zytokine, einschließlich Fibroblastenwachstumsfaktoren (FGFs) und vaskulärer Endothelwachstumsfaktoren (VEGFs), die mit höherer Metastasierung und schlechterem Überleben assoziiert sind [2]. Die Inzidenz von HNSCC in China rangiert an sechster Stelle der krebsbedingten Todesfälle; 2015 wurden etwa 250.000 Neuerkrankungen und 77.500 Todesfälle registriert. Die Gesamt-5-Jahres-Überlebensrate von HNSCC ist sehr niedrig aufgrund von Faktoren wie aggressivem Wesen, frühem Rezidiv, hoher Metastasierung und hoher Sterblichkeit aufgrund schlechter Prognose [3]. Die Hauptbehandlungsoption bei HNSCC ist chirurgischer Eingriff gefolgt von Radiotherapie oder Chemotherapie. Genauer gesagt würde Chemotherapie, wenn sie in frühen Stadien oder postoperativ effektiv eingesetzt wird, das Tumorwachstum entgegenwirken [4, 5]. Effektive Chemotherapie würde Krebszellen im Tumorgewebe eliminieren und das Tumorrezidiv hemmen. Langzeitchemotherapie mit Einzelwirkstoffen führt jedoch oft zu Medikamentenresistenz und reduzierter therapeutischer Wirksamkeit [6]. Daher ist es notwendig, innovative Strategien einzusetzen, um das Überleben und die Lebensqualität von HNSCC-Patienten zu verbessern.

Mehrere Antikrebsmittel, die bei der Behandlung von HNSCC eingesetzt werden, umfassen Cisplatin, 5-Fluorouracil (5-FU), Paclitaxel oder Docetaxel. Unter allen wird 5-Fluorouracil (5-FU) als Erstlinientherapie bei HNSCC und anderen Plattenepithelkarzinomen eingesetzt [7]. 5-FU ist ein Pyrimidin-Analogon, das durch irreversible Hemmung der Thymidylat-Synthase in Krebszellen wirkt und dadurch die DNA-Replikation unterdrückt, was zum Zelltod führt [8]. Wie alle Antikrebsmedikamente hat 5-FU unerwünschte Wirkungen im systemischen Kreislauf und verursacht Toxizität in normalen Geweben; es wird jedoch berichtet, dass die Kombination von 5-FU mit einem Zweitwirkstoff potenziell Nebenwirkungen reduzieren und die gesamte therapeutische Wirksamkeit in der Krebsbehandlung verbessern könnte [9].

NAD(P)H:Chinon-Oxidoreduktase 1 (NQO1) ist ein Flavoprotein, das in Tumorgeweben im Bereich von 100- bis 200-fach erhöht ist im Vergleich zu normalen Geweben [10]. Die Zwei-Elektronen-Oxidoreduktase ist ein induzierbares Phase-II-Entgiftungsenzym, das Chinone durch Bildung stabiler Hydrochinone entgiften kann [11]. NQO1 wird in normalen menschlichen Geweben auf niedrigem Basalniveau exprimiert, wo es Zellen vor Redox-Cycling und oxidativem Stress schützt und den p53-Suppressor stabilisiert. NQO1 ist in verschiedenen Krebsarten einschließlich Brust-, Bauchspeicheldrüsen- und Plattenepithelkarzinomen konstitutiv überexprimiert [12]. Die Überexpression von NQO1 fördert das Fortschreiten der Krebslast und macht Krebszellen resistenter gegen chemotherapeutische Medikamente wie 5-FU oder Cisplatin (Oxidativstress-Induktoren), was NQO1 zu einem potenziellen Onkoziel zur Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit macht [13]. Es wurde berichtet, dass der Knockdown von NQO1 durch siRNA die zytotoxische Wirkung mehrerer Medikamente wie Gemcitabin oder Doxorubicin verstärkt [14]. Neben mehreren synthetischen und natürlichen NQO1-Inhibitoren wie Cumarine, Curcumine oder ES936 [15–17] wurde in dieser Studie ß-Lapachon (ß-Lap, 3,4-Dihydro-2,2-dimethyl-2H-naphtho[1,2-b]pyran-5,6-dion) als NQO1-Inhibitor eingesetzt [18]. ß-Lap wirkt über einen NQO1-abhängigen Mechanismus und erzeugt eine signifikante Menge an reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die zu DNA-Strangbrüchen und Krebszelltod führen [19].

Der Einsatz von Nanopartikeln für die systemische Verabreichung kleiner Moleküle wird zu einem vielversprechenden Ansatz in der Krebsbehandlung [20]. Medikamentenbeladene Nanopartikel erfordern weniger Dosierungsschemata und haben sich als wirksam zur Verbesserung der antikrebswirksamen Effekte und zur relativen Reduzierung unerwünschter Wirkungen erwiesen. Unter allen Trägern weisen mesoporöse Silica-Nanopartikel (MSN) erhebliches Potenzial auf, die Fracht effektiv in Tumorgewebe zu liefern [21, 22]. Die mikrometergroßen Poren ermöglichen die stabile Beladung der Medikamente und verhindern deren Freisetzung in den systemischen Kreislauf, während sie die präferenzielle Anreicherung in undichten Krebsgeweben über den Enhanced Permeation and Retention (EPR)-Effekt ermöglichen [23].

Insgesamt war das Hauptziel der vorliegenden Studie, die therapeutischen Vorteile von 5-FU und NQO1-Inhibitor zu kombinieren, um die antikrebswirksame Wirkung in HNSCC zu verstärken. Die in-vitro antikrebswirksame Wirkung wurde mit verschiedenen Techniken wie Zelllebensfähigkeit, Western-Blot-Analyse, Durchflusszytometrie/Hoechst-basiertem Apoptose-Assay und Live/Dead-Assay analysiert. In-vivo-Studien wurden am Cal33-Tumorzell-tragenden Xenotransplantat-Modell durchgeführt.

Schlussfolgerung

Zusammenfassend haben wir erfolgreich 5-FU+ß-Lap-beladene, lipid-doppelschicht-beschichtete mesoporöse Silica-Nanopartikel formuliert. Wir zeigten, dass (i) die antitumorale Wirkung von ß-Lap in HNSCC-Tumorzellen konzentrationsabhängig ist, (ii) die Kombination von 5-FU + ß-Lap zu signifikanter Hemmung von NQO1-Protein und Bcl-2-Protein führt, (iii) das kombinierte FNQ-MSN eine signifikante Reduktion der Tumorlast im HNSCC-Xenotransplantat demonstriert. Diese Daten weisen eindeutig darauf hin, dass eine subletale Dosis des NQO1-Inhibitors (ß-Lap) potenziell die therapeutische Wirksamkeit von 5-FU in HNSCC-Tumoren verstärken und potenziell auf die klinische Behandlung anderer Malignome ausgeweitet werden könnte.

Materialien und Methoden

Herstellung von 5-FU/ß-Lap-beladenen Lipid-Doppelschicht-Mesoporösen Silica-Nanopartikeln

Das medikamentenbeladene MSN wurde hergestellt, indem Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) (210 mg) in 180 ml Wasser gelöst und auf 80 °C erhitzt wurde, woraufhin 5-FU und ß-Lap zu 20 % w/w der Gesamtnanopartikel hinzugefügt und anschließend Ammoniumfluorid (NH4F) (30 mg) zugegeben und 60 Minuten gerührt wurde. Anschließend wurde 1,6 ml Tetraethylorthosilikat (TEOS) tropfenweise über 30 Minuten zugegeben und 3 Stunden kontinuierlich gerührt. Halbtransparente weiße Kolloide bildeten sich, die nach Zentrifugation (15 Min) bei 10000 U/min bei 24 ± 1 °C gesammelt wurden. Die MSN wurden in ultrapurem Wasser resuspendiert, und der Zentrifugationszyklus wurde zweimal wiederholt. Separater wurde ein Dünnschichtmembran aus DSPE-PEG2000 (2 % des Gesamt-MSN-Gewichts) hergestellt und mit Wasser, das medikamentenbeladenes MSN enthielt, hydratisiert. Das Gemisch wurde sofort 5 Minuten bei 50 W bei Raumtemperatur (25 °C) sondiert. Das PEGylierte Lipid-Doppelschicht-gestützte MSN wurde schließlich zweimal gewaschen und in ultrapurem Wasser resuspendiert.

Partikelgröße, Zeta-Potenzial-Analyse und Morphologie-Analyse

Partikeldurchmesser, Polydispersitätsindex (PDI) und Zeta-Potenzial wurden mit einem Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) bewertet. Die Partikel wurden mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) analysiert, und die Partikeldispersionen wurden vor dem Experiment gut verdünnt. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur in Triplicate durchgeführt. Die Morphologie der Nanopartikel wurde durch Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) mit CM 200 UT (Philips, MA, USA) bei 100 kV bestimmt. Kurz gesagt: Partikeldispersionen wurden verdünnt, ein Tropfen auf ein 300-Mesh-TEM-Gitter gegeben und 10 Minuten absetzen gelassen. Die Partikel wurden mit 2 % Phosphortungstensäure (PTA) als negativem Kontrast gegengefärbt, luftgetrocknet und unter dem TEM-Mikroskop beobachtet.

Wirkstoffbeladung

Die Wirkstoffbeladung wurde auf zwei Wegen analysiert, indem der ungebundene oder ungeladene Wirkstoff im Überstand und der in den Nanopartikeln geladene Wirkstoff berechnet wurden. Die Beladungseffizienz wurde mittels HPLC-Methode durchgeführt. Die HPLC war mit einer Shimadzu LC-20 AD PLC-Pumpe und SPD-M20A PDA-Detektor sowie der Analysesoftware Shimadzu LC mit einer umgekehrten Phasen-C18-Säule (Phenomenex C18, 150 × 4,6 mm, 5 μm) ausgestattet. Die mobile Phase für 5-FU bestand aus einer Mischung von Acetonitril und Wasser (10:90, v/v) und wurde mit einer Rate von 1 ml/min gepumpt. Die Detektionswellenlänge wurde für 5-FU auf 265 nm eingestellt. Die mobile Phase für ß-Lap bestand aus Acetonitril/Wasser (31:69, v/v) und die Detektionswellenlänge wurde auf 254 nm bei 35 °C eingestellt. Die Beladungskapazität (LC) und Beladungseffizienz (LE) von 5-FU/ß-Lap wurden mit den jeweiligen Formeln berechnet.

LE (%) = (W_{total 5-FU+ß-Lap} − W_{free 5-FU+ß-Lap}) / W_{total 5-FU+ß-Lap} × 100

LC (%) = (W_{total 5-FU+ß-Lap} − W_{free 5-FU+ß-Lap}) / W_{total NP-Masse} × 100

Wirkstofffreisetzungsstudie

Die Freisetzung von 5-FU und ß-Lap aus FNQ-MSN wurde in PBS (pH 7,4) und ABS (pH 5,0) bei 37 °C mittels Dialysemethode bewertet. Kurz gesagt: 1 mg Äquivalent jedes medikamentenbeladenen Nanopartikels wurde in eine Dialysemembran in 1 ml jeweiligem Puffer geladen und die Enden versiegelt. Die versiegelte Dialysemembran wurde in 25 ml jeweiligem ABS- und PBS-Puffer in ein Schüttelwasserbad bei 37 °C gegeben. Proben wurden zu vorgegebenen Zeitintervallen entnommen und durch gleiches Volumen frischen Puffers ersetzt. Die Menge des in den jeweiligen Puffer freigesetzten Wirkstoffs wurde mittels HPLC-Methode wie im vorherigen Abschnitt beschrieben bewertet.

Zellkultur und NAD(P)H:Chinon-Oxidoreduktase 1 (NQO1) Aktivitätsassay

Die Cal33 HNSCC-Zelle wurde in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) kultiviert, supplementiert mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika-Gemisch. Die Zellen wurden unter Umgebungsbedingungen in einem Inkubator gehalten. Für den NQO1-Aktivitätsassay wurden Cal33-Zellen in 96-Well-Platten mit einer Aussaatdichte von 8 × 10³ Zellen pro Well ausgesät und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von ß-Lap behandelt und 24 Stunden inkubiert. 0,8 % Digitonin (50 μl von 2 nM EDTA) wurde verwendet, um die Zellen zu lysieren, und der Assay wurde mittels Menadion und MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid) als Substrat-Kupplungsreaktion durchgeführt; die Aktivität wurde bei 620 nm gemessen. Der Assay wurde in Triplicate durchgeführt.

In-vitro Zelllebensfähigkeitsassay

Der Zelllebensfähigkeitsassay von ß-Lap in steigender Konzentration und der Zelllebensfähigkeitsassay von einzelnen und kombinatorischen Regimen wurden mittels MTS-Assay (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-Carboxymethoxyphenyl)-2-(4-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium) getestet. Kurz gesagt: Cal33-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Aussaatdichte von 1 × 10⁴ Zellen pro Well ausgesät und über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurden Zellen mit steigender Konzentration von ß-Lap behandelt; separat wurden Zellen mit einzelnen und kombinatorischen Regimen von 5-FU und ß-Lap bei Basiskonzentrationen von 5, 10 und 20 μg/ml behandelt und 24 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden zweimal gewaschen und mit MTS-Lösung gemäß Herstellerangaben behandelt. Die Zelllebensfähigkeit wurde bezüglich unbehandelter Zellen berechnet, und ein Mikroplattenleser wurde für die Absorption bei 460 nm verwendet.

Western-Blot-Analyse

Die in 6-Well-Platten ausgesäten Zellen wurden mit steigender Konzentration von ß-Lap behandelt; separat wurden Zellen mit einzelnen (5-FU oder ß-Lap) und kombinatorischen Regimen von 5-FU und ß-Lap (FNQ-MSN) behandelt und 24 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden geerntet, lysiert (M-PER-Puffer) und zentrifugiert, und der Überstand mit Protein wurde gesammelt. Die Proteinkonzentration im Zelllysat wurde mittels Bicinchonsäure (BCA)-Methode bewertet. 10 % Bis-Tris-Polyacrylamidgel wurde verwendet, um die Proteine zu trennen, und sofort auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran übertragen. Die Membran wurde mit 5 % Magermilch in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) mit Tween 20 (TBST, pH 7,2) blockiert. Primärantikörper gegen rabbit polyklonales NQO1 (1:1000), mouse monoklonales Bcl-2 (1:1000) und mouse monoklonales GAPDH (1:1000) wurden über Nacht bei 4 °C auf der Membran inkubiert. Die Membran wurde mit TBST gewaschen und dann mit Sekundärantikörpern (anti-mouse oder anti-rabbit IgG) bei einer Verdünnung von 1:10000 inkubiert. Die Membran wurde erneut mit TBST gewaschen und die Blots wurden mit ECL-Substratlösung exponiert; die Dichten der Proteinbänder wurden mittels Fotodeveloper ausgewertet.

Apoptose- und Hoechst-Assay

Cal33-Zellen wurden in 6-Well-Platten mit einer Aussaatdichte von 2 × 10⁵ Zellen pro Well ausgesät und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden dann mit einzelnen (5-FU oder ß-Lap) und kombinatorischen Regimen von 5-FU und ß-Lap (FNQ-MSN) behandelt und 24 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden geerntet, gewaschen, zentrifugiert und pelletiert. Die Zellen wurden mit 2,5 μl Annexin V und 2,5 μl PI behandelt und 15 Minuten im Dunkeln inkubiert. Die Zellen wurden dann auf 1 ml aufgefüllt und mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS, BD, FACSverse) ausgewertet. Insgesamt wurden 10.000 Zellen analysiert. Ein ähnliches Verfahren für Zellaussaat und Medikamentenbehandlung wurde durchgeführt und anschließend mit Hoechst 33342-Farbstoff (10 μg/ml) gefärbt und 10 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert und erneut gewaschen. Die Zellmorphologie wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop (Nikon A1, Japan) beobachtet.

Antitumorale Wirksamkeit von FNQ-MSN im HNSCC-Xenotransplantat-Tumormodell

18- bis 22-Gramm männliche BALB/c-Mäuse, im Durchschnitt 4–5 Wochen alt, wurden vom In-House Animal Facility Center der Zhengzhou University of Light Industry, Henan, bezogen. Die Tiere wurden in einem klimatisierten Raum mit 12-Stunden Hell-Dunkel-Zyklus gehalten und hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Alle Tierprotokolle wurden vom Ethikkomitee der Zhengzhou University of Light Industry, Henan, genehmigt. Zur Etablierung eines Xenotransplantat-Modells wurden 1 × 10⁷ Cal33-Zellen in 150 μl Kulturmedium subkutan in die rechte Hüfte der Maus injiziert. Als die durchschnittliche Tumorgröße 80–100 mm³ erreichte, wurden die Mäuse zufällig in 5 Gruppen für Kontrolle, 5-FU, ß-Lap, 5-FU+ß-Lap und FNQ-MSN aufgeteilt, jeweils mit 8 Mäusen pro Gruppe. 5-FU wurde in einer festen Dosis von 5 mg/kg und ß-Lap in einer festen Dosis von 25 mg/kg verabreicht und 3-mal mit einem Abstand von 3 Tagen für jede Schwanzveneninjektion appliziert. Mausgewicht und Tumorvolumen wurden 18 Tage lang regelmäßig überwacht. Das Tumorvolumen wurde mit der Formel berechnet:

V (mm³) = Breite² (mm²) × Länge (mm) / 2

Die vorliegende Studie beobachtete keinen Mäusetod durch Tumorzellbeladung, und alle Tiere wurden am Studienende mit CO₂ euthanasiert und anschließend durch Zervikaldislokation geopfert.

Statistische Analyse

Mehrere Gruppen wurden mittels zweifacher Varianzanalyse (ANOVA) verglichen. Signifikanzniveau von p < 0,05 wurde als signifikant betrachtet, und alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, sofern nicht anders in den jeweiligen Experimenten angegeben.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung von 5-FU/ß-Lap-beladenen Lipid-Doppelschicht-gestützten Mesoporösen Silica-Nanopartikeln

In dieser Studie haben wir ein mesoporöses Silica-Nanopartikel, stabilisiert durch PEGylierte Lipid-Doppelschicht, maßgeschneidert. Das 5-FU/ß-Lap-beladene MSN wurde durch die Emulsions-Sonication-Methode hergestellt, und anschließend wurde das medikamentenbeladene MSN in den Kolben mit Lipid-Dünnschicht, bestehend aus DSPE-PEG2000, eingeführt. Das Gemisch wurde soniziert und das lipidbeschichtete MSN mit 5-FU/ß-Lap erhalten (FNQ-MSN) (Abb. 1a). Die Beladungseffizienzen (LE) von 5-FU und ß-Lap betrugen 91,5 ± 1,65 % bzw. 92,9 ± 1,24 %. FNQ-MSN wies 8,1 ± 1,12 Gew.-% 5-FU und 7,6 ± 0,95 Gew.-% ß-Lap auf, was die hohe Beladungskapazität (LC) des MSN-Trägers anzeigt. Die Lipid-Doppelschicht verhindert unerwünschte Freisetzung im systemischen Kreislauf und damit Toxizität. Die durchschnittliche Partikelgröße des medikamentenbeladenen MSN betrug 92,1 ± 0,85 nm (PDI ~ 0,089), während die Assemblierung der Lipid-Doppelschicht auf der MSN-Oberfläche (FNQ-MSN) die durchschnittliche Partikelgröße auf 128,4 ± 1,24 nm (PDI ~ 0,115) erhöhte, was auf eine solide Präsenz von Lipidmaterial auf der MSN-Oberfläche hinweist (Abb. 1b). Das Zeta-Potenzial änderte sich von −18,2 ± 1,22 auf −26,4 ± mV. Die kleine Partikelgröße von FNQ-MSN ermöglicht die präferenzielle Anreicherung des medikamentenbeladenen Trägers in undichten Tumorgeweben durch den EPR-Effekt. Zudem verleiht die Oberflächen-PEGylierung hervorragende Stabilität und verlängerte Blutkreislaufzeit, was die Chancen von FNQ-MSN im Tumorgewebe weiter erhöht. TEM-Bilder zeigten morphologische Ähnlichkeit mit Liposomen und präsentierten eine perfekt kugelförmige, gleichmäßig auf dem Gitter verteilte Struktur. TEM-Bilder zeigten deutlich eine graue äußere Schicht und einen dunkleren Kern, was die Anwesenheit der Lipidassemblierung auf der MSN-Oberfläche anzeigt (Abb. 1c). Die aus TEM beobachtete Größe korreliert mit der DLS-Partikelgröße vom Zetasizer. MSN besitzt gut geordnete Kanäle für die homogene Verteilung von Wirkstoffmolekülen. Die Oberflächeneigenschaft der Poren ist einer der wichtigen Faktoren für die stabile Beladung kleiner Moleküle. Die verschiedenen physikalischen Kräfte, die an der Wirts-Gast-Wechselwirkung beteiligt sind, umfassen hauptsächlich hydrophobe Kräfte und Van-der-Waals-Wechselwirkungen. Die höhere Wirkstoffbeladungskapazität wird höhere intrazelluläre Konzentrationen und höhere Abtötungseffizienz in Tumorarealen bereitstellen. FNQ-MSN zeigte exzellente Stabilität in PBS-Medium, und die Partikelgröße blieb während des gesamten Studienzeitraums bis zu 30 Tagen unverändert. Eine solche verbesserte Stabilität des Trägersystems und die hohe Beladungskapazität werden die Biodistribution und Effizienz in der Tumorbehandlung verbessern.

In-vitro Wirkstofffreisetzung

Die in-vitro Wirkstofffreisetzung von 5-FU und ß-Lap aus FNQ-MSN wurde in PBS und ABS untersucht (Abb. 2). Wie gezeigt, wurden zwei unterschiedliche Freisetzungstrends bei pH 7,4 und pH 5,0 beobachtet. Beispielsweise wurden 25 % von 5-FU in 24 h bei pH 7,4 freigesetzt im Vergleich zu ~40 % Wirkstofffreisetzung bei pH 5,0 in 24 h. Ähnlich wurden 20 % und 30 % von ß-Lap bei pH 7,4 bzw. pH 5,0 freigesetzt. Die Freisetzungskinetik war über den gesamten Studienzeitraum identisch, mit 50 % 5-FU-Freisetzung in alkalischem Puffer und 80 % Wirkstofffreisetzung bei pH 5,0 nach 72 Stunden Studienzeitraum. Eine pH-responsive Wirkstofffreisetzung in sauren Bedingungen ist vorteilhaft für die Krebsbehandlung. Kein Burst-Release-Phänomen wurde in beiden pH-Bedingungen beobachtet, was hauptsächlich auf die Anwesenheit der DSPE-PEG-Schicht zurückzuführen ist, die die Freisetzung des Wirkstoffs aus FNQ-MSN während des gesamten Studienzeitraums kontrollierte. Ein signifikanter Unterschied in der Wirkstofffreisetzung wurde zwischen pH 7,4 und pH 5,0 Bedingungen beobachtet. Bei pH 7,4-Bedingungen weist PEG-b-DSPE eine hohe Stealth-Schicht-Eigenschaft auf, die die Freisetzung der eingekapselten Verbindung verhindert. Das vorliegende Ergebnis zeigte, dass die Wirkstofffreisetzung bei pH 5,0 beschleunigt wurde, was auf die Disassemblierung der Schutzhülle um die MSN-Oberfläche hindeutet. Die pH-sensitive Wirkstofffreisetzungsrate, die maximale Wirkstofffreisetzung innerhalb der Krebszellen sicherstellt, kann die antitumorale Wirksamkeit verbessern und unerwünschte Toxizität für normales Gewebe verringern. Es ist möglich, dass FNQ-MSN in Gegenwart eines pH-responsiven Elements zur Ablösung der Lipid-Doppelschicht auf dem MSN führt, was zu verstärkter Freisetzung bei niedrigeren pH-Bedingungen führt.

Empfindlichkeit von NQO1 gegenüber ß-Lap

Da die Hochregulation von NQO1 in vielen Krebszellen einschließlich HNSCC mit schlechter Prognose und schlechtem therapeutischem Outcome assoziiert ist, könnten Medikamente, die NQO1 targetieren, eine potenzielle Strategie zur Krebsbehandlung darstellen [24]. NQO1 ist in Plattenepithelkarzinomen im Bereich von 100- bis 200-fach überexprimiert im Vergleich zu normalen Geweben. Daher wurde der Einfluss von ß-Lap auf die NQO1-Enzymaktivität in Cal33-Zellen untersucht. Wie gezeigt, zeigte ß-Lap eine konzentrationsabhängige Hemmung der NQO1-Enzymaktivität in Cal33-Zellen (Abb. 3a). Besonders hervorzuheben ist, dass ein signifikanter hemmender Effekt bei einer Dosis von 20–50 μg/ml ß-Lap beobachtet wurde. Weiterhin wurde das hemmende Potenzial von ß-Lap auf NQO1-Protein durch Western-Blot-Analyse untersucht (Abb. 3b). Die Ergebnisse zeigten eindeutig einen signifikanten Rückgang des NQO1-Proteins in Krebszellen mit steigender ß-Lap-Konzentration. Etwa 80 % NQO1-Hemmung wurden bei 100 μg/ml ß-Lap beobachtet. NQO1-bioaktivierbare Medikamente wie ß-Lap werden durch NQO1 metabolisiert und bilden eine instabile Hydrochinon-Verbindung, die sofort in die ursprüngliche Komponente zurückkonvertiert, wobei 2 Ein-Elektronen-Oxidationen zurückbleiben und 2 O²⁻ verbraucht werden. Dies erzeugt einen futilen Redox-Zyklus, in dem 1 Molekül ß-Lap 130 Mol Superoxid auf Kosten von 60–70 Mol NAD(P)H erzeugt. Die gebildeten Superoxid (O₂^•−) Radikale werden zu Wasserstoffperoxid (H₂O₂⁻) umgewandelt und verursachen Zellapoptose und Zelltod [25].

In-vitro Antikrebswirkung von FNQ-MSN in HNSCC-Zellen

Die in-vitro antikrebswirksame Wirkung von ß-Lap in Cal33-Zellen wurde mittels MTT-Assay untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass ß-Lap eine typische konzentrationsabhängige Abnahme der Zelllebensfähigkeit aufwies (Abb. 4a). Besonders hervorzuheben ist, dass ein signifikanter Rückgang der Zelllebensfähigkeit bei einer Konzentration von 50 μg/ml beobachtet wurde. Für weitere Experimente wurde 20 μg/ml ausgewählt (unter dem IC50-Wert von ß-Lap). Anschließend wurde der Potenzierungseffekt von ß-Lap auf 5-FU bei 3 verschiedenen Konzentrationen (5, 10 und 20 μg/ml) untersucht. Wie gezeigt, führte die Kombination von 5-FU + ß-Lap zu geringerer Zelllebensfähigkeit; am bemerkenswertesten wies FNQ-MSN signifikant geringere Zelllebensfähigkeit im Vergleich zu jedem einzelnen Medikament oder physikalischen Kombinationen auf (Abb. 4b). Beispielsweise zeigten 5-FU und ß-Lap eine Zelllebensfähigkeit von 35,7 % bzw. 70,2 %, während 5-FU+ß-Lap 26,5 % und FNQ-MSN 13,1 % aufwies. Die Ergebnisse zeigten eindeutig, dass die zytotoxische Wirkung von 5-FU signifikant erhöht wurde, wenn es mit ß-Lap kombiniert wurde. Es ist erwähnenswert, dass FNQ-MSN wirksamer war als 5-FU+ß-Lap, was auf die bessere Internalisierung und kontrollierte Freisetzung der beladenen Therapeutika aus dem Trägersystem zurückzuführen ist. Die Ergebnisse zeigen eindeutig den hemmenden Effekt von ß-Lap auf NQO1-Enzymaktivität und Proteinlevel und potenzierten die antikrebswirksame Wirkung von 5-FU, was zu einem verbesserten therapeutischen Outcome in der Behandlung von HNSCC führt.

Rolle von FNQ-MSN in Signalwegen: Western-Blot-Analyse

Der Mechanismus der ß-Lap-vermittelten zytotoxischen Wirkung wurde weiter durch Western-Blot-Analyse untersucht. Wie gezeigt, führte ß-Lap zu einer Abnahme des NQO1-Proteinbands im Vergleich zur Kontrolle; jedoch wurde der stärkste Rückgang des NQO1-Spiegels in der FNQ-MSN-behandelten Zellgruppe beobachtet (Abb. 4c). Die ß-Lap-induzierte Verstärkung der Chemosensitivität von Cal33 durch Förderung der Zellapoptose wurde durch den Bcl-2-Proteinspiegel bewertet. Die Bcl-2-Familie spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Zellhomöostase und kontrolliert Proliferation und Tod von Krebszellen. Der Prozess der Abnahme von Bcl-2 und Zunahme von Bax führt zur Freisetzung von Cytochrom C in das Zytosol, was die gesamte Caspase-Kaskade initiiert und zum Zelltod führt [26]. Die Ergebnisse hoben deutlich hervor, dass die Kombination von 5-FU und ß-Lap (FNQ-MSN) das Bcl-2 signifikant herunterregulierte, was die verstärkte antikrebswirksame Wirkung in Cal33-Krebszellen anzeigt.

Apoptose-Analyse von HNSCC

Nach der Zelllebensfähigkeitsanalyse wurde der Apoptose-Effekt von einzelnen und kombinierten Medikamenten auf Cal33-Zellen mittels Durchflusszytometrie nach Annexin V/PI-Färbung bewertet (Abb. 5). Der Apoptose-Effekt von einzelnen 5-FU (10 μg/ml) oder ß-Lap (30 μg/ml) führte zu keiner nennenswerten Apoptose von Krebszellen; jedoch führte 5-FU+ß-Lap zu einem dramatischen Anstieg des Apoptose-Anteils von Krebszellen. Wichtig: FNQ-MSN führte zu mehr als 60 % Zellapoptose (frühe und späte Apoptose), was die überlegene therapeutische Wirkung des trägerbasierten Kombinationsregimes belegt. Der Apoptose-Effekt wurde durch Hoechst 33342-Färbung weiter bestätigt. Wie gezeigt, wiesen Zellen, die mit FNQ-MSN behandelt wurden, eine höhere Anzahl an Zellen auf, die Apoptose, Kernkondensation und Fragmentierungsmerkmale aufwiesen, im Vergleich zu entweder 5-FU oder ß-Lap allein (Abb. 6). Während des Apoptose-Prozesses schrumpfen Zellen, ohne dass die äußere Zellmembran beschädigt wird, was zu Chromatinkondensation mit vermehrter Apoptosekörperchenbildung führt.

Live/Dead-Assay

Die antikrebswirksame Wirkung von einzelnen und kombinierten Medikamenten wurde weiter durch Live/Dead-Assay bewertet. Die behandelten Zellen wurden mit Calcein AM und Ethidiumbromid als jeweilige Marker für lebende und tote Zellen gefärbt (Abb. 7). Wie gezeigt, sind unbehandelte Zellen zu 100 % mit grüner Fluoreszenz gefärbt. Die einzelnen Medikamente, 5-FU (10 μg/ml) oder ß-Lap (30 μg/ml), zeigten zwar leicht rot fluoreszierende Zellen; jedoch wiesen überwiegend Zellen grüne Fluoreszenz auf, was auf begrenzten Zelltod hindeutete. Bemerkenswerter Zelltod wurde in FNQ-MSN-behandelten Krebszellen beobachtet, wie durch vorherrschende rote Fluoreszenz und weniger grün fluoreszierende Zellen angezeigt. Die höhere antikrebswirksame Wirkung von FNQ-MSN wurde der synergistischen Aktivität von 5-FU und ß-Lap in Krebszellen und der Fähigkeit von ß-Lap zugeschrieben, die Chemosensitivität von 5-FU zu erhöhen.

In-vivo Antitumorale Wirksamkeit von FNQ-MSN gegen HNSCC-Xenotransplantat-Modell

Um die Wirksamkeit des Kombinationsregimes in einem Tiermodell weiter zu bewerten, wurde ein HNSCC-Xenotransplantat hergestellt und mit 5 mg/kg 5-FU und 10 mg/kg ß-Lap verabreicht. Die pharmazeutische Qualität von ß-Lap ist ARQ761, das sich derzeit in Phase-I-Klinischen Studien zur Behandlung metastasierender Malignome befindet. ß-Lap hat gemäß präklinischen Studien die Grenze für die maximal tolerierbare Dosis beim Menschen festgelegt [27]. Dies im Hinterkopf behaltend, haben wir für die In-vivo-Studien optimal eine Dosis von 10 mg/kg ß-Lap ausgewählt. Wie gezeigt, wurde keine signifikante Abnahme des Tumorvolumens bei einzeln verabreichtem 5-FU und ß-Lap im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle beobachtet (Abb. 8a). Ein bemerkenswerter Rückgang des Tumorvolumens wurde mit einer physikalischen Mischung von 5-FU+ß-Lap beobachtet; jedoch verzögerte die kombinierte Behandlung mit trägerbasiertem 5-FU und ß-Lap (FNQ-MSN) das Tumorwachstum signifikant und verlängerte das Überleben von tumorbeladenen Xenotransplantat-Mäusen. Der Tumorvolumen-Graph von FNQ-MSN ließ sich in zwei Teile unterteilen: Eine unbedeutende Zunahme des Tumorvolumens wurde bis Tag 9 beobachtet, während der Tumor nach Tag 9 bis Tag 18 signifikant zunahm, dennoch war das Gesamt-Tumorvolumen vielfach kleiner im Vergleich zur Kontrolle oder anderen Gruppen. Die Toxizität der einzelnen und kombinatorischen Regime wurde in Bezug auf Körpergewicht bewertet (Abb. 8b). Wie gezeigt, führte die physikalische Mischung von 5-FU+ß-Lap zu schwerer Toxizität, dargestellt durch mehr als 10 % Körpergewichtsverlust, während 5-FU zu 5 % Körpergewichtsverlust führte. Wie erwartet, führte FNQ-MSN zu keinem Körpergewichtsverlust, was den einzigartigen Vorteil des Lipid-MSN-basierten Trägersystems anzeigt. Die verstärkte antitumorale Wirkung von FNQ-MSN wurde dem hemmenden Effekt von ß-Lap auf das NQO1-Enzym und -Protein zugeschrieben, was wiederum die Chemosensitivität von 5-FU erhöhte und zu synergistischer antikrebswirksamer Wirkung in menschlichen Cal33-Tumoren führte; zweitens schützte die Lipid-Doppelschicht-beschichtete MSN das Medikament während des systemischen Kreislaufs und könnte es kontrolliert im Tumorgewebe freisetzen; drittens könnte die PEGylierung des Nanocarriers die Blutkreislaufzeit verlängern und so die präferenzielle Anreicherung im Tumorgewebe aufgrund des EPR-Effekts ermöglichen [28, 29]. PEGylierte MSN wurden hauptsächlich in RES von Leber, Milz und Lunge gefangen, was über 80 % der verabreichten Dosis ausmachte. PEG-Modifikation von MSN verringerte offensichtlich die Clearance-Rate von MSN in Organen, was zeigt, dass PEGylierte NPs schwieriger aus RES-Organen entfernt werden, unabhängig von der Partikelform [30, 31]. Insgesamt bietet die In-vivo-Studie am HNSCC-Modell einen „Proof of Concept“, dass die effektive Kombination von 5-FU+ß-Lap in stabilem Nanocarrier die therapeutische Wirksamkeit im Tumor verstärken könnte, während die damit verbundenen toxischen Effekte gemildert werden.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

Abkürzungen

5-FU:

5-Fluorouracil

EPR:

Enhanced Permeation and Retention Effekt (erhöhte Permeabilität und Retention)

FNQ-MSN:

5-FU/ß-Lap-beladene mesoporöse Silica-Nanopartikel

HNSCC:

Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinome

MSN:

Mesoporöse Silica-Nanopartikel

NQO1:

NAD(P)H:Chinon-Oxidoreduktase 1

ß-Lap:

ß-Lapachon