Graphenoxid-hybridisierte nHAC/PLGA-Gerüste erleichtern die Proliferation von MC3T3-E1-Zellen

Hintergrund

Das Knochengewebe-Engineering, das dreidimensionale poröse Gerüste und Knochenzellen kombiniert, wurde weithin als attraktiver Ansatz bei der Behandlung von gestörtem oder verlorenem Gewebe untersucht [1]. Biologisch abbaubare Gerüste, die die Natur des Knochens nachahmen, spielen eine wichtige Rolle für die Aufnahme von Zellen, die Kontrolle der Zelladhäsion und -proliferation und die Erleichterung der Knochenregeneration [2]. Bisher wurden verschiedene Methoden wie Elektrospinnen, Integration von Computational Topology Design (CTD) und Solid Free-Form Fabrication (SFF) sowie Gefriertrocknung angewendet, um verschiedene dreidimensionale (3D) poröse Strukturen herzustellen [3,4,5 ,6,7]. Elektrospinnen ist in der Lage, nano- oder mikrofaserige Gerüste mit komplexen Strukturen (ausgerichtete, federartige Fasern) und Zusammensetzungen herzustellen [7]. Die Produktionseffizienz ist jedoch etwas gering. Die Integration von CTD und SFF ermöglicht das Design von anatomischen 3D-Gerüsten mit poröser Architektur und besseren mechanischen Eigenschaften. Diese Methode erfordert jedoch starke Fachkenntnisse [4]. Im Vergleich zu diesen beiden Methoden ermöglicht das Gefriertrocknungsverfahren die Herstellung poröser Strukturen mit einem viel einfacheren Verfahren durch Sublimation der gefrorenen flüssigen Phase unter Vakuum, um eine poröse Struktur herzustellen [8].

Naturknochen besitzen eine komplexe hierarchische Architektur mit zwei Hauptkomponenten, Kollagen und Hydroxyapatit [9,10,11]. Beim Knochengewebe-Engineering ist die Herstellung einer idealen Biomimikry der extrazellulären Knochenmatrix, die für die Zelladhäsion und -proliferation zur Behandlung von Fehlfunktionen geeignet ist, immer noch eine Herausforderung [12]. Bioabbaubare Gerüste auf Nano-Hydroxyapatit/Kollagen (nHAC)-Basis, die dem natürlichen Knochen nachempfunden sind, könnten eine bessere Biokompatibilität, Zellaffinität und Bioresorbierbarkeit bieten [13]. Die Nachteile von Kollagen, einschließlich der schlechten mechanischen und schnellen Abbaueigenschaften, bleiben jedoch ein Hindernis für seine Anwendung im Knochengewebe-Engineering [14]. Biologisch abbaubare aliphatische Polymere wie Poly(milchsäure-co-glycol)säure (PLGA) mit hoher mechanischer Festigkeit, hervorragender Biokompatibilität, biologischer Abbaubarkeit und guter Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln sind ideal kompensierte Materialien zum Aufbau von porösen 3D-Gerüsten für das Knochengewebe-Engineering [15 , 16]. Ein hybrides poröses Gerüst, das Kollagen und synthetische Polymere enthält, kombiniert die Vorteile von Kollagen und Polymeren und überwindet deren Schwächen, das in großem Umfang für die Knochenreparatur und -regeneration verwendet wird [17,18,19]. Liao et al. haben ein Knochengerüst entwickelt, das aus nHAC und Poly(milchsäure) (PLA) hergestellt wird, um die Knochenregeneration zu fördern [17]. Niuet al. haben Verbundgerüste aus nHAC/Poly(L-Milchsäure)/Chitosan-Mikrosphären hergestellt, um die Proliferation von Osteoblasten zu verbessern [19].

In jüngster Zeit hat Graphenoxid (GO), eine neuartige Kohlenstoffschicht mit einer Dicke von einem Atom [20, 21], großes Interesse im biologischen Bereich geweckt, da es eine gute Biokompatibilität besitzt. Die mit GO hybridisierten Gerüste sind in der Lage, sowohl die mechanischen Eigenschaften des Gerüsts als auch das zelluläre Verhalten wie Zellausbreitung und -proliferation zu bereichern [22, 23]. Luo et al. berichteten, dass der Einbau von GO in PLGA-Nanofasern die Proliferation und osteogene Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) steigerte [20]. Jinget al. berichteten, dass die Zugabe von 1,0 Gew.-% GO in das thermoplastische Polyurethan die Zellproliferation der Swiss-Maus-Fibroblasten erleichtern könnte [24]. Im Vergleich zur Zugabe chemischer Vernetzungsmittel (Genipin, Glutaraldehyd, Carbodiimid usw.). ) [25, 26], die eine gewisse Zytotoxizität aufweisen, um die mechanischen Eigenschaften von Verbundgerüsten zu verbessern, zeigen die geringen Mengen an GO-hybridisierten Gerüsten eine gute Biokompatibilität. Daher könnte die Hybridisierung von GO und nHAC/PLGA ein neuartiges künstliches Gerüst für Knochengewebe sein.

In dieser Studie wurden die porösen Nano-Hydroxyapatit/Kollagen/Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure)/Graphenoxid (nHAC/PLGA/GO)-Gerüste mit unterschiedlichen Gewichtsverhältnissen von GO (0,0, 0,5, 1,0 und 1,5 Gew.) %) hergestellt und charakterisiert wurden. Die Hybridisierungsgerüste zeigen poröse Strukturen. Die Zugabe von GO modifiziert die hydrophile Eigenschaft und die mechanische Eigenschaft der Hybridisierungsgerüste. Um die Wirkung des nHAC/PLGA/GO-Gerüsts auf das Knochengewebe-Engineering zu untersuchen, wurden die MC3T3-E1-Zellen auf den porösen Hybridisierungsgerüsten kultiviert. Die Ergebnisse zeigen, dass die mit 1,5 Gew.-% GO dotierten Hybridisierungsgerüste die Zelladhäsion, das Wachstum und die Proliferation erleichtern, was weiter darauf hindeutet, dass das nHAC/PLGA/GO-Gerüst als vielversprechender Kandidat für das Knochengewebe-Engineering angesehen werden kann.

Ergebnisse und Diskussion

Struktur von nHAC/PLGA/GO Composite Scaffolds

Abbildung 1 veranschaulicht den Herstellungsprozess von nHAC/PLGA/GO-Gerüsten. Die Details des Herstellungsprozesses sind im experimentellen Teil gezeigt. Das nHAC wurde vor der Herstellung der nHAC/PLGA/GO-Verbundgerüste synthetisiert. Das Rasterelektronenmikroskop (REM)-Bild des nHAC-Pulvers zeigt seine Nanostruktur. Die entsprechenden energiedispersiven Röntgenspektroskopie (EDS)-Spektren von nHAC sind ebenfalls gezeigt (zusätzliche Datei 1:Abbildung S1), die das Vorhandensein von Ca, Cu, P, C und O zeigen. Kupfersignale sollten Beiträge der . sein unterstützende Proben. Somit besteht nHAC aus Ca, P, C, O, und das Molverhältnis Ca:P von nHAC-Pulver beträgt 1,41, was niedriger ist als das von Hydroxyapatit (HA) (1,66). Dies weist darauf hin, dass die synthetisierte HA vom Kalziummangeltyp ist [27], was zu einer Verringerung der Härte, des Elastizitätsmoduls und der Zähigkeit bei nHAC führt. Um die mechanischen Eigenschaften des Verbundgerüsts zu erhöhen, wurden dem nHAC-Pulver PLGA und GO zugesetzt. Die optische Übersicht der hergestellten nHAC/PLGA/GO-Gerüste mit unterschiedlichem GO-Gehalt ist in Abb. 2a dargestellt. Die Probe ist ein Zylinder mit einem Durchmesser von 14 mm. Es ist offensichtlich, dass das Verbundgerüst ohne GO in weißer Farbe ist. Mit zunehmendem GO werden die Verbundgerüste immer dunkler. Die detaillierten Morphologien verschiedener nHAC/PLGA/GO-Gerüste werden durch SEM aufgedeckt (Abb. 2b–e). Es zeigt deutlich, dass alle Gerüste poröse Strukturen bilden und die Oberflächen von vier verschiedenen Gerüsten ziemlich rau sind. Um die Informationen dieser Löcher zu charakterisieren, haben wir zur Auswertung einen automatischen Oberflächen- und Porositätstester verwendet. Die Ergebnisse der Lochverteilung sind in Abb. 2f dargestellt. Die Größe der vier Gerüstlöcher liegt zwischen 0 und 200 nm. Und die Zahl der Löcher, die Dutzende Nanometer groß sind, sind mehr als die mit einigen Hundert Nanometern in vier Gerüsten. Es wurde berichtet, dass die Porosität von Biomaterialgerüsten für die Knochenbildung in vitro und in vivo nicht trivial ist [28]. Um die Integration in das umgebende Gewebe zu optimieren, sollten Gerüste für die Osteogenese die Knochenmorphologie, -struktur und -funktion nachahmen [4]. Daher ist die poröse 3D-Struktur von nHAC/PLGA/GO-Verbundgerüsten entscheidend für die Knochenregeneration. Die großformatigen REM-Bilder der vier Verbundgerüste werden ebenfalls gezeigt (Zusatzdatei 1:Abbildung S2), die die Übersichtsstrukturen verschiedener Oberflächen veranschaulicht.

Schematische Darstellung des Herstellungsprozesses für nHAC/PLGA/GO-Gerüste

a Optisches Bild der synthetisierten nHAC/PLGA/GO-Gerüste mit unterschiedlichem GO-Gehalt. b –e REM-Bilder von b nHAC/PLGA, c nHAC/PLGA/GO (0,5 Gew.%), d nHAC/PLGA/GO (1,0 Gew.-%) und e nHAC/PLGA/GO (1,5 Gew.-%) Gerüste. f Lochverteilung von nHAC/PLGA/GO(0, 0,5, 1,0 und 1,5 Gew.-%)

Physikochemische und mechanische Charakterisierung von nHAC/PLGA/GO-Verbundgerüsten

Der Mechanismus des Syntheseprozesses kann durch die Spektren der Röntgenbeugung (XRD) und der Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR) verschiedener Einzelsubstanzen und Zusammensetzungen aufgeklärt werden (Abb. 3). Wie in Abb. 3a angegeben, wurde die anorganische Phase gemäß der Pulverbeugungsdatei (PDF-Karte Nr. 09–0432) als HA bestimmt, da im XRD-Muster keine Peaks von anderen Ca-P-Materialien vorhanden waren. Im Vergleich zu nHA implizierten die breiteren Beugungspeaks von nHAC eine kleine Korngröße und eine geringe Kristallinität. Ähnlich wie bei nHAC wies auch das Muster von nHAC/PLGA/GO mit unterschiedlicher Menge an GO eine niedrige Kristallinität auf. Der GO-Peak trat jedoch nicht in den nHAC/PLGA/GO-Kompositen auf, was möglicherweise auf die geringe Menge an GO im Vergleich zur Masse zurückzuführen ist. Abbildung 3b zeigt die FT-IR-Spektren verschiedener Einzelsubstanzen und Verbundstoffe. In Abb. 3b sind die typischen Banden für Kollagen zu erkennen, z. B. die N-H-Streckung bei 3336 cm ^–1 für Amid A; C–H-Dehnung bei 3079 cm ⁻¹ für Amid B; C=O-Streckung bei 1656 cm ⁻¹ für das Amid I; N-H-Verformung bei 1548 cm ⁻¹ für das Amid II und den Absorptionspeak bei 1238 cm ⁻¹ für Amid III. Bei der Bildung von nHAC bewegt sich das Amid A von 3336 cm ⁻¹ bis etwa 3411 cm ⁻¹ , Amid B war geschwächt, Amid I, Amid II, Amid III bewegen sich von 1656, 1548 und 1238 cm ⁻¹ bis 1654, 1542 und 1240 cm ⁻¹ , bzw. Somit bestätigt es die chemische Reaktion zwischen Kollagen und HA. Außerdem die Peaks bei 1033, 601 und 563 cm ⁻¹ sind die typischen Peaks für (PO4) ³⁻ Gruppe, die auf die Neubildung von HA auf dem Kollagen hinweist, da das vermarktete HA nur charakteristische Peaks von (PO4) ³⁻ . besitzt bei 1033, 603 und 565 cm ⁻¹ . Die charakterisierten Peaks von PLGA um 2996 und 2944 cm ⁻¹ wurden −CH₂ . zugeordnet , 1752 cm ⁻¹ wurde C=O, 1183 und 1093 cm ⁻¹ . zugeordnet wurden C–O zugeordnet, sind deutlich zu erkennen. Im Vergleich zum PLGA-Gerüst bewegen sich die Peaks des nHAC/PLGA-Gerüsts von 1752 zu 1183 cm ⁻¹ bis 1760 und 1187 cm ⁻¹ , die die chemische Reaktion zwischen PLGA- und nHAC-Leistung demonstrieren. Im Vergleich zum nHAC/PLGA-Gerüst bewegten sich die Peaks von GO-dotierten nHAC/PLGA-Gerüsten von 1760 auf 1762 cm ⁻¹ ; es ist eine Rotverschiebung aufgetreten, die die chemische Reaktion zwischen GO und nHAC/PLGA zeigt.

a XRD und b FT-IR-Spektren verschiedener Komponenten

Die Nanostruktur und die mechanischen Eigenschaften der nHAC/PLGA/GO-Gerüste mit unterschiedlichem GO-Gehalt wurden durch ein quantitatives nanomechanisches Rasterkraftmikroskop (QNM-AFM) charakterisiert [29,30,31,32,33,34], das in der Lage ist, liefern spontan die Morphologie und die Steifigkeit und werden häufig verwendet, um die mechanischen Eigenschaften verschiedener Materialien zu erkennen, einschließlich Knochen [30], Zähne [35], Hornhaut [36] usw. Abbildung 4a–d zeigt die Tomographie von vier Arten von Verbundwerkstoffen Gerüste. Aufgrund der Begrenzung der Scanbereiche zeigen AFM-Bilder nur die lokale Oberflächenstruktur. Somit ist die poröse Struktur nicht offensichtlich. Die AFM-Bilder zeigen jedoch auch eine raue Oberflächenmorphologie ähnlich den SEM-Bildern. Rauheit hat einen wichtigen Einfluss auf die Zellproliferation und -differenzierung. Die Oberfläche mit rauer Oberfläche war für die Zellproliferation und -differenzierung von Vorteil [37,38,39]. Die aus der Morphologie (Abb. 4a–d) abgeleiteten Linienprofile (Abb. 4e–h) zeigen die maximalen Höhenunterschiede allein unterschiedlicher Linienrichtung. Es zeigt sich deutlich, dass die maximalen Höhenunterschiede im Bereich von ~ 200 bis ~ 600 nm liegen. Die entsprechende Steifigkeitsverteilung (Abb. 4i) zeigt, dass der Young-Modul von vier verschiedenen Gerüsten 7,53 ± 1,25, 8,34 ± 1,00, 9,15 ± 0,85 bzw. 10,20 ± 1,28 GPa beträgt. Um die Steifigkeitsunterschiede deutlich zu machen, ist auch das entsprechende Balkendiagramm angegeben (Abb. 4j). Obwohl sich der Young-Modul der nHAC/PLGA/GO-Gerüste mit einigen wenigen GO-Betragsunterschieden nicht signifikant unterscheidet, z GPa), von 0,5 und 1,0 Gew.% (8,34 ± 1,00 und 9,15 ± 0,85 GPa), von 1,0 und 1,5 Gew.% (9,15 ± 0,85 und 10,20 ± 1,28 GPa), dem Young-Modul der nHAC/PLGA/GO-Gerüste mit a etwas große GO-Mengenunterschied (0,0 Gew.-% und 1,5 Gew.-%) sind signifikant unterschiedlich (7,53 ± 1,25 und 10,20 ± 1,28 GPa). Dies weist darauf hin, dass die mechanischen Eigenschaften des nHAC/PLGA/GO-Gerüsts mit steigender GO-Menge steigen.

AFM-Bilder von a nHAC/PLGA, b nHAC/PLGA/GO (0,5 Gew.%), c nHAC/PLGA/GO (1,0 Gew.-%) und d nHAC/PLGA/GO (1,5 Gew.-%) Gerüste. e –h Aus den Morphologiebildern abgeleitete Linienprofile. ich Steifigkeitsverteilung der vier verschiedenen Gerüste gemessen mit QNM-AFM. j Das Balkendiagramm des Young-Moduls gegenüber dem GO-Betrag. k Die entsprechenden Kontaktwinkel von vier Arten von Gerüsten, gemessen nach der Methode des sessilen Tropfens

Die Hydrophilie der Gerüste spielt eine Schlüsselrolle bei der Interaktion mit Zellen. Die Zugabe von GO erhöht nicht nur die mechanischen Eigenschaften der Verbundgerüste, sondern verändert auch die Hydrophobie von vier Gerüstarten. Abbildung 4f zeigt die Kontaktwinkel verschiedener nHAC/PLGA/GO-Gerüste. Die Kontaktwinkel der nHAC/PLGA-Gerüste betrugen ~ 125,1°, während für nHAC/PLGA/GO mit unterschiedlicher GO-Menge (0,5, 1,0 und 1,5 Gew.-%) ~ 113,4°, ~ 103,4° bzw. ~ 101,4° betragen. Mit zunehmender GO-Menge nehmen die Kontaktwinkel der Kompositgerüste aufgrund sowohl der Hydroxylgruppen als auch der negativ geladenen Gruppen, wie Carbonsäuregruppen auf der GO-Oberfläche, leicht ab [40]. Somit kann GO 3D-nHAC/PLGA-Gerüsten eine bemerkenswerte Bioaktivität verleihen.

Im Allgemeinen erfordern Gerüste für das Tissue Engineering nicht nur biokompatible Morphologie und Eigenschaften, sondern auch poröse Struktur und physikalische Festigkeit [41]. Die gefriergetrockneten 3D nHAC/PLGA/GO-Gerüste besitzen durch die Sublimation des Lösungsmittels eine poröse Struktur. Die funktionellen Gruppen, einschließlich Hydroxyl (OH), Epoxy (C-O-C) und Carboxyl (COOH)-Spezies auf Gerüstoberflächen [40] induzieren eine gute Hydrophilie. Die Zugabe von PLGA und GO sorgt für ausreichende körperliche Stärke. Somit könnten die 3D-nHAC/PLGA/GO-Gerüste ein vielversprechender Kandidat für das Tissue Engineering sein.

Zellkultur

Es ist bekannt, dass die für Knochengewebe verwendeten Gerüste biokompatibel, zellproliferativ und von Immunreaktionen ausgeschlossen sein sollten [21]. Der nHAC/PLGA/GO, der die Bestandteile des natürlichen Knochens (Kollagen und HA) enthält und über geeignete mechanische Eigenschaften und Hydrophilie verfügt, sollte ein idealer Kandidat für das Knochengewebe-Engineering sein. Um die Zellproliferation dieser Gerüste zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit die MC3T3-E1-Osteoblastenzellen kultiviert. Abbildung 5 zeigt die Lebensfähigkeit der Zellen im Vergleich zur Kulturzeit, die mit dem Zellzählungs-Kit-8 (CCK-8)-Assay bewertet wurde. Die Zellproliferation war während der gesamten Kulturdauer für alle Gruppen konsistent erhöht. Genauer gesagt ist die Zellproliferation von MC3T3-E1 auf nHAC/PLGA/GO-Gerüsten (0,5 und 1,0 Gew.-%) am ersten Tag signifikant verringert, während die auf nHAC/PLGA/GO-Gerüsten (1,5 Gew.-%) ähnlich der auf nHAC/PLGA-Gerüste. Mit zunehmender Zeit nimmt die Zellproliferation von MC3T3-E1 auf nHAC/PLGA/GO-Gerüsten (1,5 Gew.-%) an den Tagen 3, 5 und 7 signifikant zu. Die Zellproliferation von MC3T3-E1 auf nHAC/PLGA/GO (0,5 und 1,0 Gew.-%) Gerüste unterscheiden sich nicht wesentlich von denen auf nHAC/PLGA-Gerüsten.

Vergleich der MC3T3-E1-Zellen auf verschiedenen Gerüstoberflächen; doppelte Sternchen zeigen p . an < 0.01, Anzahl der Proben N = 4

Der Nachweis von Zellwachstum und Proliferation auf verschiedenen Gerüsten wurde ebenfalls durch REM erfasst. Abbildung 6 zeigt die Oberflächenmorphologie von Osteoblastenzellen auf vier verschiedenen Gerüsten, nachdem sie 1, 3, 5 bzw. 7 Tage lang kultiviert wurden. Am Tag 1 sind alle Zellen gleichmäßig und isoliert auf vier verschiedenen Gerüsten verteilt. Im Laufe der Zeit (Tage 3, 5 und 7) wachsen alle Zellgruppen, proliferierten und begannen, sich auf verschiedenen Gerüsten zu integrieren und eine große Zellschicht zu bilden. Verglichen mit den Zellmorphologien auf verschiedenen Gerüsten waren die Zellen auf nHAC/PLGA/GO-Gerüstoberflächen viel größer und gestreckter als auf der Oberfläche von nHAC/PLGA-Gerüsten. Es gibt keinen signifikanten Unterschied in der Situation der Zellausbreitung, Adhäsion zwischen den Zellen auf nHAC/PLGA/GO mit unterschiedlichen Mengen (0,5, 1,0 und 1,5 Gew.-%) gemäß den SEM-Bildern.

a –p SEM-Bilder von MC3T3-E1-Zellen, die 1, 3, 5 und 7 Tage auf vier verschiedenen Gerüsten kultiviert wurden. Maßstabsbalken sind in allen Bildern 50 μm. Das weiße Sternchen steht für die MC3T3-E1-Osteoblastenzellen

Zytotoxizitätstest

Die Zytotoxizität von GO ist ein wesentliches Anliegen für seine Anwendung auf dem Gebiet der Biologie. Wir bewerten also die Zytotoxizität der vier Gerüste in der Zeit von 24 h. Die Ergebnisse sind in Abb. 7 dargestellt. Die Zellvitalität von Fibroblastenzellen (NIH-3T3) in nHAC/PLGA enthält 0,5,1 und 1,5% GO ist 99,101,11 und 97,86% beziehen sich auf nHAC/PLGA, die keinen signifikanten Unterschied aufweisen als nHAC/PLGA, was darauf hindeutet, dass der Anstieg von Graphenoxid bei 0–1,5% sicher ist.

Die relative Aktivität von HIH-373-Zellen in nHAC/PLGA (0,5, 1, 1,5 Gew.-%) bezieht sich auf nHAC/PLGA

Tabelle 1 fasst die mechanischen Eigenschaften und Zellkultureigenschaften von vier Arten von Verbundgerüsten zusammen. Mit zunehmendem GO erhöht sich der Elastizitätsmodul der Gerüste entsprechend. Allerdings unterscheiden sich nur die mechanischen Eigenschaften von nHAC/PLGA und nHAC/PLGA/GO (1,5 Gew.-%) deutlich. Die Zelllebensfähigkeit von vier Arten von Gerüsten zeigt den gleichen Trend mit der mechanischen Eigenschaft, d. h. die OD-Werte aller Gruppen steigen mit zunehmender Zellkulturzeit an, aber nur die nHAC/PLGA und nHAC/PLGA/GO (1,5 wt %) zeigen signifikante Unterschiede. Dies weist darauf hin, dass die mechanische Eigenschaft der Gerüste eng mit der Eigenschaft der Zellkultur zusammenhängt. Die Ergebnisse können darauf zurückzuführen sein, dass Gewebezellen die Steifheit ihrer Substrate spüren und darauf reagieren können [42,43,44,45]. Die Abstimmung der mechanischen Eigenschaften der Substrate kann zelluläre Reaktionen fördern, die die Zell-Oberflächen-Interaktionen zusammen mit dem Zellwachstum und der Lebensfähigkeit beeinflussen [46,47,48,49]. Haugh et al. fanden heraus, dass die Steifigkeit der Gerüste die Aktivität von MC3T3-E1-Zellen (Zellproliferation und -migration) erhöht [50]. Engleret al. zeigten, dass die Substratsteifigkeit ein wichtiger physikalischer Faktor bei der Reaktion vieler Zelltypen war [51]. Sie fanden heraus, dass glatte Muskelzellen aus der Aorta der Ratte (A7R5-Linie) stammen, sich wie andere verankerungsabhängige Zellen mehr ausbreiten und ihr Zytoskelett und ihre fokalen Adhäsionen viel stärker auf „steifen“ Substraten als auf „weichen“ Substraten organisieren. Die mechanische Eigenschaft beeinflusst nicht nur das Zellverhalten, sondern auch die Gewebeaktivitäten. Duncanet al. untersuchten die Mechanotransduktion und die mechanische Belastung der funktionellen Reaktion auf den Knochen. Sie fanden heraus, dass eine mechanische Belastung die Knochenresorption hemmen und die Knochenbildung in vivo erhöhen kann [52]. Daher könnten die steifsten nHAC/PLGA/GO-Gerüste (1,5 Gew.-%) die Proliferation von MC3T3-E1-Zellen fördern.

Die Zytotoxizität von GO ist ein wesentliches Anliegen für seine Anwendung auf dem Gebiet der Biologie. Bisher sind zwei Argumente aufgetreten. Eine Behauptung, das GO würde Zytotoxizität induzieren und seine Wirkung ist konzentrationsabhängig. Chatterjee et al. berichteten über die toxische Reaktion mit unterschiedlicher Dosisabhängigkeit für GO [53]. Pinto et al. berichteten, dass nur geringe GO-Konzentrationen in PLA eingebaut werden können, um die Zelladhäsion und -proliferation zu erleichtern [6]. Die anderen geben an, dass eine noch höhere GO-Menge eine gute Biokompatibilität aufweisen und sowohl die mechanischen Eigenschaften der Substrate als auch das Zellverhalten verbessern würde. Shinet al. untersuchten, dass die C2C12-Skelett-Myoblasten auf PLGA-GO-Kollagen-Hybridmatrizen verstärkt wurden als auf PLGA, PLGA-Kollagen-Matrizen [54]. Und Luo et al. berichteten, dass GO-dotierte PLGA-Nanofasergerüste die osteogene Differenzierung von MSCs verbessern können [22]. In dieser Studie wurde die GO aufgrund des ersten Arguments ausgewählt. Die begrenzte Menge wird den Verbundgerüsten zur Nicht-Zytotoxizität und verbesserten mechanischen Eigenschaften zugesetzt. Die Konjugation von GO in nHAC/PLGA-Gerüste steigerte das Zellwachstum und die Proliferation signifikant. Obwohl die Zellzahl sowohl bei nHAC/PLGA als auch bei nHAC/PLGA mit geringer GO-Menge, z (1,5 Gew.-%) des Gerüsts war höher als das der nHAC/PLGA-Gerüste. Diese Ergebnisse zeigen, dass die nHAC/PLGA/GO-Gerüste biofunktionell sind und die Fähigkeit besitzen, das Wachstum und die Proliferation von MC3T3-E1-Zellen zu steigern. Daher ermöglicht die hervorragende Biokompatibilität und Biofunktionalität den Einsatz von nHAC/PLGA/GO als effektive Gerüste für die Knochenregeneration.

Die Natur des Biomaterials und der Herstellungsprozess sind sehr wichtig für die Gerüsteigenschaften [28]. Bisher wurden die Biomaterialien umfassend untersucht, darunter Metalle [55], Keramiken [56], Glas [57], chemisch synthetisierte Polymere [58], natürliche Polymere [59] und Kombinationen dieser Materialien zu Verbundwerkstoffen [60] . Veränderte Komponenten von Verbundgerüsten führen zu der Gerüsteigenschaft. Um beispielsweise das biomimetische Gerüst aus natürlichem Knochen herzustellen, wird in dieser Studie das Typ-I-Kollagen verwendet. Gegenwärtig umfasst die Kollagenfamilie mehr als 20 verschiedene Arten von Kollagen, die in Haut, Knochen, Knorpel usw. vorkommen. Durch das Ersetzen von Kollagen vom Typ I durch andere Arten ist es möglich, verschiedene Verbundgerüste für unterschiedliche Zwecke herzustellen. Kollagen Typ II ist beispielsweise eines der fibrillenbildenden Kollagene und der vorherrschende Kollagentyp im Knorpel. Die Koordination von Kollagen Typ II in die Gerüste kann die Knorpelknochenregeneration erleichtern [61]. Darüber hinaus kann das Kollagen bei richtiger Temperung die Gerüste weiter stärken, was zu einem neuen Verbundmaterial mit funktionellen Strukturen führen kann. Neben der Beschaffenheit von Biomaterialien bestimmt die Verarbeitung auch die Funktion von Gerüsten, wie beispielsweise unterschiedliche Verarbeitungsverfahren. Die Materialchemie und -verarbeitung bestimmt die maximalen funktionellen Eigenschaften sowie die Interaktion der Zellen mit dem Gerüst. Gerüste mit Eigenschaften und Anforderungen beim Knochengewebe-Engineering wurden umfassend untersucht, einschließlich Abbau [62], mechanische Eigenschaften [63], Zytokinabgabe [64] und Kombinationen von Gerüsten und Zellen [65].

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend wurden nHAC/PLGA/GO-Gerüste mit unterschiedlichen Mengen an GO (0,0, 0,5, 1,0 und 1,5 Gew.-%) durch Gefriertrocknungsverfahren hergestellt. Die hergestellten nHAC/PLGA/GO-Gerüste weisen eine poröse Struktur auf. Darüber hinaus werden die mechanischen Eigenschaften und die Hydrophilie der Gerüste durch die Zugabe von PLGA und GO verbessert. Die In-vitro-Studie zeigt, dass die porösen Gerüste die Zelladsorption, das Wachstum und die Proliferation erleichtern. Diese nHAC/PLGA/GO-Gerüste könnten ein vielversprechender Kandidat für Anwendungen im Knochengewebe sein.

Methoden

Materialien

Das gereinigte lyophilisierte Typ-1-Kollagen wurde von Tianjin Saining Biological Engineering Technology Co., Ltd. erhalten. PLGA mit einem Lactid:Glykolid-Verhältnis von 75:25 und einem Mw von 95.000 g/mol wurde von Shandong Medical Appliance Factory (China) bezogen. GO wurde von Shanghai Aladdin biochemical Polytron Technologies Inc. gekauft. MC3T3-E1-Osteoblastenzellen wurden von der Zellbank der Shanghai Chinese Academy of Sciences bereitgestellt. Auf fetales Rinderserum (FBS), Antibiotikum-Antimykotikum, CCK-8 und Dulbeccos modifizierte Eagle-Medien (DMEM) wurde von Tianjin Nobuo Letter Technology Co., Ltd. zugegriffen. 1,4-Dioxan, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, 0,1 M, PH 7,4) und alle anderen Chemikalien waren analysenrein und wurden wie erhalten ohne weitere Reinigung verwendet.

Vorbereitung der nHAC Power und nHAC/PLGA/GO Composite Scaffolds

Über das Verfahren zur Zusammensetzung von nHAC-Pulver wurde bereits früher berichtet [66,67,68]. Kurz gesagt wurde Kollagen in Essigsäure (0,5 mol/l) gelöst, um eine Lösung mit einer Konzentration von 4 g/l zu bilden. Das CaCl₂ und H₃ PO₄ (Ca/P =  1,66) wurden dann getrennte Lösungen zugetropft. Die Tropfrate beträgt 100 Tropfen pro Minute. Die Lösung wurde vorsichtig gerührt und bei 37 °C mit Ammoniaklösung auf pH 9 titriert. Nach 24 h wurde die nHAC-Ablagerung durch Zentrifugieren und Gefriertrocknen geerntet. Für die Herstellung von nHAC/PLGA/GO-Verbundgerüsten wurde GO mit einem Ultraschall-Zellbrecher gleichmäßig in Dioxan dispergiert, wobei eine Endkonzentration von 0,0, 0,5, 1,0 bzw. 1,5 g/l gebildet wurde. Das PLGA wurde dann in GO-Lösungen gegeben, um eine Endkonzentration von 10 % (m/v) zu bilden. Die GO/PLGA-Lösungen wurden dann 12 h bei Raumtemperatur leicht gerührt. Die endgültige Lösung wurde durch Zugabe der nHAC-Leistung zu der GO/PLGA-Lösung in einem nHAC:PLGA-Gewichtsverhältnis von 1:1 gebildet. Die gebildete nHAC/PLGA/GO-Lösung wurde dann gerührt und 4 h mit Ultraschall behandelt. Nach dem Einfrieren bei – 20 °C über Nacht wurden die nHAC/PLGA/GO-Verbundgerüste durch Lyophilisieren erhalten, um Dioxan zu entfernen.

Charakterisierungen

Die Verbundgerüste wurden mit Gold beschichtet und unter einem SEM (JSM-7100F) beobachtet. Wir sprühen 20 s lang Gold für die Vorbereitung von Elektronenmikroskopieproben. Die Topographie und die mechanischen Eigenschaften der Matrices wurden durch Rasterkraftmikroskopie (AFM, Multimode VIII, Bruker, Deutschland) an Luft charakterisiert. Die Bildanalyse wurde unter Verwendung der Gwyddion- und Nanoscope-Analysesoftware durchgeführt. Die Zusammensetzungsanalyse der nHAC/PLGA/GO-Verbundgerüste wurde mit einem FT-IR-Spektrophotometer (VECTOR22, Bruker, Deutschland) durchgeführt. Alle Spektren wurden im Absorptionsmodus im Wellenlängenbereich von 1000–2200 cm ⁻¹ . aufgenommen mit einer Auflösung von 4,0 cm ⁻¹ und 16-maliges Scannen. Die Kontaktwinkel der Proben wurden mit einem Kontaktwinkel-Messsystem nach der Sessile-Drop-Methode (EasyDrop, Modell DAS30, Kruss, Deutschland) gemessen. Die XRD-Muster wurden unter Verwendung des Röntgendiffraktometers (D8 DISCOVER) gemessen. Die Cu-Kα-Strahlung (λ = 0,154 nm) beträgt 40 kV und 30 mA. Die Abtastrate der Messungen beträgt 8°min ⁻¹ über den 2θ-Bereich von 5–80° bei RT. Die Porosität der Gerüste wurde mit einem automatischen Oberflächen- und Porositätsanalysator (ASAP 2460, Micromeritics, GA, USA) gemessen.

Zellkultur

MC3T3-E1-Osteoblastenzellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 3 % antibiotisch-antimykotischer Lösung, bei 37 °C und 5 % CO₂ . inkubiert in einem Zellinkubator. Die initiale Anheftung und Proliferation wurden mit CCK-8 nach Herstellerangaben getestet, wobei die Zahl der lebensfähigen Zellen direkt proportional zu den im CCK-8-Assay erhaltenen Stoffwechselreaktionsprodukten war [69]. Kurz gesagt wurden die MC3T3-E1-Osteoblastenzellen mit einer Dichte von 2,5 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen pro Well auf den nHAC/PLGA-, nHAC/PLGA/GO- (0,5 Gew.-%), nHAC/PLGA/GO- (1,0 Gew.-%) und nHAC/PLGA/GO-(1,5 Gew.-%)-Matrices eingebettet in 48-Well-Zellkultur Platte. Die Zellen wurden in den letzten 2 h der Kulturperioden (1, 3, 5 und 7 Tage) zur Proliferation bei 37 °C im Dunkeln mit der CCK-8-Lösung inkubiert. Die Extinktion wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm mit einem ELISA-Lesegerät (DNM-9602) gemessen.

Die Zellproben für die SEM-Messung wurden mit Formaldehyd fixiert und die Proben wurden dann durch eine abgestufte Reihe von Ethanol (30, 50, 75, 95 und 100 %) für 15 Minuten bei jeder Konzentration dehydriert. Dann wurden die Proben getrocknet, indem man das Trocknen am kritischen Punkt mit einem Kohlendioxid-Analysator (Hitachi, HCP-2) ablaufen ließ. Schließlich wurden die Proben mit Goldbeschichtung durch REM untersucht.

Cytotoxicity Test

The fibroblasts cells concentration was adjusted to 1 × 10 ⁴ /ml and was inoculated into 96-well plates at 200 ul per well. Then, the well plates were incubated at 37 °C in a 5% CO₂ incubator for 24 h. The samples (nHAC/PLGA, nHAC/PLGA/GO (0.5 wt%), nHAC/PLGA/GO (1.0 wt%) and nHAC/PLGA/GO (1.5 wt%)) were powdered to make a 100 mg/ml suspension. The experiment group with 100 ul suspension and control group with equal volume of DMEM complete medium were incubated for 24 h and were further incubated for 4 h after the CCK-8 was added to the incubator. The cell viability was obtained by measuring the absorbance at the wavelength of 450 nm using an ELISA reader. The cell viability was calculated by using the following formula,

Where A (experiment) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution and power samples solution; A (blank) represents absorbance of wells with medium and CCK-8 solution without cells and A (control) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution without power samples solution.

Statistische Analyse

Quantitative results were expressed as the mean value from at least triplicate samples ± standard deviation (SD). Student’s t test was used to the statistical analysis. A value of p  < 0.05 was considered statistically significant. Data are marked ** to indicate p  < <0.01.

Abkürzungen

3D:

Dreidimensional

AFM:

Rasterkraftmikroskopie

CCK-8:

Cell counting kit-8

CTD:

Computational topology design

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle media

EDS:

X-ray spectroscopy

FBS:

Fetal bovine serum

FT-IR:

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

GO:

Graphene oxide

HA:

Hydroxyapatite

MC3T3-E1:

Osteoblast cells

MSCs:

Mesenchymal stem cells

nHAC:

Nano-hydroxyapatite/collagen

NIH-3T3:

Fibroblast cells

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PLA:

Poly(lactic acid)

PLGA:

poly(lactic-co-glycolic acid)

QNM-AFM:

Quantitative nano-mechanical atomic force microscope

SD:

Standard deviation

SEM:

Rasterelektronenmikroskop

SFF:

Olid free-form fabrication

XRD:

Röntgenbeugung