Einfache Synthese von Liganden-freien Iridium-Nanopartikeln und ihre In-vitro-Biokompatibilität

Hintergrund

Edelmetall-Nanopartikel sind aufgrund ihrer interessanten optischen, elektronischen und katalytischen Oberflächeneigenschaften eine tragende Säule neuer Nanotechnologien. In der Nanomedizin haben diese einzigartigen Biomaterialien aufgrund ihrer Fähigkeit, ihre biologischen Wechselwirkungen durch Oberflächenmodifikationen für ein breites Anwendungsspektrum anzupassen, große Aufmerksamkeit auf sich gezogen [1]. Goldnanopartikel (AuNPs) wurden intensiv für Sensorik und therapeutische Anwendungen untersucht [2, 3], während andere Edelmetalle, einschließlich Silber, Nischenanwendungen wie antimikrobielle Mittel gefunden haben [4]. Allerdings müssen Nanopartikel aus platinoiden Elementen, die häufig wegen ihrer katalytischen Oberflächeneigenschaften eingesetzt werden [5], für biomedizinische Anwendungen noch gründlich untersucht werden. Die außergewöhnliche Oberflächenstabilität und bekannte biologische Kompatibilität dieser Elemente sowie ihre potentiell neuartigen physikalischen Eigenschaften im Nanobereich machen sie zu einzigartigen Alternativen zu AuNPs.

Hochenergetische Strahlung wird in der Medizin umfassend verwendet, einschließlich in der diagnostischen Bildgebung und Strahlentherapie. Daher können funktionelle Materialien, die mit Strahlung interagieren, wie beispielsweise Nanopartikel mit hoher Ordnungszahl und hoher Dichte, die Leistung dieser Modalitäten verbessern. Die Mehrheit der chemischen und technischen Studien hat sich bisher auf AuNPs konzentriert, um die Strahlungswechselwirkungen zu verstärken, obwohl Wismut und Hafnium für diagnostische bzw. therapeutische Anwendungen untersucht wurden [6, 7].

Hier präsentieren wir eine synthetische Methode zur Herstellung von Iridium-Nanopartikeln (IrNPs), von denen aufgrund ihrer hohen Dichte eine starke Strahlungsdämpfung vorhergesagt wird. Iridium ist eines der am wenigsten reaktiven Metalle, gilt als allgemein biologisch verträglich und hat eine Elementdichte von 22,56 g/cm ³ (an zweiter Stelle nach Osmium, von dem bekannt ist, dass es hochgiftig ist). Ein Isotop von Iridium, ¹⁹² Ir ist ein häufig verwendeter Brachytherapie-Gammastrahler, und ein Teil des Erfolgs dieses Materials ist auf die hohe Dichte zurückzuführen, d. h. die große Anzahl von Atomen in einem kleinen Volumen des Materials. In der aktuellen Studie stellen wir die Synthese von IrNPs und deren in-vitro-Biokompatibilität sowie die von Iridium-Ionen vor, die in den ausgewählten Zelllinien bisher nicht evaluiert wurde. Diese neuartigen IrNPs wurden trotz der chemischen Inertheit und der überlegenen Dichte des Materials nicht ohne weiteres für medizinische Zwecke erforscht. Obwohl Iridium wie andere Edelmetalle ein relativ teures Material ist, beträgt sein derzeitiger Rohstoffwert etwa drei Viertel des Goldpreises und die Hälfte des Rhodiumpreises, was ihn zu einer interessanten wirtschaftlichen Alternative macht.

Methoden

Synthese von IrNPs

Alle Synthesereaktionen wurden bei Raumtemperatur unter aeroben Bedingungen in gereinigtem 18 MΩ Wasser durchgeführt. Eine 20 mM Iridium(III)-chlorid (Acros Organics)-Stammlösung wurde durch Beschallung im Bad hergestellt und mindestens 20 min gerührt, um eine optisch klare Lösung zu erzeugen. Eine Lösung von 1,0 M Boranmorpholin (Alfa Aesar) wurde auch durch Beschallung im Bad hergestellt. Für Synthesen im größeren Maßstab mit einem Gesamtvolumen von 500 ml wurden 25 ml Iridium(III)-chloridlösung verwendet (auf 1,0 mM verdünnt) und 5,0 ml Boranmorpholin wurden unter schnellem Rühren zugegeben (Endkonzentration 10 mM). Die Lösung verfärbte sich innerhalb von 30 Minuten allmählich von Dunkelbraun zu Schwarz. Die Nanopartikel durften sich mindestens 60 Minuten lang stabilisieren. Diese kolloidale Lösung wurde direkt zu Zentrifugal-Spinfiltern (Amicon Ultra-4, 10k MWCO regenerierte Cellulose) gegeben und die Nanopartikel wurden bei 4000 × g . gesammelt und in gereinigtem Wasser gewaschen. Die Nanopartikel wurden dann in Wasser suspendiert, durch einen Spritzenfilter (Millex-MP 0,22 μm EO) geleitet und zur Quantifizierung gelagert.

Nanopartikel-Charakterisierung

Für die Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS)-Analyse wurden Nanopartikel in einem gleichen Volumen Salpetersäure suspendiert, durch Zentrifugation in einem Mikrozentrifugenröhrchen (5 min, 17 rcf) gesammelt und vor der Analyse in Wasser suspendiert. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde an einem FEI Tecnai F-20 TEM durchgeführt, das bei 200 kV betrieben wurde. Gereinigte IrNPs wurden auf löchrige Kohlenstoff-Cu-gestützte TEM-Gitter (Ted Pella) tropfengegossen und bei Raumtemperatur über Nacht getrocknet. Die Linienbeugungsanalyse wurde unter Verwendung der ImageJ-Softwareanalyse durchgeführt. Für die Röntgenbeugungsanalyse (XRD) wurden konzentrierte IrNPs auf einen Glasobjektträger gegossen und bei Raumtemperatur getrocknet. XRD-Daten wurden in fokussierter Strahlgeometrie (Bragg-Brentano) auf einem Rigaku Ultima IV-Röntgenbeugungssystem unter Verwendung von graphitmonochromatisierter Cu Kα-Strahlung gesammelt. Die Scans wurden über den Winkelbereich 20–80° 2θ mit einer Scanrate von 0,1°/min bei Raumtemperatur durchgeführt. Dynamische Lichtstreuung (DLS) wurde auf einem Malvern Nano ZSP in Einweg-Polystyrolküvetten durchgeführt. Nanopartikel wurden in Wasser suspendiert und die Daten sind nach Zahlen verteilt angegeben. UV-Vis-Absorptionsspektren wurden auf einem Tecan M200 Pro in einer schwarzen 96-Well-Platte und einem Gesamtlösungsvolumen von 100 μl aufgenommen. Die Konzentrationen von Iridium wurden angepasst, um die relativen Absorptionspeaks zu veranschaulichen. Die XPS-Analyse wurde auf einer PHI Versaprobe II durchgeführt, die mit einem halbkugelförmigen Elektronenanalysator und einer Aluminium-Kɑ-(1486,7 eV)-Röntgenquelle ausgestattet war. Die Spektrumanalyse wurde mit der Multipak-Softwaresuite durchgeführt. Die Bindungsenergiekalibrierung wurde mit dem C1s-Peak bei 284,6 eV durchgeführt, und die Peakanpassung basierte auf asymmetrischen Peaks und einem iterierten Shirley-Hintergrund, was zu einem Chi-Quadrat-Wert von 1,13 führte. Induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie (ICP-MS) von IrNPs und Iridium(III)-Chlorid-Lösung wurden vor biologischen Toxizitätstests untersucht. Fünfzig Mikroliter jeder IrNP-Lösung wurden in 50 μL Königswasser (3:1 M konzentrierte Salpetersäure zu Salzsäure) über Nacht bei 70 °C in einem Aufschlussröhrchen verdaut. Die Proben wurden dann zur Analyse in 5,0 ml 1%iger Salpetersäure verdünnt. ICP-MS wurde auf einem Agilent 7900 mit Helium als Kollisionsgas durchgeführt. Kalibrierkurven wurden mit 100–0,1 μg/ml Iridium-Stammlösungen (in 1 % HCl) erstellt und alle Proben wurden so verdünnt, dass Konzentrationen im Bereich von mehreren zehn ppb gemessen wurden.

Zytotoxizitätsanalyse

HepG2- und J774A.1-Zelllinien wurden bei 2 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen pro Well (100 μL) in einer 96-Well-Platte (DMEM mit 10 % FBS) und 24 h absetzen lassen. Iridium-Nanopartikel, Iridiumsalz, Wasser oder DMSO wurden mit 10 % Volumen (10 μl zusätzliches Volumen) hinzugefügt. Die Zellen wurden dann 24 oder 48 h inkubiert. Für die Lebensfähigkeitsanalyse wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden einmal in PBS gewaschen. Einhundert Mikroliter Kulturmedium mit 10 % Alamar Blue (Thermo Scientific) wurden 2 h mit Zellen inkubiert. Das Medium wurde dann erneut in eine schwarze 96-Well-Platte ausplattiert und die Fluoreszenz wurde auf einem Tecan M200 Pro abgelesen (ex530/em590). Alle Daten wurden in vierfacher Ausfertigung durchgeführt und die Experimente wurden an unabhängigen Tagen wiederholt, um allgemeine Trends zu bestätigen. Ein hämolytischer Assay wurde wie bereits berichtet durchgeführt [8].

Ergebnisse

Iridium-Nanopartikel-Synthese und Charakterisierung

In dieser Synthese bilden wir elementare IrNPs aus Iridium(III)-Chloridsalz durch Reduktion mit einem 10-fachen molaren Überschuss an Boranmorpholin in Wasser. Die Reaktion ist leicht auf mehrere Liter skalierbar und Partikel werden bei Raumtemperatur unter aeroben Bedingungen gebildet. Diese Synthesemethode erzeugt kleine (2–3 nm) einheitliche IrNPs (Abb. 1a) mit einem hohen Kristallinitätsgrad, wie durch hochauflösende TEM-Bildgebung beobachtet. Aus TEM erhaltene Beugungsmuster bestätigen die Identität der Nanokristalle mit einem Linienabstand von 0,22 nm, der auf das Beugungsgitter von Iridium hinweist (Abb. 1b). Das Röntgenbeugungsmuster entspricht weitgehend dem von elementarem Iridium (PDF-Karten-Nr.:9008470, Abb. 1c). Nach der Synthese sind IrNPs in Wasser kolloidal stabil und bleiben mehrere Monate bei Raumtemperatur in Lösung suspendiert (Abb. 1d).

a Iridium-Nanopartikel sind gemäß TEM-Bildgebung 2–3 nm groß, mit b mit einem hochkristallinen Gitterparameter. c XRD-Spektrum stimmt mit elementarem Iridium überein und d Partikel haben eine hydrodynamische Größe von 5 nm in Wasser durch DLS

Im Verlauf von 30 Minuten bilden sich Nanokristalle, wie durch eine Farbänderung von der hellgelben Iridium(III)-Vorstufe zu einer dunkelschwarzen Nanopartikellösung beobachtet wird (Abb. 2). Wenn sie einer basischen Umgebung ausgesetzt sind, bilden diese IrNPs ein vorhergesagtes Iridiumoxid, das blau erscheint. Saure Bedingungen, wie die Inkubation in reiner Salpetersäure, scheinen die Partikelkristallinität oder Integrität des Materials nicht zu beeinträchtigen; es induziert jedoch Ausflockung und Ausfällung. Darüber hinaus wurde auch in biologisch relevanten Lösungen (phosphatgepufferte Kochsalzlösung und Gewebekulturmedien) im Laufe von Stunden eine Aggregation beobachtet, was darauf hindeutet, dass für zukünftige biomedizinische Anwendungen weitere Oberflächenmodifikationen erforderlich sein werden. Eine Röntgenphotoelektronenspektroskopie-Analyse der in Salpetersäure gespülten und in Wasser suspendierten IrNPs zeigt eine vorherrschende Iridium(0)-Oberfläche, obwohl die Peakfitting-Analyse der Daten eine Oberflächenoxidation von 20 % anzeigt (Abb. 3). Weder durch XRD noch durch XPS wird eine bevorzugte Kristallitorientierung der Partikel beobachtet. Alternativ führte die Einführung eines Thiol-Tensids in die Reaktionslösung während des Syntheseprozesses (vor der Keimbildung) zu einer Hemmung der Partikelbildung.

Iridium(III)-chlorid erscheint blassgelb mit Absorptionspeaks bei 324 und 386 nm. IrNPs sind Breitbandabsorber und erscheinen schwarz. Iridiumoxid (vorhergesagt), hergestellt aus oxidierten IrNPs, die in einer basischen Lösung behandelt wurden, erscheint blau-violett-violett mit einem Absorptionspeak bei 584 nm

Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (XPS) von IrNPs einem überwiegend elementaren Iridium-Oberflächenzustand mit ungefähr 20 % Oxidoberflächenkontamination

Iridium-Zytotoxizität

Wir untersuchten die biologische In-vitro-Verträglichkeit der nicht verkappten IrNPs und verglichen diese mit Iridium(III)-Chloridsalz in zwei Arten von Säugerzellen. HepG2, eine Hepatozyten-Karzinom-Zelllinie, wurde verwendet, um die potenzielle Toxizität für die Leber zu bewerten. J774A.1-Makrophagenzellen wurden verwendet, um die Toxizität gegenüber dem mononuklearen phagozytischen System zu bewerten. Die Zellen wurden mit IrNPs oder Iridium(III)-chlorid (normalisiert auf die Gesamtkonzentration von Iridium) 24 oder 48 h inkubiert und gewaschen, um extrazelluläres Iridium zu entfernen, und die metabolische Aktivität wurde mit dem Alamar Blue-Assay bewertet (Abb. 4). HepG2-Zellen zeigen eine erhöhte Stoffwechselaktivität in Gegenwart von Iridium(III) nach 24 Stunden (bis zu 115 % Lebensfähigkeit), aber die Reaktion wird nach 48 Stunden abgeschwächt, wobei 500 μM Iridium(III) die Lebensfähigkeit auf 90 % reduziert. Die HepG2-Zellen hatten eine reduzierte zelluläre Lebensfähigkeit von 94 auf 78 % in Gegenwart von 50 μM IrNPs nach 24 und 48 Stunden. Interessanterweise zeigen J774A.1-Zellen eine Zunahme der metabolischen Aktivität als Reaktion auf IrNPs bei einer Konzentration von 50 μM mit einer 122%igen Lebensfähigkeit nach 24 h; nach 48 h wurde jedoch die normale Zellfunktion wieder aufgenommen (98% Lebensfähigkeit), was auf eine vorübergehende Stoffwechselstimulation als Reaktion auf die Nanomaterialien hindeutet. J774A.1-Zellen, die 24 Stunden lang mit 500 μM IrNPs inkubiert wurden, zeigen eine scheinbar neutrale Stoffwechselreaktion, aber die Abnahme der Lebensfähigkeit bei dieser Konzentration nach 48 Stunden deutet darauf hin, dass dies auf Toxizität und Stoffwechselstimulation zurückzuführen ist, die als neutrale Lebensfähigkeitsreaktion auftritt. Darüber hinaus haben wir die In-vitro-Biokompatibilität von IrNPs mit Blut durch einen hämolytischen Assay bewertet und festgestellt, dass IrNPs keine signifikante Hämolyse induzierten, wenn sie mit Erythrozyten in PBS bei 37 °C für 1 h inkubiert wurden (Zusätzliche Datei 1:Abbildung S1).

Zelluläre Lebensfähigkeit von HepG2- und J774A.1-Zellen, die 24 oder 48 h mit Ir(0)-Nanopartikeln oder Ir(III)-Salz inkubiert wurden. *Statistisch signifikante Werte (p < 0,05) relativ zu unbehandelten Zellen

Diskussion

Zur Herstellung von nanoskaligem Iridium für katalytische Anwendungen wurden verschiedene Syntheseverfahren untersucht, darunter die Reduktion von Iridiumsalzen durch Hydride und Wasserstoffgas [9,10,11,12,13], UV- und Gammastrahlung [14,15,16,17], und Polyol- oder Alkoholreduktion [18, 19, 20]. Viele dieser Synthesemethoden sind jedoch auf die Integration von Iridium auf ein Substrat oder einen Träger für chemische Reaktionen ausgelegt und mit biologischen Anwendungen nicht kompatibel [21]. Kürzlich vernebelt ¹⁹² Ir wurde als nanoskaliges Modellmaterial für die Lungentoxizität verwendet und aufgrund seiner außergewöhnlichen Inertheit ausgewählt [22, 23]. Der Hauptzweck dieser Studien bestand darin, die Clearance und Translokation von eingeatmeten Feinstaubpartikeln aus der Lunge zu untersuchen; es unterstreicht jedoch auch die Biokompatibilität dieses Elements.

Wir haben die biologische In-vitro-Kompatibilität der unverkappten IrNPs untersucht und diese mit Iridium(III)-Chloridsalz in zwei Arten von Säugerzellen verglichen, von denen erwartet wird, dass sie die höchsten Konzentrationen an injizierten Nanopartikeln akkumulieren. Die Iridium(III)-Toxizität in J774A.1-Zellen folgt einer normalen Dosis-Wirkungs-Kurve der Toxizität; 100 μM Iridium(III) reduzieren die Zelllebensfähigkeit auf 93 bzw. 66 % und 500 μM führen zu einer Zelllebensfähigkeit von 40 % bzw. 10 % nach 24 Stunden bzw. 48 Stunden. Diese Daten spiegeln eine interessante zellspezifische Reaktion auf Iridium(0) und Iridium(III) wider, und wir erwarten, diese Effekte in vivo weiter zu untersuchen. Es wird erwartet, dass kleinere IrNPs und andere schwer lösliche anorganische Nanomaterialien in die Niere und die Leber transportiert werden, mit einer kurzen temporären Verweildauer in den Nieren und einer längeren Verweildauer in der Leber, was die zellspezifischen Toxizitätsprofile weiter beeinflussen kann. Bei größeren Iridiumpartikeln wird eine Ausscheidung über den Stuhl erwartet, obwohl wir erwarten, dass die extrem geringe Größe dieser IrNPs leicht durch das Nierensystem gefiltert werden kann, wenn die kolloidale Stabilität in vivo aufrechterhalten werden kann [23].

In Vorbereitung auf In-vivo-Anwendungen wurde die Blutverträglichkeit der IrNPs durch einen hämolytischen Assay bewertet. Unter Verwendung von Vollblut der Maus untersuchten wir die Wirkung dieser IrNPs auf die Ruptur von Erythrozyten und die potenzielle Freisetzung von Hämoglobin. Obwohl eingehende Studien des endgültigen oberflächenmodifizierten IrNP evaluiert werden müssen, lösen die aktuellen IrNP-Bausteine ​​erst bei extrem hohen Konzentrationen (500 μM) eine nachweisbare hämolytische Reaktion aus.

Schlussfolgerungen

Wir schließen aus diesen Studien, dass Iridium(0)-Nanokristalle leicht durch eine einfache wässrige Borhydridreduktion von Iridium(III)-chlorid synthetisiert werden können, was zu hochkristallinen 2–3 nm großen Nanopartikeln führt, die in Wasser kolloidal stabil sind und eine Hydrodynamik von etwa 5 nm aufweisen Größe. Bei akuter Exposition sind diese Partikel bei Konzentrationen von bis zu 50 μM Iridium (im Vergleich zu 10 μM für Iridiumchlorid) in Hepatozyten nicht toxisch, stimulieren die Stoffwechselaktivität in Makrophagenzellen und lösen bei praktischen Konzentrationen keine hämolytische Reaktion aus. Diese ligandenfreien Nanopartikel können als Bausteine ​​oder Kerne für nachfolgende oberflächenmodifizierte IrNPs zur Verwendung in biologischen und medizinischen Anwendungen dienen. Die weitere Untersuchung der funktionellen Eigenschaften dieser hochdichten Nanomaterialien in Gegenwart von Röntgenstrahlen oder anderer Strahlung bietet die Chance für neue therapeutische und diagnostische Wirkstoffe.

Abkürzungen

AuNP:

Gold-Nanopartikel

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

ICP-MS:

Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma

IrNP:

Iridium-Nanopartikel

PDF:

Pulverbeugungsdatei

UV:

Ultraviolett

XPS:

Röntgenphotoelektronenspektroskopie

XRD:

Röntgenbeugung