Nanoalginate über inverse Mizellensynthese:Doxorubicin-Verkapselung und Zytotoxizität bei Brustkrebs

Hintergrund

Die Einkapselung therapeutischer Nutzlasten bietet viele Vorteile gegenüber der systemischen Verabreichung freier Arzneimittel in den Blutkreislauf. Erhöhte Zirkulationszeit [1,2,3], Abschirmung von Plasmaproteinen [4] und geringere systemische Toxizität [5, 6] durch Nanocarrier-Verabreichung können die therapeutische Wirksamkeit signifikant verbessern. Darüber hinaus kann die verbesserte Permeabilität und Retention solider Tumoren für ein passives Targeting genutzt werden, wenn die Therapeutika in Trägern der entsprechenden Größe oder des geeigneten Typs eingekapselt werden [7,8,9]. Zahlreiche Therapeutika wurden in Nanocarrier integriert, darunter Doxorubicin (DOX) [6, 10, 11, 12], Cisplatin [13, 14] und Paclitaxel [15, 16, 17]. Außerdem haben viele Trägertechnologien wie Liposomen [18,19,20,21], polymerbasierte Träger [15, 22,23,24,25] und Lipid-Nanopartikel [26,27,28,29] begonnen einen Einfluss auf die klinischen Ergebnisse haben. Die Übersetzung neuer Formulierungen wird jedoch häufig durch Herausforderungen bei der Herstellung und Verarbeitung dieser Verbindungen behindert. Hier präsentieren wir eine einfache, zuverlässige und robuste Methode zur Herstellung biokompatibler Alginat-Nanocarrier, die hydrophile Chemotherapeutika einkapseln können.

Biopolymere wurden teilweise aufgrund ihrer einfachen Anwendung und ihrer biokompatiblen Natur zur Verkapselung von Therapeutika verwendet [30]. Als Polymere werden unter anderem Alginat [31, 32], Heparin [33, 34], Chitosan [35, 36] und Carrageenan [37, 38] verwendet. Alginat, ein natürlich abgeleitetes Polymer, besteht aus unterschiedlichen Mengen an β-d-Mannuronat- und α-l-Guluronat-Resten, die durch 1,4-glycosidische Bindungen verbunden sind [39] (M- bzw. G-Blöcke). Alginat kann durch Zugabe von mehrwertigen Kationen vernetzt werden, von denen häufig Calcium verwendet wird [40,41,42]. Die Anwesenheit von Calcium kann zur Bildung größerer gepackter Strukturen zwischen verknüpften G-Blöcken führen, die als „Ei-Box“-Strukturen bezeichnet werden [43]. Durch Vernetzung der Alginatstränge in Lösung entsteht ein Hydrogel. Andere Polymere wie Chitosan [43,44,45] beeinflussen die strukturellen Eigenschaften des Partikels. Die Hydroxyl- und Carbonsäuregruppen an den Alginatketten verleihen den aufgebauten Polymerstrukturen eine negative Gesamtladung [14, 46]. Durch die Verknüpfung der Carbonsäuren und die Bildung einer dreidimensionalen Matrix können Therapeutika eingeschlossen werden.

Doxorubicin ist ein weit verbreitetes Chemotherapeutikum, das bei der Behandlung verschiedener Krebsarten eingesetzt wird [47]. Der primäre Wirkmechanismus von Doxorubicin beinhaltet die Assoziation mit replikationsassoziierten Enzymen, die eine Interkalation in DNA-Stränge ermöglichen. Es ist auch in der Lage, direkt in den DNA-Strang einzufügen. Die Folge ist eine Störung des Replikationsprozesses, die die Zellproliferation verhindert und zur Apoptose führt [48]. Zusätzlich zu diesem Mechanismus wird Doxorubicin mit der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies in der Zelle in Verbindung gebracht [48, 49]. Doxorubicin ist hochwirksam [6, 50], hat jedoch schwerwiegende toxische Wirkungen auf mehrere Organe, einschließlich des Herzens [51, 52], des Gehirns [53], der Leber [47] und der Nieren [54]. Die Verkapselung kann zu einer verringerten systemischen Toxizität führen, wobei liposomales Doxil ein bekannter Erfolg wird [7].

Alginat ist eine kostengünstige, biokompatible, biologisch abbaubare und leicht zu gewinnende Substanz und gilt allgemein als nicht immunogen [55, 56]. Aus vernetztem Alginat gebildete Hydrogel-Nanopartikel wurden zur Verkapselung verschiedener Therapeutika verwendet [56]. Diese Prozesse variieren von der tensidgetriebenen Bildung inverser Micellen [39] über mechanische Reize bis hin zur temperaturinduzierten Partikelbildung [41]. Wir präsentieren ein einfaches und robustes Verfahren zur Herstellung relativ monodisperser Alginat-Nanocarrier. Dieser Syntheseprozess wird bei Raumtemperatur durchgeführt (anders als von Machado et al. vorgestellt) und kann in nur wenigen Stunden durchgeführt werden. Beim inversen Micellenprozess werden wasserlösliche Therapeutika in die Alginatmatrix eingebaut, ohne dass eine chemische Modifikation erforderlich ist. Messungen der dynamischen Lichtstreuung (DLS) der Alginat-Nanopartikel zeigten gleichmäßige Partikelverteilungen von ~80–90 nm. Elektronenmikroskopie bestätigte die Größen und die grobe sphärische Morphologie der Partikel. In der Alginatmatrix der Nanopartikel verkapseltes Doxorubicin zeigt eine deutliche in vitro-Wirksamkeit im Vergleich zu freiem Doxorubicin, was darauf hindeutet, dass zukünftige Studien die Wirksamkeit der Therapeutika in vivo untersuchen könnten.

Methoden

Materialien

Natriumalginat, Calciumchlorid-Dihydrat, Cyclohexan (99,9%) und Dodecylamin (98%) wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) bezogen. Doxorubicinhydrochlorid wurde von MedChem Express (Monmouth Junction, NJ) bezogen. Diese Reagenzien wurden unverändert verwendet, wobei Natriumalginat und die Therapeutika wie angegeben in Wasser aufgelöst wurden. Das gesamte Wasser war 18 MΩ gefiltertes Wasser aus einer Milli-Q-Quelle.

Herstellung von Nanoalginaten

Natriumalginat wurde in einem Glasfläschchen mit 15 mg/ml in Wasser gelöst und vor der Verwendung über einen Rührstab für mindestens 30 Minuten gemischt. In dieser wässrigen Phase wurde das DOX gelöst, wenn es in den Nanocarrier eingebaut werden sollte. Die Alginatlösung wurde vor der Verwendung in der Synthese auf vollständige Auflösung des Alginatpulvers überprüft. Ohne die Einführung eines mehrwertigen Kations bleibt die wässrige Alginatphase über Wochen homogen. Acht Milliliter Cyclohexan wurden in ein Fläschchen pipettiert. Dodecylamin, ein Feststoff bei Raumtemperatur, wurde einige Minuten unter warmem Wasser erhitzt, bis ein Teil des Feststoffs in flüssige Form übergegangen war. Dann wurden 80 μL Dodecylamin in das Cyclohexan pipettiert. Ein Rührstab wurde in das Glasfläschchen gegeben und die Mischung wurde dann bei 125 U/min gerührt. Nach 5 Minuten Mischen wurde die organische Phase als gut vermischt und bereit für die Zugabe der wässrigen Phase angesehen. Zwanzig Mikroliter der wässrigen Alginatphase wurden zu der organischen Cyclohexan/Dodecylamin-Phase gegeben. Die Rührgeschwindigkeit wurde auf 1200 U/min erhöht. Das Mischen erfolgte unter ständigem Rühren für 20 Minuten. Dreißig Mikroliter einer 50 mM Calciumchloridlösung wurden dann zu der Mischung gegeben. Nach 25 Minuten Mischen/Gelieren der Partikel wurden 2 ml Wasser zu der Mischung gegeben, wodurch eine wässrige Schicht unter der organischen Schicht entstand. Die Nanopartikel trennten sich in die wässrige Phase und eine 1 ml-Pipette wurde verwendet, um die wässrige Schicht zu entfernen.

Reinigung von NALG

Die wässrige Schicht wurde in einer 100 kDa-Zentrifugalfiltereinheit (Pall) 10 Minuten lang bei 3200 × g . zentrifugiert in einer Zentrifuge, um große Aggregate zu entfernen, und das Permeat wurde in eine 10 kDa-Einheit (Millipore) überführt. Die Lösung wurde dann 5 Minuten lang mit derselben Geschwindigkeit zentrifugiert, um kleine Verunreinigungen herauszufiltern. Wasser wurde zugegeben und 5 Minuten lang geschleudert, um das Retentat zu waschen. Das Endvolumen von 1 ml wurde gesammelt und dieses Produkt wurde charakterisiert.

Charakterisierung des NALG

Die filtrierte Lösung von Nanopartikeln wurde zur dynamischen Lichtstreuungsmessung in eine Küvette (Malvern Instruments, DTS 1070 Zetazelle) überführt. Die Größenverteilung wurde unter Verwendung eines Malvern Zetasizer ZSP (Malvern Instruments, UK) bestimmt. Die Größenmessungen wurden mit einem Laser mit 633 nm Wellenlänge bei 25 °C und einer Detektionsmethode mit einem Rückstreuwinkel von 173° durchgeführt. Zeta-Potentialmessungen für die Alginat-Nanopartikel wurden in derselben Küvette unmittelbar nach der Größenmessung durchgeführt. Messungen für Größe und Zetapotential wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, und die präsentierten Ergebnisse zeigen die mittlere ± ± Standardabweichung der drei Versuche. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde verwendet, um die Größe der Nanopartikel zu bestätigen und ihre Morphologie zu untersuchen. TEM-Bilder wurden mit einem Technai F-20-Transmissionselektronenmikroskop aufgenommen, das bei 4200 eV betrieben wurde. Die Vorbereitung der TEM-Gitter beinhaltete die tropfenweise Abscheidung von 10 μL einer nachgefilterten Nanopartikellösung auf der Kupferoberfläche des Formavar/Kohlenstoff-unterstützten TEM-Gitters (Ted Pella). Nasse TEM-Gitter wurden vor der Bildgebung über Nacht abgedeckt in einen Exsikkator gelegt, um eine ordnungsgemäße Trocknung sicherzustellen.

Doxorubicin besitzt eine intrinsische Fluoreszenz, die verwendet werden kann, um die Fluoreszenz der Doxorubicin-Alginat-Nanopartikel (NALG-DOX) mit einer Standardkurve von DOX zu vergleichen, um seine Konzentration abzuschätzen. Wir verwendeten Anregungs-/Emissionswellenlängen von 470/550 nm. Die Freisetzung von Doxorubicin aus NALG-DOX-Lösungen wurde durch Dialysieren der endgültigen gefilterten Nanopartikellösung in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei pH 7,4 oder Citratpuffer bei pH 5,5 bestimmt. Zwei Sätze von fünf Chargen NALG-DOX wurden wie zuvor beschrieben hergestellt, mit einer anfänglichen DOX-Konzentration von 1,25 mg/ml in der wässrigen Alginatphase. Achtzehn Slide-A-Lyzer MINI Dialysegeräte (ThermoFisher) mit einem Innenvolumen von 100 μl und einem Molekulargewichtsgrenzwert von 2 kDa wurden durch Zugabe von 100 μl NALG-DOX zu jedem Gerät hergestellt. Jedes Gerät wurde in ein Szintillationsfläschchen mit 20 ml Puffer gegeben. Ein Rührstäbchen wurde zu jedem Puffer enthaltenden Fläschchen hinzugefügt, und alle Fläschchen wurden auf eine Rührplatte zum leichten Rühren für die Dauer des Experiments gestellt. Die Fläschchen wurden abgedeckt, um den Verlust des Puffers durch Verdunstung zu verringern und vor Licht zu schützen. Zu jedem Zeitpunkt (1, 2, 4, 24, 48, 72 h) wurden drei Geräte entfernt, 100 μL der Probe aus jedem Gerät entnommen und in eine separate Vertiefung gegeben und eine Fluoreszenzmessung auf einem Tecan . durchgeführt Infinite M200 Pro Mikroplattenleser (Tecan Trading AG) bei 470/550 nm. Die Fluoreszenzmessungen wurden mit Messungen einer Standardkurve und anfänglichen Aliquots verglichen, die vor dem Experiment genommen wurden, um die Konzentration und die Menge des DOX-Verlusts an den Puffer zu bestimmen.

Zellkultur und Dosierung

Murine Brustkrebszellen, Bioware Ultra Green Cell Line 4T1 Luciferase/grün fluoreszierendes Protein (4T1-luc2-GFP, Maus-Adenokarzinom) und keine Reporter-4T1-Zellen wurden von PerkinElmer (Waltham, MA) erhalten. Diese Zellen wurden mit RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin in einem 5 % CO₂ . gehalten Inkubator, der bei 37 °C betrieben wird. Die 4T1-Zellen wurden mit 4000 Zellen/Well in eine 96-Well-Platte mit schwarzen Wänden und klarem Boden ausgesät. 24 Stunden nach dem Aussäen in die Vertiefungen wurde das anfängliche Medium abgesaugt und die Arzneimittel-/Medienformulierung wurde eingeführt.

Fluoreszenzbildgebung

Nach 48 h wurde das Medium abgesaugt, die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und den Vertiefungen wurde Formalin zugesetzt. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen erneut dreimal mit PBS gewaschen und zwei Tropfen NucBlue-ReadyProbes-Reagenz mit fixierten Zellen (ThermoFisher) pro Milliliter Medium in die Vertiefungen gegeben. Nach 1 h Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen erneut dreimal mit PBS gewaschen. Dann wurden 100 μl PBS zu den fixierten Zellen hinzugefügt und die Platten wurden auf ein EVOS FL Auto Cell Imaging System (ThermoFisher) übertragen. Ein x 20-Objektiv wurde verwendet, um Teile bestimmter Vertiefungen in jeder Platte abzubilden. Ein Bild von jedem Fluoreszenzkanal wurde separat aufgenommen; ein blaues Bild für 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), ein rotes Bild für DOX (unter Verwendung des RFP-Kanals zur Erfassung der Eigenfluoreszenz) und ein grünes Bild für GFP. Die 4T1-luc2-GFP-Zellen exprimieren grün fluoreszierendes Protein, sodass keine zusätzliche Färbung erforderlich war, damit die Zellen im grünen Kanal sichtbar waren. Die DOX-Behandlung „färbt“ die Zellen und es wird kein weiteres Reagenz benötigt, um sie im roten Kanal sichtbar zu machen. Die Bilder wurden in ImageJ an Helligkeit/Kontrast angepasst.

Lebensfähigkeitstest an lebenden/toten Zellen

Die qualitative Bewertung der Lebensfähigkeit von 4T1-Zellen nach Koinkubation mit NALG, DOX und NALG-DOX wurde unter Verwendung eines LIVE/DEAD Cell Viability Assay (ThermoFisher) bewertet. 72 h nach der Einführung des arzneimittelbeladenen Mediums wurde das Medium abgesaugt und die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen. Der LIVE/DEAD-Assay wurde durch Zugabe von zwei Tropfen NucBlue Live Reagent und NucGreen Dead Reagent (ThermoFisher) pro Milliliter Medium aus jedem Tropfer durchgeführt. Nach 30 minütiger Inkubation wurden drei weitere Waschvorgänge mit PBS durchgeführt, und Formalin wurde in die Vertiefungen gegeben, um die Zellen zu fixieren. Drei weitere Waschvorgänge mit PBS folgten dem Formalin, und eine letzte Menge von 100 μl PBS wurde in jede Vertiefung gegeben. Es wurde eine ähnliche Bildgebung wie angegeben durchgeführt, aber der grüne Kanal zeigte nun das Vorhandensein toter Zellen an, da die beschädigten Zellmembranen dem grünen Reagenz ermöglichten, in die Zelle einzudringen.

Lebensfähigkeitstest an lebenden/toten Zellen

Die quantitative Bewertung der Lebensfähigkeit von 4T1-Zellen nach Koinkubation mit NALG, DOX und NALG-DOX wurde unter Verwendung des Alamar Blue Cell Viability Assay (ThermoFisher) bewertet. 72 h nach der Einführung des mit Drogen beladenen Mediums wurde das Medium abgesaugt. Der Alamar Blue-Assay wurde durchgeführt, indem 10 μl Alamar Blue-Reagenz in jede Vertiefung mit 100 μl neuem Medium gegeben und 1 h bei 37 °C inkubiert wurde. Nach 1 h wurde die Zelllebensfähigkeit für jede Vertiefung mit einem Tecan Infinite M200 Pro Mikroplatten-Lesegerät (Tecan Trading AG) bestimmt. Die Anregungs-/Emissionswellenlängen wurden auf 560/590 eingestellt, optimale Verstärkungseinstellungen wurden für die Platte durch die Software bestimmt und ein Bottom-Read-Protokoll wurde verwendet, um die Fluoreszenzintensität für jede Vertiefung in der Platte abzulesen. Die Lebensfähigkeit der Zellen in % könnte aus der Fluoreszenzintensitätsanzeige über die Gleichung bestimmt werden:

Ergebnisse und Diskussionen

Inverses Mizellen-Emulsionsverfahren

In dieser Arbeit wurde ein Nanoalginat-Wirkstoffträger, NALG, über einen inversen Micellen-Emulsionsprozess hergestellt, wie in Abb. 1 dargestellt. Wässriges Alginat wurde zu einer Cyclohexan/Dodecylamin-Ölphase gegeben, die die inversen Micellen bildet. Das Alginat wurde dann unter Zugabe von Calciumchlorid (CaCl₂ ) Lösung. Nachdem die Zeit verstrichen war, um die Vernetzung des Alginats innerhalb der inversen Micellen zu ermöglichen, wurden die NALG durch Zugabe von Wasser extrahiert. Schließlich entfernten Zentrifugalfilter latente Verunreinigungen und trugen dazu bei, die Größenverteilung der Nanopartikel einzuengen. Das Endprodukt war eine transparente wässrige kolloidale Lösung.

Formulierungsverfahren zur Bildung von NALG und NALG-DOX. a Schematische Darstellung des inversen Micellensyntheseprozesses. Wässrige Alginatketten werden in einem organischen Bad vernetzt (oben), in eine wässrige Phase extrahiert (unten links), dann zur Reinigung filtriert (unten rechts). b Molekulare Wechselwirkung von Ca ²⁺ Vernetzung, die zu gebildetem NALG führt. c Foto der Synthese an verschiedenen Stellen, von links nach rechts, Emulsion vor CaCl₂ Zugabe, Emulsion nach CaCl₂ Zugabe und Trennung bei Zugabe von Wasser

Die Komponenten des inversen Micellenemulsionssystems wurden basierend auf experimentellen Daten und früherer Literatur bestimmt. Um die Freiheitsgrade im System einzuschränken, haben wir Cyclohexan für die organische Phase gewählt. Bei der Optimierung dieses Prozesses haben wir eine Reihe von Tensiden auf ihre Fähigkeit getestet, nanoskalige Alginatpartikel zu bilden, was sich durch eine Zunahme der Trübung der organischen Mischung nach Zugabe einer kleinen Menge wässriger Phase unter Rühren bemerkbar macht. Dodecylamin war ein geeigneter Kandidat und wurde als Tensid ausgewählt, das in Zukunft verwendet werden sollte. Als wässrige Phase wurde in den hier vorgestellten Experimenten Wasser gewählt.

Charakterisierung von NALG

In Abb. 2a, b ist die Verteilung der hydrodynamischen Größen von Nanopartikeln für NALG und NALG-DOX gezeigt. Die Nanopartikel, ob leer oder therapeutisch beladen, zeigten ähnliche Peaks im Bereich von 90 nm. Die Partikeldurchmesser für NALG bzw. NALG-DOX betrugen 92,2 ± 4,2 nm und 82,8 ± 3,6 nm. Der Polydispersitätsindex (PDI) für die Partikel betrug 0,320 ± 0,063 und 0,204 ± 0,044 und die ζ-Potentiale waren −  15,0 ± 0,8 mV und 7,2 ± 4,6 mV.

Dynamische Lichtstreuungsverteilungen von a NALG und b NALG-DOX zeigen monodisperse Verteilungen von Alginat-Nanopartikeln. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von c NALG und d NALG-DOX zeigen eine sphärische Morphologie von Partikeln. Maßstabsbalken zeigen 50 nm im größeren Bild und 20 nm im Einschub an

Die Teilchengrößen waren bei der Aufnahme des DOX in die Alginatmatrix konsistent. Das ζ-Potential war für das leere NALG negativ, was mit anderen durch Calcium verknüpften Alginat-Nanopartikeln übereinstimmte [39]. Die mit Doxorubicin beladenen Partikel besaßen ein positives -Potential. Dies könnte teilweise auf einen Überschuss an positiv geladenen Calciumionen an der Oberfläche des Partikels zurückzuführen sein, der dazu beitragen kann, dem Nanopartikel die positive Ladung zu verleihen. Außerdem kann das auf den DOX-Molekülen vorhandene primäre Amin elektrostatisch mit den freien Carbonsäuregruppen des Alginats wechselwirken, wodurch die auf der Partikeloberfläche verfügbaren negativen Ladungen reduziert werden.

Abbildung 2c, d zeigt Transmissionselektronenmikroskopiebilder von Calcium-vernetztem NALG und NALG-DOX. Beide Arten von Nanopartikeln zeigten eine sphärische Morphologie. Die allgemeine Verteilung der Nanopartikel schien in der Größe der DLS-Verteilung ähnlich zu sein. Die Konzentration der endgültigen NALG-DOX-Lösung wurde unter Verwendung der Eigenfluoreszenz des Doxorubicin-Moleküls bewertet. Das Volumen des gefilterten NALG-DOX-Produkts wurde in Dreifachsätze von Dialysevorrichtungen aufgeteilt, die in mit PBS gefüllte Szintillationsfläschchen platziert wurden, und DOX wurde verschiedene Male aus dem NALG-DOX freigesetzt. Anfänglich betrug die Konzentration von DOX in der NALG-DOX-Lösung ~  4 μg/ml, was darauf hinweist, dass die Einkapselungseffizienz oder das Verhältnis von DOX in NALG-DOX zu anfänglich der Formulierung zugesetztem DOX für NALG-DOX ~ 7 % beträgt. Obwohl diese Einkapselungseffizienz im Vergleich zu ähnlichen Partikeln als gering angesehen wird [57], ist dies wahrscheinlich auf das anfänglich in der wässrigen Phase vorhandene DOX zurückzuführen. Wir haben die Formulierung nicht iteriert, indem wir die in der anfänglichen wässrigen Phase vorhandene DOX-Menge verringert haben, und stellen die Hypothese auf, dass die Effizienz durch Verringerung der DOX-Menge in der Anfangsformulierung verbessert werden könnte. Das unverkapselte DOX passiert wahrscheinlich die 3 kDa-Filterwaschungen am Ende der Synthese. Aufgrund der Verfügbarkeit und der relativ niedrigen Kosten von Doxorubicin entschieden wir uns, die Formulierung mit DOX zu „sättigen“, da wir wussten, dass große Mengen des übrig gebliebenen DOX wahrscheinlich unverkapselt passieren würden. Eine Erhöhung der Einkapselungseffizienz könnte diese Partikelplattform in zukünftigen Arbeiten verbessern.

Die Freisetzungskurve für NALG-DOX bei pH 5,5 und 7,4 ist in Abb. 3 zu finden. NALG-DOX behält im Verlauf der ersten 4 h etwa 70 % der DOX-Nutzlast zurück, wobei 90 % die Partikel nach 24 h verlassen , bei pH 7,4. Dieses Freisetzungsmuster ist bei Polymermaterialien üblich [57, 58] und zeigt eine kontrollierte Freisetzung über die ersten 24 Stunden, wenn sie dem PBS-Reservoir ausgesetzt sind. Bei einem niedrigeren pH-Wert von 5,5, der dem pH-Wert ähnlicher ist, den die Nanopartikel während der Zellaufnahme in einem späten Endosom sehen würden [59], wird das DOX schneller freigesetzt. Dies ist ein erwünschtes Verhalten, da im allgemeinen Blutkreislauf eine langsamere Freisetzung erforderlich ist, in der sauren Tumormikroumgebung jedoch eine schnellere Freisetzung bevorzugt wird.

Die Freisetzung von Doxorubicin aus der Nanopartikellösung zeigt eine kontrollierte Freisetzung über die ersten 24 h in PBS, pH 7,4. Bei pH 5,5 erfolgt eine schnellere Freisetzung von Doxorubicin. Jeder Punkt stellt die mittlere  ± Standardabweichung von n . dar = 3 Messungen

Zelluläre Aufnahme von DOX

Die Aufnahme von NALG-DOX durch 4T1-Maus-Brustkrebszellen nach 48 h ist in Abb. 4a, b gezeigt. Jede Zeile zeigt einen separaten Farbkanal an und die untere Zeile zeigt das zusammengesetzte Bild aller Farbkanäle. In der linken Spalte wird eine hohe Konzentration von DOX oder NALG-DOX verwendet, die ausreicht, um die meisten Zellen zu eliminieren. Die mittlere Spalte zeigt eine Konzentration von 0,31 μg/ml für DOX und 0,28 μg/ml für DOX im NALG-DOX, was ein gewisses Zellabtötungspotenzial zeigt, und die rechte Spalte zeigt unbehandelte Zellen. Zellen im mittleren Bild zeigen Doxorubicin (rot) um den Zellkern (blau) und überlappen damit. Aufgrund der Anwesenheit von DOX, das die Zellproliferation im Vergleich zu den unbehandelten Vertiefungen hemmte, gibt es in den ersten beiden Spalten in beiden Feldern a und b verringerte Zellzahlen. Doxorubicin wirkt durch Interkalation in die nukleäre DNA [12], und die Kolokalisation des Doxorubicins und des Nukleus könnte darauf hinweisen, dass es bei der Aufnahme über diesen Mechanismus funktioniert. In Abb. 4b ist das eingekapselte Doxorubicin in der Peripherie des Kernbereichs deutlich. Die rechte Spalte zeigt unbehandelte Zellen, bei denen im roten Kanal kein signifikantes Signal nachgewiesen wurde. Freies DOX würde, obwohl es wirksam ist, eine Zieltoxizität verursachen und die Zirkulationszeit in vivo verkürzt haben. Die Verkapselung ermöglicht eine gleichmäßigere Freisetzung über eine längere Zirkulationszeit, wodurch NALG-DOX in vivo potenziell besser wird und in zukünftigen Arbeiten untersucht werden könnte.

Fluoreszenzmikroskopie von Bildern fixierter 4T1-luc2-GFP-Brustkrebszellen, die mit Doxorubicin (DOX) behandelt wurden (a ) und NALG-DOX (b ) nach 48-stündiger Exposition. Maßstabsbalken zeigen 100 μm an. Blaue Kernfärbung:DAPI; grün (transfizierte Zelllinie):GFP; rot (intrinsische molekulare Fluoreszenz):DOX

Zytotoxizität von NALG-DOX

Als Basistest für das zelltötende Potenzial wurden unbehandelte 4T1-Zellen und mit NALG-DOX behandelte Zellen mit dem LIVE/DEAD-Zell-Assay (ThermoFisher) gefärbt und nach 72 h Exposition fixiert. Ein Beispielbild einer unbehandelten Vertiefung, einer mit NALG behandelten Vertiefung, einer mit 0,078 μg/ml DOX behandelten Vertiefung und einer mit 0,20 μg/ml NALG-DOX behandelten Vertiefung ist in den Abb. 5a–d dargestellt. Die in Fig. 5c, d gezeigte grüne Überlappung zeigt an, dass die DOX- und NALG-DOX-Behandlung in diesen Vertiefungen zum Tod vieler Zellen in dieser Vertiefung führt. Die Zellen waren aufgrund der Anwesenheit des Therapeutikums nicht in der Lage, sich auf die gleiche Weise zu vermehren wie in den unbehandelten und leeren mit Nanopartikeln behandelten Vertiefungen, die in Fig. 5a, b gezeigt sind. Die Verdünnung der zur Dosierung verwendeten Nanopartikel in NALG und NALG-DOX war identisch.

LIVE/DEAD-Fluoreszenzassay zeigt wenig bis gar keinen Zelltod in unbehandelten 4T1-Zellen (a ) und in mit NALG behandelten Zellen (b ). Die Signalintensität des grünen Kanals (Färbung toter Zellen) ist bei einer großen Menge der mit 0,078 μg/ml DOX behandelten Zellen stark (c ) und 0,20 μg/ml NALG-DOX (d ), was auf den Zelltod hinweist. Maßstabsbalken zeigen 100 μm an. Konzentrationen geben die Menge an DOX an, entweder frei oder in Partikeln. NALG-Dosierung in (b ) bei gleicher Partikeldichte wie in NALG-DOX

Die quantitative Bewertung der Zelllebensfähigkeit der 4T1-luc2-GFP-Zellen nach 72-stündiger Exposition gegenüber NALG, freiem DOX und NALG-DOX mittels Alamar Blue (ThermoFisher)-Assay ist in Abb. 6 gezeigt. In Abb. 6a ist das freie Doxorubicin -behandelte Zellen zeigten über den gesamten Konzentrationsbereich weniger lebensfähige Zellen als die mit NALG-DOX behandelten Zellen (für eine äquivalente Konzentration von DOX). Dies wird weiter vom IC₅₀ . angezeigt Werte oder Konzentration, die erforderlich ist, um eine Hemmwirkung von 50 % zu zeigen, die 0,093 μg/ml und 0,45 μg/ml für freies DOX bzw. NALG-DOX betrugen. Der freie DOX-Wert ist ähnlich dem, der nach 72 h gegen 4T1-Zellen von Du et al. gefunden wurde. [60]. Der IC₅₀ Werte ähneln denen von Eliaz et al. mit DOX und Liposomen-eingekapseltem DOX nach 72 h gegen B16F10-Melanomzellen [61].

Zelllebensfähigkeit von 4T1-luc2-GFP-Zellen nach 72-stündiger Exposition gegenüber NALG-DOX und DOX (a ) und NALG (b ) in verschiedenen Konzentrationen. Datenpunkte und Fehlerbalken zeigen die mittlere  ± Standardabweichung von n . an = 3 Vertiefungen. Konzentrationen geben die Menge an DOX an, entweder frei oder in Partikeln, in (a ). In b , NALG-Wells wurden ab den gleichen Partikelkonzentrationen wie NALG-DOX dosiert, was auf wenig bis keinen Zelltod allein durch den Wirkstoffträger hinweist

Damit NALG-DOX eine ähnliche Wirkung wie das freie Medikament zeigt, ist eine höhere Konzentration von Doxorubicin erforderlich. Dies ist zu erwarten, da das verkapselte Therapeutikum in seinem Transport zum Wirkort stärker behindert wird. Das eingekapselte Doxorubicin zeigte immer noch zellhemmende Wirkungen, was bedeutet, dass entweder das Medikament noch therapeutisch aktiv ist oder der Nanopartikel selbst für die Zellen toxisch ist. Um dies zu testen, wurde die Lebensfähigkeit von NALG in ähnlicher Weise wie bei NALG-DOX bewertet. NALG zeigte bei allen Konzentrationen eine minimale Toxizität, wie in Fig. 6b gezeigt, was darauf hindeutet, dass das Medikament wirksam ist.

Schlussfolgerungen

Wir haben eine inverse Micellenplattform entwickelt, die in der Lage ist, sphärische Alginat-Nanopartikel mit einer Größe von ~ 90 nm herzustellen. Die NALG-DOX-Aufnahme wurde in 4T1-luc2-GFP-Brustkrebszellen untersucht und zeigte bei Einkapselung in den Alginat-Träger eine deutliche Aufnahme an kernnahe Stellen. Die Zelltoxizität des freien Arzneimittels gegenüber dem verkapselten Arzneimittel wurde durch Untersuchung des therapeutischen IC₅₀ . verglichen Werte. Verkapseltes Doxorubicin zeigte im Vergleich zu seinem freien Arzneimittelgegenstück eine geringere Toxizität. Diese NALG-DOX können für Arzneimittelabgabezwecke von großem Interesse sein, da die Off-Target-Effekte des Doxorubicins bei systemischer Dosierung der verkapselten Form reduziert würden. Zukünftige Formulierungen werden für langsamere kontrollierte Freisetzungsprofile und eine erhöhte Verkapselung optimiert. Dieser einfache Prozess bietet einen effizienten Syntheseweg, der in nur wenigen Stunden abgeschlossen werden kann, sodass die weitere Charakterisierung sowie In-vitro- und In-vivo-Experimente schnell voranschreiten können.

Abkürzungen

4T1-luc2-GFP:

4T1-Luciferase/grün fluoreszierendes Protein

CaCl₂ :

Calciumchlorid

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-phenylindol

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

DMSO:

Dimethylsulfoxid

DOX:

Doxorubicin

NALG:

Alginat-Nanopartikel

NALG-DOX:

Doxorubicin-Alginat-Nanopartikel

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

PDI:

Polydispersitätsindex

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie