Anpassen morphomechanischer Störungen von Zellen durch Metalloxid-Nanopartikel

Hintergrund

Der breite Einsatz von technisch hergestellten Nanopartikeln (ENPs) in kommerziellen Produkten schärft das Bewusstsein für ihre potenzielle Toxizität für Mensch und Umwelt [1]. Viele In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen wurden bisher mit dem Ziel durchgeführt, die molekularen Mechanismen der Toxizität aufzuklären [2, 3]. Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Nanopartikeln (NPs) und lebenden Organismen ist jedoch aufgrund fehlender standardisierter Arbeitsabläufe eher schwierig, was zu den aktuell kontrovers verfügbaren Literaturdaten führte [4, 5]. Es wurde festgestellt, dass die schädlichen Wirkungen von Nanopartikeln strikt von ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften und von der spezifischen getesteten Zelle oder dem getesteten Organismus abhängen [6]. Aus diesem Grund ist die Charakterisierung von NPs grundlegend, um zuverlässige Daten zu erhalten [7]. Metalloxid-NPs sind in kommerziellen Produkten weit verbreitet [8]. Darunter amorphes SiO₂ NPs und kristallines TiO₂ Nanopartikel werden in einer Vielzahl von Industriebereichen als Zusatzstoffe zu Arzneimitteln und Kosmetika sowie in Gesundheitsprodukten, Druckertonern, Farben, Lebensmittelverpackungen und Lebensmittelzusatzstoffen verwendet [9, 10]. Daher ist es wahrscheinlich, dass diese NPs auf verschiedenen Wegen (Aufnahme, Inhalation und dermale Penetration) auf lebende Organismen zugreifen können [11]. Beispiele sind, ohne darauf beschränkt zu sein, die Nahrungsmittelprodukte auf Basis von TiO₂ NPs (im Handelsetikett als E171 bezeichnet) und SiO₂ NPs (E551, E554, E556 im kommerziellen Label), die ein enormes Wachstum verzeichnet haben [12,13,14]. Die aktuellen Studien zu SiO₂ NPs und TiO₂ NPs deuten darauf hin, dass sie aktiv in entscheidende Zellmechanismen eingreifen. Zum Beispiel wurde nachgewiesen, dass sie die Zytokinfreisetzung stimulieren (und somit Entzündungen fördern) [15,16,17] die Darmmikrovilli schädigen [18, 19], die ROS-Produktion induzieren [20], die ATP-Synthese hemmen [21] und Genotoxizität [22,23,24,25,26]. Allerdings haben nur sehr wenige Studien untersucht, ob diese NPs mit der Zellmechanik interagieren [27], ein Thema, das weitere Untersuchungen erfordert. Zelladhäsionen und Zytoskelett-Umlagerungen sind entscheidend, um die Zellhomöostase tatsächlich aufrechtzuerhalten [28]. Jede Veränderung der Zytoskelettarchitektur kann die Zellmechanik stören und die Zellelastizität und Migrationsdynamik beeinflussen [29]. In dieser Studie haben wir die biomechanischen Effekte von 20 nm SiO₂ . sorgfältig untersucht NPs und TiO₂ NPs auf Caco-2- und A549-Zellen, die die besten Modelle sind, die den NPs ausgesetzten Geweben ähneln. Wir haben vorläufig ihre Eintrittsmechanismen untersucht und die Lebensfähigkeit der Zellen, Membranschäden und ROS-Produktion zusammen mit Superoxiddismutase (SOD) und Malondialdehyd (MDA)-Aktivierung bewertet. Dann konzentrierten wir uns auf die Charakterisierung der Veränderungen der Zellelastizität (Young-Modul) bei der Inkubation von NPs durch Rasterkraftmikroskopie (AFM). Unsere Ergebnisse zeigen, dass NPs eine signifikante Reorganisation des kortikalen Aktins induzieren können, was durch die Veränderungen des Young-Moduls bestätigt wird. Insbesondere eine große Biokompatibilität von SiO₂ NPs gegen eine chronische Toxizität von TiO₂ NPs wurden beobachtet. Unser Ansatz, Zytotoxizitätsuntersuchungen mit biomechanischen Charakterisierungen zu koppeln, stellt eine neue potenzielle Methode zur Standardisierung von Protokollen in der NP-Toxizitätsbewertung dar.

Methoden

Synthese von amorphem SiO₂ NPs

Die ternäre W/O-Mikroemulsion wurde bei Raumtemperatur durch Mischen von Wasser, einem organischen Lösungsmittel (Cyclohexan, J. T. Baker), einem Tensid (Triton X-100, Sigma-Aldrich) nach den Verfahren von Malvindi et al. [25]. Kurz gesagt wurden 880 µl Triton X-100, 3,75 µl Cyclohexan, 170 µl Wasser und 50 µl TEOS (98%, Sigma-Aldrich) gemischt und 30 min gerührt. Später 30 μl NH₄ OH (28,0–30,0%, Sigma-Aldrich) wurde der Mikroemulsion zugesetzt. Nach 24 h wurde die Suspension durch Zentrifugation (4500 U/min) getrennt, gefolgt von fünf Waschungen in Ethanol (98%, Sigma-Aldrich) und MilliQ-Wasser. Die Nanopartikel wurden dann in Wasser dispergiert.

Synthese von TiO₂ NPs

TiO₂ NPs wurden nach der Sol-Gel-Methode hergestellt, die von Leena et al. [30] mit einigen Modifikationen. Kurz gesagt, Titan(IV)isopropoxid (TTIP; 99,9% Sigma-Aldrich) wurde in eine Lösung von Ethanol und MilliQ-Wasser (5:1:1) unter Rühren unter sauren Bedingungen (pH   3) getropft. Die NPs wurden zunächst 5 Stunden lang bei 30 °C und dann 3 Stunden lang bei 430 °C inkubiert, um ein weißes Nanopulver zu erhalten.

TEM-Charakterisierung

Charakterisierungen durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurden mit einem JEOL Jem 1011 Mikroskop durchgeführt, das bei einer Beschleunigungsspannung von 100 Kv (JEOL USA, Inc.) betrieben wurde. TEM-Proben wurden hergestellt, indem eine verdünnte Lösung von Nanopartikeln in Wasser auf kohlenstoffbeschichtete Kupfergitter (Formvar/Carbon 300 Mesh Cu) getropft wurde.

DLS und ζ-Potenzialmessungen

Die durchschnittliche hydrodynamische Größe und das Zetapotential von SiO₂ NPs und TiO₂ NPs wurden durch dynamische Lichtstreuung (DLS) und ζ-Potentialmessungen bestimmt, die auf einem Zetasizer Nano-ZS durchgeführt wurden, der mit einem 4,0-mW-HeNe-Laser bei 633 nm und einem Avalanche-Photodioden-Detektor (Modell ZEN3600, Malvern Instruments Ltd., Malvern, VEREINIGTES KÖNIGREICH). Die Messungen wurden bei 25 °C in wässrigen Lösungen und in Zellkulturmedium (DMEM, High Glucose, Sigma-Aldrich) ergänzt mit FBS (Sigma-Aldrich) bei 10 % und 20 % pH 7 durchgeführt. Jede Probe wurde dreimal unter Verwendung von zwei unabhängigen technischen Replikaten untersucht, um die Durchschnittswerte der DLS-Messungen und des ζ-Potentials zu erhalten.

XRD-Charakterisierung

Pulverröntgenbeugung (XRD) zur kristallinen Phasenanalyse von TiO₂ NPs wurden auf einem Rigaku-Diffraktometer in Bragg-Brentano-Reflexionsgeometrie unter Verwendung gefilterter Cu-Ka-Strahlung durchgeführt. Die XRD-Muster wurden im Bereich von 2Q ¼ 20–80 durch schrittweises Scannen aufgezeichnet, wobei 2Q-Inkremente von 0,02 und eine feste Zählzeit von 2 s/Schritt verwendet wurden.

Zellkultur

Caco-2 (ATCC® HTB-37™) und A549 (ATCC® CCL-185™) wurden in DMEM mit 50µM Glutamin, ergänzt mit 100µU/ml Penicillin und 100µmg/ml Streptomycin, gehalten. Der FBS-Prozentsatz betrug 10 % für A549 und 20 % für Caco-2-Zellen. Die Zellen wurden in einer befeuchteten kontrollierten Atmosphäre mit einem Verhältnis von 95 bis 5 % Luft/CO₂ . inkubiert , bei 37 °C.

Bestimmung der intrazellulären Aufnahme von SiO₂ NPS und TiO₂ NPs

10 ⁵ Caco-2- und A549-Zellen wurden in 1 &mgr;l Medium in einer Sechs-Well-Platte ausgesät. Nach 24 Stunden Inkubation bei 37 °C wurde das Medium durch frisches Medium ersetzt, das das SiO₂ . enthielt NPs und TiO₂ NPs in Konzentrationen von 15 µg/ml und 45 µg/ml. Nach 48 h, 72 h und 96 h Inkubation bei 37 °C wurde DMEM entfernt und die Zellen viermal mit PBS (pH 7,4) gewaschen, um NPs zu entfernen, die an die Zellmembran gebunden sein könnten. Die Zellen wurden trypsiniert und unter Verwendung einer automatischen Zellzählkammer gezählt. Dreihundertsechzigtausend Zellen wurden in 200 μL MilliQ suspendiert und mit HCl/HNO₃ . behandelt 3:1 (v /v ) und verdünnt auf 5 ml:Die resultierende Lösung wurde analysiert, um den Si- und Ti-Gehalt zu bewerten. Die Elementaranalyse wurde durch Atomemissionsspektroskopie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-AES) mit einem Varian Vista AX Spektrometer durchgeführt.

WST-8-Assay

Caco-2- und A549-Zellen wurden in 96-Well-Mikrotiterplatten mit einer Konzentration von 5 × 10 ³ . ausgesät Zellen/Vertiefung nach 24 h Stabilisierung. NP-Stammlösungen (SiO₂ .) NPs und TiO₂ NPs) wurden den Zellmedien mit 15 µg/ml und 45 µg/ml zugesetzt. Die Zellen wurden 24 h, 48 h, 72 h und 96 h inkubiert. Am Endpunkt wurde die Lebensfähigkeit der Zellen unter Verwendung eines Standard-WST-8-Assays (Sigma-Aldrich) bestimmt. Die Assays wurden nach dem zuvor in De Matteis et al. [31]. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt.

LDH-Assay

Caco-2- und A549-Zellen wurden mit SiO₂ . behandelt NPs und TiO₂ NPs nach dem für den WST-8-Assay beschriebenen Verfahren. Der Laktatdehydrogenase (LDH)-Assay wurde auf Mikrotiterplatten unter Anwendung des CytoTox-ONE Homogeneous Membrane Integrity Assay-Reagenz (Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Das Kulturmedium wurde gesammelt und der LDH-Spiegel wurde durch Ablesen der Extinktion bei 490 nm unter Verwendung eines Bio-Rad-Mikroplatten-Spektrophotometers gemessen. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD ausgedrückt.

DCF-DA-Assay

Caco-2- und A549-Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen ausgesät und mit SiO₂ . behandelt NPs und TiO₂ NPs in einer Endkonzentration von 15 µg/ml und 45 µg/ml. Nach 24 h, 48 h, 72 h und 96 h der Zell-NP-Interaktion wurde der DCF-DA (Sigma)-Assay auf Mikrotiterplatten nach dem von De Matteis et al. [32] Die Daten wurden als Mittelwert  ± SD ausgedrückt.

SOD-Assay

Caco-2 und A549 (inkubiert mit 15 µg/ml, 45 µg/ml für 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden und 96 Stunden) wurden nach dem in [33] beschriebenen Protokoll hergestellt. Der Assay wurde auf Mikroplatten durch Anwenden eines SOD-Assays (Cayman Chemical Company, Michigan, OH, USA) durchgeführt, der alle drei Arten von SOD (Cu/ZnSOD, MnSOD und FeSOD) misst. Der Assay verwendet ein Tetrazoliumsalz zum Nachweis von Superoxidradikalen, die durch Xanthinoxidase und Hypoxanthin erzeugt werden. Eine Einheit SOD ist definiert als die Enzymmenge, die benötigt wird, um eine Dismutation des Superoxidradikals von 50 % zu zeigen. Die SOD-Aktivität wurde durch Ablesen der Absorption bei 440–460 nm unter Verwendung eines Bio-Rad-Mikroplatten-Spektrophotometers gemessen.

MDA-Assay

Caco-2 und A549 (inkubiert mit 15 µg/ml, 45 µg/ml für 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden und 96 Stunden) wurden nach den zuvor beschriebenen Verfahren hergestellt [33]. Der Assay wurde auf Mikrotiterplatten unter Anwendung des Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit (Abcam) durchgeführt:das MDA in der Probe reagierte mit Thiobarbitursäure (TBA), um ein MDA-TBA-Addukt zu erzeugen. Dieser Weg beinhaltete die spektrophotometrische Messung der roten Farbe, die während der Bildung des MDA-TBA-Addukts entsteht, die quantifiziert werden kann (in nmol/mg Protein) durch Ablesen der Absorption bei 532  nm mit einem Bio-Rad Mikroplatten-Spektrophotometer.

CLSM-Analyse

Die Zellen wurden in einer 24-Well-Platte mit einer Konzentration von 10 ⁵ . ausgesät Zellen/Well und nacheinander mit SiO₂ . inkubiert NPs und TiO₂ NPs in einer Konzentration von 15 µg/ml und 45 µg/ml für 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden und 96 Stunden. Nach der Behandlung wurde zu jedem Zeitpunkt das Nanopartikel enthaltende Medium entfernt und die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen, fixiert mit 0,25% Glutaraldehyd (v /v in PBS, Sigma-Aldrich) für 20 min und schließlich mit 0,1% Triton (v /v in PBS, Sigma-Aldrich) für 5 min Für die Aktinfärbung wurde Phalloidin-ATTO 488 (Sigma-Aldrich) in einer Konzentration von 1 µg/ml für 30 min verwendet. Kerne wurden mittels DAPI (Sigma-Aldrich) bei einer Konzentration von 1 µg/ml für 7 µm markiert. Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie wurde auf einem konfokalen Mikroskop Zeiss LSM700 (Zeiss) durchgeführt, das mit einem inversen Mikroskop Axio Observer Z1 (Zeiss) ausgestattet war, unter Verwendung einer Ölimmersionslinse mit einer numerischen Apertur von x 100, 1,46 zur Abbildung. Konfokale Datendateien wurden mit der Software ZEN2010 (Zeiss) verarbeitet und morphometrische Quantifizierungen (Kohärenz und integrierte Dichte von F-Aktin) wurden an 15 Zellen mit der Analysesoftware ImageJ 1.47 durchgeführt. Das OrientationJ-Plugin wurde verwendet, um den Kohärenzparameter zu quantifizieren, indem eine bestimmte Sequenz von ROIs in konfokalen Akquisitionen basierend auf dem Maß der Strukturtensoren in einer lokalen Nachbarschaft ausgewählt wurde. Gleichzeitig berechnete die Software den Orientierungs- und Kohärenzwert, der den Orientierungsgrad der Aktinfasern repräsentiert:Ungeordnetere Fasern haben Werte nahe 0, während perfekt ausgerichtete einen Kohärenzwert von etwa 1 aufweisen [34]. Die integrierte Dichte wurde auch aus der Summe der Pixelwerte in den ROIs bei konfokalen Aufnahmen berechnet, um die Menge an Aktinfasern in Zellen zu quantifizieren.

AFM-Analyse

Caco-2- und A549-Zellen wurden in einer Konzentration von 10 ⁵ . in Plastik-Petrischalen (Corning) ausgesät Zelle/Vertiefung und kultiviert bis zu einer Konfluenz von 70–80%. Die Zellen wurden dann mit 45 μg/ml eines TiO₂ . behandelt NP_S und SiO₂ NPs in DMEM für 72 h. Anschließend wurden die NPs entfernt und die Zellen mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden unter Verwendung von Glutaraldehyd 0,25% für 20 min fixiert, gefolgt von Waschen mit PBS. Die Messungen wurden mit einem fortschrittlichen Rastersondenmikroskop (Bioscope Catalyst, Bruker Inc., USA) durchgeführt, das auf einem inversen optischen Mikroskop (Zeiss Observer Z1, Zeiss DEUTSCHLAND) montiert war. Das gesamte System ist auf einem Sockel platziert, der als Isolator gegenüber den mechanischen Schwingungen der Umgebung wirkt. AFM-Experimente wurden im Kraft-Volumen-Modus mit V-förmigem Brukers Sharp Microlever (MSNL, Spitze C) durchgeführt:einem hochempfindlichen Siliziumnitrid-Cantilever mit einer Nennfederkonstante von 0,01 N/m. Dieser Wert wurde durch die thermische Abstimmungsmethode [35] genau geschätzt, bevor die AFM-Erfassungen durchgeführt wurden. Die verwendeten Parameter waren wie folgt:Abtastbereich 50 µm, Anstiegsrate 3 Hz, FV-Abtastrate 0,03 Hz, Triggerschwelle 100 nm, Anzahl der Abtastwerte 128, Abtastwert pro Zeile 64 und Zeilen 64. Der Young-Modul (E) wurde bestimmt auf 20 Zellen, aus denen 25 Kraft-Weg-Kurven in Übereinstimmung mit der Kernfläche und 25 Kurven in der zytoplasmatischen Region extrahiert wurden. Der aus den extrahierten Kurven abgeleitete Anfahrdatensatz (vom Kontaktpunkt bis zum maximalen Kraftwert) wurde mit einem modifizierten Sneddon-Modell angepasst:

wo z und δc waren die experimentellen Belastungsdaten (Höhe bzw. Auslenkung des Auslegers), α ist der halbe Spitzenwinkel, k _c war die elastische Konstante des Auslegers und ν ist die Poisson-Ratio (angenommen 0,5 für eine biologische Probe). Im Fit-Algorithmus wurde der Kontaktpunkt als Fit-Variable behandelt und die Adhäsionskräfte berücksichtigt wurden an 20 Zellen erfasst.

Statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert und zugehörige Standardabweichung ausgedrückt. Unterschiede zwischen verschiedenen Mittelwerten wurden bei der Durchführung des Student t . als statistisch signifikant betrachtet test mit einem p Wert ˂ 0,05 (< 0,05*, < 0,01** und < 0,005***).

Ergebnisse

Charakterisierung von SiO₂ NPs und TiO₂ NPs

SiO₂ NPs und TiO₂ NPs wurden mit unterschiedlichen und reproduzierbaren Synthesewegen synthetisiert, um NPs mit einer engen und kontrollierten Größenverteilung zu erhalten (siehe Abschnitt „Methoden“). Anschließend wurden NPs mittels TEM, DLS, ζ-Potential und XRD sowohl in Wasser als auch in Zellkulturmedien (DMEM) mit unterschiedlichen Konzentrationen der Proteinquelle (FBS) tief charakterisiert. Dies ist entscheidend, da die Medienproteine ​​die Oberfläche der NPs bedecken können und dadurch ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften und damit die biologischen Wirkungen verändern [36]. TEM-Analysen zeigten, dass SiO₂ NPs haben eine sphärische Form mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 20 ± 2 nm (Abb. 1a). TiO₂ NPs haben eine ähnliche Größe (25 ± 5 nm), aber eine unterschiedliche Morphologie (Abb. 1). DLS-Messungen in Wasser bei 96 h bestätigten einen hydrodynamischen Radius von 21 ± 7 nm und 27 ± 12 nm für SiO₂ NPs und TiO₂ NPs (Abb. 1b und Abb. 1e). Wie erwartet stimmen diese Daten gut mit den TEM-Beobachtungen überein. ζ-Potenzialanalysen bestätigten auch Oberflächenladungswerte in Wasser von − 45 ± 3 mV für SiO₂ NPs und von − 50 ± 3 mV für TiO₂ NPs (Abb. 1c, f). Wie erwartet änderten sich die physikalisch-chemischen Eigenschaften der NPs bei der Inokulation in das Zellkulturmedium. DLS bestätigte eine signifikante Zunahme der NP-Größe, insbesondere in Gegenwart von DMEM, ergänzt mit 20 % FBS (Tabelle 1). Insbesondere SiO₂ NPs zeigten eine Größe von 29 ± 9 nm, während TiO₂ Die NPs stiegen nach 96 h auf 41 ± 14 nm an. Die in den DMEM-Messungen (mit oder ohne FBS) beobachtete Vergrößerung des DLS-Peaks ist ein Zeichen für die Agglomeration der NPs, die durch die Ionenstärke des Mediums gefördert werden kann (Daten nicht gezeigt). Außerdem zeigten die ζ-Potentialmessungen, dass sich die Oberflächenladung beider NPs zu negativeren Werten verschoben hat Dieses große zeitabhängige Phänomen war auf die recht stabile Proteinkoronabildung [37, 38] zurückzuführen, die durch die Anwesenheit von Serumproteinen in Zellkulturmedien, die an der Oberfläche von NPs adsorbiert wurden, induziert wurde:Größe und Ladung der NPs ändern sich als Funktion der FBS-Konzentration.

Charakterisierungen von SiO₂ NPs und TiO₂ NP im Wasser. a –d Repräsentative TEM-Bilder. b –e Dynamische Lichtstreuung (DLS) und c –f ζ-Potentialmessungen. g Röntgenbeugungsanalyse (XRD)-Muster von TiO₂ NPs

Das XRD-Muster von TiO₂ NP_S , kalziniert bei 430 °C, zeigte eine Mischung aus Anatas- und Rutil-Kristallphasen (Abb. 1g) . Die dominanten Peaks bei 2θ = 25,4° (101), 48,1° (200), 54,1° (211), 62,4° (204) und 68,8° (116) waren charakteristisch für die Anatas-Phase, die gut mit den Standard-JCPDS-Daten übereinstimmte ( Kartennummer:21–1272). Die Rutilphase wurde mit Beugungspeaks bei 27,5° (110), 36,2° (101) und 41,2° (111) dargestellt.

Aufnahme von NPs in Caco-2- und A549-Zellen

Um die Menge an SiO₂ . zu quantifizieren NPs und TiO₂ NP_S von Zellen aufgenommen, führten wir als Voruntersuchung eine ICP-AES-Elementaranalyse an lysierten Zellen durch. Die Zellen wurden mit 15 µg/ml und 45 µg/ml NPs behandelt. Die experimentellen Daten bestätigten das Vorhandensein von SiO₂ NPs und TiO₂ NPs in beiden Zelllinien mit einer zeitabhängigen Internalisierungseffizienz (Abb. 2a). TiO₂ NPs zeigten eine größere Aufnahme als SiO₂ NPs. Dies war besonders deutlich in Caco-2, wo der Ti-Gehalt intrazelluläre Konzentrationen von 8,2 ± 0,4 µg und 9,7 ±   0,031 µg nach 72 Stunden bzw. 96 Stunden erreichte. Die im A549 nachgewiesene Ti-Menge war geringer, da wir 5 ± 0,599 μg nach 72 Stunden und 7,12 ± 0,11 μg nach 96 Stunden Inkubationszeit fanden. SiO₂ NPs wurden weniger von Zellen aufgenommen als TiO₂ NPs, auch wenn die Internalisierung in Caco-2 stärker ausgeprägt war. Auch in diesem Fall ist die Menge an internalisiertem SiO₂ Die NPs in Caco-2-Zellen betrugen 4,69 ± 0,031 µg nach 72 Stunden und 5,78 ±   0,045 µg nach 96 Stunden Inkubation. Die Werte sanken in A549, wo wir 2,58 ± 0,045 μg nach 72 Stunden und 4,7 ± 0,04 μg nach 96 Stunden quantifizierten.

TiO₂ NPs und SiO₂ Ansammlung von NPs in Caco-2- und A549-Zelllinien, die 15 µg/ml und 45 µg/ml TiO₂ . ausgesetzt waren NPs und SiO₂ NPs für 24 h, 48 h, 72 h und 96 h. Die Zellen wurden dann geerntet, lebende Zellen wurden gezählt und der Ti- und Si-Gehalt wurde in 360.000 Zellen (μg Ti und μg Si) gemessen. Daten als Mittelwert ± SD aus drei unabhängigen Experimenten; statistische Signifikanz exponierter Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen für p Wert < 0,05 (< 0,05*, < 0,01** und < 0,005***)

Auswirkungen von NPs auf CaCo-2 und A549:Lebensfähigkeit der Zellen, Membranschäden und ROS-Produktion

Die Lebensfähigkeit der Caco-2- und A549-Zellen wurde mit dem WST-8-Assay bewertet. Die Behandlung mit SiO₂ NPs und TiO₂ NPs induzierten in beiden getesteten Zelllinien eine leichte dosisabhängige Verringerung der Lebensfähigkeit (Abb. 3). TiO₂ NPs induzierten eine erhöhte Zytotoxizität gegenüber SiO₂ NPs und die Zelllebensfähigkeit von CaCo-2-Zellen war bei Behandlung mit TiO₂ . stärker beeinträchtigt als die von A549 NPs. Insbesondere beobachteten wir bei Caco-2, das mit 45 μg/ml TiO₂ . behandelt wurde, eine Verringerung der Lebensfähigkeit um etwa 40 % NPs für 72 h. Diese Reduktion ging nach 96 h weiter um bis zu 50 % zurück, während in A549-Zelllinien TiO₂ NPs führten erst nach 96 Stunden Behandlung zu einer Reduktion der Lebensfähigkeit um 30%. Die LDH-Freisetzung und ROS-Produktion wurden in Caco-2- und A549-Zellen nach Exposition gegenüber TiO₂ . bewertet NPs und SiO₂ NPs. Wie in Abb. 4a, b gezeigt, induzierten NPs die Zellmembranporation (und tatsächlich die LDH-Freisetzung) in enger Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Lebensfähigkeit. Der Effekt war bei Caco-2 deutlicher als bei A549, insbesondere bei TiO₂ NP-Behandlung zu den höchsten Zeitpunkten (72 und 96 h). Der prozentuale Anteil der LDH-Freisetzung erreichte nach 96 h Exposition einen Anstieg von etwa 160 % in Bezug auf die unbehandelten (Kontroll-)Zellen. Die ROS-Generierung wurde intensiv untersucht, da sie einer der Haupteffekte ist, die durch NPs induziert werden [39]. Dieses Phänomen stört die biologische antioxidative Abwehrreaktion [40], obwohl es wichtig zu erwähnen ist, dass der tatsächliche Wirkmechanismus noch untersucht wird. Der potenzielle NP-induzierte oxidative Stress wurde durch den DCFH-DA-Assay abgeschätzt. Wie erwartet stimulierte die Interaktion zwischen NPs und Zellen die Bildung von ROS in einer dosisabhängigen Weise mit einer starken Wirkung in Caco-2 auf TiO₂ NP-Behandlung (Abb. 4c, d). Der Prozentsatz der Freisetzung erreichte Werte von 165 % in Bezug auf die Kontrollzellen bei der höchsten getesteten Konzentration.

Lebensfähigkeitstest (WST-8) von Caco-2 (a ) und A549 (b ) Zellen nach 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden und 96 Stunden Exposition gegenüber zwei Dosen (15 µg/ml und 45 µg/ml) TiO₂ NPs und SiO₂ NPs. Die Lebensfähigkeit von NP-behandelten Zellen wurde auf unbehandelte Kontrollzellen normalisiert. Als Positivkontrolle (P) wurden Zellen mit 5% DMSO inkubiert (Daten nicht gezeigt). Daten, die als Mittelwert  ± SD aus drei unabhängigen Experimenten gemeldet wurden, gelten als statistisch signifikant im Vergleich zur Kontrolle (n = 8) für p Wert < 0,05 (< 0,05*, < 0,01** und < 0,005***)

LDH (a –b ) und ROS (c –d ) Assays an Caco-2- und A549-Zellen. Zellen wurden mit 15 µg/ml und 45 µg/ml TiO₂ . inkubiert NPs und SiO₂ NPs für 24 h, 48 h, 72 h und 96 h. Der Prozentsatz des LDH-Austritts von mit Nanopartikeln behandelten Zellen wird relativ zu unbehandelten Kontrollzellen ausgedrückt. Positivkontrollen (P) bestanden in der Behandlung von Zellen mit 0,9% Triton X-100, die ca. 500 % LDH-Anstieg (Daten nicht gezeigt). ROS-Spiegel wurden aufgezeichnet, indem Caco-2- und A549-Zellen mit 15 µg/ml und 45 µg/ml TiO₂ . exponiert wurden NPs und SiO₂ NPs für 24 h, 48 h, 72 h und 96 h inkubiert mit 100 μM DCFH-DA. Die Zellfluoreszenz wurde gemessen. Als Positivkontrolle (P) wurden Zellen mit 500 µM H₂ . inkubiert O₂ zeigt eine ca. 300 % DCFH-DA-Anstieg (nicht gezeigt). Daten, die als Mittelwert  ± SD aus drei unabhängigen Experimenten gemeldet wurden, gelten als statistisch signifikant im Vergleich zur Kontrolle (n = 8) für p Wert < 0.05 (< 0.05*, < 0.01** und < .005***)

Durch NPs induzierte Wirkungen auf die Aktivität von Antioxidantien und die Lipidperoxidation in Caco-2- und A549-Zellen

Das SOD-Enzym ist am antioxidativen Abwehrsystem nach der Induktion von oxidativem Stress beteiligt. Dieses Enzym katalysiert die Dismutation von hochreaktivem Superoxid (O₂ ^•− ) Anion in Peroxide H₂ O₂ [41]. Wir beobachteten eine dosisabhängige Verringerung der SOD-Enzymaktivität sowohl in Caco-2 als auch in A549 nach Inkubation mit SiO₂ NPs und TiO₂ NPs (15 µg/ml, 45 µg/ml) zu verschiedenen Zeitpunkten (von 24 bis 96 Stunden) (Abb. 5a, b). In enger Übereinstimmung mit den Zytotoxizitätsbewertungen war die Wirkung bei Caco-2 auf TiO₂ . deutlicher NP-Belichtung. Beispielsweise wurden die SOD-Aktivitätsniveaus von 4,1 ± 0,2 U/ml in der Kontrolle auf 1,03 ± 0,325 U/ml in Caco-2-Zellen reduziert, die 45 µg/ml TiO₂ . ausgesetzt waren NPs, nach 96 h. Die Exposition gegenüber der gleichen Konzentration von SiO₂ NPs reduzierten die SOD-Aktivität auf 1,45 ± 0,12 U/ml. Der MDA-basierte Assay wurde verwendet, um eine potenzielle ROS-vermittelte Lipidperoxidation zu überprüfen, die wiederum eine weitere Möglichkeit ist, den oxidativen Stress der Zellen zu überprüfen. [42] Die zellulären MDA-Spiegel stiegen nach Exposition gegenüber den beiden NP-Typen für Caco-2 und A549 (Abb. 5c, d). Wie erwartet waren die erhöhten MDA-Werte proportional zur Konzentration und Expositionszeit.

a –d SOD- und MDA-Assays an Caco-2- und A549-Zellen. Zellen wurden mit 15 µg/ml und 45 µg/ml TiO₂ . inkubiert NPs und SiO₂ NPs für 24 h, 48 h, 72 h, 96 h. Der SOD-Assay verwendet ein Tetrazoliumsalz zum Nachweis von Superoxidradikalen, die durch Xanthinoxidase und Hypoxanthin erzeugt werden. Die Standardkurve wurde als Positivkontrolle verwendet (Daten nicht gezeigt). Die MDA-Spiegel wurden durch die Quantifizierung des MDA-TBA-Addukts (OD =532 nm) nachgewiesen. Daten, die als Mittelwert  ± SD aus drei unabhängigen Experimenten gemeldet wurden, gelten als statistisch signifikant im Vergleich zur Kontrolle (n = 8) für p Wert < 0,05 (< 0,05*, < 0,01** und < 0,005***)

Morphomechanische Effekte durch NPs

Konfokalmikroskopische Analysen von Caco-2 und A549 inkubiert mit 15 µg/ml und 45 µg/ml SiO₂ NPs und TiO₂ NPs für 24 h, 48 h, 72 h und 96 h sind in den Fig. 3 und 4 angegeben. 6 und 7. Kontroll-Caco-2-Zellen zeigten eine ähnliche Morphologie wie intestinale Enterozyten mit Tight Junctions und Bürstensaum an der apikalen Seite [43]. Bei der Behandlung mit NPs kollabierten die Tight Junctions der Zellen und das Muster der Zellen wurde isoliert, mit einer länglichen Form. Diese Effekte waren deutlicher, wenn die Zellen mit TiO₂ . behandelt wurden NPs bei 45 µg/ml für 72 Stunden Inkubationszeit, die relevante Veränderungen der Aktinmuster sowie Veränderungen in der Zellmorphologie zeigen. Die unbehandelten A549-Zellen zeigten eine kieselähnliche Form und funktionelle Zell-Zell-Adhäsionen [44], während die Behandlung mit NPs die Zell-Zell-Kontakte verringerte und die Zellmorphologie in Richtung längerer Formen veränderte. Abbildung 8 zeigt eine vergrößerte konfokale Abbildung, die es ermöglicht, Änderungen in der Aktinverteilung zu erkennen. Die veränderte Organisation des Aktinnetzwerks nach NP-Exposition (72 h von 45 μg/ml SiO₂ NPs und TiO₂ NPs) wurde quantitativ anhand der Fluoreszenzdichte und Kohärenz mit der ImageJ-Software analysiert (Abb. 9). Wir haben uns speziell für diese beiden Parameter entschieden, da die integrierte Dichte es uns ermöglichte, die Aktinmenge zu quantifizieren, während uns die Kohärenz Informationen über den Grad der Faserorientierung im Vergleich zur Umgebung lieferte [45]. Unbehandelte Caco-2-Zellen hatten einen Dichtewert von 129,4 ±   16, und dieser blieb bei NP-Behandlungen unbeeinflusst; die Werte waren 127,7 ± 20 und 128,5 ± 18 nach der Exposition gegenüber SiO₂ NPs und TiO₂ NPs bzw. Abb. 9a). In ähnlicher Weise blieb auch die Dichte des Aktin-gefärbten Netzwerks in A549 vor und nach der Behandlung gleich (68,4 ± 14, 67,9 ± 15 und 67,7 ± ± 18 für die Negativkontrolle, SiO₂ NPs und TiO₂ NPs bzw. Abb. 9b). Obwohl NP-Behandlungen keine Veränderung der Aktinmenge bewirkten, deuteten die Kohärenzanalysen auf eine unterschiedliche räumliche Reorganisation von Aktin hin. In Caco-2 die Kohärenzwerte der behandelten Zellen für SiO₂ NP (0,16 ± 0,04) und für TiO₂ Die Behandlung mit NP (0,09 ± 0,02) verringerte sich im Vergleich zu der der Kontrolle (0,26 ± 0,03) (Abb. 9c). Even the A549 cells underwent a decrease of coherency after interacting with SiO₂ NPs and TiO₂ NPs (0.2 ± 0.07 and 0.158 ± 0.04) compared to the control cells (0.4 ± 0.03) (Fig. 9d). Hence, NPs induced a significant reorganization of actin network, which showed an actin isotropic orientation, but they did not change the overall quantity of actin expressed. In addition to cytoskeletal rearrangements, we also analyzed the area described by the nucleus/cytoplasm ratio. Values of N/C ratio were calculated as the ratio between nuclear area and the whole cellular area (measured performed on 15 cells). We observed opposite values following the treatment with 45 μg/ml of NPs for 72 h with significant statistical validity. In particular, the ratio was (0.40 ± 1.7) in untreated Caco-2 cells, and this increased up to 0.554 ± 0.09 and 0.62 ± 0.12 after SiO₂ NP and TiO₂ NP exposure (Fig. 9e). The trend was different in A549. The nuclear/cytoplasm ratio dropped down upon exposure to NPs from values of 0.550 ± 0.04 for control cells to 0.334 ± 0.06 for SiO₂ NPs and 0.225 ± 0.09 for TiO₂ NPs. After the morphological investigations, we analyzed the elastic properties of cells after exposing them to 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs for 72 h by AFM, in force–volume mode. We measured the different elasticity expressed by Young’s modulus values in the nuclear and cytoplasmic region. Caco-2 cells displayed Young’s modulus value of 105 ± 25 kPa for nuclear region and 47 ± 21 kPa for the cytoplasm. After SiO₂ NP treatment, we observed a reduction of value to 42 ± 8 kPa for the nucleus and 19.59 ± 2 kPa for the cytoplasm. The effects were more evident after treatment with TiO₂ NPs:the Young modulus for the nucleus was 27 ± 4 kPa and 18 ± 4 kPa for the cytoplasm (Fig. 10a). We found an opposite outcome concerning the elastic properties of A549 cells. In this case, Young’s modulus was 129 ± 24 kPa for the nuclear region and 147 ± 26 kPa for the cytoplasmic area. After SiO₂ NP treatment, the values of elasticity increased to 152 ± 23 kPa for nucleus and 152 ± 25 kPa for cytoplasm. When cells were doped with TiO₂ NPs, Young’s modulus values drastically increased to 372 ± 60 kPa for nucleus region and 549 ± 40 kPa for cytoplasmic region (Fig. 10b).

Effects of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network of Caco-2 cells. Caco2 were treated with 15 μg/ml and 45 μg/ml of NPs for 24 h, 48 h, 72 h, and 96 h; cells were fixed and then stained with Phalloidin–ATTO 488 and DAPI. The 2D images of cortical actin were acquired by a Zeiss LSM700 (Zeiss) confocal microscope equipped with an Axio Observer Z1 (Zeiss) inverted microscope using a × 100, 1.46 numerical aperture oil immersion lens. All data were processed by ZEN software (Zeiss)

Effect of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network on A549 cells. A549 were treated with 15 μg/ml and 45 μg/ml of NPs for 24 h, 48 h, 72 h, and 96 h; successively they were fixed and stained with Phalloidin–ATTO 488 and DAPI. The 2D images of cortical actin were acquired by a Zeiss LSM700 (Zeiss) confocal microscope equipped with an Axio Observer Z1 (Zeiss) inverted microscope using a × 100, 1.46 numerical aperture oil immersion lens. All data were processed by ZEN software (Zeiss)

Local enlargement of confocal acquisitions acquired in Figs. 6 and 7 showed (more in details) the effect of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network of Caco-2 and A549 cells after the exposure of 45 μg/ml of NPs for 72 h and 96 h

Integrated density (a , b ) and coherency (c , d ) for Caco-2 and A549 cells treated with 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs after 72 h. The integrated density and coherency values were expressed as a mean value and relative SD, calculated from confocal acquisitions by ImageJ (calculation on 15 cells). The mean values and their standard deviations were reported in the histograms. Results were statistically significant for p < 0.05 (< 0.05*, < 0.01**, and < 0.005***). e Analyses of nucleus/cytoplasm ratio on Caco-2 and A549 after exposure to 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs for 72 h. The ratio was calculated on 15 cells by ImageJ. The mean values and the SD were reported in the histogram. Results were statistically significant for p  < 0.05 (< 0.05*, < 0.01**, and < 0.005***)

Young’s modulus values expressed in kPa, calculated from the nuclear region and the cytoskeletal area of Caco-2 (a ) and A549 (b ) cell lines after a treatment to 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs for 72 h

Diskussion

The spread of different kind of ENPs in several fields raises awareness about the importance to assess their potential toxicity in living organisms and the environments as well, taking into account their potential application in biomedical field [46,47,48]. In vitro and in vivo investigations are crucial to enrich the scientific knowledge and to release reliable clinical and epidemiological data [49]. The toxicity tests performed on different cells are considered the golden standard to assess the safety of NPs. However, few studies have investigated the interactions between NPs and cells from a biomechanical point of view. Cell mechanic is an important factor that influences many cellular pathways, including apoptosis, differentiation, migration, cancer metastasis, and wound healing [50]. In our work, we have addressed this point and related cell viability with the changes in mechanical properties of cells treated with different NPs. Firstly, we synthetized amorphous SiO₂ NPs and crystalline TiO₂ NPs with a size of c.a. 20 nm. NPs were stable in water and DMEM up to 96 h, even upon incubation with 10% and 20% of FBS. This was found to induce an increase in NPs size due to the formation of protein corona, in perfect agreement with the literature data. [51]. Since the entry route of NPs often occurs through inhalation and ingestion, we opted to investigate the potential effects on Caco-2 and A549 cells, which are representative models for the intestinal tract and airways mimicking oral and inhalation uptake [52]. As primary investigation, we quantified the cellular internalization of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs by elemental analysis. The most effective uptake was observed in Caco-2 cells, especially upon treatment with TiO₂ NPs in a time-dependent manner. It has been reported that amorphous SiO₂ NPs, with a small size range of 15–20 nm, can bind the plasma membrane and then passively pass across the lipid bilayer to get access into the cells [53]. As demonstrated in A549 [54] and Caco-2 [55], in fact, small SiO₂ NPs can translocate in the cytoplasm with no apparent membrane encapsulation. The anatase crystalline form of TiO₂ NPs is the more chemically reactive [56] showing a faster absorption with respect to rutile, as previously reported [32]. However, the uptake mechanisms of Caco2 are still unclear, despite that some hypothesis have been formulated, some of these include metal ion release upon NPs degradation in the intestinal barrier lumen or/and direct uptake by endocytosis. [57]. In A549 cells, TiO₂ NPs were localized in cytoplasm and close the nucleus region [58]. We used WST-8 assay to assess the influence of different concentrations of SiO₂ NPs and TiO2NPs on cell viability. We have observed a general decrease of viability, especially in Caco-2, with TiO₂ NPs displaying the strongest toxicity. After assessing the viability, we monitored the extracellular release of the cytoplasmic enzyme LDH. We confirmed that the NPs induced an extensive membrane damage, which relates also to the increase of intracellular ROS levels, resulting in oxidative stress. In this context SOD, which acts as strong antioxidant against ROS [59], was significantly reduced most probably because of the unbalance of the redox repair systems. In addition, the oxidative stress increased the lipid peroxidation [60], as demonstrated by MDA measurements after NPs incubation. This is particularly evident in Caco-2 cells after TiO₂ NP exposure. It is worth mentioning that this effect can decrease membrane fluidity, which can further explain the observed higher entry levels of the TiO₂ NPs [61]. This was in significant accordance with the intracellular oxidative stress levels measured by SOD inhibition, as well as with the reactive oxygen species generation. After these assessments, we investigated the modulation of the cell cytoskeleton, as an increase of intracellular ROS could affect the F-actin organization [62]. The cytoskeleton is characterized by a set of filaments (actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments) organized in a network that affects the mechanical properties of cells, as well as their behavior [29]. In particular, actin filaments are crucial for cell mechanics, and any alterations may induce aberrations in cell morphology under sub-toxic conditions [63]. It has been demonstrated that actin was one of the most commonly bound protein by SiO₂ NPs and TiO₂ NPs in cellular extracts. This definitely suggests that the actin functions, as well as cell motility and organelles trafficking, can be strongly affected by the presence of these NPs [64, 65]. As a further proof, several in vivo studies have revealed the potential of NPs to induce alterations in the expression of genes related to the cytoskeleton [63]. In order to understand how NPs modulate the cytoskeleton, we performed qualitative and quantitative confocal analyses on Caco-2 and A549 cells, after SiO₂ NP and TIO₂ NP treatment. We focused on actin stress fibers and cortical actin because they allowed to maintain the physiological mechanical architecture of cells. As reported in Figs. 4 and 5, the treatment with NPs induced a significant reorganization of actin. This was more evident after 72 h of treatment with 45 μg/ml of NPs, and especially with the use of TiO₂ NPs. The adverse effects were stronger in intestinal cells, where we have observed the formation of protrusions and philopodia at the plasma membrane level, together with the disruption of tight junctions. Fluorescence coherency and fluorescence density have been used as quantitative parameters to assess alterations of actin distribution in the cytoskeleton. While coherency gives information about the organization of actin, density quantifies the levels of fluorescent actin. Caco-2 and A549 exposed to NPs showed a reduction of coherency compared to untreated cells, especially upon incubation with TiO₂ NPs. This was in good agreement with the qualitative confocal imaging analyses. The fluorescence density of actin was not altered by NP treatment in both the cell lines, even if untreated Caco-2 cells showed higher values with respect to untreated A549. These data could suggest a potential difference in the amount of actin, which is dependent on>the specific cell type. We also evaluated the nucleus-to-cytoplasm ratio as the relative area of the nucleus over the whole cell. We confirmed a reduction of values in A549 and an increase of the ratio in Caco-2 with respect to the control cells. This indicates changes in cell morphology after NP treatment:Caco-2 underwent an increase of nucleus area, whereas A549 became larger through cytoplasm extension. As a final point, we explored any potential change in cell elasticity upon NP treatment. Cell elasticity is commonly expressed by Young’s modulus (E), which is a ratio between the stress and the applied strain (with unit in Pascal) [66, 67]. Changes in cell elasticity due to cytoskeleton reorganization is often associated to disease progression [68], hence (E) can be a refined indicator of potential pathological states [67]. The deformability of cells was measured through indentation experiments by AFM [69]. Many studies showed the detrimental effects of NPs on the F-actin that induced an enhancement of cell elasticity. However, a clear relation between change in cell stiffness, actin rearrangement and cell viability has not been clearly established yet. Here, we have covered such topic and found that Caco-2 and A549 cells significantly change their (E) upon NP treatment, even though in two different ways. Caco-2 cells are softer as confirmed by the decreased Young’s modulus, which has been found to be a function of both the NPs type and the cell regions analyzed. In particular, TiO₂ NPs induced a general enhancement of elasticity, and this effect is more evident in the nuclear regions rather than the cytoplasmic one. On the other side, A549 displayed a remarkable increase of Young’s modulus after TiO₂ NP exposure in cytoplasm region, compared to control cells (594 ± 40 kPa versus 146 ± 26 kPa, respectively). These data indicated that TiO₂ NPs induce dose-dependent changes in force–deformation profiles in both cell lines, whereas SiO₂ NPs showed little effects. The decrease of Young’s Modulus, and consequently an increase of elasticity after NPs exposure, can potentially impact cell homeostasis and physiological pathways. The reorganization F-actin, together with a reduction of coherency, showed a strong modulation of mechanical cell properties. NPs have been demonstrated to make the nuclear region of Caco-2 cells softer than untreated cells. The increase of elasticity (corresponding to a reduction of Young’s modulus) is a critical factor in tumor progression, because it is an indicator of disruption of cell junctions, which promotes in turn cell migration and metastatization [70]. Therefore, the treatment with NPs on Caco-2 (and TiO₂ NP_S in particular) can potentially promote migration due to change of elastic properties and deformability of cells. Also, the larger and softer nucleus area can be associated to cancer progression [71].

Schlussfolgerung

In this paper, we careful assessed the adverse effects of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs on two different cell lines (Caco-2 and A549), mimicking the typical tissue that are exposed to NPs (ingestion and inhalation). SiO₂ NPs presented a low cytotoxicity in comparison with TiO₂ NPS. We demonstrated how the cellular exposure to high doses of NPs induced morphostructural changes in term of actin reorganization, coherency, density and nucleus/cytoplasm ratio, which were more evident upon TiO₂ NP treatment. Cell membrane deformability measurements showed different behavior in the two cells. In Caco-2, the cell elasticity increased after NP treatment, whereas A549 displayed an increase of stiffness. These results demonstrated that NPs induce modifications of cytoskeleton structures and, as consequence, a different Young’s Modulus values. Hence, the phenotype of cancer cells can turn into a more invasive profile, characterized by enhanced migration. On the other side, the increased stiffness observed in A549 might not promote the mobility of this specific cell indeed. We are sure that the analysis of cell mechanics upon NP exposure, combined with standard toxicological assays, will represent a golden standard to accurately assess the safety of NPs and to predict any potential possible diseases triggered by NPs.

Abkürzungen

A549:

Human adenocarcinoma alveolar basal epithelial cells

AFM:

Rasterkraftmikroskopie

ATP:

Adenosine triphosphate

Caco-2:

Human epithelial colorectal adenocarcinoma

CLSM:

Confocal Laser Scanning Microscopy

DAPI:

4′,6′-Diamidino-2-phenylindole

DCF-DA:

2′,7′-Dichlorofluorescein diacetate

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

DMEM:

Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium

ENPs:

Engineered nanoparticles

FBS:

Fetal bovine serum

HCl/HNO3:

Hydrochloric/nitric acid

ICP-AES:

Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy

LDH:

Lactate dehydrogenase

MDA:

Malondialdehyde

NH4OH:

Ammonium hydroxide

NPs:

Nanopartikel

PBS:

Phosphate Buffered Saline

ROIs:

Regions of interest

ROS:

Reactive Oxygen Species

SiO2NPs:

Silicon dioxide nanoparticles

SOD:

Superoxiddismutase

TBA:

Thiobarbituric acid

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

TEOS:

Tetraethyl orthosilicate

TiO2NPS:

Titanium dioxide nanoparticles

TTIP:

Titanium (IV) isopropoxide

XRD:

Röntgenbeugung