Mitochondrien-gezielte und Resveratrol-beladene Doppelfunktions-Titandisulfid-Nanoblätter für die photothermisch ausgelöste Tumor-Chemotherapie

Einführung

Krebs bleibt eine lebensbedrohliche Krankheit und ist weltweit für hohe Sterblichkeitsraten verantwortlich [1]. Chirurgie, Chemotherapie, Bestrahlung und Hormontherapie sind nach wie vor die wichtigsten Therapiemethoden in der klinischen Praxis [2, 3]. Von diesen Methoden ist die Chemotherapie aufgrund ihrer relativ hohen Wirksamkeit eine weithin akzeptierte Behandlungsoption von Klinikern und Patienten [4, 5]. Die Chemotherapie ist mit einigen schwerwiegenden Problemen verbunden, z. B. Arzneimittelresistenz, Tumorrezidiv und Unspezifität [5,6,7]. Daher ist die Entwicklung neuer Chemotherapeutika und Strategien zur Überwindung dieser Hindernisse von großer Dringlichkeit [8]. In den letzten Jahren hat sich das Laden eines Antikrebsmedikaments auf einen funktionalisierten Träger, der gleichzeitig eine gezielte Abgabe und eine kontrollierte Freisetzung des Medikaments erreichen kann, zu einem beliebten Ansatz entwickelt, um die therapeutische Wirkung zu maximieren und die Nebenwirkungen zu verringern [9,10,11] . Ein großer spezifischer Bereich, der ein besseres Wirkstoffbeladungsverhältnis bieten kann, ist für einen hervorragenden Wirkstoffträger unerlässlich [12].

Um die Spezifität des Arzneimittels zu verbessern, wird der Träger außerdem normalerweise mit einem auf Zellen gerichteten Molekül modifiziert, wie z. B. Folsäure und Glutathion, die auf den Zelloberflächenrezeptor gerichtet sind [13,14,15,16,17]. Da viele Chemotherapeutika auf spezifische subzelluläre Organellen wirken, könnte die Entwicklung eines organellenspezifischen Abgabesystems die therapeutische Wirkung deutlich verstärken und die Nebenwirkungen reduzieren [18,19,20]. Folglich ist die Auswahl des Zielortes innerhalb der Tumorzellen für das Wirkstoffabgabesystem von entscheidender Bedeutung. Mitochondrien sind nicht nur eine „Energiefabrik“ von Zellen, sondern auch ein wichtiges Ziel von Chemotherapeutika, die auf die Mitochondrien abzielen, um den intrinsischen apoptotischen Signalweg zu initiieren [21,22,23]. Daher könnte die Entwicklung eines auf Mitochondrien ausgerichteten Systems zur Verabreichung von Arzneimitteln gegen Krebs für eine wirksamere Chemotherapie bei Krebs von entscheidender Bedeutung sein. Bisher wurden verschiedene Arten von Medikamentenabgabesystemen entwickelt, wie z. B. mesoporöse Kieselsäure, Materialien auf Kohlenstoffbasis und Protein [17, 24, 25, 26]. Obwohl berichtet wurde, dass diese Träger für die Wirkstoffabgabe und Tumortherapie effizient sind, sind neue, hocheffiziente Wirkstoffabgabesysteme immer noch sehr erwünscht.

In dieser Studie haben wir eine auf Mitochondrien ausgerichtete und NIR-getriggerte Nanoplattform für die Wirkstofffreisetzung basierend auf zweidimensionalem Titandisulfid (TiS₂ .) konstruiert ) Nanoblätter für die kontrollierte und gezielte Tumorchemotherapie. TiS₂ ist ein Mitglied der Übergangsmetall-Dichalkogenide, die eine große spezifische Fläche haben [27,28,29]. Nach dem Peeling durch proteingestützte Ultraschallbehandlung wird die Oberfläche von TiS₂ nanosheets ist durch andere funktionelle Moleküle über kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen modifizierbar. Darüber hinaus wurde das tumormitochondrienspezifische Molekül IR780 (IR-780-Iodid) ausgewählt, um das TiS₂ . zu modifizieren Nanoblätter. IR780 stattet die Nanoblätter mit der auf Mitochondrien zielenden Fähigkeit aus, die sowohl durch den durch organische Anionen transportierenden Polypeptid-vermittelten aktiven Transport als auch durch das lipophile Kation-Merkmal erfolgt [30, 31]. Es wurde berichtet, dass IR780 als lipophiles Kation aufgrund des hohen mitochondrialen Membranpotentials in Tumorzellen eine stärkere Akkumulation in den Mitochondrien von Tumorzellen zeigte als in normalen Zellen [32, 33]. Darüber hinaus ist IR780 auch ein auf nahes Infrarot reagierendes photothermisches Mittel. Die vorbereitete Nanoplattform, genannt IR780-TiS₂ , wurde als biokompatibel bestätigt und konnte das Krebsmedikament Resveratrol (RV) (IR780-TiS₂) effektiv laden /RV) [24]. Der IR780-TiS₂ /RV besaß eine auf Mitochondrien zielende Fähigkeit und einen photothermischen Effekt. NIR wurde als externer Stimulus angewendet, um die lokale Wirkstofffreisetzung bei NIR-Bestrahlung auszulösen. In-vitro- und in-vivo-Experimente zeigten, dass IR780-TiS₂ /RV hat eine hocheffiziente Chemotherapie-Wirkung. Weitere Untersuchungen des Mechanismus ergaben, dass der durch IR780-TiS₂ . induzierte Zelltod /RV erfolgte über den Mitochondrien-vermittelten intrinsischen Apoptoseweg. Dieses auf Mitochondrien ausgerichtete Wirkstoffabgabesystem (Schema 1) könnte ein potenzielles Chemotherapeutikum für zukünftige klinische Anwendungen sein.

Das Vorbereitungsschema von IR780-TiS₂ /RV, das als NIR-getriggertes Wirkstoffabgabesystem für die Tumorchemotherapie verwendet wurde, die durch den intrinsischen Apoptoseweg vermittelt wird

Materialien und Methoden

Materialien

Sigma-Aldrich lieferte das IR-780 Jodid (IR780), TiS₂ Pulver, Fluoresceinisothiocyanat (FITC) (St. Louis, MO, USA). Rinderserumalbumin (BSA 98,0 %) wurde von BioSharp Co., Ltd. (Korea) bezogen. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) wurde von Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) bezogen. Zellkulturreagenzien einschließlich DMEM-Medium und fötalem Rinderserum (FBS) wurden von Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) bereitgestellt. Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich (Shanghai, China) bezogen.

Synthese von IR780-TiS₂ /RV

Der erste Schritt war die Herstellung von wasserlöslichem TiS₂ Nanoblätter nach vorherigem Bericht [34]. Im Detail 5 mg Bulk TiS₂ wurde mit 5 ml Wasser gemischt und 20 Minuten gerührt. Der TiS₂ Wassersuspension wurde dann zu 5 mg BSA gegeben und unter Eisbad-Ultraschalldissoziation unter Verwendung einer 500 W und 20 kHz Spitzenbeschallung (Sonics, VCX130, USA) für 6 h verarbeitet. Danach wurde die vorbereitete Mischung bei 12.000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert, was zu TiS₂ . führte Nanoblätter im Überstand.

Zweitens TiS₂ Nanoblätter wurden mit IR780 konjugiert. Als säurebindendes Mittel wurde Triethylamin (TEA) verwendet. 5 Milligramm IR780 wurden in 2 ml DMSO gelöst und 8 Stunden bei 60 °C unter Zugabe von TEA gerührt. Die Mischungssuspension wurde 2 Tage in destilliertem Wasser dialysiert und dann 8 Minuten lang bei 9000 U/min zentrifugiert, um das aggregierte Produkt zu entfernen. Der Überstand wurde gesammelt, was zu IR780-TiS₂ . führte .

Zuletzt wurde das RV auf IR780-TiS₂ . geladen . IR780-TiS₂ (1 µg/ml) wurde mit RV (2 µg/ml, gelöst in DMSO) gemischt, das über Nacht bei Raumtemperatur leicht gerührt wurde. Danach wurden DMSO und freies RV durch Dialyse in destilliertem Wasser über Nacht eliminiert, um IR780-TiS₂ . zu ergeben /RV. Basierend auf der Literatur wurde das RV-Beladungsverhältnis von einem UV-Vis-Spektrophotometer (UV-2550, Shimadzu, Japan) erfasst und gemäß der folgenden Gleichung berechnet:

wo A _a (mg), A _b (mg) und A _c (mg) steht für das anfängliche, ungebundene RV und das IR780-TiS₂ , bzw.

Bruker TENSOR 27 Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR)-Spektrometer (Bruker Optics Ltd., Coventry, UK) wurde verwendet, um die chemische Struktur von TiS₂ . nachzuweisen , IR780-TiS₂ , und R780-TiS₂ /RV. Zur Bestimmung der spezifischen Oberfläche der Proben, berechnet aus N₂ ., wurde eine Brunauer-Emmett-Teller (BET)-Analyse durchgeführt Adsorptionsergebnis über einen Oberflächenanalysator (Quantachrome ChemBET-3000) basierend auf der BET-Gleichung.

Zelllinie und Zellkultur

Die Mäusekolonkrebszellen CT26 wurden von der Zellbank der Zellkultursammlung der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erhalten. Die Zellen wurden in komplettem DMEM-Medium (10% FBS + 90% DMEM) in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ . kultiviert bei 37 °C.

In-vitro-Lokalisierung von IR780-TiS₂ /RV

FITC wurde verwendet, um IR780-TiS₂ . zu kennzeichnen /RV oder TiS₂ /RV. Kurz gesagt, FITC wurde in Ethanollösung (2,0 mg/ml) gelöst und mit IR780-TiS₂ . gemischt /RV oder TiS₂ /RV wässrige Lösung (1,0 mg/ml) unter 4-stündigem Rühren in dunkler Umgebung bei Raumtemperatur. Die Mischung wurde über Nacht in destilliertem Wasser dialysiert, um das überflüssige FITC und Ethanol zu entfernen, was zu FITC-markiertem IR780-TiS₂ . führte /RV oder TiS₂ /RV-Lösung. Um die mitochondriale Co-Lokalisierung von Nanopartikeln in vitro zu bestätigen, wurden die Zellen mit FITC-markiertem IR780-TiS₂ . behandelt /RV oder TiS₂ /RV für 5 h und gefärbt mit Mitochondrien-spezifischem Farbstoff MitoTracker. Danach erfolgt die zelluläre Internalisierung von IR780-TiS₂ /RV oder TiS₂ /RV wurde unter Verwendung eines CLSM (Ix81-FV1000, Olympus, Co.) beobachtet. Kurz gesagt wurden CT26-Zellen mit FITC-markiertem TiS₂ . inkubiert /RV und IR780-TiS₂ /RV (mit derselben FITC-Konzentration) für 5 h. Anschließend wurden die Zellen mit MitoTracker Red FM-Lösungen (100 µm) bei 37 °C für 30 Minuten behandelt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit einem CLSM beobachtet. Die ImageJ-Software wurde verwendet, um die Fluoreszenzintensität von Zellen zu analysieren.

In-vitro-NIR-getriggerte Tumor-Chemotherapie- und Apoptose-Studie

4 × 10 ³ Zellen/Well CT26-Zellen in 96-Well-Kulturplatten wurden mit freiem RV, IR780-TiS₂ . behandelt , IR780-TiS₂ /RV und TiS₂ /RV mit unterschiedlichen RV-Konzentrationen für 5 h und wurden dann mit oder ohne NIR für 3 min bestrahlt (808 nm, 0.3 W/cm ² ). Nach einer weiteren 24-stündigen Inkubation wurde die Lebensfähigkeit der behandelten Zellen durch den CCK-8-Assay analysiert. Die behandelten Zellen wurden auch mit Rhodamine123 (Sigma) gefärbt und mit FCM (FC 500 MCL; Beckman Coulter, USA) analysiert. Der Zell-Apoptose-Nachweis wurde auch durch FCM-Analyse unter Verwendung des Annexin V-FITC/PI-Apoptose-Nachweiskits (Bender MedSystems, Wien, Österreich) wie zuvor beschrieben durchgeführt.

Western Blot

CT26-Zellen wurden mit PBS (Kontrolle), RV, TiS₂ . behandelt /RV, IR780-TiS₂ /RV und IR780-TiS₂ /RV + NIR (Äquivalent RV, 30µg/ml; Äquivalent IR780, 0,5µg/ml) für eine 5-stündige Inkubation. Nach einer weiteren 24-stündigen Inkubation wurden die Zellen jeweils im Western-Blot gesammelt, der auf dem zuvor berichteten Protokoll beruhte [23]. Kurz gesagt wurden die Zellen lysiert und durch eine Protease und Triton X-100 gehemmt. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde verwendet, um Proteine ​​zu gewinnen und zu trennen, die dann auf eine PVDF-Membran verschoben und unter Verwendung von 5% fettfreier Milch blockiert wurden. Anschließend wurden die verdünnten Primärantikörper bei 4 °C für 12 Stunden inkubiert, einschließlich Cytochrom c (1/1000, Boster, Wuhan, China), gespaltene Caspase-3 (1/1000, CST), gespaltene Caspase-9 (1/ 1000, CST) und Aktin (1/1000, Maus, Boster, Wuhan, China) und dann mit einem sekundären Antikörper inkubiert. Schließlich wurde das ECL-Reagenz verwendet, um die Proteine ​​​​nachzuweisen.

Tiermodell

Um das subkutane CT26-Tumormodell zu erstellen, 1 × 10 ⁷ CT26-Zellen (100 µl, in PBS) wurden subkutan in den Rücken von Balb/c-Nacktmäusen injiziert. Tumorvolumen = Länge × Breite ² /2. Alle Tierverfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt und vom Tierethikausschuss des Zhumadian-Zentralkrankenhauses (Henan, China) genehmigt.

In-vivo-Bioverteilung

Bioverteilung von IR780-TiS₂ /RV in den tumortragenden Nacktmäusen wurde 24 Stunden nach der intravenösen Schwanzinjektion mit IR780-TiS₂ . nachgewiesen /RV (150 µl, 6 µg/kg). Die Hauptorgane einschließlich Herz, Leber, Milz, Lunge, Niere und Tumor wurden gewogen und mit Königswasserlösung verdaut. Der Gehalt an Ti-Elementen in diesen Geweben wurde durch ICP-OES quantifiziert.

In-vivo-NIR-getriggerte Tumor-Chemotherapie

CT26-Tumor tragende Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in sechs Gruppen (n = 6), einschließlich Kochsalzlösung, Kochsalzlösung +NIR, RV, IR780-TiS₂ /RV, TiS₂ /RV und IR780-TiS₂ /RV + NIR (Äquivalent RV, 1 mg/kg; Äquivalent IR780, 0,5 mg/kg). Die NIR-Bestrahlungsbedingung beträgt 808 nm, 0,3 W/cm ² , und 3 min. Während 30 Tagen der Behandlung wurden alle 3 Tage das Tumorvolumen und das Gewicht der Mäuse aufgezeichnet. Nach der Behandlung wurden die Organe einschließlich Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere in verschiedenen Gruppen fixiert und durch H&E gefärbt.

Statistische Analyse

Die Ergebnisse wurden als mittlere ± ± Standardabweichung dargestellt. Schüler t Test wurde verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen zwei Gruppen zu untersuchen. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen und P < 0.01 wurde als sehr signifikant erachtet.

Ergebnisse und Diskussion

Vorbereitung und Charakterisierung von IR780-TiS₂ /RV

So bereiten Sie IR780-TiS₂ vor /RV, erstens biokompatibles TiS₂ Nanoblätter wurden durch ein Rinderserumalbumin (BSA) und eine ultraschallunterstützte Exfoliation-Methode hergestellt, wie zuvor berichtet [34, 35]. Als nächstes IR780-TiS₂ wurde in einer Substitutionsreaktion zwischen einem Chloratom von IR780 und Aminogruppen von BSA synthetisiert, die auf dem TiS₂ . absorbiert wurden Nanoblätter mit einem Säurebindemittel TEA. Endlich das IR780-TiS₂ nanoplatform lud das Krebsmedikament RV über physikalische Absorption ein. Das schematische Diagramm von IR780-TiS₂ /RV ist in Schema 1 gezeigt. Zusätzliche Datei 1:Abbildung S1 zeigt das TEM-Bild des proteinunterstützten exfolierten TiS₂ , die eine angezeigte Nanoblattstruktur war. Das XRD-Muster des TiS₂ Nanoblätter wurden ebenfalls nachgewiesen, was auf eine gute Kristallinität des hergestellten TiS₂ . hinweist Nanoblätter, im Einklang mit den Beobachtungen aus TEM (Zusätzliche Datei 1:Abbildung S2). Nach der Funktionalisierung wird das IR780-TiS₂ /RV-Nanokomposit hatte eine flockenartige Morphologie mit einem Gitterabstand von 0,25 nm, wie durch Transmissionselektronenmikroskopie gezeigt (Abb. 1a, b) und einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 123,6 nm und ein Zeta-Potential von – 37,2 mV, wie durch Nanosizer (Malvern Instrumente) (Abb. 1c, d). Nach einer 2-wöchigen Lagerung in Wasser, FBS oder Kochsalzlösung beträgt die durchschnittliche Größe von IR780-TiS₂ /RV blieb konstant bei ungefähr 123 nm (Abb. 1e), was auf die Stabilität von IR780-TiS₂ . hinweist /RV, möglicherweise aufgrund der Adhäsion von BSA auf der Oberfläche des TiS₂ Nanoblätter. Abbildung 1f zeigt die Absorptionsspektren von freiem IR780, freiem RV, TiS₂ Nanoblätter und IR780-TiS₂ /RV. Das Absorptionsspektrum von IR780-TiS₂ /RV zeigte die Peaks von freiem IR780 und freiem RV, was darauf hindeutet, dass sowohl IR780 als auch RV erfolgreich mit dem TiS₂ . konjugiert wurden Nanoblätter. Das RV-Belastungsverhältnis von IR780-TiS₂ betrug etwa 112 % (W /W ), die durch nicht-kovalente Wechselwirkungen erreicht wurde (z. B. π –π Stapelung und hydrophobe Wechselwirkungen). Darüber hinaus wurden gemäß dem BET-Ergebnis die Oberflächen mit 15,2 m ² . berechnet /g und 122,1 m ² /g für Bulk-TiS₂ und TiS₂ Nanoblätter bzw. Das abgeblätterte TiS₂ Nanoblätter weisen eine viel größere BET-Oberfläche auf als die des massiven TiS₂ , die eine große aktive Fläche für die Arzneimittelbeladung bereitstellen. Die Belastung war aufgrund der großen spezifischen Oberfläche und der BSA-Adhäsion an IR780-TiS₂ . sehr wahrscheinlich Nanoblätter [23]. Um weiter zu bestätigen, wurden RV und IR780 in TiS₂ . geladen Nanoblätter, die FTIR-Spektren von TiS₂ Nanoblätter, IR780-TiS₂ , und IR780-TiS₂ /RV gemessen. In zusätzlicher Datei 1:Abbildung S6 alle charakteristischen Peaks von TiS₂ Nanoblätter erschienen in FTIR-Spektren von IR780-TiS₂ /RV. Außerdem traten drei neue Peaks auf (~ 3191 cm ⁻¹ , ~ 1510 cm ⁻¹ , 1230 cm ⁻¹ ) im Spektrum von IR780-TiS₂ /RV, was auf die Existenz von RV und IR780 hinweist [36, 37].

a Das TEM-Bild von IR780-TiS₂ /RV. b Das hochauflösende TEM-Bild von IR780-TiS₂ /RV. c Die Größenverteilung und d Zeta-Potentialverteilung von IR780-TiS₂ /RV. e Die hydrodynamische Partikelgrößenänderung von IR780-TiS₂ /RV in Wasser, FBS und Kochsalzlösung über 2 Wochen. f Die Absorptionsspektren von RV, IR780, TiS₂ Nanoblätter und IR780-TiS₂ /RV

Nach einer 3-minütigen NIR-Bestrahlung mit geringer Leistung (808 nm, 0,3 W/cm ² ), das IR780-TiS₂ /RV-Lösungstemperatur stieg proportional zur Konzentration von IR780-TiS₂ /RV (0, 5, 10 μg/ml) und die 10 μg/ml IR780-TiS₂ /RV-Lösung erreichte die höchste Temperatur von 47,6 °C (Abb. 2a). Zusätzlich IR780-TiS₂ /RV hatte seinen anfänglichen photothermischen Effekt selbst nach fünf Zyklen NIR-Bestrahlung beibehalten, während freies IR780 einen verringerten photothermischen Effekt zeigte (Abb. 2b). Diese Ergebnisse weisen auf den IR780-TiS₂ . hin /RV-Nanokomposit hat eine hervorragende Photostabilität.

a Der photothermische Effekt von IR780-TiS₂ /RV unter der NIR-Bestrahlung (808 nm, 0,3 W/cm ² ) für 3 Minuten. b Temperaturänderung von IR780 und R780-TiS₂ /RV nach fünf Zyklen NIR-Bestrahlung (808 nm, 0,3 W/cm ² , 3 Minuten). c Das Schema der photothermisch ausgelösten RV-Freisetzung. d Freisetzungskinetik von RV aus IR780-TiS₂ /RV in PBS-Puffer (pH = 7.4 und 6.5) mit oder ohne NIR-Bestrahlung (808 nm, 0.3 W/cm ² ). **P < 0,01, verglichen mit pH = 7.4 und pH = 6.5 Gruppe

Als nächstes wurde das RV-Freisetzungsverhältnis unter verschiedenen pH- und NIR-Bestrahlungsbedingungen gemessen (Abb. 2c, d). Nach 24 h betrug das RV-Freisetzungsverhältnis 8,56% unter physiologischen Bedingungen (pH 7,4), wurde jedoch bei pH 6,5 signifikant auf 16,2% erhöht, was darauf hindeutet, dass es durch schwach saure Bedingungen erhöht werden kann. Darüber hinaus wurde das RV-Freisetzungsverhältnis bei einem pH-Wert von  6,5 und einer 3-minütigen NIR-Bestrahlung (808 nm, 0,3 W/cm ² .) erneut signifikant auf 44,8% erhöht ). Diese Ergebnisse zeigen, dass die NIR-Bestrahlung ein steuerbarer externer Stimulus sein kann, um die Freisetzung von RV aus IR780-TiS₂ . auszulösen /RV. Dieser Effekt ist wahrscheinlich auf die von IR780-TiS₂ . erzeugte Hitze zurückzuführen unter NIR-Bestrahlung Schwächung der nicht-kovalenten Adsorptionswechselwirkungen zwischen RV und dem IR780-TiS₂ Oberfläche [35]. Darüber hinaus könnte das H+ in einer sauren Umgebung die Oberflächenladung von TiS₂ . ändern die das hydrophile/hydrophobe Gleichgewicht der Nanopartikel verändern [38, 39].

In-vitro-Lokalisierung von IR780-TiS₂ /RV

Um die Zellaufnahme und die intrazelluläre Verteilung von IR780-TiS2/RV zu untersuchen, wurde das IR780-TiS₂ /RV-Nanopartikel wurden mit FITC markiert und ein CLSM wurde verwendet, um die intrazelluläre Fluoreszenz sichtbar zu machen. Nach einer 5-stündigen Inkubation wird TiS₂ /RV und IR780-TiS₂ /RV zeigte eine ähnliche Fluoreszenzintensität im Zytoplasma (Abb. 3a, b), was darauf hindeutet, dass beide Nanokomposite wahrscheinlich über Endozytose in Zellen eindringen können. Der IR780-TiS₂ /RV-Nanokomposit zeigte eine größere Intensität der gelben und grünen Fluoreszenz, wenn das FITC-Signal mit der MitoTracker-Markierung zusammengeführt wurde (Abb. 3a, c). Diese Ergebnisse zeigen, dass IR780-TiS₂ /RV kann Mitochondrien mit hoher Effizienz angreifen. Darüber hinaus ist die Verteilung von IR780-TiS₂ /RV im Zytoplasma wurde mit TEM weiter bestätigt, das in einigen Mitochondrien zurückgehaltene Nanopartikel zeigte (Abb. 3d). Zusammengenommen bestätigen diese Ergebnisse eindeutig, dass IR780-TiS₂ /RV erreicht ein gutes mitochondriales Targeting, das die mitochondriale Wirkstoffakkumulation weiter fördert und eine sofortige Zelltoxizität verursacht. Das Mitochondrien-Targeting wurde wahrscheinlich sowohl durch den organischen Anionen-transportierenden Polypeptid-vermittelten aktiven Transport als auch durch das lipophile Kation-Merkmal vermittelt, was dazu führte, dass sich die Nanopartikel in den Mitochondrien von Tumorzellen stark anreicherten [30,31,32,33].

a Die Fluoreszenzbilder von CT26-Zellen, die mit FITC-markiertem TiS₂ . inkubiert wurden /RV oder IR780-TiS₂ /RV für 5 h. Grüne Fluoreszenz ist das FITC-Signal und rote Fluoreszenz ist das MitoTracker-Signal. b Die entsprechende Analyse der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) von FITC-markiertem TiS₂ /RV oder IR780-TiS₂ /RV in Zellen in Abb. 3a. c Der entsprechende Kolokalisationskoeffizient von FITC-markiertem TiS₂ /RV oder IR780-TiS₂ /RV und Mitochondrien in Zellen in Abb. 3a. M bedeutet Mitochondrien. **P < 0.01, verglichen mit TiS₂ /RV-Gruppe allein

In-vitro-NIR-getriggerte Tumor-Chemotherapie

Zunächst wurde der photothermische Effekt in vitro bewertet. Nach einer 5-stündigen Inkubation wird IR780-TiS₂ /RV zeigte einen Temperaturanstieg von ca. 17 °C, während TiS₂ /RV zeigte einen Temperaturanstieg von etwa 10 °C an (Abb. 4a). Der photothermische Effekt wurde IR780 und TiS₂ . zugeschrieben Nanoblätter. Nachweis der Biokompatibilität als Nanoplattform für die Wirkstoffbeladung, IR780-TiS₂ zeigten unterhalb der Konzentration von 300 µg/ml keine ausgeprägte Zytotoxizität (Abb. 4b). Darüber hinaus hatte RV mit oder ohne NIR-Bestrahlung einen ähnlichen konzentrationsabhängigen zelltötenden Effekt (Abb. 4c). Bei gleicher RV-Konzentration erzielte RV die beste zelltötende Wirkung, wenn es mit IR780-TiS₂ . beladen wurde und bestrahlt durch NIR im Vergleich zu allen anderen Bedingungen, d. h. freies RV, freies IR780-TiS₂ , und RV geladen von TiS₂ (Abb. 4d). Interessanterweise ist das unbelastete IR780-TiS₂ Plattform zeigte keine bemerkenswerte Anti-Krebs-Wirkung, wenn sie einer NIR-Bestrahlung ausgesetzt wurde, verglichen mit der ohne NIR-Bestrahlung (Abb. 4d), was darauf hindeutet, dass die von IR780-TiS₂ . erzeugte Wärme nach der NIR-Bestrahlung wurde der Stimulus hauptsächlich verwendet, um die Wirkstofffreisetzung auszulösen, die dann die Zellen tötete. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass IR780-TiS₂ /RV kann RV in den Mitochondrien freisetzen, wenn es durch NIR-Bestrahlung ausgelöst wird, und somit die lokale Konzentration von RV in den Mitochondrien bemerkenswert erhöhen und eine stärkere tumorhemmende Wirkung erzielen.

a Die Temperaturänderungskurven von PBS (Kontrolle), TiS₂ /RV oder IR780-TiS₂ /RV-behandelte Zellen unter einer 3-minütigen NIR-Bestrahlung (808 nm, 0,3 W/cm ² ). b In-vitro-Zytotoxizität gegen CT26-Zellen, die mit verschiedenen Konzentrationen von IR780-TiS₂ . behandelt wurden . c Zelllebensfähigkeit von Zellen, die mit RV mit oder ohne NIR-Bestrahlung behandelt wurden (808 nm, 0,3 W/cm ² ) für 3 min. d Zelllebensfähigkeit von Zellen, die mit IR780-TiS₂ . behandelt wurden , RV, TiS₂ /RV oder IR780-TiS₂ /RV mit oder ohne NIR-Bestrahlung (808 nm, 0,3 W/cm ² ) für 3 min. **P < 0.01, verglichen mit IR780-TiS₂ /RV ohne NIR-Gruppe allein

Der Zelltodmechanismus

Zur Veranschaulichung des zugrunde liegenden Mechanismus der NIR-getriggerten Chemotherapie von IR780-TiS₂ /RV analysierten wir den Zelltodtyp, das mitochondriale Membranpotential (Ψm) und das Expressionsniveau von Schlüsselproteinen, die mit der Apoptose in Verbindung stehen. Zunächst wurde FCM verwendet, um den Zelltodtyp unter Verwendung der Annexin-V-FITC/PI-Färbung nachzuweisen (Abb. 5a). Bei gleicher RV-Konzentration freies RV, TiS₂ /RV, IR780-TiS₂ /RV und IR780-TiS₂ /RV + NIR könnten alle Apoptose induzieren, hauptsächlich aufgrund des Vorhandenseins von RV. Tatsächlich wurde berichtet, dass RV die Fähigkeit besitzt, Apoptose zu induzieren. Von diesen Behandlungen IR780-TiS₂ /RV + NIR zeigte mit 90,8 % die höchste Apoptoserate. Als nächstes wurden Apoptose-Signalwege untersucht. Als Schlüsselereignis im mitochondrialen (intrinsischen) apoptotischen Signalweg wurde eine Abnahme von Ψm beschrieben [40]. Bei gleicher RV-Konzentration IR780-TiS₂ /RV + NIR verringerte Ψm um etwa 85%, was signifikanter war als eine durch IR780-TiS₂ . induzierte Abnahme von Ψm , TiS₂ /RV mit oder ohne NIR und freier RV (Abb. 5b). Dieses Experiment zeigt, dass IR780-TiS₂ /RV + NIR induzierten Zelltod, der über den mitochondrialen (intrinsischen) apoptotischen Weg vermittelt wurde [41]. Als nächstes wurde die Expression von Proteinen, die für die Apoptose kritisch sind, insbesondere Cytochrom c (Cyto c), Caspase 9 und Caspase 3, über einen Western-Blot-Assay nachgewiesen. Die mit IR780-TiS₂ . behandelten Zellen /RV + NIR exprimierte mehr zytosolisches Zyto-c als diejenigen, die mit RV, IR780-TiS₂ . behandelt wurden /RV oder IR780-TiS₂ /RV (Abb. 5c). Die Translokation von Cyto c ist der wichtigste Initiator der Caspase-Kaskade [42,43,44]. Folglich war die Expression der gespaltenen Caspase 9 und der gespaltenen Caspase 3 im IR780-TiS₂ . deutlich erhöht /RV + NIR-behandelte Zellen. Zusammengenommen legen diese Daten eindeutig nahe, dass die Apoptose durch den mitochondrialen (intrinsischen) Weg vermittelt wurde.

a Zellapoptose von CT26-Zellen behandelt mit PBS (Kontrolle), RV, TiS₂ /RV, IR780-TiS₂ /RV und IR780-TiS₂ /RV + NIR von FCM. b Die Veränderung des mitochondrialen Membranpotentials von CT26-Zellen, die mit PBS (Kontrolle), RV, TiS₂ . behandelt wurden /RV, IR780-TiS₂ /RV und IR780-TiS₂ /RV mit oder ohne NIR-Bestrahlung durch FCM. c Expression von Apoptose-assoziierten Proteinen in CT26-Zellen, die mit PBS (Kontrolle), RV, TiS₂ . behandelt wurden /RV, IR780-TiS₂ /RV und IR780-TiS₂ /RV + NIR. Cytochrom c, gespaltene Caspase-3 und gespaltene Caspase-9 wurden durch Western-Blot getestet. **P < 0.01, verglichen mit IR780-TiS₂ /RV, TiS₂ /RV + NIR und IR780-TiS₂ Gruppen

In Vivo NIR-getriggerte Tumor-Chemotherapie

Um die Wirksamkeit der NIR-getriggerten Chemotherapie in vivo zu bewerten, wurden CT26-Tumor-tragende Mäuse mit Kochsalzlösung, Kochsalzlösung + NIR, RV, IR780-TiS₂ . behandelt /RV, TiS₂ /RV + NIR und IR780-TiS₂ /RV + NIR. Die Tumorgröße im IR780-TiS₂ Die /RV + NIR-Gruppe nahm signifikant ab, und der Tumor verschwand nach 30  Tagen Behandlung fast, während in den verbleibenden Gruppen das Tumorvolumen einen steigenden Trend aufwies (Abb. 6a). Während der Behandlung gab es keinen signifikanten Unterschied im Körpergewicht zwischen den Gruppen (Abb. 6b). Schließlich zeigte die H&E-Bildgebung in allen getesteten Gruppen keine merkliche Gewebetoxizität oder -anomalie (Abb. 6c). Diese Ergebnisse zeigen, dass das IR780-TiS₂ /RV-Nanokomposit hat eine hervorragende NIR-getriggerte Anti-Tumor-Wirksamkeit und eine geringe systemische Toxizität. Darüber hinaus ist die Bioverteilung des IR780-TiS₂ /RV wurde in vivo ausgewertet. Wie in Zusatzdatei 1:Abbildung S4 gezeigt, wurden die Nanopartikel hauptsächlich in das Lebersystem aufgenommen und möglicherweise vom System metabolisiert [45].

a Das Wachstumsprofil von CT26-xenotransplantierten Tumoren nach intravenöser Injektion von Kochsalzlösung (Kontrolle), RV, TiS₂ /RV und IR780-TiS₂ /RV mit oder ohne 3-minütiger NIR-Bestrahlung (808 nm, 0,3 W/cm ² ). b Körpergewicht tumortragender Mäuse nach verschiedenen Behandlungen. c H&E-Bilder der wichtigsten Organe aller behandelten Mäuse nach 30 Tagen Behandlung. **P < 0,01, verglichen mit Kochsalzlösung, Kochsalzlösung + NIR, RV, TiS₂ /RV + NIR und IR780-TiS₂ /RV-Gruppen

Schlussfolgerung

Zusammenfassend haben wir eine auf Mitochondrien ausgerichtete und RV-beladene Nanoplattform basierend auf TiS₂ . entwickelt nanosheets for a NIR-triggered drug release and enhanced tumor chemotherapy. The as-prepared IR780-TiS₂ /RV with flake-like morphology showed good stability and biocompatibility. Owing to the mitochondria-targeted ability of IR780, IR780-TiS₂ /RV could selectively accumulate in tumor cell mitochondria and where it could release RV when triggered by the NIR irradiation. The released RV facilitated the mitochondrial membrane potential decrease, cyto c release, and, subsequently, initiated a cascade of caspase reactions to promote tumor cell apoptosis through the mitochondrial signaling pathway. In vitro and in vivo results demonstrated that IR780-TiS₂ /RV exhibited an efficacious NIR-triggered tumor chemotherapy without a significant tissue toxicity. These results suggest that IR780-TiS₂ /RV could be a promising chemotherapeutic agent in clinical practice.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

The conclusions made in this manuscript are based on the data which are all presented and shown in this paper.

Abkürzungen

IR780:

IR-780 iodide

BET:

Brunauer-Emmett-Teller

BSA:

Rinderserumalbumin

BSA:

Rinderserumalbumin

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

CLSM:

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

cyto c:

Cytochrome c

DMEM:

Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium

DMSO:

Dimethylsulfoxide

FBS:

Fötales Rinderserum

FCM:

Flow cytometry

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

FTIR:

Fourier Transform Infrared Spectroscopy

NIR:

Near-infrared

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

RV:

Resveratrol

TEA:

Triethylamin

TiS₂ :

Titanium disulfide