Mitochondrien-zielgerichtete TiS₂-Nanosheets liefern Resveratrol für photothermisch ausgelöste Tumorchemotherapie

Zusammenfassung

Eine subzelluläre Organell-zielgerichtete Abgabe von Antikrebsmedikamenten ist eine vielversprechende Strategie, um die antikrebswirksamen Effekte zu maximieren und Nebenwirkungen zu minimieren. Hier haben wir eine mitochondrien-zielgerichtete Arzneimittelabgabe-Nanoplattform basierend auf IR780-Iodid (IR780) und Titandisulfid (TiS₂)-Nanosheets hergestellt. Aufgrund der großen spezifischen Oberfläche der TiS₂-Nanosheets konnte die Nanoplattform das Antikrebsmedikament Resveratrol (RV) hochbeladen. Das hergestellte Nanokomposit (IR780-TiS₂/RV) wurde für eine wirksame photothermisch ausgelöste Tumorchemotherapie verwendet. IR780-TiS₂/RV zeigte zufriedenstellende Stabilität und Biokompatibilität, und das Beladungsverhältnis von RV und IR780 betrug etwa 112 % bzw. 56 %. Bei Bestrahlung mit nahinfrarotem (NIR) Licht konnte die von IR780-TiS₂/RV erzeugte Wärme die RV-Freisetzung auslösen. Aufgrund der Konjugation mit dem mitochondrien-spezifischen IR780 konnte IR780-TiS₂/RV in Mitochondrien zielgerichtet anreichern und RV bei NIR-Auslösung freisetzen, um das mitochondriale Membranpotenzial zu verringern, die Hochregulation wichtiger intrinsischer apoptotischer Faktoren wie Cytochrom c rasch zu induzieren und die Caspase-Kaskade zu initiieren, wodurch der chemotherapeutische Effekt erreicht wird. Das IR780-TiS₂/RV-Nanokomposit zeigte eine hohe Antitumorwirksamkeit in vitro und in vivo sowie keine nennenswerte Gewebetoxizität. Wir glauben, dass unsere Studie demonstriert, dass die NIR-ausgelöste IR780-TiS₂/RV-Nanoplattform ein vielversprechender chemotherapeutischer Wirkstoff in der klinischen Praxis sein könnte.

Einleitung

Krebs bleibt eine lebensbedrohliche Krankheit und verursacht weltweit hohe Sterberaten. Chirurgie, Chemotherapie, Strahlentherapie und Hormontherapie sind immer noch die Haupttherapiemethoden in der klinischen Praxis. Von diesen Methoden ist die Chemotherapie eine von Klinikern und Patienten gleichermaßen weit akzeptierte Behandlungsoption aufgrund ihrer relativ hohen Wirksamkeit. Chemotherapie ist mit einigen ernsthaften Problemen verbunden, zum Beispiel Medikamentenresistenz, Tumorrezidiv und Unpezifität. Daher ist die Entwicklung neuer chemotherapeutischer Wirkstoffe und Strategien zur Überwindung dieser Hindernisse von großer Dringlichkeit. In den letzten Jahren ist das Beladen eines Antikrebsmedikaments auf einem funktionalisierten Träger, der gleichzeitig eine zielgerichtete Abgabe und kontrollierte Freisetzung des Medikaments erreichen kann, zu einem beliebten Ansatz geworden, um den therapeutischen Effekt zu maximieren und Nebenwirkungen zu verringern. Eine große spezifische Oberfläche, die ein besseres Beladungsverhältnis bieten kann, ist für einen hervorragenden Arzneimittelträger essentiell.

Zusätzlich wird der Träger zur Verbesserung der Spezifität des Medikaments üblicherweise mit einem zielgerichteten Molekül modifiziert, wie z. B. Folsäure und Glutathion, die Zelloberflächenrezeptoren ansprechen. Da viele chemotherapeutische Medikamente auf bestimmte subzelluläre Organellen wirken, könnte die Entwicklung eines organellspezifischen Abgabesystems den therapeutischen Effekt bemerkenswert steigern und Nebenwirkungen reduzieren. Folglich ist die Auswahl des Zielorts innerhalb der Tumorzellen für das Arzneimittelabgabesystem entscheidend. Mitochondrien sind nicht nur die „Energiefabriken“ der Zellen, sondern auch ein wichtiges Ziel chemotherapeutischer Medikamente, die die Mitochondrien ansprechen, um den intrinsischen apoptotischen Weg einzuleiten. Daher könnte die Entwicklung eines mitochondrien-zielgerichteten Antikrebs-Arzneimittelabgabesystems für eine effektivere Krebschemotherapie entscheidend sein. Bisher wurden verschiedene Arten von Arzneimittelabgabesystemen entwickelt, wie mesoporöses Siliziumdioxid, kohlenstoffbasierte Materialien und Proteine. Obwohl diese Träger als effizient für Arzneimittelabgabe und TumorthERAPIE berichtet wurden, werden immer noch mehr neue hocheffiziente Arzneimittelabgabesysteme dringend gewünscht.

In dieser Studie konstruierten wir eine mitochondrien-zielgerichtete und NIR-ausgelöste Arzneimittelabgabe-Nanoplattform basierend auf zweidimensionalem Titandisulfid (TiS₂)-Nanosheets für kontrollierte und zielgerichtete Tumorchemotherapie. TiS₂ ist ein Mitglied der Übergangsmetall-Dichalkogenide, die eine große spezifische Oberfläche haben. Nach Exfoliation durch protein-unterstützte Ultraschallbehandlung ist die Oberfläche der TiS₂-Nanosheets durch kovalente oder nicht-kovalente Wechselwirkungen mit anderen funktionalen Molekülen modifizierbar. Zusätzlich wurde das tumormitochondrien-spezifische Molekül IR780 (IR-780-Iodid) ausgewählt, um die TiS₂-Nanosheets zu modifizieren. IR780 verleiht den Nanosheets die Mitochondrien-Zielgerichtetheit, was sowohl durch den organischen-Anion-transportierenden Polypeptid-vermittelten aktiven Transport als auch durch das lipophile Kationenmerkmal geschieht. Es wurde berichtet, dass IR780 als lipophiles Kation mehr Anreicherung in den Mitochondrien von Tumorzellen zeigt aufgrund der hohen Größe des mitochondrialen Membranpotenzials in Tumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen. Zusätzlich ist IR780 auch ein nahinfrarot-responsiver photothermischer Wirkstoff. Die hergestellte Nanoplattform, bezeichnet als IR780-TiS₂, wurde als biokompatibel bestätigt und konnte das Antikrebsmedikament Resveratrol (RV) effektiv beladen (IR780-TiS₂/RV). IR780-TiS₂/RV besaß eine Mitochondrien-Zielgerichtetheit und einen photothermischen Effekt. NIR wurde als externer Reiz angewendet, um die lokale Arzneimittelfreisetzung bei NIR-Bestrahlung auszulösen. In-vitro- und In-vivo-Experimente zeigten, dass IR780-TiS₂/RV eine hocheffiziente Chemotherapie-Wirkung hat. Weitere mechanistische Studien enthüllten, dass der durch IR780-TiS₂/RV induzierte Zelltod über den mitochondrial-vermittelten intrinsischen Apoptoseweg erfolgte. Dieses mitochondrien-zielgerichtete Arzneimittelabgabesystem (Schema 1) könnte ein potenzieller chemotherapeutischer Wirkstoff in zukünftiger klinischer Anwendung sein.

Materialien und Methoden

Materialien

Sigma-Aldrich lieferte IR-780-Iodid (IR780), TiS₂-Pulver, Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) (St. Louis, MO, USA). Rinder-Serumalbumin (BSA ≥ 98,0 %) wurde von BioSharp Co., Ltd. (Korea) bezogen. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) wurde von Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd. (Kumamoto, Japan) beschafft. Zellkultur-Reagenzien einschließlich DMEM-Medium und fötalem Rinderserum (FBS) wurden von Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) bereitgestellt. Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich (Shanghai, China) bezogen.

Synthese von IR780-TiS₂/RV

Der erste Schritt war die Herstellung wasserlöslicher TiS₂-Nanosheets gemäß vorherigem Bericht. Im Detail wurden 5 mg massives TiS₂ mit 5 ml Wasser gemischt und 20 min gerührt. Die TiS₂-Wasser-Suspension wurde dann in 5 mg BSA gegeben und unter Eisbad-Ultraschall-Dissociation mit einem 500 W und 20 kHz Tauchsonikator (Sonics, VCX130, USA) für 6 h verarbeitet. Anschließend wurde das hergestellte Gemisch bei 12.000 U/min für 10 min zentrifugiert, was zu TiS₂-Nanosheets im Überstand führte.

Zweitens wurden TiS₂-Nanosheets mit IR780 konjugiert. Triethylamin (TEA) wurde als Säurebindemittel angewendet. Fünf Milligramm IR780 wurden in 2 ml DMSO gelöst und bei 60 °C für 8 h mit Zugabe von TEA gerührt. Die Mischungssuspension wurde 2 Tage in destilliertem Wasser dialysiert und dann bei 9000 U/min für 8 min zentrifugiert, um das aggregierte Produkt zu entfernen. Der Überstand wurde gesammelt, was zu IR780-TiS₂ führte.

Zuletzt wurde RV auf IR780-TiS₂ beladen. IR780-TiS₂ (1 mg/ml) wurde mit RV (2 mg/ml, in DMSO gelöst) gemischt, was über Nacht bei Raumtemperatur leicht gerührt wurde. Anschließend wurden DMSO und freies RV durch Dialyse in destilliertem Wasser über Nacht eliminiert, um IR780-TiS₂/RV zu erhalten. Basierend auf Literatur wurde das RV-Beladungsverhältnis durch einen UV-Vis-Spektrophotometer (UV-2550, Shimadzu, Japan) detektiert und gemäß folgender Gleichung berechnet:

$$ \mathrm{RV}\ \mathrm{loading}\ \mathrm{ratio}\ \left(\%\right)=\frac{A_a-{A}_b}{A_c}\times 100\% $$

wobei A_a (mg), A_b (mg) und A_c (mg) das initiale, ungebundene RV und das IR780-TiS₂ darstellen.

Ein Bruker TENSOR 27 Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) Spektrometer (Bruker Optics Ltd., Coventry, UK) wurde verwendet, um die chemische Struktur von TiS₂, IR780-TiS₂ und IR780-TiS₂/RV zu detektieren. Eine Brunauer-Emmett-Teller (BET) Analyse wurde durchgeführt, um die spezifische Oberfläche der Proben zu bestimmen, berechnet aus N₂-Adsorptionsergebnissen über einen Oberflächenanalysegerät (Quantachrome ChemBET-3000) basierend auf der BET-Gleichung.

Zelllinie und Zellkultur

Mauskolonkrebszellen CT26 wurden von der Chinesischen Akademie der Wissenschaften Zellbank für Typkultursammlung (Shanghai, China) erhalten. Die Zellen wurden in vollständigen DMEM-Medien (10 % FBS + 90 % DMEM) in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 °C kultiviert.

In-vitro-Lokalisierung von IR780-TiS₂/RV

FITC wurde verwendet, um IR780-TiS₂/RV oder TiS₂/RV zu markieren. Kurz gesagt, FITC wurde in Ethanol-Lösung (2,0 mg/ml) gelöst und mit IR780-TiS₂/RV oder TiS₂/RV wässriger Lösung (1,0 mg/ml) unter 4-stündigem Rühren in dunkler Umgebung bei Raumtemperatur gemischt. Das Gemisch wurde über Nacht in destilliertem Wasser dialysiert, um überschüssiges FITC und Ethanol zu entfernen, was zu FITC-markiertem IR780-TiS₂/RV oder TiS₂/RV-Lösung führte. Um die mitochondriale Ko-Lokalisation von Nanopartikeln in vitro zu bestätigen, wurden Zellen, die mit FITC-markiertem IR780-TiS₂/RV oder TiS₂/RV für 5 h behandelt und mit mitochondrien-spezifischem Farbstoff MitoTracker gefärbt wurden, verwendet. Anschließend wurde die zelluläre Internalisierung von IR780-TiS₂/RV oder TiS₂/RV mit einem CLSM (Ix81-FV1000, Olympus, Co.) beobachtet. Kurz gesagt, CT26-Zellen wurden mit FITC-markiertem TiS₂/RV und IR780-TiS₂/RV (mit gleicher FITC-Konzentration) für 5 h inkubiert. Dann wurden die Zellen mit MitoTracker Red FM Lösungen (100 nM) bei 37 °C für 30 min behandelt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit einem CLSM beobachtet. Die ImageJ-Software wurde verwendet, um die Fluoreszenzintensität der Zellen zu analysieren.

In-vitro-NIR-ausgelöste Tumorchemotherapie und Apoptosestudie

4 × 10³ Zellen/Well CT26-Zellen in 96-Well-Kulturplatten wurden mit freiem RV, IR780-TiS₂, IR780-TiS₂/RV und TiS₂/RV mit unterschiedlichen RV-Konzentrationen für 5 h behandelt und dann mit oder ohne NIR für 3 min (808 nm, 0,3 W/cm²) bestrahlt. Nach weiterer 24-stündiger Inkubation wurde die Vitalität der behandelten Zellen durch CCK-8-Assay analysiert. Die behandelten Zellen wurden auch mit Rhodamin123 (Sigma) gefärbt und durch FCM (FC 500 MCL; Beckman Coulter, USA) analysiert. Zellapoptose-Detektion wurde auch durch FCM-Analyse mit Annexin V-FITC/PI Apoptose-Detektionskit (Bender MedSystems, Wien, Österreich) wie zuvor beschrieben durchgeführt.

Western Blot

CT26-Zellen wurden mit PBS (Kontrolle), RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV und IR780-TiS₂/RV + NIR (äquivalentes RV, 30 µg/ml; äquivalentes IR780, 0,5 µg/ml) für 5-stündige Inkubation behandelt. Nach weiterer 24-stündiger Inkubation wurden die Zellen jeweils für Western Blot gesammelt, basierend auf dem zuvor berichteten Protokoll. Kurz gesagt, die Zellen wurden lysiert und durch Protease und Triton X-100 inhibiert. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde verwendet, um Proteine zu gewinnen und zu trennen, die dann auf eine PVDF-Membran übertragen und mit 5 % fettfreier Milch blockiert wurden. Anschließend wurden die verdünnten Primärantikörper bei 4 °C für 12 h inkubiert, einschließlich Cytochrom c (1/1000, Boster, Wuhan, China), gespaltenes Caspase-3 (1/1000, CST), gespaltenes Caspase-9 (1/1000, CST) und Actin (1/1000, Maus, Boster, Wuhan, China) und dann mit einem Sekundärantikörper inkubiert. Schließlich wurde ECL-Reagenz verwendet, um die Proteine zu detektieren.

Tiermodell

Um ein CT26-subkutanes Tumormodell zu etablieren, wurden 1 × 10⁷ CT26-Zellen (100 µl, in PBS) subkutan in den Rücken von Balb/c-Nacktmäusen injiziert. Tumorvolumen = Länge × Breite²/2. Alle Tierverfahren wurden gemäß den Richtlinien für Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt und vom Tierschutzkomitee des Zhumadian-Zentralkrankenhauses (Henan, China) genehmigt.

In-vivo-Biodistribution

Die Biodistribution von IR780-TiS₂/RV in den tumorbeladenen Nacktmäusen wurde 24 h nach intravenöser Schwanzinjektion mit IR780-TiS₂/RV (150 µl, 6 mg/kg) detektiert. Die Hauptorgane einschließlich Herz, Leber, Milz, Lunge, Niere und Tumor wurden gewogen und mit Königswasserlösung verdaut. Der Ti-Elementgehalt in diesen Geweben wurde durch ICP-OES quantifiziert.

In-vivo-NIR-ausgelöste Tumorchemotherapie

CT26-tumorbeladene Mäuse wurden zufällig in sechs Gruppen (n = 6) aufgeteilt, einschließlich Kochsalzlösung, Kochsalzlösung + NIR, RV, IR780-TiS₂/RV, TiS₂/RV und IR780-TiS₂/RV + NIR (äquivalentes RV, 1 mg/kg; äquivalentes IR780, 0,5 mg/kg). Die NIR-Bestrahlungsbedingung ist 808 nm, 0,3 W/cm², und 3 min. Während 30 Tagen Behandlung wurden Tumorvolumen und Mäusegewichte alle 3 Tage aufgezeichnet. Nach der Behandlung wurden die Organe einschließlich Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere in den verschiedenen Gruppen fixiert und mit H&E gefärbt.

Statistische Analyse

Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Der Student'sche t-Test wurde verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen zwei Gruppen zu untersuchen. P < 0,05 wurde als signifikant und P < 0,01 als sehr signifikant angesehen.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung und Charakterisierung von IR780-TiS₂/RV

Zur Herstellung von IR780-TiS₂/RV wurden zunächst biokompatible TiS₂-Nanosheets durch eine Rinder-Serumalbumin (BSA) und ultraschallunterstützte Exfoliationsmethode wie zuvor berichtet hergestellt. Als Nächstes wurde IR780-TiS₂ in einer Substitutionsreaktion zwischen einem Chloratom von IR780 und Aminogruppen von BSA, absorbiert auf den TiS₂-Nanosheets, unter Verwendung eines Säurebindemittels TEA synthetisiert. Schließlich lud die IR780-TiS₂-Nanoplattform das Antikrebsmedikament RV über physikalische Adsorption. Das schematische Diagramm von IR780-TiS₂/RV ist in Schema 1 gezeigt. Zusatzdatei 1: Abbildung S1 zeigt das TEM-Bild der protein-unterstützten exfolierten TiS₂, das eine Nanosheet-Struktur anzeigte. Das XRD-Muster der TiS₂-Nanosheets wurde ebenfalls detektiert, was eine gute Kristallinität der hergestellten TiS₂-Nanosheets anzeigte, konsistent mit den Beobachtungen aus TEM (Zusatzdatei 1: Abbildung S2). Nach der Funktionalisierung hatte das IR780-TiS₂/RV-Nanokomposit eine flockenartige Morphologie mit einem Gitterabstand von 0,25 nm, wie durch Transmissionelektronenmikroskopie (Abb. 1a, b) gezeigt, und einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 123,6 nm und ein Zeta-Potenzial von -37,2 mV, wie durch Nanosizer (Malvern Instruments) detektiert (Abb. 1c, d). Nach 2-wöchiger Lagerung in Wasser, FBS oder Kochsalzlösung blieb die durchschnittliche Größe von IR780-TiS₂/RV konstant bei etwa 123 nm (Abb. 1e), was die Stabilität von IR780-TiS₂/RV anzeigt, möglicherweise aufgrund der Adhäsion von BSA an der Oberfläche der TiS₂-Nanosheets. Abbildung 1f zeigt die Absorptionsspektren von freiem IR780, freiem RV, TiS₂-Nanosheets und IR780-TiS₂/RV. Das Absorptionsspektrum von IR780-TiS₂/RV zeigte die Peaks von freiem IR780 und freiem RV, was anzeigt, dass sowohl IR780 als auch RV erfolgreich mit den TiS₂-Nanosheets konjugiert wurden. Das RV-Beladungsverhältnis von IR780-TiS₂ betrug etwa 112 % (W/W), was durch nicht-kovalente Wechselwirkungen (z. B. π-π-Stapelung und hydrophobe Wechselwirkungen) erreicht wurde. Darüber hinaus wurden laut BET-Ergebnis die Oberflächenflächen auf 15,2 m²/g und 122,1 m²/g für massives TiS₂ und TiS₂-Nanosheets berechnet. Die exfolierten TiS₂-Nanosheets zeigen eine viel höhere BET-Oberfläche als massives TiS₂, was große aktive Fläche für Arzneimittelbeladung bietet. Die hohe Beladung war wahrscheinlich auf die große spezifische Oberfläche und die BSA-Adhäsion an den IR780-TiS₂-Nanosheets zurückzuführen. Um RV und IR780 in TiS₂-Nanosheets weiter zu bestätigen, wurden die FTIR-Spektren von TiS₂-Nanosheets, IR780-TiS₂ und IR780-TiS₂/RV gemessen. In Zusatzdatei 1: Abbildung S6 erschienen alle charakteristischen Peaks von TiS₂-Nanosheets in den FTIR-Spektren von IR780-TiS₂/RV. Zudem erschienen drei neue Peaks (~3191 cm⁻¹, ~1510 cm⁻¹, 1230 cm⁻¹) im Spektrum von IR780-TiS₂/RV, was die Existenz von RV und IR780 anzeigt.

Nach einer 3-minütigen Niedrigleistungs-NIR-Bestrahlung (808 nm, 0,3 W/cm²) stieg die Temperatur der IR780-TiS₂/RV-Lösung proportional zur Konzentration von IR780-TiS₂/RV (0, 5, 10 µg/ml) an, und die 10 µg/ml IR780-TiS₂/RV-Lösung erreichte die höchste Temperatur von 47,6 °C (Abb. 2a). Zusätzlich behielt IR780-TiS₂/RV seinen ursprünglichen photothermischen Effekt sogar nach fünf Zyklen der NIR-Bestrahlung bei, während freies IR780 einen verringerten photothermischen Effekt zeigte (Abb. 2b). Diese Ergebnisse zeigen, dass das IR780-TiS₂/RV-Nanokomposit eine große Photostabilität hat.

Als Nächstes wurde das RV-Freisetzungsverhältnis unter verschiedenen Bedingungen von pH und NIR-Bestrahlung gemessen (Abb. 2c, d). Nach 24 h betrug das RV-Freisetzungsverhältnis 8,56 % unter physiologischen Bedingungen (pH 7,4), wurde aber signifikant auf 16,2 % bei pH 6,5 erhöht, was anzeigt, dass es durch schwach saure Bedingungen verstärkt werden kann. Darüber hinaus wurde das RV-Freisetzungsverhältnis wieder signifikant auf 44,8 % bei pH 6,5 und einer 3-minütigen NIR-Bestrahlung (808 nm, 0,3 W/cm²) erhöht. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die NIR-Bestrahlung ein kontrollierbarer externer Reiz sein kann, um die Freisetzung von RV aus IR780-TiS₂/RV auszulösen. Dieser Effekt ist wahrscheinlich auf die von IR780-TiS₂ unter NIR-Bestrahlung erzeugte Wärme zurückzuführen, die die nicht-kovalenten Adsorptionswechselwirkungen zwischen RV und der IR780-TiS₂-Oberfläche schwächt. Zusätzlich könnte in saurer Umgebung das H⁺ die Oberflächenladung von TiS₂ verändern, was das hydrophile/hydrophobe Gleichgewicht der Nanopartikel alteriert.

In-vitro-Lokalisierung von IR780-TiS₂/RV

Um die Zellaufnahme und die intrazelluläre Verteilung von IR780-TiS₂/RV zu untersuchen, wurden die IR780-TiS₂/RV-Nanopartikel mit FITC markiert, und ein CLSM wurde verwendet, um die intrazelluläre Fluoreszenz zu visualisieren. Nach 5-stündiger Inkubation zeigten TiS₂/RV und IR780-TiS₂/RV eine ähnliche Fluoreszenzintensität im Zytoplasma (Abb. 3a, b), was anzeigt, dass beide Nanokomposite in Zellen eintreten konnten, wahrscheinlich über Endozytose. Allerdings zeigte das IR780-TiS₂/RV-Nanokomposit eine größere Intensität von gelber und grüner Fluoreszenz, wenn das FITC-Signal mit MitoTracker-Markierung zusammengeführt wurde (Abb. 3a, c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass IR780-TiS₂/RV Mitochondrien mit hoher Effizienz ansprechen kann. Zusätzlich wurde die Verteilung von IR780-TiS₂/RV im Zytoplasma durch TEM weiter bestätigt, was zurückgehaltene Nanopartikel in einigen Mitochondrien zeigte (Abb. 3d). Zusammen bestätigen diese Ergebnisse fest, dass IR780-TiS₂/RV eine gute mitochondriale Zielgerichtetheit erreicht, was die mitochondriale Arzneimittelanreicherung weiter fördert und unmittelbare Zelltoxizität verursacht. Die mitochondriale Zielgerichtetheit wurde wahrscheinlich sowohl durch den organischen-Anion-transportierenden Polypeptid-vermittelten aktiven Transport als auch durch das lipophile Kationenmerkmal vermittelt, was die Nanopartikel hoch in den Mitochondrien von Tumorzellen anreichern ließ.

In-vitro-NIR-ausgelöste Tumorchemotherapie

Zunächst wurde der photothermische Effekt in vitro bewertet. Nach 5-stündiger Inkubation zeigte IR780-TiS₂/RV eine Temperaturerhöhung von etwa 17 °C, während TiS₂/RV eine Temperaturerhöhung von etwa 10 °C zeigte (Abb. 4a). Der photothermische Effekt wurde IR780 und TiS₂-Nanosheets zugeschrieben. Als Nanoplattform für Arzneimittelbeladung demonstrierend Biokompatibilität, zeigte IR780-TiS₂ keine ausgeprägte Zytotoxizität unterhalb der Konzentration von 300 µg/ml (Abb. 4b). Darüber hinaus hatte RV mit oder ohne NIR-Bestrahlung einen ähnlichen konzentrationsabhängigen Zelltötungseffekt (Abb. 4c). Bei gleicher RV-Konzentration erreichte RV den besten Zelltötungseffekt, wenn es von IR780-TiS₂ beladen und mit NIR bestrahlt wurde, im Vergleich zu allen anderen Bedingungen, d. h. freies RV, freies IR780-TiS₂ und RV beladen von TiS₂ (Abb. 4d). Interessanterweise zeigte die unbehandelte IR780-TiS₂-Plattform keinen bemerkenswerten Antikrebs-Effekt bei NIR-Bestrahlung im Vergleich zu ohne NIR-Bestrahlung (Abb. 4d), was anzeigt, dass die von IR780-TiS₂ bei NIR-Bestrahlung erzeugte Wärme hauptsächlich dazu diente, die Arzneimittelfreisetzung auszulösen, die dann die Zellen tötete. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass IR780-TiS₂/RV RV in den Mitochondrien freisetzen kann, wenn es durch NIR-Bestrahlung ausgelöst wird, und somit die lokale RV-Konzentration in den Mitochondrien bemerkenswert erhöht und einen größeren Tumoreinhibitions-Effekt erzielt.

Der Zelltodmechanismus

Um den zugrunde liegenden Mechanismus der NIR-ausgelösten Chemotherapie von IR780-TiS₂/RV zu illustrieren, analysierten wir den Zelltodtyp, das mitochondriale Membranpotenzial (Ψm) und die Expressionsniveaus wichtiger Apoptose-bezogener Proteine. Zunächst wurde FCM verwendet, um den Zelltodtyp mit Annexin V-FITC/PI-Färbung zu detektieren (Abb. 5a). Bei gleicher RV-Konzentration konnten freies RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV und IR780-TiS₂/RV + NIR alle Apoptose induzieren, hauptsächlich aufgrund der Anwesenheit von RV. Tatsächlich wurde berichtet, dass RV die Fähigkeit hat, Apoptose zu induzieren. Von diesen Behandlungen zeigte IR780-TiS₂/RV + NIR die höchste Apoptoserate von 90,8 %. Als Nächstes wurden Apoptose-Signalwege untersucht. Eine Abnahme von Ψm wurde als Schlüsselereignis im mitochondrialen (intrinsischen) apoptotischen Weg berichtet. Bei gleicher RV-Konzentration verringerte IR780-TiS₂/RV + NIR Ψm um etwa 85 %, was signifikanter war als eine Ψm-Verringerung, induziert durch IR780-TiS₂, TiS₂/RV mit oder ohne NIR und freies RV (Abb. 5b). Dieses Experiment zeigt, dass IR780-TiS₂/RV + NIR induzierten Zelltod über den mitochondrialen (intrinsischen) apoptotischen Weg vermittelt wurde. Als Nächstes wurde die Expression von für Apoptose kritischen Proteinen, speziell Cytochrom c (cyto c), Caspase 9 und Caspase 3, über einen Western-Blot-Assay detektiert. Die mit IR780-TiS₂/RV + NIR behandelten Zellen exprimierten mehr zytosolisches cyto c als jene, die mit RV, IR780-TiS₂/RV oder IR780-TiS₂/RV behandelt wurden (Abb. 5c). Die Translokation von cyto c ist der wichtigste Initiator der Caspase-Kaskade. Folglich war die Expression von gespaltenem Caspase 9 und gespaltenem Caspase 3 in den IR780-TiS₂/RV + NIR-behandelten Zellen erheblich erhöht. Zusammen deuten diese Daten klar darauf hin, dass Apoptose über den mitochondrialen (intrinsischen) Weg vermittelt wurde.

In-vivo-NIR-ausgelöste Tumorchemotherapie

Um die Wirksamkeit der NIR-ausgelösten Chemotherapie in vivo zu bewerten, wurden CT26-tumorbeladene Mäuse mit Kochsalzlösung, Kochsalzlösung + NIR, RV, IR780-TiS₂/RV, TiS₂/RV + NIR und IR780-TiS₂/RV + NIR behandelt. Die Tumorgröße in der IR780-TiS₂/RV + NIR-Gruppe verringerte sich signifikant, und der Tumor verschwand nach 30 Tagen Behandlung fast vollständig, während in den übrigen Gruppen das Tumorvolumen einen steigenden Trend zeigte (Abb. 6a). Während der Behandlung gab es keinen signifikanten Unterschied im Körpergewicht zwischen den Gruppen (Abb. 6b). Schließlich zeigte H&E-Bildgebung keine nennenswerte Gewebetoxizität oder Anomalie in allen getesteten Gruppen (Abb. 6c). Diese Ergebnisse demonstrieren, dass das IR780-TiS₂/RV-Nanokomposit eine herausragende NIR-ausgelöste Antitumorwirksamkeit und eine geringe systemische Toxizität hat. Zusätzlich wurde die Biodistribution von IR780-TiS₂/RV in vivo bewertet. Wie in Zusatzdatei 1: Abbildung S4 gezeigt, gelangten die Nanopartikel mostly in das Leber-System und wurden möglicherweise vom System metabolisiert.

Schlussfolgerung

Zusammenfassend haben wir eine mitochondrien-zielgerichtete und RV-beladene Nanoplattform basierend auf TiS₂-Nanosheets für eine NIR-ausgelöste Arzneimittelfreisetzung und verbesserte Tumorchemotherapie entwickelt. Das hergestellte IR780-TiS₂/RV mit flockenartiger Morphologie zeigte gute Stabilität und Biokompatibilität. Aufgrund der mitochondrien-zielgerichteten Fähigkeit von IR780 konnte IR780-TiS₂/RV selektiv in Tumorzellmitochondrien anreichern und dort RV freisetzen, wenn es durch NIR-Bestrahlung ausgelöst wurde. Das freigesetzte RV erleichterte die Abnahme des mitochondrialen Membranpotenzials, Cyto-c-Freisetzung und initiierte anschließend eine Kaskade von Caspase-Reaktionen, um Tumorzellapoptose über den mitochondrialen Signalweg zu fördern. In-vitro- und In-vivo-Ergebnisse demonstrierten, dass IR780-TiS₂/RV eine wirksame NIR-ausgelöste Tumorchemotherapie ohne signifikante Gewebetoxizität aufwies. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass IR780-TiS₂/RV ein vielversprechender chemotherapeutischer Wirkstoff in der klinischen Praxis sein könnte.