Vorbereitung und pharmakokinetische Studie von lang zirkulierenden Daidzein-Liposomen

Hintergrund

Daidzein ist eine natürliche Verbindung, die ausschließlich in Sojabohnen und anderen Hülsenfrüchten vorkommt und strukturell zu einer Klasse von Verbindungen gehört, die als Isoflavone bekannt sind. Die pharmakologische Aktivität von Daidzein wurde bei der Vorbeugung und Therapie von Herz-Kreislauf-Erkrankungen [1], Linderung der Menopause [2], Osteoporose [3], Senkung des Risikos einiger hormonbedingter Krebsarten [4] und entzündungshemmender Wirkung [4] berichtet. 5]. Aufgrund der chemischen Struktur weist Daidzein eine sehr schlechte Wasserlöslichkeit und Fettlöslichkeit auf und wurde nach oraler Verabreichung hauptsächlich im Darmtrakt resorbiert und kann leicht unter Bildung von Glucuronsäure-Konjugat oder Schwefelsäure-Konjugat metabolisiert werden [6,7,8,9,10]. Um seine schlechte Bioverfügbarkeit zu verbessern, konzentrierten sich jüngste Studien auf sein neuartiges Wirkstoffabgabesystem, wie den Daidzein-Phospholipid-Komplex [11], die selbstorganisierte Daidzein-Mizelle [12] und Polymilchsäure-Nanopartikel [13].

Liposom ist ein wirksames Wirkstoffträgersystem, das hydrophobe Wirkstoffe, hydrophile Wirkstoffe und Wirkstoffe, die mit Phospholipiden interagieren, einkapseln kann [14, 15]. Aufgrund ihrer sehr guten Biokompatibilität können Liposomen die Darmpermeabilität erhöhen, den chemischen und biologischen Abbau reduzieren und unspezifische Nebenwirkungen von Medikamenten reduzieren [16]. Die Verwendung konventioneller Liposomen kann jedoch ihre Bindung an Serumkomponenten und die Aufnahme durch das mononukleare Phagozytensystem (MPS) nicht vollständig überwinden [17]. Um solche Probleme zu überwinden, wurden in den letzten Jahren lang zirkulierende Liposomen entwickelt, die mit einem Hydrophilen oder einem Glykolipid wie (Polyethylenglykol) (PEG) oder Monosialogangliosid (GM1) modifiziert sind. Es wurde gezeigt, dass das Vorhandensein von PEG auf der Oberfläche des lang zirkulierenden liposomalen Trägers eine Schicht eines hydrophilen Schutzfilms bildet, der verhindern kann, dass das Liposom mit einer Vielzahl von Komponenten im Serum interagiert und durch die Erkennung von Phagozyten verbraucht wird [18]. Daher können lang zirkulierende Liposomen die Blutzirkulationszeit verlängern, indem sie die MPS-Aufnahme reduzieren und dadurch die Bioverfügbarkeit von Arzneimitteln verbessern [19, 20]. In dieser Arbeit wurden die Herstellungsmethode von Daidzein-Long-Circulation-Liposomen (DLCL) sowie seine in-vitro-Freisetzung und pharmakokinetischen Eigenschaften bei Ratten untersucht. Die Ergebnisse liefern experimentelle Grundlagen für die klinische Anwendung von DLCL.

Methoden

Materialien

Sojabohnen-Phosphatidylcholin (SPC) wurde von Lipoid GmbH (Deutschland) bezogen. Cholesterin und DSPE-mPEG2000 wurden von AVT Pharmaceutical Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Methanol und Acetonitril von HPLC-Qualität wurden von TEDIA Company (USA) bezogen. Chloroform und Methanol (analytisch rein) wurden von Sinopharm Chemistry Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Das Wasser wurde durch das Milli-Q®-Wasserreinigungssystem ((Millipore, USA) gereinigt. Daidzein (≥ 98 % Reinheit) wurde von Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Apigenin (interner Standard, IS, ≥ 98 % Reinheit) wurde von Delge Pharmaceutical Technology Co., Ltd. (Nanjing, China) bezogen. Phosphowolframsäurehydrat (analytische Qualität) wurde von Macklin Co., Ltd. (Shanghai, China) bezogen. Tween-80 und Ethyl Acetat wurde von Sigma (Missouri, USA) bezogen.Ameisensäure (MS-Qualität) wurde von Fischer (USA) bezogen.

Tiere

Zehn männliche Sprague-Dawley-Ratten (200–210 g) wurden vom Krankheitspräventions- und Kontrollzentrum der Provinz Hubei mit der Lizenznummer SCXK (E) 2017–0012 gekauft. Der Tierversuch wurde von der Ethikkommission der Universität Hubei genehmigt und entsprach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren.

Herstellung von lang zirkulierenden Daidzein-Nanoliposomen (DLCL)

Unter Verwendung von Partikelgröße und Verkapselungseffizienz (EE) als Bewertungsindizes wurde die orthogonale Auslegung von vier Faktoren und drei Niveaus (Tabelle 3) durchgeführt, um die beste Übereinstimmung des Molverhältnisses von SPC zu Cholesterin (A), dem Massenverhältnis der Medikament (Daidzein) zum Gesamtlipid (SPC und Cholesterin) (w/w) (B), Hydratationstemperatur (C) und Ultraschallzeit (D) bei einer Bedingung von 5% DSPE-mPEG2000 [21, 22] .

DLCL wurde durch die Dünnschichtverdampfungs-Beschallungsmethode hergestellt, die kurz wie folgt beschrieben wird [21]:Sojabohnen-Phosphatidylcholin, Cholesterin, DSPE-mPEG2000 und Daidzein wurden in einem Rundkolben mit 10 ml Chloroform-Methanol (1:4, v/ v) Mischung. Unter den Bedingungen von Vakuum und 40 °C (Wasserbad) wurde die Mischung in der Rotationsverdampfungsapparatur (RE-2000A, Shanghai Yi-Rong Biochemical Instrument Factory, China) getrocknet, um einen dünnen Film zu bilden, und dann mit 20 ml/l hydratisiert Reinstwasser durch Beschallung (80 w) für 24 min im Eisbad. Die liposomale Suspension wurde dreimal extrudiert, indem sie abwechselnd durch eine 0,45 &mgr;m und 0,22 &mgr;m mikroporöse Membran filtriert wurde. Die hergestellte DLCL-Lösung wurde bei 4 °C gelagert. Die Langzeitkonservierung erfordert die Zugabe von 3% Saccharose (als Lyoprotektor) zur DLCL-Suspension und die Gefriertrocknung der Konservierung bei − 20 °C.

Bestimmung von Daidzein in DLCL durch HPLC

Die Säule war eine analytische Phenomenex ODS-Säule (150 mm x 4,6 mm, 5 µm), verbunden mit einer Vorsäule (30 mm x 10 mm, 3 µm) mit einer Säulentemperatur von 40 °C. Die mobile Phase bestand aus 10 mM wässriger Ammoniumacetatlösung (A) und Methanol (B) mit der Gradientenelution wie folgt:0–3,0 min, 45 % B bis 80 % B; 3,0–4,0 min, 80 % B; 4,0–6,0 min, 80 % B bis 45 % B. Die Flussrate betrug 1 µl/min. Die Detektionswellenlänge betrug 240 nm. Das Injektionsvolumen betrug 10 µl. Der lineare Bereich von Daiazein betrug 0,313–50 μg/ml und die Regressionsgleichung war y = 35,461x + 1802,4, R ² = 0,9999. Die Retentionszeit von Daidzein beträgt 4,30 min, und bei der Bestimmung von Daidzein wurde keine Störung durch die DLCL-Formulierung festgestellt (Abb. 1). Präzision, Reproduzierbarkeit, Stabilität und Probenrückgewinnung der Analysemethode wurden streng untersucht und erfüllten die Anforderungen der quantitativen Analyse (Tabelle 1).

Typische Chromatogramme von leeren Liposomen (a ), Daidzein-Referenzsubstanz (b ) und DLCL-Beispiel (c )

Rezept-Screening durch orthogonalen Test

Unter Verwendung von Partikelgröße und Verkapselungseffizienz (EE) als Bewertungsindizes wurde das orthogonale Design von vier Faktoren und drei Niveaus durchgeführt, um die beste Übereinstimmung des Molverhältnisses von SPC zu Cholesterin (A), des Massenverhältnisses des Arzneimittels (Daidzein) zu optimieren. auf Gesamtlipid (SPC und Cholesterin) (w/w) (B), Hydratationstemperatur (C) und Ultraschallzeit (D) bei der Bedingung von 5% DSPE-mPEG2000-Gehalt [21, 22].

Durchmesser und Morphologie von DLCL

Die Partikelgröße und das Zetapotential der hergestellten DLCL-Lösung wurden mit einem Laser-Partikelgrößenanalysator (Zetasizer Nano90, Malven Instruments Limited, Worcestershire, UK) bei Raumtemperatur, 230 V und 50 Hz gemessen. Die vorbereitete DLCL-Lösung wurde mit reinem Wasser 10fach verdünnt und anschließend mit einer Pinzette vom Rand des Kupfergewebes aufgenommen. Nach dem Trocknen bei Raumtemperatur und dem Gegenfärben mit wässriger Phosphowolframsäurelösung (2%, w/v) wurde die Morphologie des vollständig getrockneten DLCL unter Verwendung eines Feldemissions-Transmissionselektronenmikroskops (JEM-2100 (HR), JEOL Ltd. , Tokio, Japan) bei Beschleunigung 200 kV und Sender LaB6.

EE und Drug Loading von DLCL

Die EE und die Wirkstoffbeladung des hergestellten DLCL wurden nach der folgenden Dialysemethode bestimmt:(1) 500 µl der hergestellten DLCL-Lösung wurden in einen Dialysebeutel mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 8000 bis 14 000 (BioSharp Sai-Guo Biotechnology Co., LTD), dann die beiden Enden des Dialysebeutels fest zubinden und den Dialysebeutel in 20 ml Wasser (Dialysemedium) geben. Nach 12 h Rütteln mit dem Schüttler wurde 1 ml des Dialysemediums entnommen und 10 min bei 12000 U/min zentrifugiert, um die Konzentration des freien Arzneimittels (C ₁ ) im Überstand. (2) 500 Mikroliter der vorbereiteten DLCL-Lösung und 2000 µl Methanol wurden durch Vortexen für 15 Minuten gemischt, um die Liposomen zu zerstören, und dann bei 12000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert, um die Gesamtarzneistoffkonzentration (C ₀ ) im Überstand. (3) Zehn Milliliter der zubereiteten DLCL-Lösung (V ₀ ) wurde lyophilisiert, um die feste Pulvermasse (W ₀ ). (4) Die EE und die Wirkstoffbeladung wurden nach folgender Formel berechnet:

In-vitro-Wirkstofffreisetzung

Die in vitro-Freisetzung von DLCL und freiem Daidzein wurde durch das Dialyseverfahren bestimmt. Die simulierte Magenflüssigkeit war 0,1 µmol/l HCl (pH 1,2), die 0,5 % Tween-80 enthielt, und die simulierte Darmflüssigkeit war 25 µM PBS-Puffer (pH 6,9), der 0,5 % Tween-80 enthielt. 0,5 ml der vorbereiteten DLCL-Lösung wurden in einen Dialysebeutel mit einem Molekulargewicht von 8000 bis 14.000 gegeben und in 20 ml der beiden Freisetzungsmedien gegeben. Die Freisetzungstestmedien wurden kontinuierlich bei 37 °C gerührt (100 U/min). Zu den angegebenen Zeitpunkten (0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 96, 120 und 144 h) werden Aliquots der Probe (1 ml ) wurden aus dem Dialysat entnommen und dann mit der gleichen Menge an frischem Freisetzungsmedium ergänzt. Ein Milligramm pro Milliliter Daidzein (gelöst in DMSO) wurde als Kontrolle verwendet und jeweils in die obigen zwei Freisetzungsmedien für dieselbe Behandlung gegeben. Daidzein wurde zu jedem Zeitpunkt gemessen und die kumulative Freisetzungsrate wurde nach folgender Formel berechnet:

In der Formel V ₁ war die Stichprobenmenge zu jedem Zeitpunkt, V ₂ war das Volumen des Dialysemediums, C ₁ ~C _ich war die zu jedem Zeitpunkt gemessene Daidzein-Konzentration und V ₀ und C ₀ waren das Volumen und die Konzentration von DLCL, die dem Dialysebeutel hinzugefügt wurden.

Pharmakokinetik von DLCL bei Ratten

Zehn männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen (n = 5). Eine Gruppe war die Daidzein-Gruppe (suspendiert in 0,5% Natriumcarboxymethylcellulose) und eine andere Gruppe war die DLCL-Gruppe (in Wasser gelöst). Die Daidzein-Dosen in den beiden Gruppen betrugen 30 mg/kg. Vor der oralen Verabreichung wurden die Ratten 12 Stunden lang gefastet und durften Wasser trinken. Nachdem den Ratten intragastrisch verabreicht worden war, wurde der Daidzein-Gruppe 0,5 µl Blut aus dem Fundus venous plexus jeder Ratte nach 3 Minuten, 5 Minuten, 10 Minuten, 15 Minuten, 30 Minuten, 45 Minuten, 60 Minuten, 1,5 Stunden, 2 Stunden entnommen , 3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 24 h bzw. 36 h. In der Zwischenzeit wurde der DLCL-Gruppe 0,5 ml Blut von jeder Ratte auf die gleiche Weise nach 1 min, 3 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 1,5 h, 2 h, 3 h entnommen , 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 24 h bzw. 36 h. Die Blutprobe wurde in ein heparinisiertes Zentrifugenröhrchen gegeben und 10 min bei 4000 U/min zentrifugiert, und das Plasma wurde bei –80 °C gelagert. Der Gehalt an Daidzein in der Plasmaprobe wurde mit der etablierten LC-MS/MS-Methode bestimmt, um seine Arzneimittel-Zeit-Kurve bei den getesteten Ratten zu erhalten. Die pharmakokinetischen Parameter wurden mit einem Nicht-Kompartiment-Modell unter Verwendung der Software DAS3.0 (Professional Member of Chinese Pharmacology Society, Shanghai, China) berechnet.

Bestimmung von Daidazein in Rattenplasma durch LC-MS/MS

Rattenplasmaproben wurden wie folgt vorbehandelt:Rattenplasma (50 µl), Methanol (10 µl), interner Standard (IS) Apigenin, gelöst in Methanol (10 µl, 500 µg/ml) und 5%ige wäßrige Ameisensäurelösung (100 µl). ) wurden in einem sauberen 1,5-ml-Reagenzglas gemischt. Nach kurzem Vortex-Mischen wurden 1,2 ml Ethylacetat in die Mischung gegeben. Nach 5-minütigem Schütteln bei Raumtemperatur wurde die Mischung 10 Minuten lang bei 12.000 U/min zentrifugiert. Die resultierende obere organische Phase (1 µl) wurde in ein weiteres sauberes 1,5-ml-Reagenzglas überführt, eingedampft und wieder in der mobilen Phase (100 µl) gelöst. Der durch Zentrifugieren bei 12.000 U/min für 10 min erhaltene Überstand wurde für die LC-MS/MS-Analyse gesammelt. Die quantitativen Bedingungen von Rattenplasmaproben sind unten beschrieben:GL Inertsustain C18 (100 mm × 2,1 mm, 3 μm) wurde mit einer Shim-Pack-Säulenhalter-Vorsäule (5,0 mm × 2,0 mm, 1,6 µm) bei einer Säulentemperatur von 40°C; die Gradientenelution mit einer Flussrate von 0,2 µl/min wurde unter Verwendung der mobilen Phase bestehend aus Wasser (A)-Methanol (B) unter den Bedingungen von 50 % B bis 80 % B (0–2,00 min), 80 % B . durchgeführt (2,00–4,00 min), 80 % B bis 50 % B (4,00–6,00 min) und 50 % B (6,10–8,00 min). Das Injektionsvolumen betrug 10 µl. Der Negativ-Ionen-Multireaktions-Überwachungsmodus (MRM) wurde verwendet, um die Ionenpaare von Daidzein (m /z 253.0 → 224.15) und IS (m /z 269.00 → 117.05). Die anderen Bedingungen wurden wie folgt angegeben:ESI-Ionenquelle, Heizblocktemperatur 400°C, DL-Rohrheiztemperatur 250°C, Zerstäubungsgas (N ₂ ) Volumenstrom 3.0 L/min, Trockengas (N ₂ ) Volumenstrom 15,0 L/min und Ionensprühspannung – 4,5 V. Die Retentionszeiten von Daidzein und internem Standard (Apigenin) betrugen 4,5 min bzw. 5,4 min, und die körpereigenen Substanzen im Plasma störten die Bestimmung von Daidzein . nicht und interner Standard (Abb. 2). Die quantitative Methodik wurde streng untersucht und erfüllte die Anforderungen der quantitativen Analyse biologischer Proben (Tabelle 2).

HPLC von leerem Plasma (a ), Daidzein + Apigenin (interne Standards) + Blindplasma (b ) und Plasmaprobe (c ). 1, daidzein; 2, Apigenin (IS)

Statistische Analyse

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Statistische Vergleiche wurden mit Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, gefolgt von Tukey-Test. Die Werte wurden bei p . als statistisch signifikant angesehen <  0.05.

Ergebnisse und Diskussion

Auswirkung von Herstellungsprozessen auf die Eigenschaften von Nanoliposomen

Das orthogonale Testdesign und die Testergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt, und die Ergebnisse der Varianzanalyse sind in Tabelle 4 gezeigt. Die intuitive Analyse (Tabelle 3) zeigte, dass die Reihenfolge des Einflusses von vier Faktoren auf die Partikelgröße das Wirkstoff-Lipid-Verhältnis > SPC- war. Cholesterin-Verhältnis > Hydratationstemperatur > Ultraschallzeit, die wenig Einfluss auf die Verkapselungseffizienz hatte. Die Varianzanalyse (Tabelle 4) zeigte das Arzneimittel-Lipid-Verhältnis; Das SPC-Cholesterin-Verhältnis hat einen signifikanten Einfluss auf die Partikelgröße. Die optimalen Vorbereitungsbedingungen für DLCL waren A₁ B₁ C₂ D₁ , das Verhältnis von SPC zu Cholesterin betrug 55:40, das Verhältnis von Arzneimittel zu Lipid betrug 1:10, die Hydratationstemperatur betrug 50°C und die Ultraschallzeit betrug 24 min.

Nach dem oben optimierten Verfahren wurden parallel drei Chargen von DLCL hergestellt. Der EE betrug 85,3 ± 3,6 % und die Medikamentenbelastung 8,2 ± 1,4 %. Die durchschnittliche Partikelgröße betrug 156,1 ± 3,0 nm mit einem PDI von 0,294 ± 0,012 und einem Zetapotential von − 49 ± 0,6 mV. Die Partikelgrößenverteilung von DLCL wurde in Abb. 3 gezeigt, was darauf hindeutet, dass das hergestellte DLCL unter den optimierten Herstellungsverfahrensbedingungen eine enge und gleichmäßige Partikelgrößenverteilung aufwies. Die durch TEM beobachtete Form und Struktur der DLCL-Partikel war rund oder elliptisch, und die Größe war im Wesentlichen einheitlich (Abb. 4).

Partikelgrößenverteilung von DLCL

TEM-Foto von DLCL

Daidzein ist ein typisches Medikament mit schlechten hydrophilen und lipophilen Eigenschaften. Die gerichtete Kombination des Arzneimittels mit dem polaren Ende des Phospholipids kann beide in einen stark dispergierten Zustand bringen. Die Kristalleigenschaften des Arzneimittels werden gehemmt und die Lipidlöslichkeit erhöht [11]. Es wurde berichtet, dass bei der Wechselwirkung zwischen Daidzein und Lipiddoppelschicht ca. 15% des Daidzeins in der hydrophilen Region der Liposomenmembran lokalisiert sind [23, 24] und der Rest an der Wasser/Membran-Grenzfläche verteilt ist [25]. Nach den Ergebnissen von TEM war die Doppelstruktur von DLCL offensichtlich und die Insertion von Daidzein hatte keinen Einfluss auf die Doppelstruktur der Lipide.

Auswirkung von Vorbereitungsprozessen auf die In-vitro-Wirkstofffreisetzung

Die Ergebnisse der in-vitro-Freisetzungsexperimente sind in Abb. 5 dargestellt. Im Freisetzungsmedium des simulierten Magensafts (0,1 mol/l HCL mit 0,5 % Tween-80) betrug die kumulative Freisetzungsrate von Daidzein etwa 85 % bei 1 h und vollständige Freisetzung um 12 Uhr; DLCL setzte 18 % nach 1 Stunde, 60 % nach 12 Stunden und 100 % nach 48 Stunden frei. Im Freisetzungsmedium simulierter Darmflüssigkeit (25 mM PBS-Puffer mit 0,5 % Tween-80, pH 6,9) betrug die kumulative Freisetzungsrate von Daidzein etwa 73 % nach 1 h, 84 % nach 12 h und die vollständige Freisetzung nach 24 h; DLCL setzte 3 % nach 1 h, 59 % nach 12 h und 100 % nach 48 h frei.

In-vitro-Freisetzung von DLCL und freiem Daidzein bei Hydrochloridlösung (pH 1,2) mit 0,5 % Tween 80 (a ) und Phosphatpuffer (pH 6,9) mit 0,5% Tween 80 (b ) (Mittelwert ± SD, n = 3)

Die Ergebnisse des in vitro-Freisetzungsexperiments zeigten, dass DLCL in Dialysemedien mit pH 1,2 und pH 6,9 signifikant langsam freigesetzt wurde und die Freisetzungsrate in Dialysemedien mit pH   1,2 schneller war als in Dialysemedien mit pH 6,9. Dies kann an der Tatsache liegen, dass Lipiddoppelschichtstrukturen unter sauren Bedingungen anfällig sind und eine geringe Stabilität aufweisen.

Auswirkung von Aufbereitungsprozessen auf die In-vivo-Pharmakokinetik

Die mittleren Plasmakonzentrations-Zeit-Kurven von Daidzein nach oraler Gabe einer Einzeldosis von Daidzein und DLCL sind in Abb. 6 dargestellt, und die wichtigsten nicht kompartimentären pharmakokinetischen Parameter von Daidzein in beiden Gruppen sind in Tabelle 5 dargestellt. Die Ergebnisse zeigten, dass unter der Isodosis Daidazein (30 mg/kg) in beiden Gruppen war die Plasmakonzentration von Daidzein in der DLCL-Gruppe immer höher als in der Daidzein-Gruppe. Die AUC_0−t (die Fläche unter der Plasmakonzentrations-Zeit-Kurve, die die Gesamtabsorption nach einer Einzeldosis darstellt und den Wirkstoffabsorptionsgrad widerspiegelt) von Daidzein in der DLCL-Gruppe betrug 1515,52 ±   532,40 μg/l*h, was dem 2,5-fachen von . entspricht die daidzein-Gruppe (p <  0,05). Darüber hinaus ist das MRT_0−t (mittlere Verweilzeit, das ist die Zeit, die für die Elimination von 63,2 % des Arzneimittels im Körper erforderlich ist) und t _1/2 (die Eliminationshalbwertszeit, d. h. die Zeit, die erforderlich ist, um die Plasmakonzentration des Arzneimittels der terminalen Phase zu halbieren) von Daidzein in der DLCL-Gruppe um das 1,6-fache bzw. 1,8-fache gegenüber der Daidzein-Gruppe verlängert (p <  0,05). Die pharmakokinetischen Ergebnisse zeigten, dass DLCL nicht nur den First-Pass-Effekt von Daidzein reduzieren konnte, um seine orale Absorption zu fördern, sondern auch seine durchschnittliche Verweilzeit verlängern konnte, um den langsamen Freisetzungseffekt zu erzielen.

Mittlere Plasmakonzentrations-Zeit-Kurven von DLCL und freiem Daidzein nach oraler Gabe einer Einzeldosis Daidzein (30 mg/kg) (Mittelwert ± SD, n = 5)