Graphenoxid in einem Komposit mit Silbernanopartikeln reduziert die Zytotoxizität von Fibroblasten und Endothelzellen einer antibakteriellen Nanoplattform

Einführung

Materialien mit antibakteriellen Oberflächen wurden für den Einsatz in der Medizin und der biomedizinischen Industrie umfassend erforscht [1]. Nanomaterialien gelten als wirksame alternative antimikrobielle Wirkstoffe, die anstelle von Antibiotika und chemischen Wirkstoffen eingesetzt werden können [2]. Silbernanopartikel (AgNPs) werden am häufigsten wegen ihrer antibakteriellen Eigenschaften verwendet [3]. Nanopartikel, die antimikrobielle Aktivität zeigen, einschließlich AgNPs, insbesondere in höheren Konzentrationen, können jedoch für menschliche Zellen toxisch sein und möglicherweise die menschliche Gesundheit beeinträchtigen [4, 5]. Daher wirft in der biomedizinischen Industrie die Anwendung von Materialien mit mit Nanomaterialien beschichteten Oberflächen Fragen zu deren Sicherheit und Toxizität auf.

Eine Möglichkeit, die potenzielle Toxizität von Nanomaterialien zu minimieren, besteht darin, ihre Mobilität einzuschränken, ohne ihre antimikrobiellen Eigenschaften zu verändern. Fest gebundene Nanomaterialien, die in antibakteriellen Oberflächen verwendet werden und sich nicht vom Material lösen, reduzieren deren Toxizität für menschliche Zellen [6]. Eine der effektivsten Methoden zur Beschichtung von Oberflächen mit Nanopartikeln ist die Ultraschalltechnologie [7]. Ultraschallwellen führen zu strukturellen Veränderungen der Nanomaterialien, die je nach Nanomaterial zur Desagglomeration oder Agglomeration führen [8]. Ultraschalltechnologie kann auch für die Synthese von Nanokompositen aus verschiedenen Materialien verwendet werden, einschließlich Metallionen und Nanopartikeln [9,10,11]. Beschallung wurde für den Aufbau verschiedener Nanomaterialien verwendet, einschließlich der Dekoration von Graphenoxid (GO)-Flakes mit AgNPs und anderen Nanopartikeln [12].

Der Mechanismus der antibakteriellen Aktivität von Nanopartikeln variiert zwischen den verschiedenen Arten von Nanopartikeln; die Hauptprozesse, die für die antimikrobiellen Eigenschaften von Nanopartikeln verantwortlich sind, sind jedoch folgende:direkte Wechselwirkungen mit den Zellbestandteilen und indirekte Prozesse einschließlich der Oxidation von Zellbestandteilen und der Störung oxidoreduktiver Prozesse [3]. Die antibakterielle Aktivität von AgNP resultiert aus der direkten Zerstörung der bakteriellen Zellmembran durch AgNPs und die freigesetzten Ag+-Ionen, was die Synthese reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) induziert, und den Kollaps des Plasmamembranpotentials, was zur Erschöpfung von intrazellulärem ATP führt [13 ,14,15]. GO kann aufgrund der ROS-Synthese und der direkten Zellimmobilisierung auf der GO-Oberfläche zytotoxisch für Bakterienzellen sein [16, 17], verursacht durch die hohen Adsorptionskapazitäten von GO und GO-Nanokompositen [18, 19].

Die Toxizität von Nanopartikeln wurde jedoch nicht nur in Bakterienzellen beobachtet. Im Allgemeinen sind menschliche Zellen aufgrund ihres größeren Ausmaßes und ihrer effektiven Reparatur- und Abwehrmechanismen weniger anfällig für Nanopartikel als Bakterien, aber Zytotoxizität wurde insbesondere bei hohen Konzentrationen beobachtet. AgNP-Toxizität in In-vitro-Studien tritt in Konzentrationen ähnlicher Größenordnung auf, obwohl sie für komplexere verschiedene biologische Systeme oder Organismen erheblich variieren können [20]. Die Toxizität von AgNPs für mehrzellige Organismen ist aufgrund ihrer strukturellen und physiologischen Unterschiede, wie zum Beispiel spezialisierter Zellgewebe, einschließlich Epithelzellen, oft geringer [21]. Die Biokompatibilität von GO für menschliche Zellen hängt von der Konzentration und der Blattmorphologie ab. Bei höheren Konzentrationen kann GO zu einer Penetration der Plasmamembran und einer erhöhten Synthese von ROS führen [22,23,24].

In unseren früheren Studien haben wir gezeigt, dass Nanoplattformen aus AgNP und GO (Ag-GO) Nanokomposit eine hohe antimikrobielle Wirksamkeit gegenüber Bakterien (Escherichia coli , Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis ) und pathogenen Hefen (Candida albicans ), was mit der erhöhten ROS-Synthese und der Plasmamembranperforation zusammenhängt [25]. Ag-GO zeigte aufgrund der kombinierten Aktivität beider Nanomaterialien eine höhere antibakterielle Aktivität als die AgNP- oder GO-Nanoplattformen. Hier stellten wir die Hypothese auf, dass mit Ag-GO-Nanokomposit beschichtete Polyurethanfolien eine geringere Toxizität gegenüber Fibroblasten, humanen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) und einem alternativen In-vivo-Modell – der Chorioallantoismembran von Hühnerembryonen – aufweisen als Folien, die nur mit AgNPs beschichtet sind.

Ergebnisse

AgNPs und GO bildeten ein Nanokomposit in Hydrokolloid

Die Analyse mit dem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) wurde verwendet, um die Morphologie der Nanomaterialien und ihre Wechselwirkungen innerhalb des Ag-GO-Komposits zu bewerten (Abb. 1). AgNPs waren kugelförmige Nanopartikel mit einer mittleren Größe von ungefähr 55 nm. Darüber hinaus zeigten TEM-Bilder die Haftung von Silbernanopartikeln an GO (Abb. 1e). Diese Beobachtungen wurden in der Zetapotentialanalyse weiter bestätigt. Das Zetapotential von Ag-GO zeigte, dass das Hydrokolloid unmittelbar nach der Beschallung instabil war, sich aber nach 24 h stabilisierte (Zetapotential:− 15.68 bzw. − 27.7 mV; Tabelle 1). Im Gegensatz dazu war das AgNP-Hydrokolloid sowohl unmittelbar nach der Beschallung als auch nach 24 h instabil, während das GO-Hydrokolloid recht stabil war und sich nach 24 h nicht signifikant veränderte (Zetapotential:− 31.11 mV bzw. − 28.42 mV). Darüber hinaus zeigte eine dynamische Lichtstreuungsanalyse (DLS), dass die Z - Die durchschnittliche Größe der AgNPs betrug 93,1 nm, GO betrug 1485.0 nm und Ag-GO betrug 1157.0 nm. Die AgNP-Größenverteilung zeigte drei Peaks im Zusammenhang mit der Agglomeratbildung, während die GO- und Ag-GO-Größenverteilung einen Peak anzeigte (Abb. 1b, d, f).

Nanopartikelmorphologie und Größenverteilung. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von a Silbernanopartikel, c Graphenoxid und e Silbernanopartikel und Graphenoxid-Komposit. Größenverteilung von b Silbernanopartikel, d Graphenoxid und f Silbernanopartikel und Graphenoxid-Komposit

Raman-Spektren und Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR) wurden verwendet, um die strukturellen Merkmale von GO zu charakterisieren (Abb. 2). Abbildung 2a zeigt die Entfaltung von D, G und D’ von GO. Die Position des D-Bandes beträgt 1347 cm ^− 1 und das G-Band 1578 cm ^− 1 ; das ID/IG-Verhältnis beträgt 1,34. Die FT-IR-Analyse ergab einen breiten Peak bei ~ 3500 cm ^− 1 , das hauptsächlich Wasser und Hydroxylgruppen zugeordnet wird. Der Peak bei 1600 cm ^− 1 wird C=C-Bindungen zugeordnet, die in graphitischem Kohlenstoff vorhanden sind. Andere im FT-IR-Spektrum beobachtete Peaks zeigen, dass GO reich an Gruppen mit C=O-Bindungen (hauptsächlich Carboxylgruppen) ist, Peaks um 1720 cm ^− 1 und 915 cm ^− 1 , Epoxy (C–O–C) mit dem sichtbaren Peak um 1200 cm ^− 1 , und C-H-Bindungen (Peak um 2800 cm ^− 1 ).

Strukturelle Merkmalsanalyse von Graphenoxid. a Raman-Spektrum von Graphenoxid mit vorgeschlagener Dekonvolution von D, G und D’. b Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (ATR, Attenuated Total Reflectance) Spektrum von Graphenoxid mit Zuordnung funktioneller Gruppen

AgNP-, GO- und Ag-GO-beschichtete Folien reduziert Salmonella enteritidis Wachstum

Die antibakterielle Aktivität der Nanoplattformen GO, AgNP und Ag-GO wurde mit S. Enteritis . Die Inkubation von Bakterien auf mit Nanomaterialien beschichteten Folien bei 37 °C für 24 Stunden führte zu vermindertem Wachstum (Abb. 3). Der stärkste S. Enteritis Wachstumshemmung wurde auf der Ag-GO-Nanoplattform beobachtet. Allerdings führten sowohl die AgNP- als auch die GO-Nanoplattformen auch zu einem verringerten S. Enteritis Wachstum. Ein Vergleich der Rasterelektronenmikroskop(REM)-Bilder von Bakterien, die auf der Ag-GO-Nanoplattform inkubiert wurden, mit der Kontrollgruppe zeigte eine reduzierte Anzahl von S. Enteritis Zellen. Darüber hinaus hafteten Bakterien an den Nanoplattformen und zeigten morphologische Veränderungen, die auf eine Zerstörung ihrer Zellmembran hinweisen.

Mit Silbernanopartikeln und Graphenoxid beschichtete Nanoplattformen verringerten die Lebensfähigkeit von S. enteritidis. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von a Kontrolle S. Enteritis Bakterien und b S. Enteritis inkubiert auf einer mit Silbernanopartikeln und Graphenoxid beschichteten Nanoplattform, nach Inkubation bei 37 °C für 24 h. c Lebensfähigkeit von S. Enteritis nach Inkubation auf der Nanoplattform für 24 h wurde mit einem PrestoBlue-Assay bewertet. Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3, jedes Experiment in dreifacher Ausfertigung). Statistische Signifikanz wird durch verschiedene hochgestellte Zeichen angezeigt (einfache ANOVA; P < 0,05). Abkürzungen:C, Kontrollgruppe (Folie ohne Nanopartikel); AgNPs, Nanoplattform beschichtet mit Silbernanopartikeln; GO, mit Graphenoxid beschichtete Nanoplattform; Ag-GO, Nanoplattform beschichtet mit Komposit aus Graphenoxid und Silbernanopartikeln; RU, relative Einheiten

AgNP-Toxizität wird durch GO in einer verbundbeschichteten Ag-GO-Nanoplattform gehemmt

Die Toxizität von Nanoplattformen wurde durch direkte Inkubation von Fibroblasten und HUVECs für 24 h auf Nanoplattformen und unbeschichteten Folien untersucht (Abb. 4). Es gab signifikante Unterschiede zwischen der Lebensfähigkeit von Fibroblasten und HUVECs auf den verschiedenen Nanoplattformen (P = 0,0003 und P =0,0156, entsprechend). GO-Nanoplattformen veränderten die Lebensfähigkeit von Fibroblasten nicht, verglichen mit der Lebensfähigkeit von Zellen, die auf unbeschichteten Folien inkubiert wurden. Ebenso gab es keine signifikanten Auswirkungen von GO auf die Lebensfähigkeit von HUVECs. Die Beschichtung mit AgNPs führte jedoch zu einer 40–50%igen Abnahme der Lebensfähigkeit von Fibroblasten und HUVECs. Die Zelllebensfähigkeit von Fibroblasten und HUVECs wurde bei der Inkubation auf mit Ag-GO-Nanokomposit beschichteten Nanoplattformen nicht verändert, was die Hemmung der AgNP-Toxizität zeigte. Die Zellmorphologie auf unbeschichteten Folien zeigte die typische Morphologie von Fibroblasten, die unter 2D-Kulturbedingungen gezüchtet wurden (Abb. 4a). Auf AgNP-beschichteter Folie inkubierte Zellen zeigten eine intensive Zellaggregation. Die Zellmorphologie auf den GO- und Ag-GO-beschichteten Nanoplattformen zeigte eine Verringerung der Agglomerationstendenzen und der Zellausbreitung.

Mit Graphenoxid beschichtete Nanoplattformen verringerten die Zytotoxizität von Silbernanopartikeln Morphologie von auf a . kultivierten Fibroblasten unbeschichtete Nanoplattformen, b mit Silbernanopartikeln beschichtete Nanoplattformen, c Graphenoxid-beschichtete Nanoplattformen, d Silbernanopartikel und Graphenoxid-Komposit-beschichtete Nanoplattformen. Die Morphologie wurde durch Lichtmikroskopie unter Verwendung von Phasenkontrast mit einer Vergrößerung von ×   200 beurteilt. Fibroblast (e ) und HUVEC (f ) wurde die Lebensfähigkeit nach 24 h Inkubation auf den Nanoplattformen mit einem PrestoBlue-Assay bestimmt. Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3, jedes Experiment in dreifacher Ausfertigung). Statistische Signifikanz wird durch verschiedene hochgestellte Zeichen angezeigt (einfache ANOVA; P < 0,05). Abkürzungen:HUVECs, humane Endothelzellen der Nabelschnurvene; C, Kontrollgruppe (Folie ohne Nanopartikel); AgNPs, Nanoplattform beschichtet mit Silbernanopartikeln; GO, mit Graphenoxid beschichtete Nanoplattform; Ag-GO, Nanoplattform beschichtet mit einem Komposit aus Graphenoxid und Silbernanopartikeln; RU, relative Einheiten

Die Toxizität der Nanoplattform wurde auch unter Verwendung einer Chorioallantoismembran eines Hühnerembryos bewertet (Abb. 5). Nanoplattformen wurden direkt auf einer Chorioallantoismembran inkubiert und ihre Morphologie an der Kontaktstelle nach 48 h untersucht. AgNPs verursachten morphologische Veränderungen an der Chorioallantoismembran, während im Fall der GO- und Ag-GO-Nanoplattformen die Morphologie mit der der Kontrollgruppe vergleichbar war (Abb. 5b). Die Chorioallantoismembran zeigte nach Inkubation auf der AgNP-Nanoplattform eine verringerte Anzahl von Kapillargefäßen, was auf eine direkte Toxizität für Endothel- und Mesenchymzellen schließen lässt.

Graphenoxid verringerte die morphologischen Veränderungen der Chorioallantoismembran, die durch Silbernanopartikel verursacht wurden. Die Morphologie der Chorioallantoismembran des Hühnerembryos nach 48 h Inkubation mit den Nanoplattformen. a Kontrollgruppe (Folie ohne Nanopartikel), b Nanoplattform beschichtet mit Silbernanopartikeln, c Nanoplattform beschichtet mit Graphenoxid, d Nanoplattform beschichtet mit Komposit aus Graphenoxid und Silbernanopartikeln

AgNPs haben die Freisetzung von Interleukin 6 und 8 verringert

Ein Antikörper-Array wurde verwendet, um den Zellmediengehalt von 40 von Fibroblasten synthetisierten Entzündungsproteinen zu analysieren (Abb. 6). Die von Fibroblasten hauptsächlich freigesetzten Entzündungsproteine ​​waren Interleukin 8 (IL-8; Abb. 6, Punkte:E5, F5) und Interleukin 6 (IL-6; Abb. 6, Punkte:E8, F8). Die AgNP- und Ag-GO-Nanoplattformen verringerten die Freisetzung von IL-8 signifikant, während die GO-Nanoplattform einen solchen Effekt nicht hatte. Darüber hinaus verringerten sowohl die GO- als auch die Ag-GO-Nanoplattform die Freisetzungsmenge des Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktors (GM-CSF; Abb. 6, Punkte:G5, H5). Die GO- und Ag-GO-Nanoplattformen führten auch zu einer erhöhten Freisetzung von Tumornekrosefaktor beta (TNF-β; Abb. 6, Punkte:A9, B9). Interessanterweise verringerten AgNP-, GO- und Ag-GO-Nanoplattformen die Freisetzung von IL-6 signifikant. Die Freisetzungshöhe der anderen analysierten Proteine ​​wurde nicht verändert. Eine Array-Karte mit einer Liste aller analysierten Zytokine ist in der zusätzlichen Datei 1 enthalten:Abbildung S1.

Antikörper-Array-Analyse der inflammatorischen Zytokinfreisetzung von Fibroblasten nach 24 h Inkubation. a Kontrollgruppe (Folie ohne Nanopartikel), b Nanoplattform beschichtet mit Silbernanopartikeln, c Nanoplattform beschichtet mit Graphenoxid, d Ag-GO-Nanoplattform, beschichtet mit einem Verbund aus Graphenoxid und Silbernanopartikeln. Die Nanoplattformen AgNP und Ag-GO verringerten die Freisetzung von IL-8 (Punkte:E5, F5). Sowohl die GO- als auch die Ag-GO-Nanoplattform verringerten die Synthese von GM-CSF (Punkte:G5, H5). Darüber hinaus führten die GO- und Ag-GO-Nanoplattformen zu einer erhöhten Synthese von TNF-β (Punkte:A9, B9). Die Nanoplattformen AgNP, GO und Ag-GO verringerten die Freisetzung von IL-6 (Punkte:E8, F8). Eine vollständige Array-Karte ist in der zusätzlichen Datei 1 verfügbar

Diskussion

In biomedizinischen Anwendungen ist die Sicherheit von Nanomaterialien, die in antimikrobiellen Materialien verwendet werden, ebenso wichtig wie ihre Wirksamkeit bei der Abtötung von Bakterien. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass Beschichtungsmaterialien mit GO die Toxizität von Nanomaterialien effizient verringern können. Mit AgNPs und GO (Ag-GO) beschichtete Polyurethanfolie erhöht nicht nur ihre antimikrobiellen Eigenschaften, sondern verringert auch ihre Toxizität in menschlichen Zellen.

Die Raman-Spektroskopie wurde verwendet, um strukturelle Merkmale von Graphenoxid zu analysieren. Die G-Bande in den Raman-Spektren entspricht sp ² hybridisiertes kohlenstoffbasiertes Material [26]. Der D-Peak steht im Zusammenhang mit einer Defekt- oder Gitterstörung aufgrund der Bindung einer funktionellen Sauerstoffgruppe [27]. Die Intensität der D-Bande hängt mit der Größe von sp ² . zusammen Domänen in der Ebene [26]. Die zusätzlichen Bänder D’ entstehen durch Defekte in der graphitischen Struktur des Kohlenstoffmaterials. Das ID/IG-Verhältnis (berechnet aus der Intensität der D- und G-Banden) kann verwendet werden, um die Unordnung der graphitischen Struktur in Kohlenstoffmaterialien zu charakterisieren. Wie gezeigt hat GO eine stark ungeordnete Struktur aufgrund vieler funktioneller Gruppen in der Struktur, die während der Oxidation von Graphitpulver gebildet werden [28].

Das FT-IR-Spektrum von Graphenoxid, das im ATR-Modus gesammelt wurde, zeigte, dass GO viele funktionelle Gruppen in der Struktur aufweist, einschließlich Carboxyl- und Epoxygruppen, Peaks um 1720 cm ^− 1 und 915 cm ^− 1 , Epoxy (C–O–C) mit dem sichtbaren Peak um 1200 cm ^− 1 , und C-H-Bindungen (Peak um 2800 cm ^− 1 ). Die FT-IR-Analyse stimmt gut mit XPS-Messungen überein, die für GO durchgeführt wurden, bei denen auch Hydroxyl-, Carboxyl-, Epoxy- und Carbonylgruppen identifiziert wurden [29].

Die Beschichtung von Nanomaterialien wurde mit Ultraschalltechnologien durchgeführt, die sich als wirksame Methode zur Beschichtung verschiedener Materialien mit antibakteriellen und fungiziden Substanzen, einschließlich AgNPs, erwiesen haben [30, 31]. Ultraschallwellen nutzen Kavitationsphänomene, indem sie Kavitationsblasen erzeugen und kollabieren, wodurch hohe Energie und Druck erzeugt werden [32]. Auf hohe Geschwindigkeiten beschleunigte Nanomaterialien kollidieren mit dem beschichteten Material und lagern sich auf der Oberfläche ab [33]. Die Effektivität der Abscheidung von Nanomaterialien kann jedoch nicht nur durch die Verwendung eines geeigneten Beschichtungsverfahrens erhöht werden, sondern auch durch die Herstellung von Kompositen mit Nanomaterialien, die sich leichter an der Oberfläche anbringen lassen. GO ist ein günstiges Nanomaterial für die Herstellung stabiler Komposite sowohl mit unterschiedlichen Nanomaterialien als auch mit Oberflächen. Aufgrund seiner einzigartigen Struktur mit Kohlenstoffatomen in einem hexagonalen Muster mit zahlreichen sauerstoffhaltigen funktionellen Gruppen in unmittelbarer Nähe, einschließlich Carboxyl- und Hydroxylgruppen, neigt GO dazu, kovalente Bindungen oder elektrostatische Wechselwirkungen zu bilden [34]. Normalerweise werden GO-Nanopartikel-Komposite durch die Anlagerung von Metallionen oder Metallnanopartikeln an GO-Oberflächen durch elektrostatische oder kovalente Wechselwirkungen synthetisiert. Zusätzlich wird die Reduktion von Metallionen und/oder GO durchgeführt, um kovalente Bindungen zu bilden [35]. Ag-GO-Verbundwerkstoffe wurden unter Verwendung von Ultraschall durch in-situ-Reduktion von Ag ⁺ . hergestellt [36, 37] sowie durch Abscheidung von AgNPs [12]. In unserem vorherigen Bericht haben wir gezeigt, dass Ultraschallmethoden verwendet werden können, um Ag-GO-beschichtete Nanoplattformen auf Polyurethanfolien zu synthetisieren [25]. Die Beschallung führte jedoch nicht nur zur Beschichtung von Polyurethanfolien mit Nanomaterialien, sondern auch zur Bildung eines Ag-GO-Verbunds. Die Bildung des Ag-GO-Verbundstoffs noch vor der Beschichtung der Folien könnte zu einer größeren Stabilität der AgNPs nach der Beschichtung geführt haben.

In unseren Studien wurden Fibroblasten und HUVECs für Zytotoxizitätsstudien verwendet, gefolgt von einer Analyse der Chorioallantoismembran von Hühnerembryonen. Hautfibroblasten gelten als gutes Modell für Hautirritationsstudien im Vergleich zur In-vivo-Analyse [38], während Endothelzellen, einschließlich der HUVEC-Zytotoxizität, häufig aufgrund des wahrscheinlichen direkten Kontakts von Nanopartikeln in biomedizinischen Anwendungen und der Empfindlichkeit dieser Zellen gegenüber Nanopartikeln untersucht werden [38]. 39, 40]. Die Chorioallantoismembran von Hühnerembryonen ist ein alternatives In-vivo-Modell zu Nagetiermodellen für verschiedene toxikologische Studien, einschließlich Materialtoxikologie und akute toxikologische Studien [41, 42].

Fibroblasten und HUVECs hatten eine höhere Lebensfähigkeit, wenn sie auf Ag-GO gezüchtet wurden als AgNP-beschichtete Nanoplattformen. Darüber hinaus verursachte die AgNP-Nanoplattform morphologische Veränderungen in der Chorioallantoismembran, während im Fall der GO- und Ag-GO-Nanoplattformen die Zellmorphologie mit der der Kontrollgruppe vergleichbar war. Die Verringerung der Toxizität auf der Ag-GO-Nanoplattform könnte aus den kombinierten Effekten einer höheren Stabilität von AgNPs im Komplex mit GO und einer besseren Abscheidung von AgNPs in der Nanoplattform resultieren. Die Toxizität tierischer Zellen ist oft schwerwiegender, nachdem Nanopartikel durch direkte Penetration oder Endozytose in die Zelle gelangt sind [43]. Die Endozytose von Nanopartikeln ist größen- und formabhängig. Größere Partikel und Komposite werden in geringerem Maße aufgenommen als Partikel mit einer Größe von ca. 45 nm [44]. Der auffälligste Zusammenhang zwischen Endozytose und Form oder Größe von Nanomaterialien ist charakteristisch für Kohlenstoffwand-Nanoröhren. Nanoröhren mit einer Länge von weniger als 1 µm dringen effektiv durch direkte Diffusion in die Plasmamembran ein, während Phagozytose- oder Endozytosewege längere Nanoröhren und Agglomerate internalisieren [45]. Kürzlich wurde gezeigt, dass das Ag-GO-Nanokomposit von J774-Makrophagen internalisiert wird, etwa 60 % weniger als AgNPs. Da Ag-GO jedoch mehr ROS induzierte, war die Gesamttoxizität für die Zellen höher [46]. Darüber hinaus zeigt die kinetische Analyse der formabhängigen Internalisierung von Nanopartikeln, dass kugelförmige Nanopartikel im Allgemeinen viel schneller internalisiert werden als flache Partikel [47]. Darüber hinaus ist die Toxizität von Nanopartikeln für menschliche Zellen in der Regel größenabhängig, wobei kleinere Partikel stärkere zytotoxische Eigenschaften aufweisen. In Studien zur größenabhängigen Zytotoxizität von AgNPs für RAW hatten 264,7 Makrophagen und L929-Fibroblasten-Nanopartikel nach Behandlung mit 20-nm-AgNPs eine geringere Lebensfähigkeit als nach Behandlung mit größeren Nanopartikeln (80, 113  nm) [13]. Daher könnten die größere Größe von Ag-GO-Kompositen und die verringerte Fähigkeit der Zellen, Nanopartikel aufzunehmen, die aus einer stabilen Ablagerung an der Oberfläche resultieren, der Grund für die beobachtete höhere Lebensfähigkeit sowohl von HUVECs als auch von Fibroblasten sein, die auf der Ag-GO-Nanoplattform kultiviert wurden.

Die Nanoplattformen AgNP und Ag-GO verringerten die Freisetzung von IL-8 durch Fibroblasten signifikant. Die Nanoplattformen GO und Ag-GO führten zu einer erhöhten Freisetzung von TNF-β. Darüber hinaus verringerten AgNP-, GO- und Ag-GO-Nanoplattformen die Freisetzung von IL-6. Interessanterweise standen Veränderungen in der Synthese von proinflammatorischen Proteinen durch Fibroblasten in Zusammenhang mit der Inkubation von Zellen auf Nanoplattformen, die mit AgNPs oder GO beschichtet waren. Die Synthesegrade von Zellen, die auf Ag-GO inkubiert wurden, unterschieden sich nicht von denen, die auf Nanoplattformen inkubiert wurden, die nur mit einem dieser Nanomaterialien beschichtet waren, was darauf hindeutet, dass sich die biologische Aktivität nach der Synthese des Komposits nicht änderte. Fibroblasten spielen eine wichtige Rolle bei Entzündungs- und Umbauprozessen, indem sie Entzündungsreaktionen auslösen und den Übergang von einer akuten Entzündung zur Gewebereparatur herbeiführen [48, 49]. Daher ist die Analyse der Fibroblasten-Sekretion von inflammatorischen Zytokinen wichtig, um die immunologische Reaktion auf Nanoplattformen vorherzusagen. Sowohl IL-6 als auch IL-8 sind eines der wichtigsten inflammatorischen Zytokine, das nach Synthese durch Fibroblasten zur Aktivierung der immunologischen Reaktion führt [50, 51]. Der Synthesespiegel von IL-6 in den humanen epidermalen Keratinozyten nimmt nach Behandlung mit AgNPs ab [52]. In ähnlicher Weise wurde die Hemmung der IL-6-Freisetzung durch AgNPs in Jurcat-Zellen nachgewiesen und umfasst den MAPK-Weg. AgNPs verringern auch die Synthese von Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) [53]. TNF-α und, in Struktur und Funktion sehr ähnlich, TNF-β sind entzündliche Zytokine, die während der akuten Entzündungsphase von Bedeutung sind. Während während der akuten Entzündungsphase hauptsächlich Immunzellen für die Freisetzung dieser Proteine ​​verantwortlich sind, sind Fibroblasten und verschiedene Zellen an der Synthese von inflammatorischen Zytokinen während des frühen Wundheilungsprozesses beteiligt [54]. Die Aktivität zur Induktion von TNF-α nach der Behandlung mit GO wurde unter Verwendung von RAW264.7-Makrophagen nachgewiesen [55], was auf eine immunologische Stimulation hindeutet. In unseren Studien wurden die Freisetzungsmengen der meisten analysierten proinflammatorischen Proteine ​​jedoch nicht verändert, nachdem die Zellen auf den GO- und Ag-GO-Nanoplattformen kultiviert wurden. Daher legen diese Analysen nahe, dass sowohl die GO- als auch die Ag-GO-Nanoplattform eine gute Biokompatibilität aufweisen und nicht zu starken immunologischen Reaktionen führen sollten.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend zeigen die präsentierten Ergebnisse, dass mit einem Ag-GO-Komposit beschichtete Nanoplattformen eine stärkere Wachstumshemmung von S gezeigt haben. Enteritis als AgNP- und GO-beschichtete Nanoplattformen. Darüber hinaus reduzierte Ag-GO-Komposit die Zytotoxizität gegenüber Fibroblasten, HUVECs und der Chorioallantoismembran von Hühnerembryonen im Vergleich zu mit AgNPs beschichteten Nanoplattformen signifikant. Die Zelllebensfähigkeit von Fibroblasten und HUVECs wurde bei der Inkubation auf mit Ag-GO-Nanokomposit beschichteten Nanoplattformen nicht verändert, was die Hemmung der AgNP-Toxizität zeigte. Diese Ergebnisse, zusammen mit einer geringen immunologischen Stimulation, legen nahe, dass die GO zur Verringerung der Zytotoxizität verschiedener Nanomaterialien in Nanokompositen verwendet werden könnte. Darüber hinaus legen die Ergebnisse nahe, dass die Ag-GO-Nanoplattform für den Einsatz in biomedizinischen Anwendungen in Betracht gezogen werden könnte. Es sind jedoch zusätzliche Studien erforderlich, um die Ag-GO-Nanoplattform für spezifische Anwendungen, einschließlich Wundauflagen, zu bewerten.

Materialien und Methoden

Herstellung und Charakterisierung von Nanoplattformen, die mit Nanomaterialien beschichtet sind

Nanoplattformen aus nanopartikelbeschichteten Polyurethanfolien wurden wie zuvor beschrieben hergestellt [25]. Quadratische Polyurethanfolien (15 × 15 mm, 0,05 mm dick) wurden mit Suspensionen von AgNPs (HydroSilver1000, Amepox, Łódź, Polen) bedeckt, die durch eine chemische Reduktionsreaktion in Gegenwart von Polyvinylalkohol synthetisiert von Amepox und/oder GO synthetisiert von . synthetisiert wurden modifiziertes Hummers-Verfahren. Zehn Gramm Graphitpulver wurden mit 230 ml konzentrierter Schwefelsäure (98%) (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) bei einer Temperatur unter 10ºC gemischt. Anschließend wurden 4,7 µg Natriumnitrat (Sigma-Aldrich) und 30 µg Kaliumpermanganat (Sigma-Aldrich) zu der Graphitmischung gegeben, während die Temperatur unter 10ºC gehalten wurde. Dann wurde die Mischung auf 30 °C erhitzt und 2 h gerührt. Anschließend wurden 100 ml Wasser zugegeben und die Mischung mit 10 ml Wasserstoffperoxid behandelt. GO wurde durch Filtration gereinigt und mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis der pH des Filtrats 6,5 erreichte. Suspensionen von GO, AgNPs und der Zusammensetzung von AgNPs und GO (Ag-GO) wurden in entionisiertem Wasser hergestellt. Bei der Beschichtung waren die Konzentrationen der Nanomaterialien wie folgt:GO, 200 µmg/l; AgNPs, 100 mg/l; Ag-GO, 200 mg/l; und AgNPs, 100 mg/l. Die Nanopartikelbeschichtung wurde unter Verwendung eines Ultraschallhorns (Ti-Horn, Ø13 mm, 60% Effizienz, 20 kHz; Sonics &Materials, Inc., Newtown, CT, USA) bei einer Temperatur von 30 ± 1 °C durchgeführt. Die abgedeckten Proben wurden in entionisiertem Wasser gespült und unter sterilen Bedingungen getrocknet. Es wurde bereits über die Charakterisierung von Nanoplattformen mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM), einem Rasterkraftmikroskop (AFM) und einem Lateralkraftmikroskop (LFM) berichtet, die Nanoplattformen zeigen, die fast vollständig mit Nanomaterialien bedeckt sind [25].

Die zur Herstellung der Nanoplattformen verwendeten Nanomaterialien wurden mit einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) abgebildet. TEM-Bilder wurden unter Verwendung eines JEM-1220-Mikroskops (JEOL, Tokio, Japan) bei 80 kV mit einer Morada 11-Megapixel-Kamera (Olympus Corporation, Tokio, Japan) aufgenommen. Proben wurden hergestellt, indem Tröpfchen von Hydrokolloiden auf Formvar-beschichtete Kupfergitter (Agar Scientific, Stansted, UK) platziert wurden, die vor den Beobachtungen an der Luft trocknen gelassen wurden.

Raman-Spektren wurden unter Verwendung eines Renishaw inVia-Spektrometers mit einer 532-nm-Laserquelle (Wotton-under-Edge, UK) gesammelt. Um eine Erwärmung der Probe zu vermeiden, wurde die Laserleistung gering gehalten (0,3 µmW, auf die Probe kalibriert). Der Raman-Mapping-Modus wurde mit einem Scanbereich von ungefähr 10 × 10 μm verwendet, der 25 Spektren enthält. Jedes Spektrum besteht aus zwei Hauptbändern, einem G-Band (~ 1578 cm ^− 1 ) und D-Band (~ 1347 cm ^− 1 ), wurde unter Verwendung der Lorentzschen Linienform angepasst. FT-IR-Messungen wurden unter Verwendung eines Nicolet iS10-Spektrometers (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) im abgeschwächten Totalreflexionsmodus an einem Diamantkristall durchgeführt. Graphenoxidsuspension wurde auf der Polyethylenoberfläche bei Raumtemperatur getrocknet, um eine dünne GO-Folie zu erzeugen. Das Spektrum wurde im Bereich 400–4000 cm ^− 1 . aufgenommen .

Zeta potential measurements of GO (20 mg/l), AgNPs (10 mg/l) and Ag-GO (GO 20 mg/l and AgNPs 10 mg/l) were carried out with a Nano-ZS90 Zetasizer (Malvern Instruments, Malvern, UK) at 25 °C, using the Smoluchowski approximation. Nanomaterials were sonicated for 30 min and zeta potential was immediately measured. Subsequently, nanomaterials were left for 24 h at room temperature and the zeta potential was measured again. Each measurement was repeated at least seven times after 60 s of stabilisation at 25 °C.

The hydrodynamic diameter of nanoparticles in water and their size distribution were measured with dynamic light scattering (DLS) using a Nano-ZS90 Zetasizer (Malvern). Similar to for the zeta potential analysis, GO (20 mg/l), AgNPs (10 mg/l) and Ag-GO (GO 20 mg/l and AgNPs 10 mg/l) were sonicated for 30 min and left for 24 h at room temperature. Each sample was measured at least seven times at 25 °C.

Bacterial Cultivation

Salmonella enteritidis subspecies enterica serovar Enteritidis (ATCC 13076) was obtained from LGC Standards (Łomianki, Poland). The bacteria were grown on tryptic soy agar (Merck Millipore, Darmstadt, Germany). The bacteria, grown on agar plates, were harvested by gently washing the plates with sterile distilled saline solution. To calculate the number of bacteria in the cell suspension, the optical density of the suspensions at 600 nm (OD600) was measured using a spectrophotometer (Helios Epsilon, Unicam, Milwaukee, WI, USA). A calibration curve was prepared by performing serial tenfold dilutions of bacterial suspensions of a known optical density, up to 10 ^− 5 . After 24 h of incubation at 37 °C, the number of formed colonies was enumerated and the number of colony-forming units (CFU) of the original bacterial suspension was calculated.

Bacteria Viability Assay

Viability was evaluated using a PrestoBlue Cell Viability Assay (Thermo Fisher Scientific). Bacteria were cultured onto foils coated with GO, AgNPs and Ag-GO, located on inserts inserted into six-well plates (200 μl MH broth with 5 × 10 ³  CFU per foil) and incubated for 24 h. Subsequently, 90 μl of each sample was transferred to 96-well plates and 10 μl of PrestoBlue reagent was added to each well and incubated for an additional 2 h at 37 °C. The optical density of each well was recorded at 570 nm using a microplate reader (Infinite M200, Tecan, Durham, NC, USA). Bacteria viability was expressed as the relative value after substitution of the absorbance from the blank samples. Experiments were repeated three times.

Scanning Electron Microscopy Analysis

Bacteria were incubated on foils with Ag-GO and a sterile cover glass. Bacteria cultures (100 μl, 10 ⁶ CFU/ml) were incubated on foils and a cover glass for 24 h at 37 °C. Alle Proben wurden getrocknet und mit Gold bedeckt. Cells were fixed with 2.5% glutaraldehyde in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) and contrasted with 1% osmium tetroxide (Sigma-Aldrich) and 1% carbohydrazide (Sigma-Aldrich). Subsequently, cells were dehydrated in increasing concentrations of hexylene glycol (Sigma-Aldrich). Drying was performed using a Polaron CPD 7501 critical point dryer (Quorum Technologies, Laughton, UK). Finally, the samples were imaged with a SEM (FEI Quanta 200, Tokyo, Japan) at an acceleration voltage of 15 kV.

Human Cell Lines

Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs; catalogue number:C0035C) and human fibroblasts (catalogue number:C0135C) were obtained from Thermo Fisher Scientific. HUVECs were maintained on low-serum Medium 200 basal media supplemented with Large Vessel Endothelial Supplement (Thermo Fisher Scientific) and 1% penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific), whereas fibroblasts were cultured in low-serum Medium 106 (Thermo Fisher Scientific) supplemented with Low Serum Growth Supplement (Thermo Fisher Scientific) and 1× penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific). Cells were maintained at 37 °C in a humidified atmosphere of 5% CO₂ /95% air.

To analyse biological interactions, the nanoplatforms were put into six-well plates. After detachment from the cell culture flask, HUVECs or fibroblasts were placed directly on the nanoplatform with 100 μl of growth media. To avoid the media drying during incubations, plates were kept in humidity chambers.

Analysis of Nanoplatform Toxicity to HUVECs and Fibroblasts

To analyse HUVEC and fibroblast viability on the nanoplatforms, cells were cultured in the droplet directly on the nanoplatforms or uncoated foil (1 × 10 ⁴ cells in 100 μl growth media). After 24 h of incubation, cell viability was analysed using a PrestoBlue assay (Thermo Fisher Scientific). PrestoBlue reagent was incubated with assessed cells for 2 h in a cell culture incubator. Subsequently, 50 μl of growth media with PrestoBlue reagent was transferred to a 96-well plate where fluorescence (excitation λ  = 560 nm, emission λ  = 590 nm) was analysed using a Tecan Infinite 200 microplate reader (Tecan, Durham, USA). Cell viability was expressed as the relative value after substitution of the fluorescence from blank samples. Experiments were repeated three times.

Fibroblast morphology was observed using an inverted optical microscope (Olympus Corporation) using phase contrast. Fibroblasts were seeded in 35-mm diameter Petri dishes directly on the nanoplatforms (1 × 10 ⁴ cells in 100 μl growth media). Images were taken after 24 h of incubation.

Chorioallantoic Membrane Assay

Fertilised eggs from Ross 308 hens were obtained from a certified hatchery and kept for 4 days at 12 °C. The eggs were cleaned, sterilised with UVC light and divided into four groups (4 × 20 eggs). Embryos were incubated at standard conditions (temperature 37 °C, humidity 60% and turned once per hour). At 8 days of embryonic development, small holes (1 cm ² ) were made in the shell above the air space, the inner membrane was gently striped off and the nanoplatforms were placed on the chicken embryo chorioallantoic membrane. Subsequently, chicken embryos were incubated for the next 48 h, when nanoplatforms were cut out with the chorioallantoic membrane that was directly below the nanoplatform. The chorioallantoic membrane on the nanoplatforms was imaged using a stereoscopic microscope (SZX10, Olympus Corporation).

Antibody Array Analysis

An analysis of inflammation cytokines in fibroblast growth medium was performed using an antibody array (Abcam, Cambridge, UK; catalogue number ab134003). Fibroblast cells (1 × 10 ⁴ ) were incubated on nanoplatforms coated with AgNPs, GO, Ag-GO and uncoated foil with 100 μl of media. After 24 h, 80 μl of growth medium was collected. For each experimental group, the growth medium from six foils was used for analysis. Pooled growth medium from the six experiments was centrifuged (1600 rpm for 5 min), and 500 μl of growth media was diluted in 500 μl of PBS. Therefore, 1 ml of diluted growth media was used per each analysed membrane. The assay was performed in accordance with the manufacturer’s instructions. Diluted growth media was incubated with the membranes for 24 h at 4 °C. Subsequently, antibodies conjugated with biotins were added and incubated for the next 24 h at 4 °C. In the next step, the membranes were incubated with streptavidin conjugated with horseradish peroxidase for 2 h at room temperature. Membranes were visualised after the addition of the provided horseradish peroxidase substrate using a ChemiDoc imaging system (Bio-Rad, Hercules, USA).

Statistical Analysis

Data were analysed using one-way analysis of variance with GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Differences between groups were tested with Tukey’s HSD post hoc tests. Results are shown as means with standard deviations. Differences at P  < 0.05 were considered significant.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

The datasets used and/or analysed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

Abkürzungen

Ag-GO:

Composite of silver nanoparticles and graphene oxide

AgNPs:

Silver nanoparticles

CFU:

Colony-forming units

DLS:

Dynamische Lichtstreuung

FT-IR:

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

GM-CSF:

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

GO:

Graphenoxid

HUVECs:

Human umbilical vein endothelial cells

IL-6:

Interleukin 6

IL-8:

Interleukin 8

SEM:

Rasterelektronenmikroskop

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop

TNF-α:

Tumour necrosis factor alpha

TNF-β:

Tumour necrosis factor beta