Die Studie zur verbesserten hochintensiven fokussierten Ultraschalltherapie durch sonodynamische N2O-Mikrobläschen

Einführung

Bösartige Tumoren sind eine der wichtigsten Krankheiten, die das Leben und die Gesundheit des Menschen bedrohen [1]. Hochintensiver fokussierter Ultraschall (HIFU) ist eine neue Technik zur nicht-invasiven lokalen Ablation von Tumoren. HIFU wird erfolgreich bei der Behandlung gutartiger und bösartiger solider Tumoren in Leber, Niere, Bauchspeicheldrüse, Prostata, Brust, Knochen und Gebärmutter eingesetzt [2, 3]. Die inhärenten Einschränkungen von HIFU, wie der Abfall der Ultraschallenergie während der Behandlung, die Abschwächung der Energieakkumulation im Zielgebiet und die Schädigung von gesundem Nichtzielgewebe, reduzieren jedoch seine therapeutische Wirkung [4, 5]. Das durch die HIFU-Bestrahlung gebildete Fokusfeld ist klein, normalerweise im Millimeterbereich. Es dauert lange, große Tumore zu entfernen. Die Verlängerung der HIFU-Bestrahlungszeit erhöht die Körpertemperatur und erreicht sogar 39,2 °C. Mit zunehmender Tumortiefe im Körper muss auch die Energie der HIFU-Ablation zunehmen [6]. Diese erhöhen das Risiko einer körperlichen Schädigung des Patienten und verringern die Effizienz und Sicherheit der HIFU-Behandlung. Daher haben sich Forscher in den letzten Jahren verpflichtet, Wege zur Steigerung der therapeutischen Effizienz von HIFU zu finden [7,8,9]. Mikrobläschen könnten die therapeutische Wirksamkeit von HIFU synergistisch verbessern [7, 10]. Das Gas in der Mikroblase gehört zum Material mit hoher akustischer Impedanz. Die Mikrobläschen erhöhen die Streuung und Reflexion der Ultraschallwelle im Zielgebiet, wenn das HIFU den Tumorgewebebereich bestrahlt [11, 12]. Mikrobläschen erhöhen die Temperatur des Tumorzielbereichs und verstärken die thermische Wirkung der HIFU-Behandlung, indem sie die Ansammlung von HIFU-Energie im Zielbereich erhöhen [13]. Darüber hinaus senken Mikrobläschen als exogener Kavitationskern auch die Gewebekavitationsschwelle und verstärken die Kavitationswirkung von HIFU beim Durchgang durch die Blutzirkulation in das Tumorgewebe [14]. In den letzten Jahren haben Studien gezeigt, dass die sonodynamische Therapie (SDT) die Wirksamkeit der HIFU-Behandlung synergistisch verbessern kann [15, 16]. Die Wechselwirkungen zwischen den Sonosensibilisatoren und Ultraschall produzieren reaktive Sauerstoffspezies (ROS), einschließlich Singulett-Sauerstoff und Hydroxylradikale, die Tumorzellen abtöten und das Tumorwachstum durch Apoptose und Nekrose hemmen [17]. SDT hat in den letzten Jahren große Fortschritte bei der nicht-invasiven Tumorbehandlung gemacht. Es ermöglicht die Reduzierung der Medikamentendosis und der HIFU-Bestrahlungsleistung im Vergleich zu herkömmlichen Monotherapien. Um die Vorteile der beiden voll auszuschöpfen, kombinierte diese Studie die Mikrobläschen und den sonodynamischen Effekt, um die Wirksamkeit von HIFU weiter zu verbessern. Sonosensitizer sind ein wichtiger Bestandteil der SDT [18, 19]. Die meisten der derzeit untersuchten traditionellen Sonosensibilisatoren stammen von Photosensibilisatoren. N₂ O ist ein Photosensibilisator [20, 21], der unter Bestrahlung mit ultraviolettem Licht giftige Substanzen produziert. In dieser Studie wurde die Sonosensitivität von N₂ O wurde auch zunächst erforscht. Wir haben bereits festgestellt, dass die Anwendung von N₂ O-Inhalationsanästhesie bei HIFU-Operation verschlimmerte den Verletzungsgrad des Gewebes, einschließlich der erhöhten Dicke der Bauch- und Hautstauung [22]. Die kombinierte Nutzung von N₂ O und HIFU spielten eine synergistische Wirkung auf die Gewebeschädigung. Aber welche biologische Wirkung N₂ O in der HIFU-Behandlung hat, ist unklar. N₂ O ist ein relativ stabiles kleinmolekulares Gas ohne Biotransformation und ohne Gewebespezifität in Zellen. Es ist im Gewebe breit einsetzbar und hat keine toxische Wirkung auf den Körper [23, 24]. Es ist also eine attraktive Perspektive als Sonosensibilisator. In dieser Studie wurden nanoskalige Mikrobläschen (N₂ O-mbs) wurden mit lipidumhülltem N₂ . hergestellt O und C₃ F₈ . Die Dosierung von N₂ O wurde reduziert und sein Wirkungsbereich in vivo wurde auch effektiv auf den Bereich des Tumorgewebes beschränkt. Der sonodynamische Effekt von N₂ O und seine synergistische Wirkung auf die HIFU-Wirksamkeit wurden untersucht.

Materialien und Methoden

Materialien

1,2-Dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphocholin (DPPC) und 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N -[Methoxy(polyethylenglykol)-2000] (DSPE-mPEG2000) wurden von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA) bezogen. Glycerin und Agarose wurden von Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. N₂ O und C₃ F₈ wurden von Chongqing Ruixin Gas Co., Ltd (China) bezogen. 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyaninperchlorat (DiI), 2′,7′-Dichlorfluorescindiacetat (DCFH-DA) , 3-Amino,4-aminomethyl-2',7'-difluorescein, diacetat (DAF-FM DA) und CCK-8 wurden von Beyotime Biotechnology (Chongqing, China) bezogen. Calcein-AM (CAM) und Propidiumiodid (PI) wurden von Santa Cruz Biotechnology (TX, USA) bezogen. Annexin V-FITC/PI wurden von Nanjing Keygen Biotech (Nanjing, China) bezogen. Singulett-Sauerstoffsensor grün (SOSG) wurde von Invitrogen (NY, USA) bezogen.

Vorbereitung von N₂ O-mbs und C₃ F₈ -mbs

N₂ O-mbs wurden durch den rotierenden Film in Kombination mit dem mechanischen Oszillationsverfahren hergestellt. Wir haben DPPC und DSPE-PEG2000 als Schalenmaterialien und N₂ . genommen O als Kern. Kurz gesagt wurden 5 mg DPPC, 2 mg DSPE-PEG2000 und 10 ml Chloroform gleichzeitig in einen Rundkolben gegossen, gemischt und durch Ultraschallwellen vollständig aufgelöst. Dann wurden die Lipidfilme durch Rotationsverdampfer (60 min, 55 °C, 100 U/min) gebildet. Als nächstes wurden 2 ml 10 % Glycerin zugegeben, um die Lipidfilme zu hydratisieren und eine Suspension herzustellen. 500 µl davon wurden in ein Kapselröhrchen gegeben. Das Kapselröhrchen wurde mit einer Gummikappe verschlossen. Die Luft in der Röhre wurde durch N₂ . ersetzt O und C₃ F₈ durch eine Gasverdrängungsvorrichtung. Anschließend wurde die Suspension mit einem Silber-Quecksilber-Kapselmischer (YJT-2, Shanghai Medical Device Co., Ltd., China) 150 s lang mechanisch oszilliert. Schließlich wurde die resultierende Suspension einer Differenzzentrifugation unterzogen, um das Ziel-N2 zu erhalten O-mbs und wurde 5 min bei 300 Upm zentrifugiert und dann 5 min bei 800 Upm zentrifugiert. N₂ O-mbs wurden in PBS resuspendiert und dann zur weiteren Verwendung bei 4 °C gelagert.

Die C₃ F₈ -mbs wurden mit der gleichen mechanischen Oszillationsmethode wie zuvor beschrieben hergestellt [25]. DiI-markiertes N₂ O-mbs können durch Zugabe von DiI während der Spinfilmbildung hergestellt werden. Es ist erwähnenswert, dass N₂ O hat ein niedriges Molekulargewicht und ist instabil. Die N₂ O in der Mikroblase läuft leicht über. Daher wird die Halbwertszeit der Mikroblase verringert. C₃ F₈ ist ein makromolekulares Inertgas, das bei der Untersuchung von Ultraschall-Mikrobläschen-Kontrastmitteln weit verbreitet ist. C₃ F₈ kann die Stabilität der Mikrobläschen erhöhen. Daher ist in dieser Studie N₂ O und C₃ F₈ (2:1) wurden als N₂ . gemischt O-mbs-Kern, um ihre Stabilität zu erhöhen.

Herstellung und Leistungserkennung von N₂ O-mbs

Die Morphologie und Größenverteilung von N₂ O-mbs wurden unter optischer Hellfeldmikroskopie beobachtet. Die Konzentrationen von N₂ O-mbs und C₃ F₈ -mbs wurden mit dem Globulimeter gemäß den Berechnungsrichtlinien berechnet. Die durchschnittliche Partikelgröße und das Zetapotential von N₂ O-mbs wurden durch ein dynamisches Laserlichtstreuungssystem (Malvern Instruments, Malvern, UK) bestimmt. Die Struktur und Morphologie des N₂ O-mbs wurden durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, Hitachi H-7600, Hitachi Ltd., Tokio, Japan) charakterisiert. Die vorbereiteten N₂ O-mbs wurden bei 4 °C gelagert. Um die Stabilität von N₂ . zu beobachten O-mbs, die Morphologie und Konzentration wurden am ersten, zweiten und dritten Tag aufgezeichnet. Gleichzeitig wurden die durchschnittliche Partikelgröße und das Zetapotential der Mikrobläschen bestimmt.

Zellkultur und Tiermodell

Menschliche Brustkrebszellen (MDA-MB-231; Jinxique Technology Development Co., Ltd. Chongqing, China) wurden im Labor für weniger als 3 Monate nach der Reanimation passagiert. Die Zellen wurden in einem 37 °C Inkubator mit 5 % CO₂ . gehalten , unter Verwendung von DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum, 50 µg/L Streptomycin und 50 µg/L Penicillin. Als die Zellen 80 % Konfluenz erreichten, wurden sie für Experimente verwendet.

Alle Tierversuche wurden nach den Richtlinien des Animal Ethics Committee der Chongqing Medical University durchgeführt. Eine bestimmte Anzahl weiblicher Nacktmäuse (4–6 Wochen alt; Gewicht 15–20 g) wurde vom Animal Experiment Center der Chongqing Medical University (Chongqing, China) gekauft. Zur Etablierung eines soliden Tumors, MDA-MB-231-Zellen (1 × 10 ⁶ Zellen/ml), die in normaler Kochsalzlösung (100 &mgr;l) suspendiert waren, wurden jeder Maus subkutan in die rechte hintere Flanke injiziert. Alle tumortragenden Mäuse wurden für therapeutische Experimente verwendet, als das Tumorvolumen etwa 150 mm ³ . erreichte .

Intrazelluläre Aufnahme und Biokompatibilitätsbewertung von N₂ O-mb

MDA-MB-231-Zellen in der Wachstumsphase wurden mit einer Dichte von ungefähr 1 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen pro konfokaler Laserscanning-Mikroskopie (CLSM)-Kolben für 24 h. Als nächstes 100 μl (1 × 10 ⁵ .) Blasen/ml) von DiI-markiertem N₂ O-mbs komplette Medium-Verdünnungslösung wurde zugegeben, um die konfokale Schale mit Medium zu füllen. Die Schale wurde mit Mikrotiterplatten-Versiegelungsmitteln versiegelt und in einem Inkubator umgedreht aufbewahrt, wobei das N₂ . erhalten blieb O-mbs in Kontakt mit den Zellen. Nach 2 h und 4 h Co-Inkubation wurden die Zellen dreimal vorsichtig mit PBS gewaschen, mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min fixiert und mit DAPI für 20 min gefärbt. Schließlich das Zell-Targeting-Verhalten von N₂ O-mbs wurde von CLSM (Nikon A1, Japan) beobachtet.

Die Zytotoxizität von N₂ O-mbs wurde durch einen Standard-CCK-8-Assay bewertet. MDA-MB-231-Zellen wurden in eine 96-Well-Platte ausgesät (5 × 10 ⁴ Zellen/Well) für 24 h. Als nächstes 100 μl verschiedener Konzentrationen (1 × 10 ⁴ /ml, 1 × 10 ⁵ /ml und 1 × 10 ⁶ /ml) von N₂ O-mb wurden hinzugefügt. Nach 24 h Inkubation wurde CCK-8-Lösung (10 &mgr;l) in jede Vertiefung gegeben. Anschließend wurden die MDA-MB-231-Zellen weitere 2 h bei 37 °C kultiviert. Schließlich wurde die Extinktion jedes Wells bei 450 nm mit einem Bio-Tek Mikroplatten-Lesegerät (Bio-Tek Instruments, Thermo Fisher Scientific, Winooski, VT, USA) gemessen.

Zehn gesunde weibliche Nacktmäuse mit einem Gewicht von ungefähr 20 g wurden zufällig in zwei Gruppen eingeteilt. Die N₂ O-mbs (n =5) der Gruppe wurde N₂ . intravenös injiziert O-mbs (200 μl, 1 × 10 ⁵ .) /ml) und die Kontrollgruppe (n =5) mit normaler Kochsalzlösung (200 μl) injiziert. Nach 21 Tagen wurden die Hauptorgane (Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere) aller Mäuse ausgeschnitten und mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) gefärbt.

In-vitro-SDT-Effizienz von N₂ O-mbs

Die Methode zum Nachweis von Sauerstoffradikalen basierte auf einem früheren Bericht [26]. Kurz gesagt wurden 10 µl SOSG (500 µM) mit 2 ml der Probenlösung gemischt. Die Behandlungen wurden wie folgt gruppiert:Gruppe C (die leere Kontrollgruppe), PBS allein wurde hinzugefügt; N₂ O-mbs-Gruppe, 100 μl N₂ O-mbs (1 × 10 ⁵ /ml) in 2 ml PBS-Lösung wurde zugegeben; C₃ F₈ -mbs-Gruppe, 100 μl C₃ F₈ -mbs (1 × 10 ⁵ /ml) in 2 ml PBS-Lösung wurde zugegeben; LIFU-Gruppe, PBS wurde mit Ultraschall bestrahlt (2 W/cm ² ; Institute of Ultrasound Imaging of Chongqing Medical Sciences, Chongqing, China) für 100 s; LIFU–N₂ O-mbs-Gruppe, PBS mit hinzugefügtem N₂ O-mbs wurde mit Ultraschall bestrahlt; LIFU–C₃ F₈ -mbs Gruppe, PBS mit hinzugefügtem C₃ F₈ -mbs wurde mit Ultraschall bestrahlt. Die Behandlungsparameter der Versuchsgruppe wurden auf 2 W/cm ² . festgelegt und 100 s durch die Analyse und den Vergleich der experimentellen Ergebnisse und die Konsultation der Literatur [27, 28]. Die zu Behandlungszwecken eingesetzten Ultraschallparameter wurden wie folgt eingestellt:Frequenz 650 kHz; Brennweite 12,5 mm; Pulswellenmodus, 50% Arbeitszyklus; und Impulsdauer, 1 s. Die Erzeugung von Singulett-Sauerstoff ( ¹ O₂ ) wurde durch Fluoreszenzspektrometrie (Cary Eclipse, Agilent Technologies) durch Messung der Fluoreszenzintensität (λ Erregung/λ Emission =504 nm/525 nm). Die Auswahl der Ultraschallintensität und -dauer entsprach in-vitro-Zellexperimenten.

Nachdem die Erzeugung von extrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) unter Verwendung des SOSG-Assays nachgewiesen wurde, wurde die Produktion von intrazellulärem ROS durch einen DCFH-DA-basierten ROS-Assay-Kit nachgewiesen. MDA-MB-231-Zellen wurden mit einer Dichte von ungefähr 1 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen pro CLSM-Flasche. Dann wurden sie zufällig in sechs Gruppen aufgeteilt:die Kontrollgruppe (ohne Behandlung), die N₂ Nur O-mbs-Gruppe (100 μl, 1 × 10 ⁵ Blasen/ml), die C₃ F₈ - nur mbs-Gruppe (100 μl, 1 × 10 ⁵ Blasen/ml), die einzige LIFU-Gruppe (2 W/cm ² für 100 s), die LIFU–C₃ F₈ -mbs-Gruppe, die LIFU–N₂ O-mbs-Gruppe. Nach einer Inkubation für 24 h, um eine Zellanheftung zu ermöglichen, wurde jede Gruppe der entsprechenden oben beschriebenen experimentellen Intervention unterzogen. Dann wurde in jeder Gruppe die gleiche Menge DCFH-DA (30 µM) in die entsprechende Schale gegeben und die Schale wurde 20 min im Dunkeln inkubiert. Die Zellen wurden dann dreimal vorsichtig mit PBS gespült, um die DCFH-Sonde zu entfernen, die nicht in die Zelle eindrang. Schließlich wurde die Erzeugung von intrazellulärem ROS durch CLSM bestimmt. Um die SDT-Effizienz von N₂ . weiter zu überprüfen O-mbs, Zellen wurden in 6-Well-Platten ausgesät, für 24 h kultiviert und zufällig in sechs Gruppen verteilt, wie oben beschrieben. Anschließend wurden in jeder Gruppe die entsprechenden Behandlungen durchgeführt. Die Zellen in jeder Gruppe wurden verdaut und in Zellsuspensionen mit geeigneten Konzentrationen präpariert und in eine CLSM-Schale gegeben. Schließlich wurden die Zellen nach der Co-Färbung mit CAM- und PI-Farbstoffen durch CLSM gescannt, um tote (rot) und lebende (grün) Zellen zu unterscheiden. Apoptose wurde durch Durchflusszytometrie und Annexin V-FITC/PI-Färbung nachgewiesen. Nach 1 h Behandlung wurde jede Zellgruppe zentrifugiert und die Zellen wurden gesammelt. Nach Annexin V-FITC/PI-Co-Färbung wurde eine Durchflusszytometrie (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) durchgeführt.

Sonodynamischer In-vitro-Effekt von N₂ O-mbs verbessert die Wirksamkeit der HIFU-Behandlung

Ein HIFU-System (JC200, HIFU Technology Co., Ltd., Chongqing, China) bestehend aus einem diagnostischen Ultraschallgerät, einem therapeutischen Ultraschallgerät und einem zentralen Verarbeitungssystem wurde wie zuvor beschrieben verwendet [29]. Die für Behandlungszwecke verwendeten HIFU-Parameter wurden wie folgt eingestellt:Arbeitsfrequenz 0,94 MHz; Brennweite 140 mm; Durchmesser 220 mm; und Echtzeit-Diagnosewandlerfrequenz 3,5 MH. Die integrierten Wandler wurden in entgastes Wasser getaucht. Um den Verstärkungseffekt von N₂ . zu bewerten O-mbs bei HIFU-Behandlung, MDA-MB-231-Zellen wurden zentrifugiert, 5 × 10 ⁵ /mL und in vier Gruppen aufgeteilt:die Kontrollgruppe (ohne Behandlung), die HIFU-only-Gruppe (125 W, 5 s), die HIFU-N₂ Nur O-mbs-Gruppe, die HIFU–C₃ F₈ -mbs nur Gruppe. Als nächstes wurden die unterschiedlichen jeweiligen Behandlungen für jede Gruppe durchgeführt. Die behandelten Zellen wurden zentrifugiert und mit PBS gewaschen, mit Annexin V-FITC/PI doppelt gefärbt und für die Durchflusszytometrie geerntet. Die Stickstoffmonoxid (NO)-Sonde DAF-FM wurde verwendet, um NO im Überstand jeder Behandlungsgruppe nachzuweisen. Alle Experimente wurden dreimal durchgeführt. TEM wurde verwendet, um die ultrastrukturelle Morphologie der behandelten Zellen zu identifizieren. Nach jeder Behandlung wurden die behandelten Zellen sofort mit 2% OsO₄ . fixiert , dehydriert in einer abgestuften Reihe von Alkohol und flach eingebettet in Epon 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA). Ultradünne Schnitte (100 nm) wurden hergestellt, mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und unter einem Elektronenmikroskop untersucht.

Ex Vivo und In Vivo sonodynamischer Effekt von N₂ O-mbs verbessert die Wirksamkeit der HIFU-Ablation

Frisches Rinderlebergewebe wurde von einem örtlichen Schlachthof gekauft und innerhalb von 12 Stunden nach der Schlachtung verwendet. Frische ex vivo Rinderleber mit wenig Bindegewebe und weniger Blutgefäßen wurde in 10 cm × 5 cm × 5 cm große Abschnitte geschnitten und 1 h bei 37 °C entgast. Die Rinderleber wurden in drei Gruppen eingeteilt:C₃ F₈ -mbs-Gruppe, N₂ O-mbs-Gruppe und PBS-Gruppe. Zuerst wurde frisch isolierte Rinderleber in einen Behälter mit entlüftetem Wasser gegeben. Dann 200 μl (1 × 10 ⁵ .) Bläschen/ml) von Mikrobläschen in PBS wurde auf die in Fig. 6a gezeigte Weise direkt in die Rinderleber injiziert. Unter Anleitung eines diagnostischen Ultraschallwandlers wurde der HIFU-Brennpunkt an der Injektionsstelle positioniert. Dann wurde der therapeutische Schallkopf verwendet, um eine 5 s lange Ablation bei unterschiedlicher Leistung (100 W, 125 W, 150 W) an der Injektionsstelle der Rinderleber durchzuführen. Schließlich wurde das koagulative nekrotische Volumen des Zielgebiets im Rinderlebergewebe gemäß der gemessenen maximalen Länge, Breite und Tiefe (mm) mit der folgenden Gleichung berechnet:V (mm ³ ) =π/6 × Länge × Breite × Tiefe. Darüber hinaus wurde der Grauwert des Zielbereichs vor und nach der HIFU-Ablation in jeder Gruppe auf den diagnostischen Ultraschallbildern aufgezeichnet.

Zwanzig tumortragende Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in vier Gruppen (n =5 pro Gruppe), einschließlich einer Kontrollgruppe (ohne Behandlung), einer HIFU-PBS-Gruppe, einer HIFU-C₃ F₈ -mbs-Gruppe und ein HIFU–N₂ O-mbs-Gruppe. HIFU (125 W, 5 s) Ablation des Tumors wurde angewendet, nachdem die Mäuse eine intravenöse Injektion von 200 μl C₃ . erhalten hatten F₈ -mbs-Gruppe, N₂ O-mbs und PBS. Das HIFU-Ablationsverfahren von soliden Tumoren war dem von ex vivo isolierter Rinderleber ähnlich. Zuerst wurden Mäuse mit 1% Pentobarbital (8 ml/kg) anästhesiert. Die Tumorstelle der Maus wurde in einen Behälter geimpft, der entlüftetes Wasser enthielt. Unter Anleitung eines diagnostischen Ultraschallwandlers wurde der HIFU-Brennpunkt am Tumorgewebe positioniert. Die Körpergewichte der Mäuse und das Tumorvolumen wurden im 3-Tage-Intervall aufgezeichnet. Schließlich wurden alle Mäuse 21 Tage nach der Behandlung getötet, und Tumorgewebe wurden von den Mäusen seziert und dann zur H&E, Proliferation Cell Nuclear Antigen (PCNA)-Färbung, Terminale Desoxynukleotidyltransferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL) geschickt.

Statistische Analyse

Alle Daten wurden mit GraphPad Prism (Version 7, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) dargestellt und analysiert. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. Jedes Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt. Statistische Analysen wurden durch Einweg-ANOVA mit Bonferroni-Nachtest (Vergleich aller Gruppen) oder Dunnett-Nachtest (Vergleich aller Gruppen mit einer Kontrollgruppe) durchgeführt. Ein Wert von p <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Charakterisierung von N₂ O-mbs

Die Herstellung von N₂ O-mbs durch das modifizierte mechanische Oszillationsverfahren führt zu einer hochstabilen milchig-weißen Suspension (Abb. 1a). Die N₂ O-mbs veränderte sich nach 72 h Lagerung bei Raumtemperatur nicht signifikant in Partikelgröße und Morphologie. Unter dem Lichtmikroskop N₂ O-mbs wurden mit einheitlicher Größe, guter Dispersion und hoher Stabilität beobachtet (Abb. 1b). Die Konzentration von N₂ O-mbs war 5,12 ± 0,45 × 10 ⁸ Blasen/ml. Wie in den TEM-Bildern (Abb. 1c) gezeigt, ist die Größe von N₂ O-mbs war gleichmäßig verteilt und die mittlere Größe betrug ungefähr 450 nm. Die N₂ Die Ergebnisse der dynamischen O-mb-Lichtstreuung zeigten hydrodynamische Durchmesser von 458,1 ± 17,26 nm (Polydispersitätsindex =0,368; Abb. 1d), was mit den TEM-Ergebnissen übereinstimmt. Das Potenzial des N₂ O-mbs war − 16,2 ± 0,35 mV (Abb. 1e) (Zusatzdatei 1:Abbildung S1).

a Fotos von N₂ O-mbs dispergiert in entionisiertem Wasser; b Bild von N₂ O-mbs unter optischer Hellfeldmikroskopie; c Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von N₂ O-mbs; d Größenverteilung von N₂ O-mbs; e scheinbares Zetapotential von N₂ O-mbs

Intrazelluläre Aufnahme und Biokompatibilität von N₂ O-mbs

Die Zytotoxizität von N₂ O-mbs gegen Zellen in vitro wurde mit der CCK-8-Methode untersucht. Wir definierten die Zelllebensfähigkeit der Kontrollgruppe als 100 %. Nach 24 h Inkubation zeigten die Ergebnisse der Zelllebensfähigkeit keine signifikante Zytotoxizität gegenüber MDA-MB-231-Zellen. Selbst bei hohem N₂ O-mb-Konzentrationen blieb die Zelllebensfähigkeit größer als 95 % (Abb. 2a). Die Zytotoxizität von N₂ O-mbs in vivo an gesunden Nacktmäusen wurde analysiert. Wie in Abb. 2b gezeigt, zeigte die histopathologische Analyse der Hauptorgane (Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere), dass N₂ O-mbs verursachte bei Mäusen keine signifikanten toxischen Schäden. Diese Ergebnisse zeigten, dass N₂ O-mbs haben eine hohe Biokompatibilität.

a Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den CCK-8-Assay bestimmt; b H&E-Färbung der Hauptorgane (Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere) bei gesunden weiblichen Nacktmäusen mit oder ohne N₂ O-mbs; c die Bilder von a bis d Zelle im Hellfeld zeigen, Zellkerne gefärbt mit DAPI, N₂ O-mbs, gefärbt mit DiI, und die zusammengeführten Ergebnisse der drei Fluoreszenzbilder; Maßstabsbalken =50 μm [NS keine Signifikanz im Vergleich zur Kontrollgruppe (0 Blasen/ml)]

Die intrazelluläre Aufnahme von N₂ O-mbs über verlängerte Inkubationszeiten (2 h und 4 h) wurden durch CLSM visualisiert. Die Inkubation von Zellen mit DiI-markiertem N₂ O-mbs führten zur Ansammlung einer großen Anzahl von N₂ O-mbs in der Krebszellmembran und im Zytoplasma. Wie in Abb. 2c gezeigt, gab es eine gute Kolokalisation von rot fluoreszierendem N₂ . O-mbs mit den blau fluoreszierenden Zellen. Dieses Ergebnis legt nahe, dass N₂ O-mbs werden effizient in MDA-MB-231-Krebszellen internalisiert.

Sonodynamischer Effekt von N₂ O-mbs In Vitro

SOSG ist eine häufig verwendete Sonde zur Singulett-Sauerstoffdetektion, die hochempfindlich und zuverlässig für die Detektion der Bildung von freien Sauerstoffradikalen ist. Um das Potenzial von N₂ . zu erkunden O-mbs als Sonosensitizer, SOSG wurde verwendet, um die ROS-Erzeugung in vitro nachzuweisen [30, 31]. SOSG kombiniert mit ¹ O₂ um SOSG-EP zu bilden, das sich durch eine Zunahme der Fluoreszenzintensität auszeichnet. Wie in Abb. 3a gezeigt, nach Ultraschallbestrahlung einer SOSG-Lösung, die N₂ . enthält O-mbs, der Fluoreszenzintensitätswert stieg signifikant an; im Vergleich zu den anderen Gruppen war die Produktion von freien Sauerstoffradikalen signifikant erhöht (p <0,01).

a Fluoreszenzspektrum von SOSG mit N₂ O-mbs mit LIFU bestrahlt; b die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den CCK8-Assay bestimmt; c konfokale Bilder der intrazellulären ROS-Erzeugung (grüne Fluoreszenz zeigt eine positive Färbung für mit DCFH-DA gefärbtes ROS an); d der durchschnittliche Fluoreszenzintensitätswert (DCFH-DA) jeder Gruppe, berechnet nach Image J. (Die Daten wurden als Mittelwert ± SD, n =5 pro Gruppe, *p <0,05, verglichen mit LIFU–C₃ F₈ -mbs-Gruppe)

Zusätzlich zum Nachweis der ROS-Erzeugung in wässriger Lösung nach Ultraschallbestrahlung von N₂ O-mbs, ein DCFH-DA ROS-Assay-Kit wurde verwendet, um die intrazelluläre ROS-Produktion von N₂ . zu bestimmen O-mbs. Wie in Abb. 3b gezeigt, zeigte die Positivkontrollgruppe die stärkste Fluoreszenzintensität. Das nächststärkste grüne Fluoreszenzsignal erschien nur im LIFU–N₂ O-mbs-Gruppe, die die konsequente Produktion von ROS bei gleichzeitiger Anwesenheit von N₂ . aufdeckt O-mbs und LIFU-Bestrahlung. In keiner der verbleibenden Gruppen wurde jedoch eine offensichtliche Fluoreszenz nachgewiesen (Abb. 3c). Die Zelllebensfähigkeit der Kontrollgruppe wurde als 100 % definiert. Die Ergebnisse des CCK-8-Assays zeigten etwa 46 % Zelltod in der LIFU-N₂ O-mbs-Gruppe (Abb. 3d). Die Zytotoxizität von N₂ O-mbs in Kombination mit LIFU wurde durch CLSM-Beobachtung des Zelltods nach der Behandlung bewertet. CAM wurde verwendet, um lebende Zellen mit grüner Fluoreszenz zu färben. PI wurde verwendet, um tote Zellen mit roter Fluoreszenz anzufärben. Wie in Abb. 4a gezeigt, gab es viele tote Zellen in der LIFU-N₂ . O-mbs-Gruppe. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse der Durchflusszytometrie, dass die Apoptoserate der MDA-MB-231-Zellgruppe signifikant höher war als die anderer Gruppen (p <0,05) nach dem kombinierten N₂ O-mbs mit LIFU-Behandlung (Abb. 4b). Die kombinierte C₃ F₈ -mbs mit LIFU-Behandlung verursachten keinen offensichtlichen Zelltod oder Apoptose. Die Ergebnisse zeigten ferner, dass als Reaktion auf SDT eine ausgedehnte Apoptose und Nekrose auftrat. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie stimmten mit denen des CLSM überein. Diese Ergebnisse zeigen, dass N₂ O-mbs in Kombination mit LIFU induzieren Tumorzell-Apoptose in vitro (Zusatzdatei 2:Abbildung S2; Zusatzdatei 3:Abbildung S3).

a Durchflusszytometrie-Analyse von Tumorzell-Apoptose und -Nekrose; b konfokale Bilder von CAM/PI-co-gefärbten MDA-MB-231-Zellen nach verschiedenen Behandlungen. Die Maßstabsbalken sind 100 μm

In-vitro-HIFU-Synergistische Wirkungsbewertung in Krebszellen

Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie sind in Abb. 5a dargestellt. Beide N₂ O-mbs und C₃ F₈ -mbs erhöhte die Mortalität von MDA-MB-231-Zellen nach HIFU-Ablation. Darüber hinaus im Vergleich zu HIFU-C₃ F₈ -mbs, N₂ O-mbs erhöhte die Apoptose von MDA-MB-231 signifikant (p <0,05; Abb. 5b). Die Ergebnisse des NO-Tests zeigten, dass die Fluoreszenzintensität des Überstands des HIFU-N₂ Die O-mbs-Gruppe war auch signifikant höher als die der übrigen Gruppen (p <0,05) (Abb. 5c). Veränderungen im Zytoplasma und in den Organellen wurden durch TEM beobachtet (Abb. 5d). Die Zelle der Kontrollgruppe (ohne jegliche Behandlung) zeigte eine vollständige Zellmorphologie. Im Zellzytoplasma der HIFU-Gruppe wurden große Mengen vakuolärer Substanzen gefunden. Aber die Zellen haben noch vollständige Zellmembranen und Kernmembranen. Sowohl die HIFU-N₂ O-mbs-Gruppe und HIFU–C₃ F₈ -mbs-Gruppe zeigte einen Verlust der Zellmembranintegrität und einen vollständigen Zerfall der Zellstruktur. Es war erwähnenswert, dass die TEM-Beobachtungen nur den Moment im Prozess des Zelltods und der Apoptose nach der Behandlung in jeder Gruppe darstellten. N₂ O-mbs als exogene Mikrobläschen haben einen offensichtlich synergistischen Effekt auf die HIFU-Behandlung. Im HIFU–N₂ O-mbs-Gruppe, der sonodynamische Effekt von N₂ O-mbs könnten mehr Zellapoptose fördern. Die Ergebnisse wurden sowohl im Durchflusszytometrie-Nachweis als auch im In-vivo-Experiment validiert (Zusatzdatei 4:Abbildung S4; Zusatzdatei 5:Abbildung S5)

a Ergebnisse des Annexin V-FITC/PI-Bindungsassays; b die durchschnittliche Zellapoptoserate in jeder Gruppe; c quantitative Analyse der NO-Erzeugung von N₂ O-mbs bestrahlt mit HIFU; d Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von Zellen. Die Maßstabsbalken betragen 100 µm. (Die Daten wurden als Mittelwert ± SD, n =5 pro Gruppe, *p <0,05, im Vergleich zur Kontrolle, HIFU , HIFU–C₃ F₈ -mbs-Gruppen)

N₂ O-mbs als Synergist für die HIFU-Therapie

Nach HIFU-Ablation der isolierten Rinderleber trat im Zielgebiet eine grau-weiße koagulative nekrotische Region auf (Abb. 6b). Die durchschnittlichen Echointensitätsänderungen im Zielbereich vor und nach HIFU sind in Abb. 6c dargestellt. Im Vergleich zu denen der PBS-Gruppe sind die Zielechointensitätswerte des C₃ F₈ -mbs-Gruppe und die N₂ O-mbs group were significantly increased after HIFU treatment (p <0.05) and increased as the HIFU ablation intensity increased. The coagulative necrotic volume of the latter two groups and the echo intensity of the B-mode ultrasound images of the target area both increased as the HIFU power increased (Fig. 6d, e).

a Schematic illustration of ex vivo HIFU ablation on degassed bovine livers; b photography of the targeted area in excised bovine liver after HIFU ablation; c real-time ultrasound images before and after HIFU irradiation on bovine livers at 100 W, 125 W and 150 W for 5 s; d quantitative analysis of echo intensity; e quantitative analysis of coagulative necrosis volume of the targeted area in the excised bovine liver after HIFU ablation. (The data were shown as mean ± SD, n =5 per group, *p <0.05, compared with 100 W, 5 s, 125 W, 5 s groups)

The synergistic effect of N₂ O-mbs on HIFU therapy was further verified in vivo. As shown in Fig. 7a, the digital photos of mice and corresponding tumor tissue were recorded 21 days after different treatment. Tumor growth was more effectively inhibited after N₂ O-mbs combined with HIFU treatment. The synergistic effect of N₂ O-mbs on HIFU treatment was also evaluated by H&E, PCNA, and TUNEL staining (Fig. 7b), which demonstrated that N₂ O-mbs combined with HIFU irradiation could cause larger scale of tumor cell necrosis as compared with HIFU–C₃ F₈ -mbs group. The cell morphology changes exhibited in HIFU–N₂ O-mbs were more obvious than other groups, including karyopyknosis, karyorrhexis and karyolysis, indicating the substantial necrosis of cancer cells.

a Digital photos of tumor-bearing mice and ex vivo tumors 21 days after different treatments; b H&E, PCNA and TUNEL staining of tumor sections after various treatments; c the corresponding calculated tumor volume of each group after 21 days of different treatments; d body weight of tumor-bearing mice for each group. The scale bars in HE staining are 100 μm; the scale bars in TUNEL and PCNA staining are 50 μm. (The data were shown as mean ± SD, n =5 per group, *p <0.05, compared with HIFU-C₃ F₈ -mbs group)

In addition, the tumor volume of HIFU–N₂ O-mbs exhibited a more significant inhibited tendency than HIFU–C₃ F₈ -mbs within the 21 days (Fig. 7c, d).

Diskussion

HIFU, as a new method of oncotherapy, has been clinically recognized and has achieved notable progress in the treatment of many solid tumors [32]. The thermal effect, cavitation effect, mechanical effect and acoustic chemical effect play significant roles in killing tumor cells and causing irreversible damage to the target area tissue during HIFU ablation [33]. HIFU has limited impact on surrounding normal tissues and is essentially a non-invasive tumor treatment. However, the energy carried by the ultrasound is attenuated due to increased transmission distance, absorption by the blood flow in the target area and the blockage of bones or gas in the body during the HIFU treatment, so that the energy transferred to the target area is reduced. However, prolonging the ablation time and increasing the treatment power increases the risk of normal tissue damage, such as skin burns, neurovascular damage and other complications [34]. Therefore, it is necessary to increase the efficacy of HIFU. Many studies have confirmed that both microbubbles and SDT can improve the efficacy of HIFU [15, 16, 35]. Die N₂ O-loaded microbubbles prepared in this study have a smaller particle size, but similar characteristics as ultrasonic microbubble contrast agents. Studies have shown that nano/microbubbles have the same imaging capability as microbubbles in vitro, but have greater capability than microbubbles in vivo [36]. So, N₂ O-mbs not only could be used for ultrasound guidance and localization for HIFU treatment, but also could be used as exogenous microbubbles to enhance the efficacy of HIFU (Additional file 6:Figure S6). At the same time, the sonodynamic effect of N₂ O-mbs could effectively improve the efficacy of HIFU. The generation of ROS after ultrasonic excitation is one of the most important factors for sonosensitizers [16]. To verify the sonosensitivity of N₂ O-mbs, the production of ROS in both extracellular and intracellular environments was detected in this study. The consistent result of both tests showed that N₂ O-mbs can generate ROS in both aqueous solution and intracellularly. Studies have also shown that gases (N₂ and O₂ ) trapped in cavitation nuclei in solution can undergo cleavage reactions and produce N and O free radicals [37, 38], as follows:

The cavitation effect and the advantage of microbubble packaging reduce the difficulty of the N₂ O reaction [39]. When incubated with cells, N₂ O-mbs exhibit good biocompatibility. The high selectivity, high affinity and high drug loading of nanoparticles [40], as well as the active phagocytosis by cells, promote efficient N₂ O-mbs binding to cancer cells. The nanobubbles display increased penetration, stability and ease of cell entry or aggregation around the cells [36]. In addition, the sonoporation effect of ultrasound can effectively promote the transfer of microbubbles into cells [41].

In contrast to the traditional microbubble contrast agent C₃ F₈ -mbs, N₂ O-mbs have a greater inhibitory effect on cell growth after ultrasonic irradiation, which is characterized by increased intracellular ROS, decreased cell viability, and apoptosis and necrosis. These results preliminarily suggested the sonodynamic toxic effect of N₂ O-mbs.

In the HIFU synergy experiment, the treatment parameters in the experimental group were set to 125 W for 5 s by analyzing and comparing the experimental results and consulting the literature, which validated a low HIFU power could induce sufficient ablation effect and reduce adverse effects. The results showed that N₂ O-mbs increased the necrosis and advanced apoptosis of more tumor cells. N₂ O-mbs acted as a nanoscale microbubble synergizer and its sonodynamic effect in response to HIFU may be the reason for the different experiment results. As a microbubble, N₂ O-mbs increased the deposition of HIFU energy in the target area and increased the temperature of the target area and increased the thermal effect of HIFU treatment [11]. The generation of the cavitation effect is closely related to the cavitation threshold and cavitation nucleus concentration [42]. N₂ O-mbs were cavitation nucleus that reduce the cavitation threshold of HIFU and facilitate the cavitation effect. Therefore, N₂ O-mbs effectively promoted cell necrosis. As a nanoscale microbubble synergizer, N₂ O-mbs were lysed and generate free radicals and nitrogen oxide in response to ultrasound. Studies have confirmed that ROS are important factors in apoptosis induction [43]. It is worth noting that many kinds of free radicals can cause damage to cells. In addition to the generation of oxygen radicals, N₂ O can generate other types of free radicals in cleavage reactions, such as nitrogen free radicals, which contribute to the killing of tumor cells. A small amount of nitric oxide (NO) production was detected in the cell supernatant after HIFU treatment, further indicating that the N₂ O cleavage reaction occurred. An et al. [44] reported that NO may have an anti-tumor function, the mechanism of which involves NO attacking suspected iron enzymes that cause cells to fail to grow and divide when they are trapped. In addition, unstable NO can interact with oxygen molecules to form hydroxyl radicals (HO ^· ) and NO₂ . Hydroxyl radicals are extremely cytotoxic and promote tumor cell apoptosis. NO is also an endothelium-derived relaxing factor. The generation of NO may be the reason for hyperaemia and abnormal swelling in patients during HIFU operation. In an excised bovine liver experiment, we carefully compared the echo intensity of B-mode ultrasound images, pathological changes and coagulative necrotic volume of the target area after HIFU ablation in the presence of N₂ O-mbs, C₃ F₈ -mbs and PBS. All of these results were consistent. Compared with PBS, N₂ O-mbs effectively enhanced the ablation effect of HIFU. This synergistic effect was also better demonstrated in the ablation of solid tumor in vivo, manifested by tumor cell apoptosis increased, tumor volume reduced and tumor growth inhibition. This finding further indicates that N₂ O-mbs may be a novel auxiliary agent for ultrasound that can be used to promote HIFU thermal tumor ablation. The synergistic effect of N₂ O-mbs in HIFU and the synergistic mechanism provide new ideas and theoretical practice for HIFU synergist research. But, the other related mechanisms of the synergy should be further explored. The effect of tumor ablation by HIFU combined with N₂ O-mbs should be further addressed.

Schlussfolgerung

In summary, we have developed N₂ O-mb nanoparticles. The characterization and biocompatibility of the N₂ O-mbs were determined. The sonosensitivity of N₂ O-mbs was examined by detecting the production of ROS in aqueous solution and intracellularly. Compared with C₃ F₈ -mbs, N₂ O-mbs generated ROS and promoted the apoptosis and necrosis of tumor cells, which exhibited extraordinary sonosensitivity. In the HIFU synergy experiments, the sonodynamic effects of N₂ O-mbs significantly increased the apoptosis and necrosis of tumor cells in vitro, and increased the coagulative necrotic volume and echo intensity in the ex vivo isolated bovine liver target area, and effectively inhibited tumor growth in vivo. These results suggested that N₂ O-mbs could be a new kind of sonosensitizer and a novel auxiliary agent for ultrasound therapy that can be used for the ablation of tumors by HIFU.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Schlussfolgerungen in diesem Manuskript basieren auf den Daten, die alle in diesem Papier präsentiert und gezeigt werden.

Abkürzungen

N₂ O-mbs:

N₂ O microbubbles

C₃ F₈ -mbs:

C₃ F₈ microbubbles

HIFU:

high-intensity focused ultrasound

LIFU:

low-intensity focused ultrasound

SOSG:

singlet oxygen sensor green

SDT:

sonodynamic therapy

DPPC:

1,2-dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphocholine

DSPE-mPEG2000:

1,2-distearoyl-sn-glycero-3phosphoethanolamine-N -[methoxy(polyethylene glycol)-2000

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-phenylindol

DiI:

1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate

DCFH-DA:

2′,7′-dichlorofluorescin diacetate

DAF-FM:

3-amino,4-aminomethyl-2′,7′-difluorescein, diacetate

CAM:

Calcein-AM

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

CLSM:

confocal laser scanning microscopy

TEM:

transmission electron microscope

DMEM:

Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium

FBS:

fetal bovine serum

PBS:

phosphate-buffered saline

DI:

deionized water

ROI:

regions of interest

ROS:

reactive oxygen species

NO:

nitric oxide