Verbesserung der HIFU-Krebsbehandlung durch sonodynamische N₂O-Mikrobläschen

Zusammenfassung

Hochintensiver fokussierter Ultraschall (HIFU) ist eine repräsentative nicht-invasive Krebstherapie, doch geringe therapeutische Wirksamkeit und das Risiko von Schäden am umliegenden gesunden Gewebe behindern die klinische Weiterentwicklung. Sonodynamische Therapie (SDT) tötet Tumorzellen durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die von Sonosensibilisatoren während der Ultraschallbehandlung erzeugt werden. SDT kann die HIFU-Wirksamkeit wie Mikrobläschen steigern. In dieser Arbeit entwickelten wir nanoskalige N₂O-Mikrobläschen (N₂O-mbs) mittels eines verbesserten mechanischen Oszillationsverfahrens. Diese Mikrobläschen zeigten gute Biokompatibilität und Tumorzellbindung. Die Sonosensitivität der N₂O-mbs wurde sowohl extrazellulär als auch intrazellulär durch ROS-Nachweis untersucht. Die toxischen Effekte dieser sonodynamischen Mikrobläschen auf Tumorzellen und der synergistische Effekt auf die HIFU-Behandlung wurden evaluiert. Signifikante Apoptose wurde durch ROS verursacht, die von N₂O-mbs unter Ultraschallbestrahlung erzeugt wurden. N₂O-mbs in Kombination mit HIFU erhöhten Nekrose und Apoptose von Tumorzellen in vitro sowie koagulatives Nekrosevolumen und Echointensität im bovinen Leberzielgebiet ex vivo. Diese sonodynamischen Mikrobläschen hemmten auch effizient Tumorwachstum in vivo. N₂O-mbs haben signifikanten Einfluss auf Behandlung und Ablationseffekt von HIFU aufgrund der Vorteile von Mikrobläschen und außergewöhnlicher Sonosensitivität. Dies deutet darauf hin, dass N₂O-mbs ein neuartiger Hilfsagent für Ultraschall sein könnten, um die HIFU-Tumorthermale Ablation zu fördern.

Einleitung

Malignome Tumoren gehören zu den Hauptkrankheiten, die menschliches Leben und Gesundheit bedrohen [1]. HIFU ist eine neue Technik für die nicht-invasive lokale Tumorablation. HIFU wurde erfolgreich bei gut- und bösartigen soliden Tumoren in Leber, Niere, Bauchspeicheldrüse, Prostata, Brust, Knochen und Uterus eingesetzt [2, 3]. Inherent begrenzungen von HIFU – Abfall der Ultraschallenergie während Behandlung, Abschwächung der Energieakkumulation im Zielgebiet, Schädigung nicht-zielgerichteten gesunden Gewebes – reduzieren den therapeutischen Effekt [4, 5]. Der fokussierte HIFU-Strahl ist klein (Millimeterbereich); Ablation großer Tumore dauert lange. Verlängerte Bestrahlungszeit erhöht Körpertemperatur (bis 39,2 °C). Mit zunehmender Tumortiefe muss auch die HIFU-Ablationsenergie steigen [6]. Dies erhöht das Risiko physischer Schäden und verringert Effizienz und Sicherheit. Daher suchen Forscher seit Jahren nach Wegen zur Steigerung der HIFU-Therapieeffizienz [7-9]. Mikrobläschen können die HIFU-Wirksamkeit synergistisch verbessern [7, 10]. Das Gas in der Mikroblase gehört zu hochakustisch-impedanten Materialien. Mikrobläschen erhöhen Streuung und Reflexion der Ultraschallwelle im Zielgebiet bei HIFU-Bestrahlung [11, 12]. Sie erhöhen die Temperatur im Tumorzielgebiet und verstärken den thermischen Effekt durch erhöhte HIFU-Energieakkumulation [13]. Als exogene Kavitationskeime senken Mikrobläschen auch den Gewebekavitationsschwellenwert und verstärken den Kavitationseffekt beim Passieren der Blutzirkulation in das Tumorgewebe [14]. In jüngster Zeit zeigte sich, dass sonodynamische Therapie (SDT) die HIFU-Behandlung synergistisch verbessern kann [15, 16]. Wechselwirkungen zwischen Sonosensibilisatoren und Ultraschall erzeugen ROS (Singulettsauerstoff, Hydroxylradikale), die Tumorzellen über Apoptose und Nekrose abtöten und Tumorwachstum hemmen [17]. SDT hat in der nicht-invasiven Tumorbehandlung große Fortschritte gemacht. Sie ermöglicht Reduktion von Arzneimitteldosis und HIFU-Bestrahlungsleistung im Vergleich zu Monotherapien. Um beide Vorteile zu nutzen, kombinierte diese Studie Mikrobläschen und sonodynamischen Effekt zur weiteren HIFU-Wirksamkeitssteigerung. Sonosensibilisatoren sind zentral für SDT [18, 19]. Die meisten traditionellen Sonosensibilisatoren stammen von Photosensibilisatoren. N₂O ist ein Photosensibilisator [20, 21], der unter UV-Bestrahlung toxische Substanzen erzeugt. Hier wurde die Sonosensitivität von N₂O erstmals erforscht. Wir fanden zuvor, dass N₂O-Inhalationsnarkose bei HIFU-Operationen Gewebeschäden verschlimmerte (erhöhte Bauchhautkongestion) [22]. Die kombinierte Nutzung von N₂O und HIFU zeigte synergistischen Effekt auf Gewebeschädigung. Der biologische Effekt von N₂O in der HIFU-Behandlung war jedoch unklar. N₂O ist ein relativ stabiles, kleines Molekülgas ohne Biotransformation und Gewebespezifität, weit im Gewebe verteilt, ohne toxische Wirkung [23, 24] – attraktiv als Sonosensibilisator. In dieser Studie wurden nanoskalige Mikrobläschen (N₂O-mbs) aus lipid-ummanteltem N₂O und C₃F₈ hergestellt. Die N₂O-Dosis wurde reduziert und der Wirkungsbereich in vivo effektiv auf das Tumorgewebe begrenzt. Der sonodynamische Effekt von N₂O und sein synergistischer Effekt auf die HIFU-Wirksamkeit wurden untersucht.

Materialien und Methoden

Materialien

1,2-Dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphocholin (DPPC) und 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-2000] (DSPE-mPEG2000) von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). Glycerin und Agarose von Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). N₂O und C₃F₈ von Chongqing Ruixin Gas Co., Ltd (China). 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanin-perchlorat (DiI), 2′,7′-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA), 3-Amino,4-aminomethyl-2′,7′-difluorescein-diacetat (DAF-FM DA) und CCK-8 von Beyotime Biotechnology (Chongqing, China). Calcein-AM (CAM) und Propidiumiodid (PI) von Santa Cruz Biotechnology (TX, USA). Annexin V-FITC/PI von Nanjing Keygen Biotech (Nanjing, China). Singulettsauerstoff-Sensor Green (SOSG) von Invitrogen (NY, USA).

Herstellung von N₂O-mbs und C₃F₈-mbs

N₂O-mbs wurden durch Rotationsfilm- und mechanisches Oszillationsverfahren hergestellt. DPPC und DSPE-PEG2000 als Schalenmaterial, N₂O als Kern. Kurz: 5 mg DPPC, 2 mg DSPE-PEG2000, 10 ml Chloroform in Rundkolben, Ultraschall zur vollständigen Lösung. Lipidfilmbildung durch Rotationsverdampfer (60 min, 55 °C, 100 U/min). 2 ml 10 % Glycerin zur Hydratation des Lipidfilms und Suspensionsherstellung. 500 µl davon in Kapselröhrchen. Gummikappe, Luft im Röhrchen durch Gasverdrängungsvorrichtung mit N₂O und C₃F₈ ersetzt. Suspension 150 s mechanisch oszilliert (Silber-Quecksilber-Kapselmischer YJT-2, Shanghai Medical Device Co., Ltd., China). Differenzialzentrifugation zur Erzielung der Ziel-N₂O-mbs: 300 rpm 5 min, dann 800 rpm 5 min. N₂O-mbs in PBS resuspendiert, bei 4 °C gelagert.

C₃F₈-mbs wurden mit derselben mechanischen Oszillationsmethode hergestellt [25]. DiI-markierte N₂O-mbs durch DiI-Zugabe während der Drehfilmbildung. Bemerkung: N₂O hat geringes Molekulargewicht und ist instabil; N₂O in der Mikroblase entweicht leicht → verkürzte Halbwertszeit. C₃F₈ ist makromolekulares Inertgas, weit verbreitet in Ultraschall-Mikroblasen-Kontrastmitteln, erhöht Stabilität. Daher wurden N₂O und C₃F₈ (2:1) als N₂O-mbs-Kern gemischt zur Stabilitätserhöhung.

Herstellung und Leistungsdetektion von N₂O-mbs

Morphologie und Größenverteilung per Hellfeld-Lichtmikroskopie. Konzentrationen von N₂O-mbs und C₃F₈-mbs via Globulimeter nach Berechnungsrichtlinien. Mittlere Partikelgröße und Zeta-Potenzial per dynamischer Laserlichtstreuung (Malvern Instruments, Malvern, UK). Struktur und Morphologie per TEM (Hitachi H-7600, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan). Hergestellte N₂O-mbs bei 4 °C gelagert. Stabilitätsbeobachtung: Morphologie und Konzentration an Tag 1, 2, 3 aufgezeichnet. Gleichzeitig mittlere Partikelgröße und Zeta-Potenzial bestimmt.

Zellkultur und Tiermodell

Humane Brustkrebszellen (MDA-MB-231; Jinxique Technology Development Co., Ltd., Chongqing, China) im Labor <3 Monate nach Reanimation passagiert. 37 °C, 5 % CO₂, DMEM mit 10 % FBS, 50 µg/l Streptomycin, 50 µg/l Penicillin. Bei 80 % Konfluenz für Experimente verwendet.

Alle Tierexperimente gemäß Richtlinien des Tierschutzkomitees der Chongqing Medical University. Weibliche Nacktmäuse (4–6 Wochen, 15–20 g) vom Tierversuchszentrum der Chongqing Medical University. Für soliden Tumor: MDA-MB-231-Zellen (1×10⁶ Zellen/ml) in NaCl (100 µl) subkutan in rechte Rückenflanke injiziert. Alle tumorbeladenen Mäuse für Therapieexperimente bei Tumorvolumen ~150 mm³ verwendet.

Intrazelluläre Aufnahme und Biokompatibilität von N₂O-mb

MDA-MB-231-Zellen in Wachstumsphase, Dichte ~1×10⁵ Zellen pro CLSM-Schale, 24 h. 100 µl (1×10⁵ Blasen/ml) DiI-markierte N₂O-mbs in Vollmedium verdünnt, Schale mit Medium gefüllt. Mit Mikroplattendichter versiegelt, invertiert in Inkubator, N₂O-mbs in Kontakt mit Zellen. Nach 2 h und 4 h Koinkubation: 3× PBS-Waschen, 4 % PFA 20 min Fixierung, DAPI 20 min Färbung. Zellzielverhalten per CLSM (Nikon A1, Japan) beobachtet.

Zytotoxizität per CCK-8-Assay. MDA-MB-231 in 96-Well-Platte (5×10⁴ Zellen/Well) 24 h. 100 µl verschiedener Konzentrationen (1×10⁴/ml, 1×10⁵/ml, 1×10⁶/ml) N₂O-mb zugegeben. 24 h Inkubation, CCK-8-Lösung (10 µl) pro Well. Weitere 2 h bei 37 °C. Absorption bei 450 nm (Bio-Tek Mikroplattenreader, Thermo Fisher Scientific).

10 gesunde weibliche Nacktmäuse (~20 g) randomisiert in zwei Gruppen (je 5). N₂O-mbs-Gruppe: i.v. 200 µl N₂O-mbs (1×10⁵/ml); Kontrollgruppe: 200 µl NaCl. Nach 21 Tage: Hauptorgane (Herz, Leber, Milz, Lunge, Niere) exzidiert, H&E-Färbung.

In vitro SDT-Effizienz von N₂O-mbs

Sauerstoffradikaldetektion basierend auf Vorbericht [26]. 10 µl SOSG (500 µM) mit 2 ml Probenlösung gemischt. Gruppen: C (Blankokontrolle, nur PBS); N₂O-mbs (100 µl, 1×10⁵/ml in 2 ml PBS); C₃F₈-mbs (100 µl, 1×10⁵/ml in 2 ml PBS); LIFU (PBS, Ultraschall 2 W/cm², 100 s, Institut für Ultraschallbildgebung Chongqing Medical Sciences); LIFU–N₂O-mbs (PBS + N₂O-mbs, Ultraschall); LIFU–C₃F₈-mbs (PBS + C₃F₈-mbs, Ultraschall). Parameter: 2 W/cm², 100 s (basierend auf Experimenten und Literatur [27, 28]). Ultraschallparameter: Frequenz 650 kHz, Brennweite 12,5 mm, Pulswellenmodus 50 % Duty Cycle, Pulsdauer 1 s. Singulettsauerstoff (¹O₂) via Fluoreszenzspektrometrie (Cary Eclipse, Agilent) durch Fluoreszenzintensität (λ_ex/λ_em = 504/525 nm). Ultraschallintensität und -dauer konsistent mit in vitro Zellexperimenten.

Nach extrazellulärem ROS-Nachweis (SOSG) intrazellulärer ROS-Nachweis per DCFH-DA-ROS-Assay-Kit. MDA-MB-231 ~1×10⁵ Zellen/CLSM-Schale, randomisiert in 6 Gruppen: Kontrolle (ohne Behandlung), N₂O-mbs only (100 µl, 1×10⁵/ml), C₃F₈-mbs only (100 µl, 1×10⁵/ml), LIFU only (2 W/cm², 100 s), LIFU–C₃F₈-mbs, LIFU–N₂O-mbs. 24 h Anheftung, dann jeweilige Intervention. 30 µM DCFH-DA pro Schale, 20 min Dunkelinkubation. 3× PBS-Spülung zur Entfernung nicht internalisierter DCFH-Sonde. Intrazellulärer ROS per CLSM detektiert. Zur weiteren SDT-Effizienzverifizierung: Zellen in 6-Well-Platten, 24 h, gleiche 6 Gruppen. Behandlungen durchgeführt. Zellen verdaut, Zellsuspensionen, CLSM-Schale. CAM/PI-Co-Färbung (lebend grün, tot rot), CLSM-Scan. Apoptose per Durchflusszytometrie und Annexin V-FITC/PI-Färbung. 1 h post-Behandlung: Zentrifugation, Zellsammlung, Annexin V-FITC/PI-Co-Färbung, Durchflusszytometrie (Becton-Dickinson).

In vitro sonodynamischer Effekt von N₂O-mbs verstärkt HIFU-Behandlung

HIFU-System (JC200, HIFU Technology Co., Ltd., Chongqing, China) mit Diagnostik-Ultraschall, Therapie-Ultraschall, Zentrale Verarbeitung [29]. HIFU-Parameter: Arbeitsfrequenz 0,94 MHz, Brennweite 140 mm, Durchmesser 220 mm, Echtzeit-Diagnostik-Transducer 3,5 MHz. Integrierte Transducer in entgastem Wasser. Evaluierung der Verstärkung von N₂O-mbs auf HIFU: MDA-MB-231 zentrifugiert, 5×10⁵/ml, 4 Gruppen: Kontrolle (ohne Behandlung), HIFU only (125 W, 5 s), HIFU–N₂O-mbs, HIFU–C₃F₈-mbs. Jeweilige Behandlungen. Behandelte Zellen zentrifugiert, PBS-Waschen, Annexin V-FITC/PI-Doppelfärbung, Durchflusszytometrie. NO-Sonde DAF-FM für NO im Überstand jeder Behandlungsgruppe. Alle Experimente 3× wiederholt. TEM für Ultrastruktur behandelter Zellen. Nach Behandlung: Sofortfixierung 2 % OsO₄, Dehydrierung (Alkoholgradient), Flacheinbettung Epon 812 (Electron Microscopy Sciences). Ultradünnschnitte (100 nm), Uranylacetat/Bleicitrat-Färbung, Elektronenmikroskopie.

Ex vivo und in vivo sonodynamischer Effekt von N₂O-mbs verstärkt HIFU-Ablation

Frisches Rinderlebergewebe vom lokalen Schlachthof, innerhalb 12 h post mortem verwendet. Frische ex vivo Rinderleber (wenig Bindegewebe, wenige Blutgefäße) in 10×5×5 cm Scheiben, 1 h bei 37 °C entgast. Rinderlebern in 3 Gruppen: C₃F₈-mbs, N₂O-mbs, PBS. Frische Leber in Container mit entgastetem Wasser. 200 µl (1×10⁵ Blasen/ml) Mikrobläschen in PBS direkt in Rinderleber injiziert (Schema Abb. 6a). Unter Diagnostik-Ultraschallführung HIFU-Fokus an Injektionsstelle positioniert. Therapeutischer Transducer: 5 s Ablation bei verschiedenen Leistungen (100 W, 125 W, 150 W) an Injektionsstelle. Koagulatives Nekrosevolumen im Zielgebiet berechnet aus maximaler Länge, Breite, Tiefe (mm): V (mm³) = π/6 × Länge × Breite × Tiefe. Grauwert des Zielgebiets vor/nach HIFU-Ablation in jeder Gruppe im diagnostischen Ultraschallbild aufgezeichnet.

20 tumorbeladene Mäuse randomisiert in 4 Gruppen (je 5): Kontrolle (keine Behandlung), HIFU–PBS, HIFU–C₃F₈-mbs, HIFU–N₂O-mbs. HIFU (125 W, 5 s) Tumorablation nach i.v. Injektion von 200 µl C₃F₈-mbs, N₂O-mbs, PBS. HIFU-Ablationsprozedur ähnlich ex vivo Rinderleber. Mäusenarkose: 1 % Pentobarbital (8 ml/kg). Tumorstelle in Container mit entgastetem Wasser. Unter Diagnostik-Ultraschallführung HIFU-Fokus auf Tumor. Mäusegewicht und Tumorvolumen alle 3 Tage erfasst. Nach 21 Tagen alle Mäuse getötet, Tumorgewebe exzidiert, H&E, PCNA, TUNEL.

Statistische Analyse

Daten mit GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) dargestellt und analysiert. Daten als Mittelwert ± SD. Jedes Experiment ≥3 Wiederholungen. Statistik: Einfaktorielle ANOVA mit Bonferroni-Post-Test (alle Gruppen vergleichen) oder Dunnett-Post-Test (alle Gruppen vs. Kontrolle). p < 0,05 = statistisch signifikant.

Ergebnisse

Charakterisierung von N₂O-mbs

Herstellung via modifizierter mechanischer Oszillation ergab hochstabile milchig-weiße Suspension (Abb. 1a). N₂O-mbs änderten Partikelgröße und Morphologie nach 72 h bei Raumtemperatur nicht signifikant. Lichtmikroskopie: gleichmäßige Größe, gute Dispersion, hohe Stabilität (Abb. 1b). Konzentration: 5,12 ± 0,45 × 10⁸ Blasen/ml. TEM (Abb. 1c): gleichmäßig verteilte Größe, mittlere Größe ~450 nm. Dynamische Lichtstreuung: hydrodynamischer Durchmesser 458,1 ± 17,26 nm (Polydispersitätsindex 0,368; Abb. 1d) – konsistent mit TEM. Zeta-Potenzial: −16,2 ± 0,35 mV (Abb. 1e) (Zusatzdatei 1: Abb. S1).

Intrazelluläre Aufnahme und Biokompatibilität von N₂O-mbs

Zytotoxizität in vitro per CCK-8. Kontrollgruppe Zellviabilität = 100 %. Nach 24 h: keine signifikante Zytotoxizität gegen MDA-MB-231. Selbst bei hohen N₂O-mb-Konzentrationen Zellviabilität >95 % (Abb. 2a). In vivo Zytotoxizität an gesunden Nacktmäusen: Histopathologie der Hauptorgane (Herz, Leber, Milz, Lunge, Niere) zeigte keine signifikanten toxischen Schäden durch N₂O-mbs (Abb. 2b). → Hohe Biokompatibilität.

Intrazelluläre Aufnahme über längere Inkubation (2 h, 4 h) per CLSM visualisiert. Inkubation mit DiI-markierten N₂O-mbs → Anreicherung zahlreicher N₂O-mbs an Krebszellmembran und im Zytoplasma. Abb. 2c: gute Kolokalisierung roter N₂O-mbs-Fluoreszenz mit blauer Zellfluoreszenz. → N₂O-mbs werden effizient in MDA-MB-231-Krebszellen internalisiert.

Sonodynamischer Effekt von N₂O-mbs in vitro

SOSG – hochempfindlicher, zuverlässiger Singulettsauerstoff-Nachweis [30, 31]. SOSG + ¹O₂ → SOSG-EP → Fluoreszenzintensitätsanstieg. Abb. 3a: Nach Ultraschallbestrahlung von SOSG-Lösung mit N₂O-mbs signifikant erhöhte Fluoreszenzintensität; vs. andere Gruppen signifikant erhöhte Sauerstofffreiradikalerzeugung (p < 0,01).

Zusätzlich intrazellulärer ROS-Nachweis per DCFH-DA-ROS-Assay-Kit. Abb. 3b: Positive Kontrollgruppe stärkste Fluoreszenz. Nächststärkere grüne Fluoreszenz nur in LIFU–N₂O-mbs-Gruppe → signifikante ROS-Produktion bei simultaner Präsenz von N₂O-mbs und LIFU. Andere Gruppen: keine offensichtliche Fluoreszenz (Abb. 3c). Kontrollgruppe Zellviabilität = 100 %. CCK-8: ~46 % Zelltod in LIFU–N₂O-mbs-Gruppe (Abb. 3d). Zytotoxizität von N₂O-mbs + LIFU per CLSM nach CAM/PI-Co-Färbung (lebend grün, tot rot). Abb. 4a: viele tote Zellen in LIFU–N₂O-mbs-Gruppe. Durchflusszytometrie: Apoptoserate der MDA-MB-231-Gruppe nach N₂O-mbs + LIFU signifikant höher als andere Gruppen (p < 0,05) (Abb. 4b). C₃F₈-mbs + LIFU verursachte keinen offensichtlichen Zelltod/Apoptose. Ergebnisse deuten auf extensive Apoptose und Nekrose durch SDT hin. Durchflusszytometrie konsistent mit CLSM. → N₂O-mbs + LIFU induzieren Tumorzellapoptose in vitro (Zusatzdatei 2: Abb. S2; Zusatzdatei 3: Abb. S3).

In vitro HIFU-Synergieeffekt in Krebszellen

Durchflusszytometrie (Abb. 5a): Sowohl N₂O-mbs als auch C₃F₈-mbs erhöhten Mortalität von MDA-MB-231 nach HIFU-Ablation. Vs. HIFU–C₃F₈-mbs: N₂O-mbs erhöhten MDA-MB-231-Apoptose signifikant (p < 0,05; Abb. 5b). NO-Test: Fluoreszenzintensität des Überstands der HIFU–N₂O-mbs-Gruppe signifikant höher als andere Gruppen (p < 0,05) (Abb. 5c). Zytoplasma- und Organellveränderungen per TEM (Abb. 5d). Kontrollgruppe: vollständige Zellmorphologie. HIFU-Gruppe: große vakuoläre Substanzen im Zytoplasma, aber intakte Zell- und Kernmembran. HIFU–N₂O-mbs und HIFU–C₃F₈-mbs: Verlust Zellmembranintegrität, vollständige Zellstrukturdesintegration. TEM zeigt Moment im Zelltod/Apoptose-Prozess. N₂O-mbs als exogene Mikrobläschen haben offensichtlichen Synergieeffekt auf HIFU. In HIFU–N₂O-mbs-Gruppe fördert sonodynamischer Effekt mehr Zellapoptose. Validiert in Durchflusszytometrie und in vivo (Zusatzdatei 4: Abb. S4; Zusatzdatei 5: Abb. S5).

N₂O-mbs als Synergist für HIFU-Therapie

Nach HIFU-Ablation isolierter Rinderleber: grau-weißes koagulativ-nekrotisches Areal im Zielgebiet (Abb. 6b). Mittlere Echointensitätsänderungen vor/nach HIFU (Abb. 6c). Vs. PBS-Gruppe: Ziel-Echointensität von C₃F₈-mbs- und N₂O-mbs-Gruppe nach HIFU signifikant erhöht (p < 0,05), Anstieg mit HIFU-Ablationsintensität. Koagulatives Nekrosevolumen und B-Mode-Echointensität des Zielgebiets stiegen mit HIFU-Leistung an (Abb. 6d, e).

Synergieeffekt in vivo verifiziert. Abb. 7a: Digitalfotos von Mäusen und Tumorgewebe 21 Tage post-Behandlung. Tumorwachstum nach N₂O-mbs + HIFU effektiver inhibiert. H&E, PCNA, TUNEL (Abb. 7b): N₂O-mbs + HIFU verursachten größeren Tumorzellnekrose vs. HIFU–C₃F₈-mbs. Zellmorphologieveränderungen in HIFU–N₂O-mbs offensichtlicher: Karyopyknose, Karyorrhexis, Karyolyse → substanzielle Nekrose.

Zudem: Tumorvolumen von HIFU–N₂O-mbs zeigte über 21 Tage signifikant stärkere Inhibierungstendenz vs. HIFU–C₃F₈-mbs (Abb. 7c, d).

Diskussion

HIFU als neue Onkotherapie-Methode klinisch anerkannt, beachtlicher Fortschritt bei soliden Tumoren [32]. Thermischer Effekt, Kavitationseffekt, mechanischer Effekt, akustisch-chemischer Effekt spielen signifikante Rollen bei Tumorzelltötung und irreversibler Zielgewebeschädigung [33]. HIFU hat begrenzte Auswirkung auf umliegendes Normale Gewebe, im Wesentlichen nicht-invasiv. Doch Ultraschallenergie wird attenuiert durch erhöhte Transmissionsdistanz, Absorption durch Blutfluss im Zielgebiet, Blockierung durch Knochen/Gas im Körper → Energie im Zielgebiet reduziert. Verlängerte Ablationszeit und erhöhte Behandlungsleistung erhöhen Risiko von Normalgewebeschäden (Hautverbrennungen, neurovaskuläre Schäden, Komplikationen) [34]. Daher notwendig, HIFU-Wirksamkeit zu steigern. Viele Studien bestätigen: Mikrobläschen und SDT verbessern HIFU-Wirksamkeit [15, 16, 35]. In dieser Studie hergestellte N₂O-beladene Mikrobläschen haben kleinere Partikelgröße, aber ähnliche Eigenschaften wie ultraschall-Mikroblasen-Kontrastmittel. Nano-/Mikrobläschen haben gleiche Bildgebungsfähigkeit in vitro, aber größere Fähigkeit in vivo [36]. → N₂O-mbs nicht nur für Ultraschallführung/Lokalisierung bei HIFU, sondern auch als exogene Mikrobläschen zur HIFU-Wirksamkeitssteigerung nutzbar (Zusatzdatei 6: Abb. S6). Gleichzeitig verbessert sonodynamischer Effekt von N₂O-mbs HIFU-Wirksamkeit effektiv. ROS-Erzeugung nach ultraschallischer Anregung ist entscheidender Faktor für Sonosensibilisatoren [16]. Zur Verifizierung der Sonosensitivität von N₂O-mbs wurde ROS-Produktion in extrazellulärer und intrazellulärer Umgebung detektiert. Konsistente Ergebnisse beider Tests: N₂O-mbs erzeugen ROS in wässriger Lösung und intrazellulär. Studien zeigen: Gase (N₂, O₂) in Kavitationskeimen in Lösung können Spaltungsreaktionen durchlaufen und N- und O-Freiradikale erzeugen [37, 38]:

$$ N_2O \to N_2 + O_2 \quad O_2 \to 2\bullet O \quad N_2 \to 2N\cdot + HO\cdot \to NO + H\cdot \quad NO + HO\cdot \to HNO $$

Kavitationseffekt und Mikroblasenverpackung verringern Schwierigkeit der N₂O-Reaktion [39]. Bei Zellinkubation: N₂O-mbs zeigen gute Biokompatibilität. Hohe Selektivität, Affinität, Drug-Loading von Nanopartikeln [40] sowie aktive Phagozytose fördern effiziente N₂O-mbs-Bindung an Krebszellen. Nanobläschen zeigen erhöhte Penetration, Stabilität, leichteren Zelleintritt oder Aggregation um Zellen [36]. Sonoporationseffekt von Ultraschall fördert Mikroblasentransfer in Zellen [41].

Im Gegensatz zu traditionellem Mikroblasen-Kontrastmittel C₃F₈-mbs: N₂O-mbs haben größeren hemmenden Effekt auf Zellwachstum nach Ultraschallbestrahlung – charakterisiert durch erhöhte intrazelluläre ROS, verringerte Zellviabilität, Apoptose und Nekrose. → Vorläufige Evidenz für sonodynamischen Toxizitätseffekt von N₂O-mbs.

Im HIFU-Synergieexperiment: Behandlungsparameter der Experimentalgruppe auf 125 W, 5 s gesetzt (basierend auf Experimenten und Literatur), validiert dass niedrige HIFU-Leistung ausreichende Ablation induziert und Nebenwirkungen reduziert. Ergebnisse: N₂O-mbs erhöhten Nekrose und fortgeschrittene Apoptose mehrerer Tumorzellen. N₂O-mbs wirken als nanoskaliger Mikroblasensynergist; sonodynamischer Effekt auf HIFU könnte Grund für unterschiedliche Ergebnisse sein. Als Mikroblase: N₂O-mbs erhöhen HIFU-Energieablagerung im Zielgebiet, erhöhen Zieltemperatur, verstärken thermischen Effekt [11]. Kavitationserzeugung eng verknüpft mit Kavitationsschwellenwert und -keimkonzentration [42]. N₂O-mbs als Kavitationskeime senken HIFU-Kavitationsschwellenwert, erleichtern Kavitationseffekt → effektive Förderung von Zellnekrose. Als nanoskaliger Mikroblasensynergist: N₂O-mbs lysieren unter Ultraschall, erzeugen Freiradikale und Stickstoffoxide. ROS sind wichtige Faktoren der Apoptoseinduktion [43]. Viele Freiradikalarten schädigen Zellen. Neben Sauerstoffradikalen kann N₂O in Spaltungsreaktionen Stickstofffreiradikale erzeugen, die Tumorzelltötung unterstützen. Geringe NO-Produktion im Zellüberstand nach HIFU detektiert → N₂O-Spaltungsreaktion erfolgt. An et al. [44]: NO kann antitumoröse Funktion haben (Mechanismus: NO attackiert vermutete Eisenenzyme → Zellen können nicht wachsen/teilen). Instabiles NO interagiert mit O₂ zu Hydroxylradikalen (HO·) und NO₂. Hydroxylradikale extrem zytotoxisch → Tumorzellapoptose. NO auch endotheliales Relaxationsfaktor → NO-Erzeugung könnte Ursache für Hyperämie und abnorme Schwellung bei Patienten während HIFU-Operation sein. Im ex vivo Rinderleberexperiment: sorgfältiger Vergleich Echointensität B-Mode-Ultraschall, pathologische Veränderungen, koagulatives Nekrosevolumen nach HIFU-Ablation mit N₂O-mbs, C₃F₈-mbs, PBS. Alle Ergebnisse konsistent. Vs. PBS: N₂O-mbs verstärkten HIFU-Ablationseffekt effektiv. Synergieeffekt auch bei solider Tumorablation in vivo besser demonstriert: erhöhte Tumorzellapoptose, reduziertes Tumorvolumen, Tumorwachstumsinhibition. → N₂O-mbs könnten neuartiger Hilfsagent für Ultraschall sein zur Förderung der HIFU-thermalen Tumorablation. Synergieeffekt und -mechanismus liefern neue Ideen und theoretische Praxis für HIFU-Synergist-Forschung. Weitere verwandte Mechanismen sollten erforscht werden. Effekt der Tumorablation durch HIFU + N₂O-mbs weiter adressieren.

Schlussfolgerung

Zusammenfassend haben wir N₂O-mb-Nanopartikel entwickelt. Charakterisierung und Biokompatibilität der N₂O-mbs bestimmt. Sonosensitivität durch ROS-Nachweis in wässriger Lösung und intrazellulär untersucht. Vs. C₃F₈-mbs: N₂O-mbs erzeugten ROS, förderten Apoptose und Nekrose von Tumorzellen – außergewöhnliche Sonosensitivität. In HIFU-Synergieexperimenten: sonodynamische Effekte von N₂O-mbs erhöhten signifikant Apoptose und Nekrose von Tumorzellen in vitro, steigerten koagulatives Nekrosevolumen und Echointensität im ex vivo bovinen Leberzielgebiet, hemmten Tumorwachstum in vivo effektiv. Ergebnisse deuten darauf hin, dass N₂O-mbs ein neuartiger Sonosensibilisator und Hilfsagent für Ultraschalltherapie sein könnten, zur Tumorablation via HIFU.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die in diesem Manuskript gezogenen Schlussfolgerungen basieren auf den Daten, die alle in diesem Papier präsentiert und gezeigt werden.

Abkürzungen

N₂O-mbs:

N₂O-Mikrobläschen

C₃F₈-mbs:

C₃F₈-Mikrobläschen

HIFU:

hochintensiver fokussierter Ultraschall

LIFU:

niedrigintensiver fokussierter Ultraschall

SOSG:

Singulettsauerstoff-Sensor Green

SDT:

sonodynamische Therapie

DPPC:

1,2-Dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphocholin

DSPE-mPEG2000:

1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-2000]

DAPI:

4′,6-Diamidino-2-phenylindol

DiI:

1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanin-perchlorat

DCFH-DA:

2′,7′-Dichlorfluoresceindiacetat

DAF-FM:

3-Amino,4-aminomethyl-2′,7′-difluorescein-diacetat

CAM:

Calcein-AM

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

CLSM:

Konfokale Laserscanning-Mikroskopie

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop

DMEM:

Dulbecco's Modified Eagle Medium

FBS:

Fetales Kälberserum

PBS:

Phosphate-buffered saline

DI:

Deionisiertes Wasser

ROI:

Regions of interest

ROS:

Reaktive Sauerstoffspezies

NO:

Stickstoffmonoxid