pH- und akustisch ansprechende Plattformen auf Basis von Perfluorpentan-beladenen Protein-Nanopartikeln für die auf Eierstocktumoren ausgerichtete Ultraschallbildgebung und -therapie

Einführung

Eierstockkrebs ist weltweit einer der tödlichsten weiblichen Krebsarten [1,2,3]. Die Behandlung von Eierstockkrebs bleibt klinisch abhängig von Strahlentherapie, Chemotherapie, Operation und anderen Begleittherapien [4,5,6]. Unzulänglichkeiten dieser Strategien verhindern jedoch weiterhin Verbesserungen der Überlebensraten der Patienten. Um diese Mängel zu überwinden, sind effektivere und sicherere Diagnoseverfahren erforderlich. In den letzten Jahren hat sich die Integration von Bildgebung und Therapeutika in eine einzige Behandlungsplattform zu einem heißen Thema entwickelt [7,8,9].

Die Ultraschalltechnologie (US) wird aufgrund ihrer nicht-invasiven, nicht-strahlenden, kostengünstigen und spezifischen Eigenschaften häufig in der klinischen Diagnose und bei der Tumorbehandlung eingesetzt [10,11,12]. In den letzten Jahrzehnten wurde eine Acoustic Response Platform (ARP) mit US-Bildgebung und therapeutischen Fähigkeiten für eine effektive Tumordiagnose und -behandlung entwickelt [13,14,15,16]. ARP umfasst hauptsächlich Mikrobläschen oder Nanobläschen (MB oder NB) und Nanopartikel (NP)-basierte Plattformen [16, 17]. Unter diesen ARPs zeigen MB oder NB gute akustische Reaktionsfähigkeiten, aber aufgrund ihrer großen Größe ist die Gewebepenetration in vivo schwach und die Probenstabilität ist schlecht. NP weist aufgrund seiner geringen Größe eine stärkere Gewebepermeabilität und einen längeren pharmakokinetischen Zyklus auf. Allerdings sind die akustischen Reaktionsfähigkeiten von NPs begrenzt. Es ist daher dringend erforderlich, ARPs kleiner Größe mit hoher Stabilität und starker Reaktionsfähigkeit zu entwickeln.

Flüssige Fluorkohlenwasserstoffe durchlaufen als Reaktion auf externe Stimulation einen Flüssigphasen-Gasphasenübergang [18, 19]. Natalya und Kollegen entwickelten eine Nanoemulsion mit flüssigem Fluorkohlenstoff, die unter fokussiertem Ultraschall geringer Intensität (LIFU) akustische Tröpfchenverdampfungseffekte (ADV) erzeugte [20,21,22]. Die Emulsionen bildeten Blasen und lösten gleichzeitig die Wirkstofffreisetzung aus, wodurch eine Tumorbehandlung ermöglicht wurde. Eine um den flüssigen Fluorcarbon gewickelte Schicht aus Versiegelungsmaterial führte jedoch zu einer Erhöhung der Intensität und Dauer des zur Tumorbehandlung benötigten Ultraschalls, was zu einer Schädigung des umliegenden gesunden Gewebes führte. Eine weitere Optimierung des flüssigen Fluorcarbon-Trägers ist daher gefragt.

In dieser Studie entwickelten wir ein Ferritin (FRT)-Nanopartikel, beladen mit flüssigem Fluorkohlenstoff Perfluorpentan (PFP), das weiter mit dem Tumorzielmolekül Folsäure (FA) kombiniert wurde, um FA-FRT-PFP zu bilden. Ferritin ist ein hoch biokompatibles endogenes Nanokäfigprotein, das eine pH-Sensitivität zeigt [23,24,25]. Das Protein kann in einer sauren Umgebung zerfallen und in einer alkalischen Umgebung wieder zusammengesetzt werden. Dies ermöglicht die kontrollierte Beladung und Freisetzung von Ferritin als Reaktion auf pH-Änderungen [26,27,28]. PFP ist ein häufig verwendetes Phasenumwandlungsmaterial, das eine Siedetemperatur von 29 ^o . aufweist Die niedrige Siedetemperatur erleichterte die leichte Phasenumwandlung durch LIFU, die sicherer war als HIFU. Das PFP wurde in Ferritin geladen und das resultierende FA-FRT-PFP hatte einen Durchmesser von ~47,3 ± 2,8 nm mit hoher Stabilität bei physiologischen Lösungen und Temperaturen. Den Ergebnissen zufolge hatte FA-FRT-PFP die folgenden Vorteile:(1) PFP konnte leicht in FRT geladen werden, indem der pH-Wert von sauer auf neutral geändert wurde; (2) unter schwach fokussiertem Ultraschall (LIFU, 2 W/cm ² .) , 3 min) und pH =5,0, FA-FRT-PFP setzt PFP frei und durchläuft Phasenänderungen, um US-Bildgebungssignale durch akustische Tröpfchenverdampfung (ADV) zu verstärken; 3) Unter Langzeit-LIFU-Bestrahlung (4 min) und pH =5,0 explodierte das aus FA-FRT-PFP freigesetzte PFP und erzeugte eine physikalische Stoßwelle, die Tumorzellen effektiv durch Nekrose zerstören konnte. Nach unserem Kenntnisstand ist dies das erste Beispiel für das Laden von PFP in die FRT als Tumor-US-Theranostikum. Diese Ergebnisse zeigen, dass FA-FRT-PFP + LIFU eine neue Strategie für die integrierte Tumordiagnose und -behandlung ist.

Materialien und Methoden

Materialien

Agarosegel, Ferritin (FRT), Folsäure (FA) und Perfluorpentan (C₃ .) F₈ , PFP) wurden von Sigma (St. Louis, MO, USA) bezogen. NH₂ -PEG₂₀₀₀ -FA und NH₂ -PEG₂₀₀₀ -COOH wurden von Xi’an Ruixi Biotechnology Co., Ltd. (China) geliefert. 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) und N-Hydroxysuccinimid (NHS) wurden von Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) bezogen. Zellzählungskit-8 (CCK-8) wurde von Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan) erhalten. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Penicillin-Streptomycin, Trypsin-EDTA und fetales Rinderserum (FBS) wurden von Gibco (Grand Island, NY, USA) bezogen.

Zellkultur

Die menschliche Eierstockkrebszelllinie SK-OV-3 wurde vom Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, bereitgestellt. Normale Eierstockepithelzellen HUM-CELL-0088 wurden von PriCells, Wuhan, China, bezogen. Die Zellen wurden in DMEM-Medium kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung enthielt. Die Zellen wurden in einem Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ . gehalten bei 37 °C

Vorbereitung des FA-FRT-PFP

Zunächst wurde das Zielmolekül FA durch die Veresterungsreaktion mit FRT konjugiert [29]. Kurz gesagt, NH₂ -PEG₂₀₀₀ -FA (10 mg) und FRT-Lösung wurden mit der Anwesenheit von EDC (5 mg/ml) und NHS (20 mg/ml) gemischt. Nach 3 h Reaktion bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren wurde die Mischung durch Dialyse gegen destilliertes Wasser (MW cut-off =1,2 kDa) für 24 h gereinigt. Die resultierende Lösung bestand aus FA-FRT-Nanopartikeln. Zweitens wurde das Laden von PFP in die Kavität der FRT mit dem Prozess der Denaturierung und Renaturierung von Protein vorbereitet [30]. Kurz gesagt, FA-FRT wurde in 5 ml PBS auf 2 mg/ml verdünnt und auf pH =5,0 mit 30 min leichtem Rühren bei Raumtemperatur eingestellt, um eine vollständige Dissoziation der FRT sicherzustellen. Danach wurden 500 µl PFP in die Lösung im Eisbad gegeben und einer Pulsbeschallung mit 5 s an und 5 s Pause für insgesamt 5 min bei 80 W im Eisbad unterzogen. Nach der Beschallung wurde der pH-Wert der Mischung auf neutral eingestellt (pH =7,4). Da PFP im Ölzustand und nicht in Wasser löslich war, wurde das überschüssige PFP leicht durch Flüssigkeitstrennung entfernt, um FA-FRT-PFP zu sein. FRT-PFP wurde mit einer ähnlichen Methode hergestellt, außer dass NH₂ . geändert wurde -PEG₂₀₀₀ -FA in NH₂ -PEG₂₀₀₀ -COOH.

Charakterisierung von FA-FRT-PFP

Die Größen und Zetapotentiale der Nanopartikel wurden mit einem Zeta Sizer (Malvern, NanoZS, UK) getestet. Die Morphologie von FA-FRT-PFP wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM, Hitachi, Japan) und invertierte Fluoreszenzmikroskopie (Olympus, Japan) beobachtet. Die chemische Struktur der Nanopartikel wurde durch eine Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (Bruker Tensor 27, Bruker Optik, Ettlingen, Deutschland) nachgewiesen. Die zelluläre Aufnahme des FA-FRT-PFP wurde durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (LEXT OLS4100, Olympus, Japan) nachgewiesen. Die FITC/PI-Doppelfärbungszellen wurden durch Durchflusszytometrie (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) analysiert.

Die Leistung der pH- und Ultraschall-responsiven Gaserzeugung

FA-FRT-PFP im pH =5,0- und 7,5-Zustand wurden mit unterschiedlicher akustischer Intensität von LIFU (1,5 und 2,0 W/cm ² .) bestrahlt ) und für verschiedene Gesamtzeiten (1, 2, 3 und 4 min) im Agarosegelmodell, dann wurden US-Bilder mit US-Geräten (Esaote Mylab 90, Italien) mit einer Frequenz von 5–12 MHz und einem mechanischen Index ( MI) von 0,06. Danach wurde das Auftreten von FA-FRT-PFP rechtzeitig durch Lichtmikroskopie beobachtet. Die US-Intensität des interessierenden Bereichs im US-Bild wurde mit der ImageJ-Software analysiert.

Mobilfunkaufnahme

Kurz gesagt wurde 1 mg FITC in 1 ml DMSO gelöst und dann mit FRT-PFP und FA-FRT-PFP für 30 min unter leichtem Rühren gemischt. Dann wurde die gemischte Lösung über Nacht in entionisiertem Wasser dialysiert, um freies FITC und DMSO zu entfernen, um FITC-markierte Nanopartikel zu erhalten. Als nächstes wurden SK-OV-3- und normale Ovarialzellen (HUM-CELL-0088) in dem Medium für 24 h kultiviert, und dann wurden freies FITC, FITC-markiertes FRT-PFP und FA-FRT-PFP mit . co-inkubiert SK-OV-3-Zellen für 5 h. Außerdem wurde FITC-markiertes FA-FRT-PFP mit FA-vorbehandelten SK-OV-3-Zellen für 5 h inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit 4% Paraformaldehyd fixiert und mit 0,2 mg/ml DAPI-Lösung 10 min gefärbt. Die Zellen wurden durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie abgebildet, um Fluoreszenzbilder zu erfassen. Das Fluoreszenzsignal wurde mit einem Durchflusszytometer quantifiziert.

In-vitro-Ultraschallbildgebung

SK-OV-3-Zellen wurden 24 h in FA-freiem Medium kultiviert, und dann wurden PBS, FRT-PFP und FA-FRT-PFP und FA-FRT-PFP + FA mit den SK-OV-3-Zellen für inkubiert 6 Std. Die Zellen wurden gesammelt und mit Agarosegel gemischt und dann wurden die Zellen mit oder ohne LIFU für 3 min bestrahlt (1 s an und 1 s Pause für insgesamt 3 min; 1 MHz; 2,0 W/cm2 .). ). Endlich wurden US-Bilder aufgenommen.

In-vitro-Wirksamkeit bei Krebs

SK-OV-3-Zellen wurden in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 1 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen/Vertiefung und 24 h anheften gelassen. Für die Zytotoxizität von FA-FRT wurden verschiedene Konzentrationen (0, 20, 40, 100, 200 und 500 µg/ml) von FA-FRT mit SK-OV-3-Zellen kultiviert. Nach 24 h Behandlung wurden die Zellen 20 min lang in einem Inkubator mit DMEM-Medien behandelt, die 10 % CCK-8 enthielten. Die Extinktion der Zellen bei einer Wellenlänge von 450 nm wurde mit einem Multimode-Plattenleser (Thermo Scientific) nachgewiesen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu charakterisieren. Darüber hinaus wurden die SK-OV-3-Zellen und die normalen Ovarialzellen (HUM-CELL-0088) 3 h lang mit PBS, FRT-PFP und FA-FRT-PFP und FA-FRT-PFP + FA behandelt und dann bestrahlt mit LIFU (1 s mit 1 s Pause für insgesamt 4 min; 1 MHz; 2,0 W/cm ² ). Die behandelten Zellen wurden weitere 21 h inkubiert. Als Kontrolle wurden die Zellen ohne LIFU 24 h mit PBS, FRT-PFP und FA-FRT-PFP und FA-FRT-PFP + FA behandelt. Danach wurde die Lebensfähigkeit der behandelten Zellen durch den CCK-8-Assay nachgewiesen.

Zelltodanalyse

Um die Art des Zelltods zu beurteilen, wurden SK-OV-3-Zellen in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 5 × 10 ⁴ . ausgesät Zellen/ml. Nach 24 h wurden die Zellen 3 h mit PBS, FRT-PFP und FA-FRT-PFP und FA-FRT-PFP + FA behandelt, dann mit LIFU bestrahlt (1 s, 1 s Pause für insgesamt 4 min; 1 MHz; 2,0 W/cm ² ). Die behandelten Zellen wurden weitere 23 h inkubiert. Als Kontrolle wurden Zellen mit PBS, FRT-PFP und FA-FRT-PFP und FA-FRT-PFP + FA 24 h in Abwesenheit von LIFU behandelt. Die Zellen wurden trypsiniert, bei 1500 × g . zentrifugiert für 3 min gewaschen, dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen und dann in 200 ml Bindungspuffer resuspendiert. Danach wurden 5 µL Annexin V-FITC und 10 µL PI zugegeben und mit den Zellen 15 min im Dunkeln inkubiert. Die gefärbten Zellen wurden mit einem Durchflusszytometer analysiert.

Western Blotting

Das Western-Blotting wurde nach bisheriger Literatur durchgeführt. Die Zellen wurden mit 40 μg/ml PBS (Kontrolle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA und FA-FRT-PFP kombiniert mit oder ohne LIFU-Bestrahlung (2,0 W/cm2 , 4 min) und weitere 21 h Inkubation. Und dann wurden die behandelten Zellen in RIPA-Puffer (Sigma) lysiert. 50 Mikrogramm jedes Proteins mit Laemmli-Probenpuffer wurden 5 min gekocht und einer SDS-PAGE unterzogen. Die Proteine ​​wurden unter Verwendung von halbtrockenem Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories) auf eine PVDF-Membran (Bio-Rad Laboratories) übertragen. Blots wurden zunächst in TBS-Blockierungspuffer mit entweder 2 % Milch oder 2 % BSA (für phosphospezifische Antikörper) 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und dann mit den jeweiligen Primärantikörpern verdünnt in TBST (enthaltend 0,1 % Tween20 und 2 % BSA) über Nacht bei 4 °C. Anschließend wurden Blots gewaschen und mit geeigneten sekundären Antikörpern (Santa Cruz) in TBST inkubiert und unter Verwendung von SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo) nachgewiesen.

Statistische Analyse

Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Analysen wurden unter Verwendung des Student-t-Tests durchgeführt. *P <0,05, **P <0,01 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse und Diskussion

Herstellung und Charakterisierung von FA-FRT-PFP

FA-FRT-PFP wurde synthetisiert und zur Tumortherapie verwendet (Abb. 1). Phasenumwandlungströpfchen wurden durch pH-induzierten reversiblen Abbau und Wiederzusammenbau von FRT in die FRT geladen. Das PFP mit LIFU-induzierter akustischer Tröpfchenverdampfung (ADV) wurde in Zellen abgegeben und diente als Ultraschallbildgebungsmittel. Abbildung 2a–c zeigt TEM-Bilder von FRT, FRT-PFP und FA-FRT-PFP, die eine sphärische Morphologie aufwiesen. Die mittleren Partikelgrößen von FRT, FRT-PFP und FA-FRT-PFP betrugen 6,9 ± 0,3 nm, 43,8 ± 1,6 nm bzw. 47,3 ± 2,8 nm (Abb. 2d), was zeigt, dass die PFP-Beladung und die FA-Konjugation die Größe von FRT. Das mittlere Zetapotential von FRT und FA-FRT-PFP betrug − 43,2 ± 3,1 mV, − 46,9 ± 2,2 mV bzw. − 41,5 ± 2,7 mV (Abb. 2e). Darüber hinaus wurde die Konjugation von FA mit FRT durch FT-IR charakterisiert, wie in Zusatzdatei 1:Abbildung S1 gezeigt. Das FT-IR-Spektrum zeigte Absorptionsbanden bei ~ 1110 cm ⁻¹ kann der Schwingungs-C-O-C-Ether-Verknüpfung von PEG entsprechen; Absorptionspeaks bei ~ 1601 cm ⁻¹ und ~ 1710 cm ⁻¹ gehören zu den Schwingungs-C=O-Bindungen von PEG und FRT sowie von –COOH und –CONH₂ von FA und FRT; die Banden bei ~ 2820 cm ⁻¹ , ~ 2920 cm ⁻¹ , und ~ 2950 cm ⁻¹ entsprechen asymmetrischen und symmetrischen C–H-Streckschwingungen von –CH₂ von FA und PEG; Absorptionspeaks bei ~ 1440 cm ⁻¹ sind mit dem Phenylring von FA verbunden. Das Ergebnis bestätigt die erfolgreiche Konjugation von FA mit FRT. Über den 28-tägigen Lagerzeitraum blieben die Größe und der PDI von FA-FRT-PFP in Wasser, PBS, Kochsalzlösung und FBS keine signifikante Veränderung (Fig. 3a, b), was darauf hindeutet, dass FA-FRT-PFP eine ausgezeichnete Stabilität zeigt. Abbildung 3c zeigt die Größenänderung von FA-FRT-PFP bei verschiedenen Temperaturen von 25 ^o C bis 45 ^o C. Die Größe von FA-FRT-PFP blieb fast unverändert, als die Temperatur auf 25–40 °C gesenkt wurde, was darauf hindeutet, dass FA-FRT-PFP eine hohe Stabilität unter 40 ^o . aufweist C. Als die Temperatur 45 °C erreichte, lag die Größe von FA-FRT-PFP im Bereich von 42,1 nm bis 6 nm, wahrscheinlich aufgrund der starken Vergasung des PFP in FA-FRT-PFP, die zum Aufbrechen der Nanopartikel führte. Die Vergasungstemperatur von FA-FRT-PFP stieg von 29 ^o C (Vergasungstemperatur von PFP unter Normaldruck) bis 45 ^o C, wahrscheinlich aufgrund der Abdeckung der FRT-Schale [21, 31,32,33].

Schematische Darstellung der Synthese von FA-FRT-PFP und seiner Anwendung in der Tumortheranostik

a –c TEM-Bilder von FRT, FRT-PFP und FA-FRT-PFP. d , e Die Größen- und Zetapotentialverteilung von FRT, FRT-PFP und FA-FRT-PFP

a , b Größen- und PDI-Änderung von FA-FRT-PFP in Wasser, PBS, Kochsalzlösung und FBS über 28 Tage. c Die Größenänderung von FA-FRT-PFP bei verschiedenen Temperaturen von 25 ^o C bis 45 ^o C

Responsive US-Verbesserung von pH und LIFU

US-Phantomexperimente von FA-FRT-PFP wurden bei verschiedenen pH-Werten und LIFU-Leistungsintensität durchgeführt. Wie in 4a gezeigt, war das US-Signal in Abwesenheit der LIFU-Bestrahlung (vor) in allen Gruppen schwach. Bei pH 7,5 nach 3 min LIFU-Bestrahlung zeigte FA-FRT-PFP ein niedriges US-Signal sowohl bei 1,5 als auch 2,0 W/cm ² , während bei pH =5,0 unter der gleichen LIFU-Bestrahlungszeit FA-FRT-PFP eine stärkere US-Signalintensität aufwies. Dies zeigte, dass das FA-FRT-PFP zeit- und schallintensitätsabhängige ADV-Effekte zeigte. Dies lag daran, dass FA-FRT-PFP bei pH =5,0 zerlegt und PFP freisetzte, was die Phasenumwandlung leichter machte. Interessanterweise wurde bei einer Verlängerung der LIFU-Bestrahlungszeit auf 4 min FA-FRT-PFP bei pH =5,0 und 2,0 W/cm ² von LIFU hatte eine schwächere US-Signalintensität im Vergleich zu einer kürzeren Bestrahlungszeit, wahrscheinlich aufgrund der zu starken LIFU unter diesem Zustand, die das Platzen der Blasen verursacht. Diese Ergebnisse zeigten, dass das FA-FRT-PFP PFP freisetzen kann, wodurch Phasenumwandlungen und Explosionen bei 2,0 W/cm ² . erzeugt werden der LIFU-Bestrahlung bei pH =5,0. Die Ergebnisse der US-Intensität sind in Abb. 4b, c dargestellt. Abbildung 4d–g zeigt die Morphologie von FA-FRT-PFP-Lösungen nach 3 min LIFU-Bestrahlung (2,0 W/cm ² ) und bei pH =7,5 und 5,0. FA-FRT-PFP bei pH =5,0 und 2,0 W/cm ² LIFU erzeugte große Blasen, was unsere Ergebnisse weiter bestätigt.

a US-Bilder von FA-FRT-PFP, gemischt mit Agarosegel bei verschiedenen pH-Werten und bestrahlt mit unterschiedlicher LIFU-Leistungsintensität. b , c Die entsprechenden statistischen Daten des US-Signals in a . d –g Die optischen Mikroskopiebilder von FA-FRT-PFP, gemischt mit Agarosegel bei verschiedenen pH-Werten und bestrahlt mit 2,0 W/cm ² für 3 Minuten

Zellenaufnahme

Abbildung 5 zeigt die zelluläre Aufnahmekapazität von FA-FRT-PFP. Freie FITC-behandelte Zellen zeigten eine vernachlässigbare Fluoreszenz, aber nach der Markierung auf FA-FRT-PFP war ein starkes Fluoreszenzsignal offensichtlich, was darauf hinweist, dass FA-FRT-PFP eine starke zelluläre Aufnahmekapazität besitzt. FRT-PFP-behandelte und FA-FRT-PFP-behandelte Zellen, die mit FA vorinkubiert wurden, zeigten eine schwächere FITC-Fluoreszenz. Dies zeigte weiter, dass FA das aktive Targeting von Nanopartikeln verbessert. Darüber hinaus zeigte FA-FRT-PFP ein vergleichbares Aufnahmeverhalten wie FCM (Abb. 5c, d). Die Aufnahmeraten von FA-FRT-PFP betrugen 46,5 ± 2,8%, was signifikant höher war als die von freiem FITC (Kontrolle), FRT-PFP und FA-FRT-PFP + FA. Darüber hinaus zeigt Zusatzdatei 1:Abbildung S2 die zelluläre Aufnahme von Nanopartikeln in normale Eierstockzellen. Es gibt keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA und FA-FRT-PFP in der zellulären Aufnahme. Dies ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass die normalen Eierstockzellen (HUM-CELL-0088) im Vergleich zu SK-OV-3-Zellen eine niedrige FA-Rezeptorexpression aufweisen.

Zelluläre Aufnahme. a , b Die konfokalen Fluoreszenzbilder von Zellen, die mit freiem FITC und FITC-markiertem FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA und FA-FRT-PFP behandelt wurden. Grüne und blaue Farben repräsentierten die FITC- bzw. DAPI-Fluoreszenz. Maßstabsbalken =25 µm. c , d Das FITC-Fluoreszenzsignal und die entsprechenden statistischen Daten in Zellen, die mit freiem FITC und FITC-markiertem FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA und FA-FRT-PFP behandelt wurden

In-vitro-Ultraschallbildgebung

Um zu bestätigen, dass FA-FRT-PFP die Ultraschallbildgebung durch ADV in vitro verbessert, wurden Nanopartikel mit den Zellen 5 h lang inkubiert und mit oder ohne LIFU (2,0 W/cm ² .) bestrahlt ). Wie in Fig. 6a gezeigt, zeigten die Zellen in allen getesteten Gruppen ohne LIFU-Bestrahlung keine verstärkten Ultraschallsignale, während nach der LIFU-Bestrahlung FA-FRT-PFP-behandelte Zellen im Vergleich zu Kontroll-FRT-PFP und FA-FRT . hohe US-Intensitäten aufwiesen -PFP + FA-Gruppen bzw. Für die Ultraschallbildgebung wurde die quantitative Analyse der Graustufenwerte mit der ImageJ-Software berechnet. Die Ergebnisse stimmten mit den US-Bildgebungsdaten überein (Abb. 6b), die zeigten, dass die US-Intensität von FA-FRT-PFP-behandelten Zellen nach Bestrahlung mit LIFU mit 2,0 W/cm2 erhöht wurde für 3min. FA-FRT-PFP dringt in Zellen ein und wird in der sauren Umgebung von Lysosomen (pH =~ 5,0) zerlegt und PFP in das Zytoplasma freigesetzt [34, 35]. Nach der LIFU-Bestrahlung erzeugte das PFP leicht Phasenumwandlungen von Tröpfchen zu Gas, was die US-Intensität erhöhte.

Ultraschallbildgebung in vitro. a Die Ultraschallbilder und die dazugehörigen statistischen Daten (b ) von PBS (Kontrolle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA und FA-FRT-PFP-behandelten Zellen mit oder ohne LIFU-Bestrahlung (2,0 W/cm ² .) , 3 Minuten)

In-vitro-Antikrebs-Wirksamkeits- und Zelltod-Analyse

Abbildung 7a zeigt die Zytotoxizität von FA-FRT-PFP bei Konzentrationen bis zu 0,5 mg/ml. In Abwesenheit von LIFU-Bestrahlung zeigte FA-FRT-PFP keine offensichtliche Unterdrückung der Lebensfähigkeit in SK-OV-3-Zellen. CCK-8-Assays wurden verwendet, um die Anti-Krebs-Wirksamkeit von FA-FRT-PFP in Kombination mit LIFU zu analysieren. Wie in 7b gezeigt, zeigten FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA und FA-FRT-PFP in Abwesenheit von LIFU-Bestrahlung im Vergleich zu Kontrollgruppen keine bemerkenswerte Zytotoxizität. In Kombination mit einer 4-minütigen LIFU-Bestrahlung zeigte FA-FRT-PFP eine signifikante Zytotoxizität, die höher war als die von FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, mit maximalen Zellhemmungsraten von annähernd 90 % bei 40 µg/ml. Dies kann daran liegen, dass FA-FRT-PFP im Vergleich zu FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA leichter in das Zytoplasma und dann in die Lysosomen aufgenommen wird. In der sauren Umgebung von Lysosomen setzte FA-FRT-PFP PFP in das Zytoplasma frei. Unter 4 Minuten LIFU-Bestrahlung vergaste das freigesetzte PFP, was zu Kavitation und Ruptur führte, was eine Reihe von physikalischen Stoßkräften erzeugte, die die Abtötungswirkung der Tumoren signifikant verstärkten [36,37,38]. Darüber hinaus zeigt Zusatzdatei 1:Abbildung S3 die Zytotoxizität von Nanopartikeln in normalen Ovarialzellen. Es gibt keine signifikanten Unterschiede zwischen den FRT-PFP-, FA-FRT-PFP + FA- und FA-FRT-PFP-Gruppen in der Zytotoxizität, wenn sie mit LIFU kombiniert werden. Das Ergebnis kann sein, dass HUM-CELL-0088-Zellen eine niedrige FA-Rezeptor-Expression aufweisen, die keine FA-Targeting-Wirkung zeigten.

In-vitro-Wirksamkeit gegen Krebs. a Zelllebensfähigkeit von SK-OV-3-Zellen nach 24 h Inkubation mit unterschiedlicher Konzentration von FA-FRT-PFP. b Zelllebensfähigkeit von SK-OV-3-Zellen, die mit 40 μg/ml PBS (Kontrolle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA und FA-FRT-PFP kombiniert mit oder ohne LIFU-Bestrahlung (2,0 W/cm²) behandelt wurden ² , 4 min) und weitere 21 h Inkubation

Wie in 8a , b gezeigt, zeigten die Zellen in Abwesenheit von LIFU-Bestrahlung in allen Gruppen einen minimalen Zelltod. Nach 4 Minuten LIFU-Bestrahlung zeigten FA-FRT-PFP-behandelte Zellen im Vergleich zu anderen Gruppen eine signifikante Nekrose (~ 91,6%) aufgrund der physikalischen Stoßwellen, die durch LIFP-induzierte PFP-Kavitation oder Blasensprengung erzeugt wurden. Darüber hinaus zeigt zusätzliche Datei 1:Abbildung S4 das TNF-Protein-Expressionsniveau von Zellen. Ohne LIFU exprimierten die Zellen kaum TNF-Protein. Während mit LIFU die Zellen in der FA-FRT-PFP-Gruppe ein hohes Maß an TNF-Expression aufweisen, verglichen mit denen in den FRT-PFP- und FA-FRT-PFP + FA-Gruppen, was darauf hinweist, dass das TNF-Protein ein lebenswichtiges FA-FRT-PFP . war + LIFU-induziertes todesbezogenes Protein [39]. Basierend auf der hervorragenden In-vitro-Krebstherapie-Wirkung [40,41,42] ist FA-FRT-PFP vielversprechend für die zukünftige Krebstherapie in vivo.

a Durchflusszytometrie-Analyse und die entsprechenden statistischen Daten von SK-OV-3-Zellen, die mit 40 μg/ml PBS (Kontrolle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA und FA-FRT-PFP kombiniert mit oder ohne LIFU . behandelt wurden Bestrahlung (2,0 W/cm ² , 4 min) und weitere 23 h Inkubation

Schlussfolgerung

Zusammenfassend haben wir erfolgreich FRT-basierte und PFP-beladene Phasentransformations-Nanopartikel entwickelt, die mit einem FA-Zielmolekül (FA-FRT-PFP) modifiziert wurden. Als neuartiges zielgerichtetes US-Theranostikum hatte FA-FRT-PFP mehrere Vorteile:(1) FA-FRT-PFP hatte eine Teilchengröße im Nanobereich; (2) FRT wurde als Träger verwendet, der sich zerlegen und wieder zusammensetzen konnte, um PFP-Tröpfchen bei sauren bzw. neutralen Bedingungen hochzuladen und freizusetzen; (3) unter 3 Minuten LIFU-Unterstützung und sauren Bedingungen setzte FA-FRT-PFP PFP frei und erzeugte Phasentransformationen durch ADV, was seinen US-Kontrast signifikant erhöhen könnte; (4) Unter 4 min Bestrahlung mit LIFU und einer sauren Umgebung könnte das freigesetzte PFP leicht einen intrazellulären „Explosionseffekt“ induzieren, der zu physikalischen Antitumoreigenschaften führt. Diese Ergebnisse zeigen, dass FA-FRT-PFP mit LIFU-Unterstützung eine neue Strategie für die molekulare Ultraschallbildgebung und Tumortherapie bietet.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Schlussfolgerungen in diesem Manuskript basieren auf den Daten, die alle in diesem Papier präsentiert und gezeigt werden.

Abkürzungen

ADV:

Akustische Tröpfchenverdampfung

ARP:

Akustische Reaktionsplattform.

CCK-8:

Zellzähl-Kit-8

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid

FA:

Folsäure

FBS:

Fötales Rinderserum

FITC:

Fluoresceinisothiocyanat

FRT:

Ferritin

LIFU:

Fokussierter Ultraschall mit niedriger Intensität

NHS:

N-Hydroxysuccinimid

PFP:

Perfluorpentan

USA:

Ultraschall