Biosynthese und antibakterielle Aktivität von Silbernanopartikeln unter Verwendung von Hefeextrakt als Reduktions- und Verkappungsmittel

Einführung

Arzneimittelresistente Infektionen sind eine der Haupttodesursachen und haben zu einem ernsthaften Risiko für die öffentliche Gesundheit geführt. Darüber hinaus kristallisiert sich die zunehmende Resistenz gegen antimikrobielle Medikamente als dringendes Problem in der Medizin heraus [1]. Eine Reihe von Stämmen von Staphylococcus aureus sind resistent gegen Methicillin und sind die Hauptursache für erworbene Infektionen in Krankenhäusern. Darüber hinaus gehören zu anderen antibiotikaresistenten Bakterien Penicillin-resistente Neisseria gonorrhoeae und multiresistente Escherichia coli (E. coli ) [2, 3]. Die wichtigsten Resistenzmechanismen sind ein erhöhter Efflux und eine verminderte Aufnahme von Antibiotika [4]. Ein weiterer Mechanismus der Arzneimittelresistenz ist die Expression von Enzymen, die die Molekülstruktur von Antibiotika verändern [5]. Obwohl große Anstrengungen auf die Entwicklung der nächsten Generation antimikrobieller Wirkstoffe gerichtet wurden, besteht ein erhöhter Bedarf an überlegenen Desinfektionsmethoden.

Silbernanopartikel (Ag-NPs) wurden in vielen Anwendungen verwendet, wie z. B. als Proteinträger, Radiosensibilisatoren, Verbesserung der Effizienz von Solarbrennstoffzellen und antibakterielle Wirkstoffe [6,7,8]. Nanopartikel, einschließlich metallhaltiger Nanopartikel, Ag-NPs werden am häufigsten als antimikrobielle Wirkstoffe verwendet [9]. In Wirklichkeit haben Silbernanopartikel eine signifikante antimikrobielle Aktivität gegen Bakterienstämme gezeigt, aber eine vernachlässigbare Zytotoxizität gegenüber tierischen Zellen [10, 11]. Darüber hinaus haben Ag-NPs antimikrobielle Aktivität gegen Pilze, bestimmte Viren und antibiotikaresistente Bakterienstämme gezeigt. Hinsichtlich ihres Wirkmechanismus sind die Unterdrückung der DNA-Replikation, die Blockierung der in zytoplasmatischen Membranen benötigten elektrischen Potentialdifferenz und die Unterdrückung der Atmungskette die Hauptwirkungsmechanismen von Ag-NPs. Daher spielen Größe, Oberflächenstruktur und kontrollierte Formen von Ag-NPs eine entscheidende Rolle bei ihrer antimikrobiellen Aktivität und anderen Anwendungen. Die allgemeine Methode zur Herstellung von Ag-NPs beinhaltet die Reduktion von Silberionen in Gegenwart eines geeigneten Tensids, um ein kontrolliertes Wachstum von Ag-NPs zu erreichen [12]. Die Mehrheit der Reduktionsmittel und Tenside zeigt Zytotoxizität gegenüber menschlichen Gewebezellen und kann möglicherweise eine Umweltkontamination verursachen. Daher sind weitere Anstrengungen bei der Entwicklung grüner Methoden zur Herstellung von formkontrollierten Ag-NPs unerlässlich.

In dieser Arbeit präsentieren wir eine neue Route für die Biosynthese von Ag-NPs unter Verwendung von Hefeextrakt. Während des Prozesses liefert Hefeextrakt Reduktions- und Verkappungsmittel, darunter Aminosäuren, Vitamine und Kohlenhydrate, während Silberionen als Elektronenakzeptor dienen. Dadurch kann die günstige Stabilität der organischen Verkappungsmittel auf der Oberfläche, der monodispersen Ag-NPs, ohne Ausfällungen über ein Jahr lang erhalten bleiben. Es wurde festgestellt, dass Ag-NPs im Vergleich zu Ampicillin eine überlegene antibakterielle Aktivität gegen Ampicillin-resistente E. coli Zellen. Im Vergleich zu herkömmlichen Synthesemethoden ist der hier vorgestellte Biosyntheseansatz biokompatibel, kostengünstig und umweltschonend. Darüber hinaus zeigten die formkontrollierten und gut dispergierten Ag-NPs gute antibakterielle Wirkungen gegenüber E. coli .

Methoden

Materialien

Silbernitrat (AgNO₃ .) ), Saccharose (C₁₂ H₂₂ O₁₁ ), Natriumchlorid (NaCl) und Natriumhydroxid (NaOH) wurden von Sinopharm Co., Ltd. bezogen. Trockenbackhefe wurde von AB/MAURI Co., Ltd. bezogen. E. coli wurde von TransGen Biotech Co., Ltd. bezogen. Der CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit (MTS) wurde von Promega Biotech Co., Ltd. bezogen. pcDNA3.4-Plasmid, 1 × NuPAGE® LDS-Probenpuffer, Dulbecco modifiziertes Eagle® Medium (DMEM) und fötales Rinderserum (FBS) wurden von Thermo Fisher Scientific Inc. bezogen. Ampicillin und Luria-Bertani (LB) Medium wurden von Sangon Biotech Co., Ltd. bezogen. Alle Chemikalien waren analytische Reagenzien und wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Entionisiertes ultrareines Wasser (18,2 MΩ.cm) wurde während der gesamten Experimente verwendet.

Synthese von Ag-NPs

Die gelagerten Hefezellen wurden in Luria-Bertani (LB)-Medium beimpft und zur Aktivierung über Nacht bei etwa 150 U/min bei 25 °C geschüttelt. Dann wurden die aktivierten Hefezellen mit 0,9% Kochsalzlösung gewaschen und in 2% Saccharoselösung unter Schütteln bei ungefähr 150 U/min für 6 Stunden bei 25°C dispergiert. Schließlich wurde der zellfreie Hefeextrakt für die Biosynthese von Ag-NPs durch Zentrifugation bei 2000 U/min für 5 Minuten gewonnen. Während des Biosyntheseprozesses wurde der pH-Wert des Hefeextrakts mit einer NaOH-Lösung auf 10 eingestellt und dann der AgNO₃ Lösung wurde nach und nach zu der obigen Lösung unter kräftigem magnetischem Rühren zugegeben. Schließlich wurden die erhaltenen Ag-NPs 5 Tage lang mit 1 kDa-Dialysemembranen dialysiert und zur weiteren Charakterisierung gefriergetrocknet.

Charakterisierungen

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Bilder von Ag-NPs wurden auf einem JEM-2100-Mikroskop mit einer Beschleunigungsspannung von 200 kV (JEOL, Japan) beobachtet. Rasterelektronenmikroskopie (REM)-Bilder wurden auf einem Carl Zeiss ULTRA plus Rasterelektronenmikroskop (Carl Zeiss, Deutschland) erhalten, das mit einem energiedispersiven Spektrometer (EDS) ausgestattet war, das bei 20 kV betrieben wurde. Ultraviolett-sichtbare (UV-Vis) Absorptionsspektren wurden auf einem Lambda 950 UV/Vis/NIR Spektrophotometer (Perkin-Elmer, USA) aufgenommen. Röntgenpulverbeugungsmuster (XRD) wurden unter Verwendung eines D8 Advance-Instruments (Bruker, Deutschland) erhalten. Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR) wurde von 4000–500 cm ⁻¹ . aufgenommen mit Proben, die als KBr-Pellets auf einem Vertex 70 FTIR-Spektrometer (Bruker, Deutschland) hergestellt wurden. Das Zeta-Potential von Ag-NPs wurde mit einem Malvern Zeta Nano ZS-90 (Malvern, Großbritannien) bei 25 °C gemessen. Die Oberflächenelemente auf Ag-NPs wurden durch Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (XPS) unter Verwendung eines Kratos AXIS Ultra DLD-Instruments mit einer monochromatischen Al Kα-Quelle (1486,6  eV) (Shimadzu, Japan) identifiziert. Die Aminosäurekomponenten wurden mit einem L-8900-Hochgeschwindigkeits-Aminosäureanalysator (Hitachi, Japan) analysiert.

Zell-Zytotoxizitäts-Assay

Um die Biokompatibilität der präparierten Ag-NPs zu untersuchen, wurde ein MTS-Assay verwendet, um die Zellzytotoxizität der Ag-NPs zu bewerten [13]. Cos-7-Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS-Vollmedium, in einem Inkubator mit feuchter Atmosphäre, der 5 % CO₂ . enthielt, kultiviert bei 37 °C. Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit flachem Boden mit einer Dichte von 10000 Zellen pro Well ausplattiert und 24 h kultiviert. Dann wurde das Wachstumsmedium durch frisches DMEM-Medium ersetzt, das unterschiedliche Konzentrationen von Ag-NPs enthielt. Nach weiteren 24 h Inkubation wurden die relativ lebensfähigen Zellen durch MTS bestimmt. Die Extinktion wurde bei 490 nm unter Verwendung eines SpectraMax® M5-Mikroplattenlesegeräts (Molecular Devices, USA) gemessen. Als Kontrolle wurden unbehandelte Zellen in DMEM-Medium verwendet.

SDS-PAGE Assay

Standard-SDS-PAGE wurde mit einem 10% (w/v) Trenngel und einem 4% Sammelgel durchgeführt. Die Proben wurden 5 Min. mit 1 × NuPAGE® LDS Sample Buffer gekocht und vor dem Auftragen auf die Gele 5 Min. bei 12000 U/min zentrifugiert. Als Referenzkontrolle wurde der Standardproteinmarker verwendet. Die Gele wurden mit 0,5% Coomassie Blue gefärbt. Bilder von Gelen wurden mit GelDoc XR ⁺ . aufgenommen Gel-Bildgebungssysteme (Bio-Rad, USA).

Antimikrobielle Aktivitätsstudien

Um die antimikrobielle Aktivität zu bestimmen, wurden die synthetisierten Ag-NPs auf bakterizide Aktivität gegen E. coli [14]. Eine einzelne Kolonie von E. coli wurde über Nacht bei 37 °C in LB-Medium auf einem Orbitalschüttler bei 150 U/min gezüchtet. Kolonien wurden mit frischem LB-Medium auf eine OD von 0,01–0,02 bei 600 nm eingestellt. Dann wurden 100 µl serielle Verdünnungen von Ag-NPs auf 96-Well-Mikrotiterplatten gefüllt. Die Mikrotiterplatten wurden dann mit 100 µl verdünntem E beimpft. coli Lösung und inkubiert für 16 h bei 37 °C. Die Lebensfähigkeit von E. coli wurde durch die Messung der Extinktion bei 600 nm mit einem SpectraMax® M5 Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices, USA) bestimmt. Eine Zeitverlaufsanalyse wurde durchgeführt, um die antibakterielle Empfindlichkeit gegenüber E. coli im Laufe der Zeit. Schließlich 100 μL E. coli Lösung wurde sterilen Röhrchen mit 10 bzw. 20 µg/ml Ag-NPs zugesetzt. Die Extinktion bei 600 nm wurde mit einem SpectraMax® M5 Mikroplatten-Lesegerät (Molecular Devices, USA) nach 1, 2, 4 und 6 h gemessen.

Koloniebildungseinheitsassay wurde eingeführt, um die Ag-NPs gegen die antibiotikaresistenten Bakterienzellen zu untersuchen. E. coli exprimiert stabil das pcDNA3.4-Plasmid, das das β-Lactamase-Gen enthält, das als Modell Resistenz gegen Ampicillin verleiht. Wenn das Ampicillin-resistente E. coli (E. coli -Verstärker ⁺ ) Zellen erreichten das Wachstum in der logarithmischen Phase, die E. coli -Verstärker ⁺ Zellen wurden in der LB-Agarplatte bei der Behandlung mit Ampicillin allein oder bei der kombinierten Behandlung mit Ag-NPs gezüchtet und bei 37 °C für 18 Stunden inkubiert. Die Anzahl von E. coli -Verstärker ⁺ Kolonien, die auf LB-Platten gebildet wurden, wurden berechnet. Alle Assays wurden mindestens dreimal durchgeführt.

Ergebnisse und Diskussion

Synthese von Ag-NPs

Wie in Schema 1 schematisch dargestellt, begann die Herstellung von Ag-NPs mit der Selbstorganisation von Biomolekülen im Hefeextrakt zu Hefemizellen. Dann, Ag ⁺ wurde in situ durch die Reduktionsmittel im Hefeextrakt reduziert, einschließlich Aminosäuren, Vitaminen und Kohlenhydraten. Die gebildeten Ag-Nanopartikel wurden durch die Biomoleküle stabilisiert. Die Oberflächenbeschichtung von Ag-NPs erhöht die Affinität zur Bakterienmembran und erhöht die Permeabilität der Zellwand. Die Wechselwirkung zwischen Ag-NPs und Peptidoglycan veränderte die Konfiguration von Peptidoglycan, was schließlich zum Apoptoseprozess führte, um die Bakterien zu schädigen.

Vorgeschlagene schematische Darstellung der Biosynthese von Ag-NPs

Strukturelle Charakterisierung von Ag-NPs

Wie in Abb. 1a gezeigt, zeigte das typische REM-Bild, dass die synthetisierten Ag-NPs eine Kugelform und eine feine Größe haben. Der EDX bestätigte die Bildung von Ag-NPs (Abb. 1b). Bei ungefähr 3 keV wurde ein starker optischer Absorptionspeak beobachtet, der ein typischer optischer Absorptionspeak von Silbernanokristalliten für die Oberflächenplasmonenresonanz ist. Die geringen Mengen an Sauerstoff und Kohlenstoff könnten der dünnen Schicht organischer Deckschichten auf den synthetisierten Ag-NPs zugeschrieben werden. Die Reaktion von AgNO₃ Lösung mit NaOH führt zur Bildung einer kleinen Menge Ag₂ O. Daher kann eine geringe Menge O auch auf das Vorhandensein von Ag₂ . zurückgeführt werden O. Die Morphologie und Größe der Ag-NPs wurden weiter durch hochauflösendes TEM (HRTEM) charakterisiert. Die Ag-NPs hatten einen Durchmesser von 10,3 bis 18,9 nm (Abb. 1c) mit einer durchschnittlichen Größe von 13,8 nm (Abb. 1d). Größe, Form und Oberflächenchemie von Ag-NPs zeigten einen wichtigen Einfluss auf die antimikrobielle Aktivität. Die kleinere Größe und größere Oberfläche ermöglichte es den Ag-NPs, besser mit der Bakterienmembran zu interagieren, um die antimikrobielle Aktivität weiter zu verbessern [15,16,17]. Die klaren Gitterstreifen im HRTEM-Bild zeigten einen Streifenabstand von 0,15 nm (Abb. 2a), was den (220) Ebenen von Silber entspricht. Wie in Abb. 2b gezeigt, wurde die kristalline Natur der Ag-NPs durch die typischen Selected-Area-Beugungsmuster (SAED) demonstriert, wobei die hellen Kreisringe den (311), (220), (200) und ( 111) Ebenen [18, 19].

a Feldemissions-REM-Aufnahme von Ag-NPs, b EDX-Spektrum von Ag-NPs, c TEM-Aufnahme von Ag-NPs und d Größenverteilung von Ag-NPs

a Gitterstreifen von Ag-NPs im HR-TEM-Bild, b kreisförmige Ringe von Ag-NPs aus den typischen Selected-Area-Beugungsmustern (SAED)

Das UV-Vis-Spektrum von Ag-NPs zeigte einen starken Peak bei 418 nm, der auf Oberflächenplasmonenresonanz zurückzuführen war (Abb. 3a). Abbildung 3b zeigt eine gelbe Lösung synthetisierter Ag-NPs, die die Bildung von Ag-NPs anzeigt. Die XRD-Musteranalyse der synthetisierten Ag-NPs zeigte vier intensive Peaks bei 77,36°, 64,30°, 43,52° und 38,16°, entsprechend den (311), (220), (200) und (111) Ebenen für Silber. bzw. (Abb. 3c). Die Daten wurden durch Standardsilberdaten der JCPDS-Karte Nr. 04-0783 [20] bestätigt. Das XRD-Muster zeigte in Übereinstimmung mit einem früheren Bericht [21] die kristalline Natur der synthetisierten Ag-NPs. Die FTIR-Analyse wurde verwendet, um die potentiellen Biomoleküle auf den synthetisierten Ag-NPs zu charakterisieren und zu identifizieren (Abb. 3d). Das breite Band bei 3405 cm ⁻¹ entspricht –OH-Streckung [22]. Der schwächere Peak bei 2915 cm ⁻¹ wird der -CH2-Streckschwingung zugeordnet. Die Bande bei 1655 cm ⁻¹ im Hefeextrakt ist auf die C=O-Streckschwingung der Carboxyleinheiten zurückzuführen, und diese Bande verschiebt sich auf 1573 cm ⁻¹ in Ag-NPs aufgrund der Wechselwirkung zwischen Carboxyl-Einheiten und Ag-NPs [23]. Der scharfe Peak bei 1375 cm ⁻¹ wird der C-N-Streckschwingung zugeschrieben. Die Banden bei 1048 cm ⁻¹ und 1083 cm ⁻¹ werden den Streckschwingungen von C–O–C bzw. C–OH zugeordnet [24, 25]. Diese Ergebnisse zeigten, dass Biomoleküle des Hefeextrakts für die Biosynthese von Ag-NPs verantwortlich sind. Die Oberflächenbeschichtung von Ag-NPs beeinflusste die Affinität zur Bakterienmembran [26, 27]. Die Zustände von Ag-NPs wurden weiter durch XPS charakterisiert. Wie in Abb. 4a gezeigt, wurde der vollständige Scan des XPS-Spektrums mit klaren Peaks C 1s . zugeschrieben , Ag 3d , Ag 3p , Ag 3s , und O 1s . Das Ag 3d (5/2) und Ag 3d (3/2)-Peaks wurden bei Bindungsenergien von ungefähr 368,5 bzw. 374,5 eV beobachtet (Abb. 4b). Dieser Energieaufspaltungswert von 6.0 eV demonstrierte die Bildung von Ag-NPs [28, 29].

a UV-Vis-Spektrum von Ag-NPs, b Foto synthetisierter Ag-NPs, c XRD-Muster von Ag-NPs und d FTIR-Spektrum von Ag-NPs und Hefeextrakt

a Der vollständige Scan des XPS-Spektrums von Ag-NPs und b das Ag 3d XPS-Spektrum

Die Oberflächenladung von Ag-NPs wurde mit dem Malvern Zeta Nano ZS-90 Instrument bestimmt, was ein wichtiger Parameter für die Stabilität und Dispersion der kolloidalen Lösungen ist. Das Zetapotential ist das elektrostatische Oberflächenpotential an der Grenze zwischen der diffusen Schicht und der kompakten Schicht von Nanopartikeln und ist ein Indikator für Anwendungen biomedizinischer Polymere [30]. Wie in Zusatzdatei 1:Abb. S1 gezeigt, zeigte das Zetapotential von Ag-NPs bei einem niedrigeren pH-Wert von 3 eine leicht negative Ladung (− 3.2 mV). Das Zetapotential von Ag-NPs nahm monoton von − 12.1 mV bei pH 7.0 auf −24.4 mV bei pH 11.0 ab, was die negativ geladenen Gruppen auf der Oberfläche von Ag-NPs bestätigte. Gaoet al. berichteten, dass die Dispersion und Stabilität von Ag-NPs hauptsächlich auf die Oberflächenladung zurückzuführen ist [31]. Das Vorhandensein negativ geladener Gruppen verbessert die Stabilität und Dispersion von Ag-NPs in wässrigen Lösungen [32].

Zytotoxizität von Ag-NPs und Analyse von Biomolekülen

Die Biokompatibilität der synthetisierten Ag-NPs ist wichtig für ihre weitere biomedizinische Anwendung. Um die Zytotoxizität der Ag-NPs zu untersuchen, wurde die Zelllebensfähigkeit von Cos-7-Zellen mit dem MTS-Assay nachgewiesen. Die Cos-7-Zellen wurden mit Ag-NPs in unterschiedlichen Konzentrationen 24 h lang inkubiert. Wie in Fig. 5a gezeigt, wurde keine signifikante Zytotoxizität festgestellt, wenn Zellen mit den Ag-NPs in Konzentrationen von bis zu 200 µg/ml behandelt wurden. Daraus kann geschlossen werden, dass die Ag-NPs eine vernachlässigbare Zytotoxizität und eine gute Biokompatibilität gegenüber Cos-7-Zellen zeigten.

a Zytotoxizität von Ag-NPs in Cos-7-Zellen und b SDS-PAGE-Analyse. Bahn 1:Ladepufferkontrolle. Bahnen 2–4:synthetisierte Ag-NPs. Spur 5:Hefeextrakt zentrifugiert mit 8000 rpm

Um die Synthesemechanismen der synthetisierten Ag-NPs zu untersuchen, analysierten wir Biomoleküle auf der Oberfläche von Ag-NPs und Hefeextrakt. Wie in Fig. 5b gezeigt, zeigte die SDS-PAGE-Analyse kein nachweisbares oder marginales Protein auf der Oberfläche der synthetisierten Ag-NPs oder im Hefeextrakt. Weiterhin haben wir die Biomoleküle im Hefeextrakt mit einem Hochgeschwindigkeits-Aminosäure-Analysator bestimmt. Wie in Zusatzdatei 1:Tabelle S1 mit ergänzenden Informationen zusammengefasst, gibt es ungefähr 22 Arten von Aminosäuren im Hefeextrakt, die reich an Glutaminsäure, γ-Aminobuttersäure, Ornament und Alpha-Linolensäure sind. Der isoelektrische Punkt dieser Aminosäuren beträgt ungefähr 6, außer der von Lysin und Arginin liegt bei ungefähr 10-11. Darüber hinaus enthält eine Vielzahl von Komponenten −NH₂ , wie Harnstoff, Ammoniak, Asparagin und Glutamin gefunden werden. Die Biomoleküle aus reduktiven Aminosäuren, Alpha-Linolensäure und Kohlenhydraten im Hefeextrakt spielen eine bedeutende Rolle bei der Bildung von Ag-NPs. Es wurde berichtet, dass die NADH-abhängige Reduktase [33, 34] oder das Nitratreduktase-Enzym am Reduktionsprozess [35,36,37] bei der Biosynthese von Ag-NPs über den Mikroorganismenextrakt beteiligt ist.

Biomoleküle des Hefeextrakts spielen eine entscheidende Rolle bei der Bildung von Ag-NPs, indem sie diese vor Aggregation schützen. Stabilisatoren von Biomolekülen helfen, redundante Reaktionen zwischen Ag-NPs zu verhindern [38]. Die amphoteren Moleküle von Aminosäuren enthalten sowohl basische als auch saure Gruppen. Die Nettoladung dieser Aminosäureverbindungen kann je nach pH-Änderung der Hefeextraktlösung negativ oder positiv sein, was die Bindungsfähigkeit während der Synthese von Ag-NPs weiter beeinflusst [39]. In alkalischer Lösung tragen Aminosäuren auf der Oberfläche von Ag-NPs negative Nettoladungen, die die elektrostatischen Abstoßungswechselwirkungen maximieren [40,41,42]. Die Biomoleküle aus dem Hefeextrakt wirken als Verkappungsmittel und spielen eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der Größenverteilung, Form und Morphologie bei der Bildung von Ag-NPs. Der pH-Wert ist ein wichtiger Faktor mit Einfluss auf die kontrollierte Synthese von Ag-NPs in der Studie. Wenn der pH-Wert unter 7 liegt, tritt die Nukleation mit geringer Geschwindigkeit auf. Ag-NPs können bei höheren pH-Werten in wenigen Minuten gebildet werden, und die Partikelgröße nimmt mit steigendem pH-Wert der Lösung ab. Die optimale Balance zwischen Wachstumsprozessen und Keimbildung wurde nachgewiesen [43]. Die im Reduktionsprozess von Lösungen mit extremen pH-Werten (> 11) immer vorliegenden instabilen und agglomerierten Ag-NPs [44].

Antibakterielle Aktivität

E. coli wurde ausführlich auf die antimikrobielle Aktivität von Ag-NPs untersucht. Das Wachstum von E. coli in Gegenwart oder Abwesenheit von Ag-NPs beweist die antimikrobielle Fähigkeit. Wie in Fig. 6a gezeigt, zeigten die synthetisierten Ag-NPs konzentrationsabhängig eine signifikante antibakterielle Aktivität gegen E. coli . Der Wachstumshemmtest zeigte eine vollständige Reduktion von E. coli bei Ag-NP-Konzentrationen über 20,0 µg/ml im Vergleich zur Negativkontrolle. Die halbe Hemmkonzentration (EC₅₀ ) der Ag-NPs betrug 13,4 µg/ml. Die Dosis von 20,0 µg/ml Ag-NPs zeigte eine signifikante antibakterielle Wirkung gegen E. coli während der gesamten Testzeit, während die 10,0 µg/mL Ag-NPs eine teilweise hemmende Wirkung zeigten (Abb. 6b).

a Die Wachstumshemmung von E. coli und b Zeitverlaufsanalyse der antibakteriellen Wirkung

Um zu untersuchen, ob die Ag-NPs wirklich die antibiotikaresistenten Bakterienzellen beeinflussen, haben wir die antibakterielle Aktivität von Ag-NPs gegen Ampicillin-resistente E untersucht. coli durch Koloniebildungseinheitsassay. E. coli -Verstärker ⁺ exprimiert stabil eine hohe Kopienzahl des pcDNA3.4-Plasmids, das das β-Lactamase-Gen enthält, das E Ampicillin-Resistenz verleiht. coli [45]. Das E. coli -Verstärker ⁺ Zellen wurden in der LB-Agarplatte bei der Behandlung mit Ampicillin allein oder bei der kombinierten Behandlung mit Ag-NPs gezüchtet. Die inhibitorische Aktivität der hergestellten Ag-NPs ist in Fig. 7 dargestellt. Es wurde festgestellt, dass die Ag-NPs in Kombinationsbehandlung mit Ampicillin im Vergleich zu Ampicillin allein eine überlegene antibakterielle Aktivität zeigten. Im Gegensatz dazu hat die Behandlung mit Ampicillin allein keine hemmende Wirkung auf E. coli -Verstärker ⁺ . Die Kombinationstherapie von Antibiotika und Ag-NPs bietet eine komplementäre Strategie zur Überwindung antibiotikaresistenter Bakterienzellen, die die aktuellen therapeutischen Ansätze weiter verbessert. Die in dieser Studie präsentierten Gesamtergebnisse tragen zur Entwicklung alternativer antibakterieller Inhibitoren bei, um bakterielle Infektionen zu behandeln, die durch multiresistente Bakterienstämme verursacht werden.

Das Wachstum von E. coli -Verstärker ⁺ bei der Behandlung mit Ampicillin allein (50 µg/ml) oder in Kombination mit Ag-NPs (25 µg/ml). a Hohe Dichte und b geringe Dichte von E. coli -Verstärker ⁺ Zellen

Es besteht ein großer Bedarf an neuartigen Medikamenten mit unterschiedlichen Mechanismen zur Bekämpfung von bakteriellen Resistenzen. Aufgrund ihrer starken antimikrobiellen Aktivität wurden Ag-NPs in Medizinprodukten, Körperpflegeprodukten und Textilien verwendet. Es gibt mehrere Mechanismen, mit denen Ag-NP die mikrobielle Resistenz bekämpfen [46]. Ag-NPs reicherten sich auf der Oberfläche der Bakterienmembran an und erhöhten die Durchlässigkeit der Zellwand. Die Wechselwirkung zwischen Ag-NPs und Peptidoglycan veränderte die Konfiguration von Peptidoglycan und beschädigte so die Bakterienmembran [47]. Die Eigenschaften Form, Oberflächenstruktur, Morphologie, Dispersität und Biokompatibilität von Ag-NPs spielen eine bedeutende Rolle bei ihrer antimikrobiellen Aktivität.

Schlussfolgerungen

Hier berichten wir über eine neue biosynthetische Methode zur Herstellung von Ag-NPs unter Verwendung des Hefeextrakts. Die Hefemicellen, die gebildet werden, wenn das Ag ⁺ Lösung wurde mit dem Hefeextrakt vermischt. Bioreduzierende Biomoleküle spielen eine wichtige Rolle bei der Reduzierung von Ag ⁺ . Darüber hinaus bieten die Biomoleküle eine günstige Stabilität, Monodispersität und kontrollierbare Größenverteilung für die synthetisierten Ag-NPs und zeigen eine gute Stabilität von mehr als einem Jahr ohne Ausfällung. Die schnelle Aminosäureanalyse ergab, dass der Hefeextrakt reich an Biomolekülen ist, darunter Aminosäuren, Alpha-Linolensäure und Aminobuttersäure. Die Ag-NPs zeigten konzentrationsabhängig eine signifikante antibakterielle Aktivität gegen E. coli . Der Wachstumshemmtest zeigte eine vollständige Reduktion von E. coli bei Konzentrationen von Ag-NPs über 20,0 µg/ml. Die Ag-NPs in Kombinationsbehandlung mit Ampicillin zeigen im Vergleich zu Ampicillin allein eine überlegene antibakterielle Aktivität gegen Ampicillin-resistente E. coli (E. coli -Verstärker ⁺ ) Zellen. Die Oberflächenbeschichtungen von Ag-NPs erhöhten die Affinität zur Bakterienmembran und erhöhten die Permeabilität der Zellwand. Die Wechselwirkung zwischen Ag-NPs und Peptidoglycan veränderte die Konfiguration von Peptidoglycan und führte schließlich zur Apoptose von Bakterien. Darüber hinaus zeigten diese durch die Biomoleküle stabilisierten Ag-NPs eine geringe Zytotoxizität und eine gute Biokompatibilität gegenüber Cos-7-Zellen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die Datensätze, die die Schlussfolgerungen dieser aktuellen Studie stützen, sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

Abkürzungen

Ag-NPs:

Silbernanopartikel

DMEM:

Dulbeccos modifizierte Eagle medium

E. coli :

Escherichia coli

EDS:

Energiedispersives Spektrometer

FBS:

Fötales Rinderserum

FTIR:

Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie

HRTEM:

Hochauflösendes TEM

LB:

Luria-Bertani

SAED:

Beugung im ausgewählten Bereich

SEM:

Rasterelektronenmikroskopie

TEM:

Transmissionselektronenmikroskopie

UV-Vis:

Ultraviolett-sichtbar

XRD:

Röntgenpulverbeugung