Eine Gruppe von Komplexen basierend auf PAMAM und Quantum Dots, die in klinischen Immunassays verwendet werden

Einführung

Quantum Dots (QDs) werden aufgrund ihrer hohen Fluoreszenzquantenausbeuten, ihrer hohen Photostabilität und ihrer geringen Photobleichungseigenschaften häufig als Leuchtkörper verwendet. Sie werden auch häufig als organische Fluorophore in der zellulären Bildgebung und in biotechnologischen Anwendungen verwendet. Insbesondere cadmiumhaltige QDs (d. h. CdSe und CdTe) haben erhebliche Vorteile, da sie bei Bestrahlung derselben Wellenlänge im Bereich von 430–660 nm ein größenabhängiges elektromagnetisches Emissionsspektrum aufweisen [1, 2]. Daher sind antikörperkonjugierte QDs die vielversprechendsten Sonden für die molekulare Bildgebung.

Das Polyamidoamin-Dendrimer (PAMAM) weist als eines der am besten untersuchten dendritischen Makromoleküle die folgenden Eigenschaften auf:eine große Anzahl funktioneller Oberflächengruppen, eine große Anzahl von Hohlräumen im Inneren der Moleküle, eine nanoskalige Größe und eine hohe Biokompatibilität. In Konjugation mit Arzneimitteln und Antikörpern können diese Dendrimere die Löslichkeit und die systemische Zirkulation eines Arzneimittels verbessern, aber die biologische Aktivität des Arzneimittels nicht beeinträchtigen [3]. Daher werden mit PAMAM modifizierte Antikörper häufig bei der klinischen Immunisierung verwendet.

Klinische Immunoassays umfassen viele Methoden wie WB, ELISA, IHC (Immunhistochemie), ICC (Immunzytochemie) und FCM (Durchflusszytometrie). Unter diesen führen FCM unter Verwendung spezifischer Antikörpersonden eine schnelle Analyse von Einzelzellen oder anderen biologischen Partikeln auf zellulärer und molekularer Ebene durch. Daher ist FCM einer der am häufigsten verwendeten Immunoassays. Wird ein Zellscreening durchgeführt, ist die Verwendung der entsprechenden Antikörpersonde ausreichend; Wenn jedoch ein Screening kleiner biologischer Moleküle erwünscht ist, wie das eines kleinen Proteins, Virus oder Zytokins, sollte die CBA-Methode (zytometrischer Bead-Array) verwendet werden, da FCM kleine Zytokine nicht direkt nachweisen kann. Das CBA-Verfahren verwendet farbstoffmarkierte Kügelchen, die mit spezifischen Einfang-Antikörpern auf der Oberfläche konstruiert sind. Wenn CBA-Beads mit der Probe und den entsprechenden farbstoffmarkierten Antikörpern gemischt werden, bilden sich Sandwich-Komplexe wie im ELISA, und das kleine Antigen kann durch FCM nachgewiesen werden.

In dieser Studie stellen wir eine Gruppe von Komplexen vor, darunter ein PAMAM-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG und ein QDs-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG. Diese Gruppe von Komplexen kann für FCM, ICC und IHC verwendet werden. Wenn Kaninchen-Anti-Antigen und Maus-Anti-Antigen hinzugefügt werden, wird das entsprechende Antigen nachgewiesen. Dieses Modell kann viele Arten von Antigenen nachweisen, einschließlich kleiner Proteine, Viren und Zytokine, wenn die entsprechenden Maus- und Kaninchen-Antikörper vorhanden sind. Schema 1 zeigt die in FCM verwendeten Komplexe, wir nehmen HSP27 als Beispiel. HSP27 ist auch als HSPB1 (Hitzeschockproteinfamilie B Nummer 1) bekannt und ist ein wichtiges Protein, das an der Arzneimittelresistenz, dem Zellwachstum, der Apoptose, dem Auftreten von Tumoren und der Metastasierung usw. beteiligt ist [4, 5]. In diesem Modell fungiert das PAMAM-konjugierte Ziege-Anti-Kaninchen-IgG als Träger und Einfang, ähnlich den CBA-Kügelchen (Cytometric Bead Array) und ermöglicht den Nachweis der niedermolekularen Antigene durch FCM. Das QDs-konjugierte Ziegen-Anti-Maus-IgG fungiert als Fluoreszenzsonde. Wenn es sich bei den Antigenen um Membranproteine ​​oder intrazelluläre Proteine ​​handelt, können wir die traditionelle FCM-Methode zum Nachweis der Antigene verwenden. Wir müssen nur die QDs hinzufügen und nicht die PAMAM-Einheit. Für intrazelluläre Proteine ​​und Membranproteine ​​können Zellen als Ziele angesehen werden, die direkt durch die FCM-Methode nachgewiesen werden können; sie brauchen die PAMAM-Einheit nicht, um eine Pseudozelle zu bilden. Daher können wir die Komplexe aufteilen und einzeln verwenden.

Darstellung, wie die Komplexe gebildet und von FCM zum Nachweis von HSP27 verwendet werden. Zuerst muss das G5-Amino-PAMAM mit Bernsteinsäureanhydrid reagieren, um neutrales PAMAM zu bilden

Ergebnisse und Diskussion

Die Gruppe der Komplexe umfasst zwei Teile, einen PAMAM-Teil und einen QDs-Teil. Der PAMAM-Teil ist ein PAMAM-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG. Wir verwendeten aminoterminierte PAMAM-Dendrimere der fünften Generation (G5 PAMAM) als Oberflächenstabilisierungsmittel, um Löslichkeitseigenschaften ideal für wässrige Umgebungen bereitzustellen, aber dieses Dendrimer hat eine starke positive Ladung, die für die Antikörperbindung schädlich ist. Um die positive Ladung zu neutralisieren, lösten wir PAMAM in DMSO und fügten Bernsteinsäureanhydrid (Dihydro-2,5-Diketotetrahydrofuran) hinzu, um die PAMAM-Aminogruppe zu neutralisieren. Die Aminogruppe in PAMAM reagiert mit Bernsteinsäureanhydrid unter Bildung von Amidbindungen [6,7,8,9,10]. Nach der Reaktion wurde das Produkt dialysiert, lyophilisiert, gewogen und wieder aufgelöst, die Produktion ist nahezu neutral und wir nannten das Produkt „N-PAMAM“, das mit Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG konjugieren kann. PAMAM, insbesondere G5 PAMAM, enthält eine große Anzahl von Hohlräumen, und das IgG kann in den Hohlräumen von G5 PAMAM eingekapselt sein [11]. Ziegen-anti-Kaninchen-IgG wurde zuerst in MES-Puffer (0,1 µmol/l, pH 6,0) gelöst, dann wurden EDC und Sulfo-NHS (in einem Molverhältnis von 1:1) zugegeben und das Gemisch wurde 15 Minuten lang inkubiert. Schließlich wurde N-PAMAM (neutrales PAMAM) zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 4 °C in einem Schüttelbett über Nacht. Dieses Polymer organisierte sich in wässriger Lösung selbst zu polymeren Micellen, die die ansonsten unlöslichen niedermolekularen Gäste einkapselten [12]; nach der Reaktion war eine Dialyse erforderlich, um die nicht umgesetzten Materialien zu entfernen. Dann wurde die Produktion lyophilisiert, gewogen und in Konservierungspuffer wieder aufgelöst, und schließlich wurde das N-PAMAM-konjugierte Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG hergestellt.

Die Fluoreszenz- und UV-Vis-Spektren von N-PAMAM-IgG (Ziege-Anti-Kaninchen) in MES sind in Abb. 1 gezeigt. Im Vergleich zu N-PAMAM (neutrales PAMAM) und IgG ist der Fluoreszenzemissionspeak von N-PAMAM-IgG hatte die geringste Intensität. Das UV-vis-Spektrum zeigt, dass im Vergleich zu IgG, MES-Puffer, PAMAM und N-PAMAM nur N-PAMAM-IgG einen Absorptionspeak bei einer Wellenlänge von 200 nm aufwies. Ob Fluoreszenzspektrum oder UV-Vis-Spektrum, N-PAMAM-IgG zeigt andere Eigenschaften als N-PAMAM und IgG, was indirekt beweist, dass N-PAMAM und IgG kombiniert und nicht einfach gemischt wurden. Um die Antikörperaktivität von N-PAMAM-IgG nachzuweisen, wurde ein ELISA durchgeführt. Wie in 2 gezeigt, ging die IgG (Ziege-anti-Kaninchen)-Antikörperresistenz bei der Kopplung mit N-PAMAM nicht verloren.

a Fluoreszenzspektren von PAMAM-IgG (Ziege-Anti-Kaninchen) in MES. Die Anregungswellenlänge betrug 548 nm. b UV-Vis-Spektren von PAMAM-IgG (Ziege-Anti-Kaninchen) in MES und Emissionsspektren über einen Wellenlängenbereich

ELISA-Methode zum Nachweis der N-PAMAM-IgG (Ziege-anti-Kaninchen)-Antikörperresistenz. Als Antigen wurde N-PAMAM-IgG verwendet und auf verschiedene Konzentrationen verdünnt. Kaninchen-IgG-HRP wurde als Antikörpersonde verwendet, um die Resistenz von N-PAMAM-IgG nachzuweisen. Die Absorptionsmessung wurde bei einer Wellenlänge von 450 nm

Der Teil der QDs ist ein QDs-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG. Antikörper-konjugierte QDs werden normalerweise durch Kreuzkupplungsreaktionen gebildet, bei denen Antikörpermoleküle an funktionelle Gruppen wie Carboxylgruppen oder Aminogruppen auf der Oberfläche der QDs binden [13, 14]. In dieser Studie verwendeten wir wasserlösliche Kern/Schale-CdSe/ZnS-Quantenpunkte, die mit Carboxylliganden stabilisiert wurden, und die Carbodiimid-Kupplungsreaktion unter Verwendung von EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-Hydrochlorid). Diese Methode ist eine der beliebtesten Methoden zur Konjugation eines Antikörpers an die Oberfläche von QDs [15,16,17]. Die Micellen der CdSe/ZnS-QDs wurden zunächst in Gegenwart von EDC und Sulfo-NHS in Boratpuffer (5 µM BS, pH 7,2) inkubiert. Dann wurde Ziege-Anti-Maus-IgG zugegeben und die Mischung bei 4°C in einem Schüttelbett über Nacht im Dunkeln inkubiert. Schließlich wurde 10 % BSA (Rinderserumalbumin) zugegeben, um die nicht umgesetzten QDs zu blockieren, und die Produktion wurde durch aufeinanderfolgendes Zentrifugieren und Wiederauflösen gereinigt, um die nicht umgesetzten Materialien zu entfernen. Die Antikörperaktivität des QDs-konjugierten IgG (Ziege-Anti-Maus) kann nach Lagerung bei 4 °C im Dunkeln 3  Monate halten.

Die Partikelgröße von QDs-IgG (Ziege-Anti-Maus) und QDs in Konservierungspuffer (2,5 µM BS, pH 8,0, 0,1 % BSA) sind in Abb. 3 a dargestellt. Nach der Kupplungsreaktion nahm der Durchmesser der Produkte offensichtlich zu und die Produkte wiesen eine gute Homogenität und Stabilität auf. Diese Eigenschaften sind der Schlüssel zu ihrer Verwendung als Nachweissonde. Die Fluoreszenzspektren von QDs-IgG und QDs sind in Abb. 3b gezeigt, und wie in Abb. 3a gezeigt, zeigt der erhöhte Produktionsdurchmesser, dass das IgG mit den QDs kombiniert wurde, aber der QDs-IgG-Fluoreszenzemissionspeak war der gleiche wie die QDs. Dieses Ergebnis bedeutet, dass die Kopplung von IgG und QDs die optischen Eigenschaften der QDs nicht veränderte, was für ihre Anwendung in Immunoassays nützlich ist. Um die Antikörperaktivität des QDs-IgG nachzuweisen, verwendeten wir ein ELISA-Verfahren mit einer PVDF-Membran. Der Maus-Anti-AKT-Antikörper wurde auf Konzentrationen von 1 µg/ml, 10 µg/ml, 100 µg/ml und 200 µg/ml verdünnt, und die vier Konzentrationsgradienten-Antigene wurden mit QDs-IgG (Ziege-Anti-Maus) hybridisiert. bei der gleichen Konzentration von 0,1 mg/ml. Nach 40 min Hybridisierung bei 37 °C im Dunkeln wurde die PVDF-Membran dreimal mit PBST (pH 6,0, 0,1% Tween 20) gewaschen und die PVDF-Membran mit UV-Licht bestrahlt. Die Fluoreszenzintensität wurde in Abb. 3c gezeigt, die Fluoreszenzintensität nahm mit steigender Antigenkonzentration zu, was darauf hindeutet, dass QDs-IgG eine hohe Antikörperaktivität besitzt.

a Verteilung des hydrodynamischen Durchmessers der QDs und QDs-konjugierten IgG (Ziege-Anti-Maus). (a ) QDs-Durchmesser und (b ) QDs-konjugiertes IgG (Ziege-Anti-Maus). Der durchschnittliche Durchmesser der QDs beträgt 64,87 nm und der von QDs-IgG beträgt 211,4 nm, nachgewiesen durch DLS. b Fluoreszenzspektren von QDs-IgG (Ziege-Anti-Maus), QDs und Konservierungspuffer (2,5 µM BS, pH 8,0, 0,1 % BSA). Der QDs-IgG-Fluoreszenzemissionspeak war der gleiche wie der der QDs, was darauf hindeutet, dass die Kopplung von IgG an QDs die optischen Eigenschaften der QDs nicht veränderte. c ELISA-Methode zum Nachweis der Antikörperresistenz von QDs-IgG (Ziege-Anti-Maus), die PVDF-Membran wurde mit UV bewertet

In diesem Abschnitt wird erläutert, wie Sie diese Gruppe von Komplexen in FCM verwenden. Wie oben erwähnt, können wir viele Arten von Antigenen nachweisen, wie kleine Proteine, Viren und Zytokine [18], und wir haben das HSP27-Protein als Beispiel genommen, lassen Sie uns nun im Detail auf den Prozess eingehen. HSP27 befindet sich im Zytoplasma und wird in großen Mengen in Tumorzellen sezerniert, insbesondere bei Lungenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Harnepithelkrebs, Nierenkrebs, Brustkrebs und Melanom-Hautkrebs. Da ein kleiner Teil von HSP27 extrazellulär sezerniert wird, müssen wir die Zelle lysieren, um das Protein zu extrahieren. In diesem Experiment wählten wir zwei Zelllinien aus, MCF-7 (menschliche Brustkrebszellen) als Testgruppe und L02 (normale menschliche Leberzellen) als Kontrollgruppe. Die Zellen wurden lysiert, um die intrazellulären Proteine ​​zu extrahieren. Die Gesamtproteine ​​wurden gesammelt, dann wurden Kaninchen-Anti-HSP27 und Maus-Anti-HSP27 entsprechend der Proteinkonzentration zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C für 50 Minuten. Dann wurde dem Gemisch N-PAMAM-IgG zugesetzt, das Gemisch wurde 30 Minuten bei 37 °C inkubiert und dann in zwei gleiche Gruppen aufgeteilt:eine Testgruppe und eine PAMAM-Gruppe. Schließlich wurde der Testgruppe QDs-IgG zugesetzt und bei 37 °C für 30 Minuten im Dunkeln inkubiert. Abbildung 4 zeigt die Fluoreszenzanalyse für die beiden Zellgruppen mittels Durchflusszytometrie. Die Fluoreszenzintensität der Testkurve war in der MCF-7-Gruppe viel höher als die der PAMAM-Kurve, während sich in der L02-Gruppe die beiden Kurven fast überlappten. Wenn HSP27 in Zellextrakten vorhanden ist, binden N-PAMAM-IgG und QDs-IgG indirekt zusammen, um eine Sandwich-Kombination in Gegenwart von Kaninchen-Anti-HSP27 und Maus-Anti-HSP27 zu bilden. Wenn HSP27 nicht existiert, wird nur eine kleine Menge QDs-IgG durch unspezifische Adsorption an N-PAMAM-IgG binden. Daher ist HSP27 in der Probe enthalten, wenn die Fluoreszenzintensität der Testkurve höher ist als die der PAMAM-Kontrollkurve. Abbildung 4 zeigt, dass MCF-7-Zellen mehr HSP27-Protein sezernierten als L02-Zellen.

Fluoreszenzanalyse von HSP27 durch Durchflusszytometrie. a L02-Zellen. b MCF-7-Zellen. Die Testgruppe wurde mit N-PAMAM-IgG und QDs-IgG inkubiert, die PAMAM-Gruppe als Kontrolle, die nur mit N-PAMAM-IgG inkubiert wurde, um eine Pseudozelle für durch FCM nachgewiesenes Mikromolekülprotein zu bilden. Wenn sich die beiden Kurven fast überlappen, kann festgestellt werden, dass kein HSP27 in der Probe vorhanden ist; Daher ändert sich die Fluoreszenzintensität nicht, unabhängig davon, ob QDs-IgG hinzugefügt wird oder nicht.

Wie oben erwähnt, können diese Komplexe sezernierte intrazelluläre Proteine ​​durch FCM nachweisen; prinzipiell können diese Komplexe auf jede Art von Antigen aufgebracht werden. Außerdem können die beiden Teile der Kombination separat verwendet werden. Befindet sich das Antigen, das wir nachweisen möchten, in der Zelle oder auf der Zelloberfläche, können wir nur den Teil der QDs verwenden. β-Aktin ist beispielsweise einer der Hauptbestandteile des Zytoskeletts in Zellen und kommt in eukaryontischen Zellen weit verbreitet vor. Abbildung 5a zeigt die Fluoreszenzanalyse des nur verwendeten QD-Teils für β-Aktin in HeLa-Zellen durch FCM. HeLa-Zellen wurden gewaschen und mit Methanol behandelt, um die Penetration der Zellmembran zu verbessern, und dann in zwei gleiche Gruppen aufgeteilt. Die β-Actin-Gruppe wurde mit Maus-Anti-β-Actin bei 37 °C für 30 min inkubiert, und die Kontrollgruppe wurde mit BSA inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden beide Gruppen mit QDs-IgG (Ziege-Anti-Maus) bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden beide Gruppen durch FCM nachgewiesen. Die Fluoreszenzintensität der β-Aktin-Kurve war viel höher als die der Kontrollkurve, was darauf hindeutet, dass die HeLa-Zellen das β-Aktin-Protein enthielten.

a Fluoreszenzanalyse für β-Aktin in HeLa-Zellen. Die β-Aktin-Gruppe wurde mit Maus-Anti-β-Aktin und QDs-IgG (Ziege-Anti-Maus) inkubiert und die Kontrollgruppe wurde mit BSA und QDs-IgG inkubiert. Die Kontrollgruppe kann den Ausschluss der Hintergrundfluoreszenz ermöglichen, die durch die unspezifische Adsorption von QDs-IgG verursacht wird. b Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von HeLa-Zellen unter UV-Vis-Bestrahlung. DAPI färbte die Zellkerne und emittierte blaue Fluoreszenz; QDs-IgG kombinierte indirekt mit β-Aktin und emittierte rote Fluoreszenz. Maßstabsleiste 20 μm

Darüber hinaus können diese Komplexe auch auf ICC angewendet werden. Für ICC ist es jedoch erforderlich, dass sich das Zielantigen in der Zelle oder auf der Zelloberfläche befindet und in großen Mengen vorhanden ist [19]; andernfalls ist das experimentelle Ziel schwer vom Hintergrund zu unterscheiden. Wir haben zum Beispiel das β-Aktin-Protein genommen und HeLa-Zellen in eine 10 cm-Zellplatte ausgesät und ein Mikroskop-Deckglas hineingelegt, um die Zellen mit Methanol zu immobilisieren. Die Zellen wurden dann mit Maus-Anti-β-Aktin (PBS, 1% BSA) bei 37 °C für 1 Stunde inkubiert, zweimal mit PBST gewaschen und mit QDs-IgG (Ziege-Anti-Maus) bei 37 °C in der 1 h dunkel. Nach zweimaligem Waschen mit PBST und Anfärben des Zellkerns mit DAPI wurde die Fluoreszenz mit einem Fluoreszenzmikroskop nachgewiesen [20, 21]. Abbildung 5b zeigt die fluoreszenzmikroskopischen Bilder der HeLa-Zellen. Der Vorteil von QDs als Fluoreszenzfarbstoff besteht darin, dass das Signal der QDs und das DAPI-Signal gleichzeitig unter Bestrahlung des ultravioletten Kanals beobachtet werden können; daher kann das Ziel je nach Kern offensichtlich lokalisiert werden. In diesem Experiment ist β-Aktin Proteine ​​des Zytoskeletts um den Zellkern und kann offensichtlich beobachtet werden.

Schlussfolgerungen

Zusammenfassend haben wir die Anwendung der Komplexe demonstriert, die in klinischen Immunoassays wie FCM und ICC verwendet werden. Die Gruppe der Komplexe umfasst ein PAMAM-konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG und ein QDs-konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG. Bei Zugabe von Kaninchen-Anti-Antigen und Maus-Anti-Antigen wurde das entsprechende Antigen nachgewiesen. Diese Komplexe sind aufgrund ihres breiten Spektrums, ihrer hohen Biokompatibilität, ihrer hohen Lichtstabilität und ihrer geringen biologischen Toxizität von Vorteil. Dieser Komplex ist ein universelles Modell, bei dem nur die entsprechenden Primärantikörper verändert werden müssen. In diesem Artikel haben wir die Komplexe zum Nachweis von HSP27 und β-Aktin verwendet, aber theoretisch kann dieses Verfahren auf jede Art von Antigen angewendet werden. Darüber hinaus können wir die Nachweismethode nach den Eigenschaften der Antigene wählen und die Komplexe auch aufteilen und individuell nach den tatsächlichen Bedürfnissen einsetzen. Mit dieser Methode können auch kleine Moleküle, wie kleine Proteine ​​und Viren, mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen werden. Wir glauben, dass es mit entsprechender Verbesserung auch auf andere Methoden wie Immunfluoreszenz (IF), Western Blot (WB) und Lateral-Flow-Immunchromatographiestreifen (LCS) angewendet werden kann.

Methoden/Experimental

Materialien

CdSe/ZnS-Quantenpunkte (wasserlösliche QDs mit Carboxylgruppen, Cas-Nr. N/A) wurden von NEPQD, China, bezogen. PAMAM (Aminoterminierte der fünften Generation, Chargen-Nr. CYD-150A) wurde von CYD, China, bezogen. Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (ab6702) und Maus-Anti-β-Actin (ab8226) wurden von Abcam, UK, bezogen; Maus-Anti-HSP27 (BF0624) und Kaninchen-Anti-HSP27 (AF6082) wurden von Affinity, USA, bezogen; Ziegen-Anti-Maus-IgG (bs0296G) wurde von Bioss, China, bezogen; EDC und Sulfo-NHS wurden von Thermo Fisher bezogen; DMEM und fötales Rinderserum wurden von Gibco bezogen; und PVDF-Membranen (0,2 µm) wurden von Millipore bezogen. Alle anderen chemischen Reagenzien waren von analytischer Reagensqualität.

Vorbereitung von N-PAMAM-IgG (Ziegen-Anti-Kaninchen)

1. a)

   Herstellung von N-PAMAM (neutrales PAMAM):PAMAM (G5-Aminoterminiert, durchschnittliches MW 28826) (60 mg, 2,081 mM) wurde in DMSO (2 ml) und Bernsteinsäureanhydrid (Dihydro-2,5-Diketotetrahydrofuran) (0,266 ) gelöst g, 2,66 µM) wurde zugegeben, um die Aminogruppen zu neutralisieren. Da ein Mol G5 PAMAM-Makromoleküle 128 Mol Aminogruppen enthält, enthalten 60 mg PAMAM 0,266 mM Aminogruppen und das Molverhältnis für PAMAM-Aminogruppen und Bernsteinsäureanhydrid beträgt ungefähr 1:10. Dann wurde die Mischung in einem Schüttelbett bei 100 U/min 4 Stunden lang gemischt, wonach die Lösung 24 Stunden lang durch eine 3500 MWCO-Dialysemembran dialysiert wurde, und N-PAMAM wurde nach Lyophilisierung erhalten

2. b)

   Herstellung von N-PAMAM-IgG (Ziege-Anti-Kaninchen):formulierter MES-Puffer (100 µM, pH 6,0), dann 100 µl MES-Puffer in ein Röhrchen geben, 20 µM EDC und 20 µM Sulfo-NHS zugeben und mit a . rühren Wirbel mit niedriger Geschwindigkeit. 35,7 µl IgG (pH, 0,5 µM) zugeben und vortexen, danach 19 µg N-PAMAM zugeben und über Nacht bei 4 °C inkubieren, schließlich wird die Lösung 3 Tage lang durch eine 3500MWCO- und eine 8000MWCO-Dialysemembran dialysiert, nach Lyophilisat wird das N-PAMAM-IgG gewonnen.

Vorbereitung von QDs-IgG (Ziegen-Anti-Maus)

1. a)

   Formulierung von BS-Puffer:

1. 1.

   Bereiten Sie Boraxpuffer (50 mM) vor:Wiegen Sie 19,07 g Borax und lösen Sie es in 1 L Reinstwasser auf.

2. 2.

   Bereiten Sie Borsäurepuffer (50 mM) vor:Wiegen Sie 3,09 g Borsäure ab und lösen Sie sie in 1 L Reinstwasser auf.

3. 3.

   pH 8,0 BS-Puffer und pH 7,2 BS-Puffer wurden durch Mischen der beiden obigen Lösungen hergestellt.

4. 4.

   Waschpuffer, der auch als Konservierungspuffer verwendet wird, wurde hergestellt, indem der BS-Puffer mit einem pH-Wert von 8,0 auf eine Konzentration von 5 mM verdünnt und 0,1 % Tween 20 zugegeben wurde

5. 5.

   Die Aktivierungslösung wurde hergestellt, indem der BS-Puffer mit einem pH-Wert von 7,2 auf eine Konzentration von 5 mM verdünnt und 0,1 % Tween 20 zugegeben wurde

6. 6.

   EDC-Puffer wurde durch Auflösen von 0,27 g EDC in 5 ml Aktivierungslösung hergestellt, und Sulfo-NHS-Puffer wurde durch Auflösen von 0,378 g Sulfo-NHS in 5 ml Aktivierungslösung hergestellt

1. b)

   Herstellung von QDs-IgG (Ziege-Anti-Maus):

Zuerst wurden 450 µl QDs (CdSe/ZnS, 5 µg/ml) in 2,25 µl Aktivierungslösung gelöst, dann wurden 150 µl EDC-Puffer und 150 µl Sulfo-NHS-Puffer zugegeben und die Lösung wurde 5 Minuten lang auf Eis beschallt Mindest. Zweitens wurde die Lösung bei 12.000 U/min 5 Minuten lang zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, und der Niederschlag wurde in 1,2 ml Waschpuffer gelöst. Nach 30 Minuten Ultraschallmischen wurden 100 µg IgG-Antikörper zugegeben, dann wurde die Lösung über Nacht in einem Schüttelbett bei einer Temperatur von 4 °C inkubiert. Drittens wurden 150 µl 10 % BSA zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 30 °C für 30 Minuten und einer Zentrifugation bei 12.000 U/min für 2 Minuten, um den Überstand zu entfernen. Das Präzipitat wurde in 1 ml Waschpuffer wieder aufgelöst, dann bei 12.000 Upm für 2 Minuten zentrifugiert, dieser Schritt wurde wiederholt und schließlich das Präzipitat in 1 ml Konservierungspuffer gelöst. Am Ende wurde 10 % BSA zugegeben; die Mischung wurde mit vollständigem Ultraschall-Schockmischen gemischt und mit 820 µg/min zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen, wobei der Überstand QDs-IgG enthielt. QDs-IgG sollte 3 Monate bei 4 °C im Dunkeln gelagert werden. Zu beachten ist, dass die Proben nur bei 4 °C gelagert werden können und auch mit Glycerin nicht eingefroren werden können; Andernfalls wird eine große Anzahl von Quantenpunkten verursacht, die sich zu Clustern sammeln und einen Niederschlag bilden, der mit PBST nicht weggespült werden könnte, was zu einer ernsthaften Hintergrundfluoreszenz führt.

FCM-Analyse auf HSP27-Protein

HSP27 befindet sich im Zytoplasma und wird in großen Mengen in Tumorzellen sezerniert. In diesem Experiment wählten wir zwei Zelllinien aus, MCF-7 (menschliche Brustkrebszellen) als Testgruppe und L02 (normale menschliche Leberzellen) als Kontrollgruppe. Die beiden Zellgruppen wurden in eine 10 cm-Kulturschale ausgesät und in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 °C inkubiert. Wenn die Zellen 80% der Platte bedeckten, wurden die Zellen mit Trypsin verdaut und zweimal mit PBS gewaschen. Dann wurden die Zellen in 1 ml PBS resuspendiert. Die Zellen wurden mit einem Hämozytometer gezählt, T-PER-Zelllysepuffer wurde entsprechend der Zellkonzentration zugegeben, danach wurde das intrazelluläre Protein aus dem Zelllysat extrahiert. Dann wurde das Zelllysat bei 14000 U/min für 10 Minuten zentrifugiert, um den Überstand zu sammeln, und die Proteinkonzentration wurde durch das BCA-Verfahren gemessen, entsprechend der Proteinkonzentration wurden Kaninchen-Anti-HSP27 und Maus-Anti-HSP27 zugegeben und bei . inkubiert 37 °C für 50 min. In diesem Experiment betrug die Proteinkonzentration von L02 ungefähr 0,2 µg/ml und MCF-7 0,25 µg/ml, und das Volumen von beiden betrug 500 µl. Die beiden Antikörper, Kaninchen-Anti-HSP27 und Maus-Anti-HSP27, wurden zu den Zellen gegeben (0,625 µl zu MCF-7- und 0,5 µl zu L02-Zellen).

Dann wurde den Mischungen 1 mg/ml N-PAMAM-IgG zugesetzt, gefolgt von einer Inkubation bei 37ºC für 30 min; 6,25 µl wurden der MCF-7-Gruppe und 5 µl der L02-Gruppe hinzugefügt. Nach der Inkubation wurde die Produktion in zwei gleiche Gruppen aufgeteilt, die Testgruppe und die PAMAM-Gruppe. Schließlich wurde der Testgruppe QDs-IgG zugesetzt, die 30 Minuten bei 37 °C im Dunkeln inkubiert wurde. Dann wurden die beiden Zellgruppen durch Durchflusszytometrie analysiert.

FCM-Analyse für das β-Aktin-Protein

β-Aktin ist ein intrazelluläres Protein, das einer der Hauptbestandteile des Zytoskeletts ist und in eukaryontischen Zellen weit verbreitet ist. HeLa-Zellen wurden in eine 10 cm-Kulturschale ausgesät und in DMEM mit 10 % FBS bei 37 °C 2 Tage lang inkubiert, dann wurde der Überstand entfernt und die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit Trypsin verdaut, wonach die Zellen 3 min bei 800 U/min zentrifugiert wurden, um den Überstand zu entfernen, und 1 ml kaltes Methanol wurde zugegeben, um die Zellen zu resuspendieren. Nach 5 min wurden die Zellen 3 min bei 800 Upm zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen, und die Zellen wurden in 1 ml PBS resuspendiert. Dieser Schritt wurde wiederholt und die HeLa-Zellen wurden in zwei gleiche Gruppen aufgeteilt. Die Testgruppe wurde mit Maus-Anti-β-Aktin bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert, und die Kontrollgruppe wurde mit BSA (Rinderserumalbumin) inkubiert. In diesem Experiment wurde Maus-Anti-β-Actin in PBST (1% BSA, 5 µg/ml) gelöst, und 100 µl IgG wurden zu 300 µl der Testgruppe gegeben, und eine äquivalente Menge BSA wurde zu der Testgruppe gegeben Kontrollgruppe. Nach einer halben Stunde Inkubation wurden beide Gruppen mit QDs-IgG (Ziege-Anti-Maus) bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden beide Gruppen durch FCM bewertet.

ICC-Analyse für das β-Aktin-Protein

HeLa-Zellen wurden in eine Kulturschale von 10 cm ausgesät und in DMEM mit 10 % FBS bei 37 °C 1 Tag lang inkubiert. Dann wurden mehrere sterilisierte Deckgläser in die Zellschale gelegt und die Zellen wurden 2 Tage lang weiter kultiviert. Die Deckgläschen wurden entfernt und zweimal mit PBS gewaschen, dann wurden die Deckgläschen in 400 &mgr;l Methanol 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Deckgläser wurden dreimal mit PBS gewaschen. Dann wurde Blockierungspuffer mit PBST (0,1 % Tween 20), 22,52 mg/ml Glycin und 10 % BSA hergestellt. Ein Deckglas wurde in Blockierungspuffer gegeben und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde der Blockierungspuffer entfernt und ein Deckglas wurde mit Maus-Anti-β-Actin (PBS, 1% BSA) bei 37 °C für 1 Stunde inkubiert, zweimal mit PBST gewaschen und mit QDs-IgG (Ziege-Anti- Maus) bei 37 °C für 1 h im Dunkeln. Nach zweimaligem Waschen mit PBST und Anfärben des Zellkerns mit DAPI für 2 min wurde das Deckglas einmal mit PBS und einmal mit Wasser zur Visualisierung unter einem Fluoreszenzmikroskop gespült.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten sind uneingeschränkt verfügbar.

Abkürzungen

CBA:

Zytometrisches Bead-Array

DMEM:

Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium

FBS:

Fötales Rinderserum

FCM:

Durchflusszytometrie

ICC:

Immunzytochemie

N-PAMAM:

Neutrales PAMAM

PAMAM:

Das Polyamidoamin-Dendrimer

QDs:

Quantenpunkte