Fortgeschrittene PAMAM-Quantenpunkt-Komplexe für schnelle klinische Immunoassays

Zusammenfassung

Es wird eine Gruppe von Komplexen für klinische Immunoassays vorgestellt. Die Komplexe umfassen ein PAMAM-konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen-IgG und ein QD-konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG. Bei Zugabe von Kaninchen-anti-Antigen und Maus-anti-Antigen wird das entsprechende Antigen detektiert. Das Experiment mit diesen Komplexen ist einfach, bequem, kurz in Zeit und Schritten. Es ist auch für verschiedene Experimentiermethoden anwendbar, wie FCM (Durchflusszytometrie), ICC (Immunzytochemie) und IHC (Immunhistochemie) zum Nachweis vieler Antigentypen.

Einleitung

Quantenpunkte (QDs) werden aufgrund hoher Fluoreszenzquantenausbeute, hoher Photostabilität und geringer Photobleichung weit als Leuchtmittel eingesetzt. Sie dienen auch als organische Fluorophore in Zellbildgebung und biotechnologischen Anwendungen. Besonders cadmiumhaltige QDs (CdSe, CdTe) bieten Vorteile: Bei Bestrahlung gleicher Wellenlänge (430–660 nm) zeigen sie größenabhängige Emissionsspektren. Daher sind Antikörper-konjugierte QDs vielversprechende Sonden für molekulare Bildgebung.

Der Polyamidoamin-Dendrimer (PAMAM), einer der am meisten untersuchten dendritischen Makromoleküle, zeichnet sich aus durch: große Anzahl oberflächenfunktionaler Gruppen, viele innere Hohlräume, Nanoskalengröße und hohe Biokompatibilität. Bei Konjugation mit Medikamenten und Antikörpern verbessern diese Dendrimere die Löslichkeit und systemische Zirkulation des Medikaments ohne Beeinträchtigung der biologischen Aktivität. Daher werden PAMAM-modifizierte Antikörper oft in klinischen Immunisierungen eingesetzt.

Klinische Immunoassays umfassen viele Methoden: WB, ELISA, IHC, ICC, FCM. FCM nutzt spezifische Antikörpersonden für schnelle Analyse einzelner Zellen oder biologischer Partikel auf zellulärer/molekularer Ebene und ist eines der am häufigsten verwendeten Immunoassays. Für Zellscreening reicht die entsprechende Antikörpersonde; für kleine Biomoleküle (kleine Proteine, Viren, Zytokine) muss die CBA-Methode (Cytometric Bead Array) verwendet werden, da FCM kleine Zytokine nicht direkt detektieren kann. CBA nutzt farbstoffmarkierte Beads mit spezifischen Capture-Antikörpern. Beim Mischen mit Probe und farbstoffmarkierten Antikörpern bilden sich Sandwich-Komplexe wie bei ELISA, sodass kleine Antigene per FCM detektierbar sind.

In dieser Studie wird eine Komplexgruppe vorgestellt: PAMAM-konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen-IgG und QD-konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG. Diese Gruppe ist für FCM, ICC, IHC einsetzbar. Bei Zugabe von Kaninchen-anti-Antigen und Maus-anti-Antigen wird das entsprechende Antigen detektiert. Das Modell kann viele Antigentypen detektieren, einschließlich kleiner Proteine, Viren, Zytokine, sofern entsprechende Maus- und Kaninchenantikörper vorliegen. Schema 1 zeigt die Komplexe in FCM am Beispiel HSP27. HSP27 (HSPB1) ist ein wichtiges Protein in Medikamentenresistenz, Zellwachstum, Apoptose, Tumorentstehung, Metastase. In diesem Modell wirkt PAMAM-konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen-IgG als Träger und Capture, ähnlich CBA-Beads, ermöglicht Detektion kleiner Molekülantigene per FCM. QD-konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG wirkt als fluoreszente Sonde. Sind Antigene Membran- oder intrazelluläre Proteine, kann traditionelles FCM verwendet werden – nur QDs, kein PAMAM nötig. Für intrazelluläre/Membranproteine dienen Zellen als direkt detektierbare Targets; PAMAM für Pseudozell-Bildung nicht nötig. Daher können die Komplexe geteilt und einzeln verwendet werden.

Ergebnisse und Diskussion

Die Komplexgruppe besteht aus zwei Teilen: PAMAM-Teil und QDs-Teil. Der PAMAM-Teil ist PAMAM-konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen-IgG. Fünfte Generation aminoterminierter PAMAM-Dendrimer (G5 PAMAM) wurde als Oberflächenstabilisator für ideale Löslichkeit in wässrigen Umgebungen genutzt, aber der starke positive Ladung schadet Antikörperbindung. Zur Neutralisierung wurde PAMAM in DMSO gelöst und Succinsäureanhydrid (Dihydro-2,5-diketotetrahydrofuran) zugesetzt. Aminogruppen in PAMAM reagieren mit Succinsäureanhydrid zu Amidbindungen. Nach Reaktion Dialyse, Lyophilisierung, Wiegen, Wiederauflösung – Produkt nahezu neutral, bezeichnet als „N-PAMAM“, fähig zur Konjugation mit Ziegen-anti-Kaninchen-IgG. PAMAM, besonders G5, enthält viele Hohlräume; IgG kann in Hohlräumen von G5 PAMAM eingekapselt werden. Ziegen-anti-Kaninchen-IgG in MES-Puffer (0,1 mol/L, pH 6,0) gelöst, EDC und Sulfo-NHS (molares Verhältnis 1:1) zugegeben, 15 min inkubiert. Dann N-PAMAM zugegeben, über Nacht bei 4 °C im Schüttelbett inkubiert. Polymer selbstassembliert in wässriger Lösung zu polymeren Mizellen, die unlösliche niedermolekulare Gäste einkapseln. Nach Reaktion Dialyse zur Entfernung unreaktiver Materialien. Dann Lyophilisierung, Wiegen, Wiederauflösung in Puffer – N-PAMAM-konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen-IgG erhalten.

Fluoreszenz- und UV-Vis-Spektren von N-PAMAM-IgG (Ziege-anti-Kaninchen) in MES (Abb. 1). Verglichen mit N-PAMAM und IgG war Fluoreszenzemissionspeak von N-PAMAM-IgG am niedrigsten. UV-Vis: Nur N-PAMAM-IgG zeigte Absorptionspeak bei 200 nm. Sowohl Fluoreszenz- als auch UV-Vis-Spektrum zeigen unterschiedliche Charakteristika vs. N-PAMAM und IgG, was indirekt beweist, dass N-PAMAM und IgG kombiniert, nicht nur gemischt sind. Antikörperaktivität von N-PAMAM-IgG per ELISA geprüft (Abb. 2): IgG (Ziege-anti-Kaninchen) Antikörperresistenz nicht verloren durch Kopplung mit N-PAMAM.

Der QDs-Teil ist QDs-konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG. Antikörper-konjugierte QDs entstehen meist durch Querkupplungsreaktionen, wo Antikörper an Funktionsgruppen (Carboxyl-/Aminogruppen) auf QD-Oberfläche binden. Hier: Kern/Schale CdSe/ZnS wasserlösliche QDs mit Carboxyl-Liganden stabilisiert, Carbodiimid-Kupplung mit EDC. Beliebte Methode für Antikörper-QD-Konjugation. CdSe/ZnS QD-Mizellen zunächst mit EDC und Sulfo-NHS in Boratpuffer (5 mM BS, pH 7,2) inkubiert. Dann Ziegen-anti-Maus-IgG zugegeben, über Nacht bei 4 °C im Schüttelbett im Dunkeln inkubiert. Schließlich 10 % BSA (Rinderserumalbumin) zur Blockierung unreaktiver QDs, Reinigung durch mehrfaches Zentrifugieren und Wiederauflösen. Antikörperaktivität von QDs-IgG (Ziege-anti-Maus) hält 3 Monate bei 4 °C im Dunkeln.

Partikelgröße von QDs-IgG und QDs in Puffer (Abb. 3a): Nach Kopplung Durchmesser deutlich erhöht, Produkte gute Homogenität und Stabilität – Schlüssel für Detektionssonden. Fluoreszenzspektren (Abb. 3b): QDs-IgG Emissionspeak identisch mit QDs, Kopplung verändert optische Eigenschaften nicht – nützlich für Immunoassays. Antikörperaktivität von QDs-IgG per ELISA mit PVDF-Membran geprüft (Abb. 3c): Maus-anti-AKT Antikörper in 4 Konzentrationen (1–200 μg/ml) mit QDs-IgG (0,1 mg/ml) hybridisiert, 40 min bei 37 °C im Dunkeln. Nach Waschen UV-Bestrahlung, Fluoreszenzintensität stieg mit Antigenkonzentration – hohe Antikörperaktivität bestätigt.

Anwendung in FCM

Detektion verschiedener Antigene (kleine Proteine, Viren, Zytokine), Beispiel HSP27. HSP27 im Zytoplasma, in Tumorzellen (Lungen-, Bauchspeicheldrüsen-, Harnwegs-, Nieren-, Brustkrebs, Melanom) stark sezerniert. Da kleiner Teil extrazellulär sezerniert, Zelllyse zur Protein-Extraktion. Zwei Zelllinien: MCF-7 (menschliche Brustkrebszellen) Testgruppe, L02 (normale menschliche Leberzellen) Kontrollgruppe. Zellen lysiert, intrazelluläre Proteine extrahiert. Gesamtproteine gesammelt, Kaninchen-anti-HSP27 und Maus-anti-HSP27 nach Proteinkonzentration zugegeben, 50 min bei 37 °C inkubiert. Dann N-PAMAM-IgG zugegeben, 30 min bei 37 °C, in zwei gleich große Gruppen geteilt: Testgruppe und PAMAM-Gruppe. Schließlich QDs-IgG zu Testgruppe, 30 min bei 37 °C im Dunkeln. Abb. 4 zeigt Fluoreszenzanalyse per Durchflusszytometrie. Testkurve Fluoreszenzintensität deutlich höher als PAMAM-Kurve in MCF-7 Gruppe; in L02 Gruppe Kurven fast überlappend. Wenn HSP27 vorhanden, binden N-PAMAM-IgG und QDs-IgG indirekt zu Sandwich-Komplex in Gegenwart von Kaninchen-anti-HSP27 und Maus-anti-HSP27. Ohne HSP27 nur unspezifische Adsorption. Höhere Fluoreszenz der Testkurve vs. Kontroll-PAMAM-Kurve = HSP27 in Probe. MCF-7 sezernieren mehr HSP27 als L02.

Getrennte Verwendung der Komplexteile

Komplexe können sekretierte intrazelluläre Proteine per FCM detektieren; prinzipiell auf jedes Antigen anwendbar. Beide Teile trennbar nutzbar. Wenn Antigen in Zelle oder auf Zelloberfläche: nur QDs-Teil. Beispiel β-Aktin, Hauptkomponente des Zytoskeletts, in Zellen, weit verbreitet in Eukaryoten. Abb. 5a: Fluoreszenzanalyse nur QD-Teil für β-Aktin in HeLa-Zellen per FCM. HeLa-Zellen gewaschen, mit Methanol behandelt (Membranpermeabilisierung), in zwei Gruppen geteilt. β-Aktin-Gruppe: Inkubation mit Maus-anti-β-Aktin 30 min bei 37 °C; Kontrollgruppe: BSA. Nach PBS-Waschen beide Gruppen mit QDs-IgG (Ziege-anti-Maus) 30 min bei 37 °C. Nach 2x PBS-Waschen FCM. β-Aktin-Kurve Fluoreszenz deutlich höher als Kontrolle – HeLa-Zellen enthalten β-Aktin.

Anwendung in ICC (Abb. 5b): Erfordert Antigen in/auf Zelle in großen Mengen, sonst schwer von Hintergrund unterscheidbar. Beispiel β-Aktin: HeLa-Zellen in 10 cm Schale, Deckglas eingelegt, Methanol-Fixierung. Inkubation mit Maus-anti-β-Aktin (PBS, 1 % BSA) 1 h bei 37 °C, 2x PBST waschen, QDs-IgG (Ziege-anti-Maus) 1 h bei 37 °C im Dunkeln. 2x PBST waschen, Zellkern mit DAPI färben (2 min), Fluoreszenzmikroskopie. Vorteil QDs als Fluoreszenzfarbstoff: QDs-Signal und DAPI-Signal simultan unter UV-Kanal beobachtbar, Target laut Kern offensichtlich lokalisierbar. β-Aktin als Zytoskelettprotein um Kern herum gut sichtbar.

Schlussfolgerungen

Anwendung der Komplexe in klinischen Immunoassays (FCM, ICC) demonstriert. Gruppe umfasst PAMAM-konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen-IgG und QDs-konjugiertes Ziegen-anti-Maus-IgG. Bei Zugabe von Kaninchen-anti-Antigen und Maus-anti-Antigen wird entsprechendes Antigen detektiert. Vorteile: breites Spektrum, hohe Biokompatibilität, hohe Lichtstabilität, geringe biologische Toxizität. Universelles Modell – nur entsprechende Primärantikörper austauschen. Hier HSP27 und β-Aktin detektiert, prinzipiell auf jedes Antigen anwendbar. Detektionsmethode wählbar nach Antigeneigenschaften; Komplexe trennbar nutzbar. Ermöglicht Detektion kleiner Moleküle (Proteine, Viren) per Durchflusszytometrie. Mit Verbesserungen auch auf andere Methoden anwendbar: Immunfluoreszenz (IF), Western Blot (WB), lateral-flow immunochromatografische Teststreifen (LCS).

Methoden / Experimentelles

Materialien

CdSe/ZnS QDs (wasserlöslich, Carboxylgruppen) von NEPQD, China. PAMAM (G5 aminoterminiert, Lot CYD-150A) von CYD, China. Ziege-anti-Kaninchen-IgG (ab6702), Maus-anti-β-Aktin (ab8226) von Abcam, UK. Maus-anti-HSP27 (BF0624), Kaninchen-anti-HSP27 (AF6082) von Affinity, USA. Ziege-anti-Maus-IgG (bs0296G) von Bioss, China. EDC, Sulfo-NHS von Thermo Fisher. DMEM, FBS von Gibco. PVDF-Membranen (0,2 μm) von Millipore. Alle anderen Chemikalien analytischer Grad.

Herstellung von N-PAMAM-IgG (Ziege-anti-Kaninchen)

1. a) Herstellung N-PAMAM (neutrales PAMAM): PAMAM (G5 aminoterminiert, MW 28826) (60 mg, 2,081 mM) in DMSO (2 ml) gelöst, Succinsäureanhydrid (0,266 g, 2,66 mM) zur Neutralisierung der Aminogruppen zugegeben. 1 Mol G5 PAMAM hat 128 Mol Aminogruppen, 60 mg PAMAM enthalten 0,266 mM Aminogruppen, molares Verhältnis PAMAM-Aminogruppen : Succinsäureanhydrid ≈ 1:10. Mischung 4 h bei 100 rpm im Schüttelbett, dann Dialyse (3500 MWCO) 24 h, Lyophilisierung → N-PAMAM.
2. b) Herstellung N-PAMAM-IgG: MES-Puffer (100 mM, pH 6,0) formuliert, 100 μl in Röhrchen, 20 μM EDC, 20 μM Sulfo-NHS, niedriges Vortex. 35,7 μl IgG (pH, 0,5 μM) zugeben, Vortex, dann 19 μg N-PAMAM, über Nacht bei 4 °C inkubieren. Dialyse (3500 MWCO und 8000 MWCO) 3 Tage, Lyophilisierung → N-PAMAM-IgG.

Herstellung von QDs-IgG (Ziege-anti-Maus)

1. a) BS-Puffer Formulierung:
   1. Borax-Puffer (50 mM): 19,07 g Borax in 1 L Ultrapure Wasser.
   2. Borsäure-Puffer (50 mM): 3,09 g Borsäure in 1 L Ultrapure Wasser.
   3. pH 8,0 BS und pH 7,2 BS durch Mischen der obigen Lösungen.
   4. Waschpuffer (auch Erhaltungs-pH 8,0 BS 5 mM + 0,1 % Tween 20).
   5. Aktivierungslösung (pH 7,2 BS 5 mM + 0,1 % Tween 20).
   6. EDC-Puffer (0,27 g EDC in 5 ml Aktivierungslösung), Sulfo-NHS-Puffer (0,378 g Sulfo-NHS in 5 ml Aktivierungslösung).
2. b) Herstellung QDs-IgG: 450 μl QDs (CdSe/ZnS, 5 mg/ml) in 2,25 ml Aktivierungslösung, 150 μl EDC-Puffer, 150 μl Sulfo-NHS-Puffer, 5 min Eisbad-Ultrasonikation. Zentrifugation 12.000 rpm, 5 min, Überstand entfernen, Niederschlag in 1,2 ml Waschpuffer, 30 min Ultraschallmischen. 100 μg IgG-Antikörper zugeben, über Nacht bei 4 °C im Schüttelbett inkubieren. 150 μl 10 % BSA zugeben, 30 min bei 30 °C, Zentrifugation 12.000 rpm, 2 min, Überstand entfernen. Niederschlag in 1 ml Waschpuffer, Zentrifugation 12.000 rpm, 2 min, wiederholen, schließlich in 1 ml Erhaltungs-pH 8,0 BS 5 mM + 0,1 % BSA auflösen. 10 % BSA zugeben, vollständiges Ultraschallmischen, Zentrifugation 820 g/min, Überstand enthält QDs-IgG. Lagerung 4 °C im Dunkeln 3 Monate. NICHT einfrieren (auch nicht mit Glycerin), sonst QD-Clusterbildung, Fällung, nicht waschbar, starker Hintergrund.

FCM-Analyse für HSP27 Protein

HSP27 im Zytoplasma, in Tumorzellen stark sezerniert. Zwei Zelllinien: MCF-7 (Test), L02 (Kontrolle). 10 cm Kulturgefäß, DMEM + 10 % FBS, 37 °C. Bei 80 % Konfluenz: Trypsinisieren, 2x PBS waschen, in 1 ml PBS resuspendieren. Zellzählung, T-PER Lysepuffer nach Zellkonzentration, intrazelluläres Protein aus Lysat extrahieren. Zentrifugation 14.000 rpm, 10 min, Überstand sammeln, Proteinkonzentration per BCA. Nach Proteinkonzentration Kaninchen-anti-HSP27 und Maus-anti-HSP27 zugeben, 50 min bei 37 °C. Proteinkonzentration L02 ~0,2 mg/ml, MCF-7 ~0,25 mg/ml, Volumen je 500 μl. Antikörpervolumen: 0,625 μl (MCF-7), 0,5 μl (L02). Dann 1 mg/ml N-PAMAM-IgG zugeben, 30 min bei 37 °C (6,25 μl MCF-7, 5 μl L02). In Testgruppe und PAMAM-Gruppe teilen. QDs-IgG zu Testgruppe, 30 min bei 37 °C im Dunkeln. FCM-Analyse.

FCM-Analyse für β-Aktin Protein

β-Aktin intrazellulär, Hauptzytoskelettkomponente, in Eukaryoten weit verbreitet. HeLa-Zellen 10 cm Schale, DMEM + 10 % FBS, 37 °C, 2 Tage. Überstand entfernen, 2x PBS waschen. Trypsinisieren, Zentrifugation 800 rpm, 3 min, Überstand entfernen, 1 ml kaltes Methanol, 5 min, Zentrifugation 800 rpm, 3 min, Überstand entfernen, in 1 ml PBS resuspendieren. Wiederholen, HeLa-Zellen in zwei gleich große Gruppen teilen. Testgruppe: Maus-anti-β-Aktin 30 min bei 37 °C; Kontrollgruppe: BSA. Maus-anti-β-Aktin in PBST (1 % BSA, 5 μg/ml), 100 μl IgG zu 300 μl Testgruppe, äquivalentes BSA zu Kontrolle. Nach 30 min beide Gruppen QDs-IgG (Ziege-anti-Maus) 30 min bei 37 °C. 2x PBS waschen, FCM.

ICC-Analyse für β-Aktin Protein

HeLa-Zellen 10 cm Schale, DMEM + 10 % FBS, 37 °C, 1 Tag. Mehrere sterile Deckgläser in Schale, weitere 2 Tage Kultur. Deckgläser entnehmen, 2x PBS waschen, 400 μl Methanol, 20 min RT. 3x PBS waschen. Blockierpuffer: PBST (0,1 % Tween 20), 22,52 mg/ml Glycin, 10 % BSA. Deckglas in Blockierpuffer, 30 min RT. Blockierpuffer entfernen, Deckglas mit Maus-anti-β-Aktin (PBS, 1 % BSA) 1 h bei 37 °C, 2x PBST waschen, QDs-IgG (Ziege-anti-Maus) 1 h bei 37 °C im Dunkeln. 2x PBST waschen, Zellkern mit DAPI 2 min färben, 1x PBS, 1x Wasser spülen, Fluoreszenzmikroskopie.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten uneingeschränkt verfügbar.

Abkürzungen

CBA:

Zytometrisches Bead-Array

DMEM:

Dulbecco's Modified Eagle Medium

FBS:

Fetales Rinderserum

FCM:

Durchflusszytometrie

ICC:

Immunzytochemie

N-PAMAM:

Neutrales PAMAM

PAMAM:

Polyamidoamin-Dendrimer

QDs:

Quantenpunkte