Potenzielle osteoinduktive Wirkung von Hydroxyapatit-Nanopartikeln auf mesenchymale Stammzellen durch Interaktion mit Endothelzellen

Einführung

Die Rekonstruktion von Knochendefekten durch Traumata, angeborene Fehlbildungen oder chirurgische Resektion stellt eine große Herausforderung für die orthopädische Chirurgie dar [1]. Als Knochenersatz wurde Hydroxyapatit (HA), eine repräsentative bioaktive Keramik, eingesetzt [2]. Allerdings schränken unerwünschte mechanische und osteoinduktive Eigenschaften die klinische Anwendung ein [3]. In den letzten Jahren hat Nano-HA aufgrund seiner einzigartigen bionischen Eigenschaften eine optimalere bessere Bioaktivität und verbesserte mechanische Leistung gezeigt und ein erhebliches Interesse in biomedizinischen Bereichen im Zusammenhang mit der regenerativen Medizin geweckt [4]. Wenn Nano-HA in Knochendefekte implantiert wird, werden ihm mehrere Zellen ausgesetzt, die an der Knochenreparatur beteiligt sind. Daher ist es notwendig, das biologische Verhalten von Nano-HA zu beurteilen. Mehrere Beweislinien haben direkt gezeigt, dass HA-Nanopartikel (HANPs) durch die aus Gelee gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (hWJ-MSCs) und Osteoblasten von Wharton aus der menschlichen Nabelschnur aufgenommen werden können, was zu einer verbesserten osteogenen Differenzierung führt [5,6,7]. Duaet al. berichteten zuvor über die Fähigkeit von HANPs, die Integration von künstlich hergestelltem Knorpel in de novo-Knorpel zu fördern [8]; umgekehrt hemmen HANPs die angiogenetische Fähigkeit von humanen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) [9]. In Bezug auf die menschliche Gesundheit ist ein umfassenderes Verständnis der Auswirkungen von HANPs auf die Knochenregeneration gerechtfertigt, und laufende Anwendungen von technisch hergestelltem künstlichem Knochen auf Nanobasis erhöhen die Dringlichkeit solcher Studien.

Die Knochenregeneration geht unweigerlich mit der Invasion von Neogefäßen einher. ECs sind die innere Zellauskleidung des Gefäßsystems, die der passiven Blutversorgung dienen und auch eine Rolle bei der Induktion, Spezifizierung und Steuerung der Organregeneration sowie der Aufrechterhaltung der Homöostase und des Stoffwechsels spielen [10, 11]. MSCs sind ein Teil der periendothelialen Nische und besitzen Selbsterneuerungs- und Multidifferenzierungs-Fähigkeiten unter Induktion bestimmter physiologischer und biochemischer Mikroumgebungen innerhalb ihrer residenten Nischen [12]. Tsaiet al. fanden heraus, dass ECs Endothelin-1 sezernieren können, um MSCs in Richtung Osteo- und Chondroliniendifferenzierung zu lenken [13]. Außerdem haben Saleh et al. verwendeten Microarray-Datenanalysen, um HUVEC-sekretierte Proteine ​​und verwandte Crosstalk-Signalwege zu identifizieren, die mit MSC-membrangebundenen Rezeptoren interagieren, um die Proliferation und osteogene Differenzierung zu verbessern [14]. Beim Knochengewebe-Engineering können HANPs mit Neogefäßen in Kontakt kommen und von ECs endozytiert werden, was nachweislich die physiologische Funktion dieser Zellen verändert [9, 15]. Dies kann auch die umgebenden Osteoprogenitorzellen beeinflussen und die Knochenreparatur beeinflussen, indem es die parakrine Signalübertragung verändert. Obwohl der direkte Einfluss von HANPs auf MSCs untersucht wurde, fehlt jedoch immer noch ein klares Verständnis darüber, ob HANPs indirekt eine osteogene Differenzierung von MSCs durch ECs induzieren können, was für unser Verständnis der Wirkung von HANPs in Bezug auf zur Knochenreparatur.

Um weitere Einblicke in die biologischen Effekte von HANPs auf die Interaktion zwischen ECs und MSCs zu gewinnen, wurde in dieser Studie ein indirektes Kokulturmodell mit HUVECs und hWJ-MSCs etabliert. Unter Verwendung dieses Systems wurden die Zytotoxizität und osteoinduktive Wirkung von HANPs auf hWJ-MSCs über HUVEC-vermittelte parakrine Signalübertragung untersucht. Um Schlüsselfaktoren zu identifizieren, die HANP-induzierte Endothelzellen-MSC-Interaktionen beeinflussen, wurden lösliche Faktoren im Überstand von HUVECs, die mit HANPs stimuliert wurden, untersucht, wobei der Schwerpunkt auf den verwandten Mechanismen sowohl auf Gen- als auch auf Proteinebene lag. Die Ergebnisse zeigten, dass der Hypoxie-induzierbare Faktor (HIF)-1α bei diesen Interaktionen eine entscheidende Rolle spielt.

Um den Einfluss von HIF-1α auf den Prozess der Osteogenese quantitativ zu beobachten und vorherzusagen, wurde ein mathematisches Modell entwickelt, das eine zweistufige Zelllinie mit HIF-1α kombiniert. Hier wurde durch Analyse der empirischen Daten das zweistufige Zelllinienmodell verwendet, um die MSC-Zahl und den Differenzierungsgrad zu jedem Zeitpunkt basierend auf der definierten anfänglichen Zellaussaatdichte und HIF-1α-Konzentration vorherzusagen, und dies kann wiederum Geben Sie geeignete Vorschläge für die anfänglichen Kulturbedingungen und Inkubationszeiten. Die Ergebnisse dieser Studie werden dazu beitragen, die Wechselwirkungen zwischen nanobasierten Knochenersatzstoffen und biologischen Systemen zu beleuchten, die dazu dienen können, die Entwicklung innovativer Biomaterialien für den Einsatz in der regenerativen Medizin voranzutreiben.

Materialien und Methoden

Vorbereitung und Charakterisierung von Partikeln

HANPs bei 20 nm (np20), 20*80 nm (np80) und HA-Partikel in Mikrogröße (m-HAP) mit einer Reinheit von  ≥ 99,0 % wurden von der Nanjing Emperor Nano Material Company Ltd (Nanjing, China) bezogen. Die Größe und Form der Partikel wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM; FEI Tecnai G2 Spirit Bio-Twin, FEI, Hillsboro, OR, USA) und Rasterelektronenmikroskopie (REM; LEO1530VP, Deutschland) betrachtet. Die hydrodynamische Größe und das Zetapotential von HA-Partikeln (HAPs) wurden mit Zetasizer Nano ZS90 und Mastersizer 3000 (Malvern Instruments, Malvern, UK) bestimmt.

Zellvorbereitung und -kultur

Alle Versuchsprotokolle wurden von der Ethikkommission der Medizinischen Universität Nanjing genehmigt. HUVECs und hWJ-MSCs wurden, wie zuvor beschrieben, aus frischen menschlichen Nabelschnüren nach schriftlicher Einwilligung der Spender gewonnen [16, 17]. Kurz gesagt wurden die Nabelschnur und die Nabelvene mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült, die 1% Penicillin und Streptomycin enthielt (PS; Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, Pasching, Österreich). Anschließend wurde die Nabelvene mit 0,1 % Collagenase I (Sigma, St. Louis, MO, USA) gefüllt und 15 min bei 37 °C inkubiert. Nach der Sammlung wurden die HUVECs in EC-Medium (ECM) (Scienceell, San Diego, CA, USA) kultiviert.

Anschließend wurden die Blutgefäße entfernt und das Wharton-Gelee in 1 mm ² . geschnitten Stücke und dann in 25 cm ² gelegt Gewebekulturflaschen (Corning Incorporated, Corning, NY, USA). Diese Zellen wurden in L-DMEM (GIBCO Life Technology, Grand Island, NY, USA), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (GIBCO) und 1 % PS, inkubiert.

hWJ-MSCs wurden bewertet, um den Phänotyp unter Verwendung monoklonaler Antikörper gegen CD13, CD29, CD34, CD44, CD45, CD51 und CD105 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) zu bestätigen. HUVECs wurden mit dem von-Willebrand-Faktor (vWF; Shanghai ChangDao Biotech Co, Ltd., Shanghai China) bewertet. HUVECs zwischen den Passagen 3–7 und hWJ-MSCs zwischen den Passagen 3–5 wurden in diesen Experimenten verwendet.

Partikelsuspensionen mit 1 mg/ml in PBS wurden dann in L-DMEM auf die Endkonzentration verdünnt. Wie in Abb. 1 gezeigt, wurden die HUVECs in der angegebenen HAP-Konzentration 18 h lang inkubiert. Das Kulturmedium wurde bei 15.000 U/min bei 4 °C für 15 Minuten zentrifugiert, und die mit 10 % FBS ergänzten Überstände wurden als konditioniertes Medium (CM) für hWJ-MSCs verwendet, um die folgenden Experimente durchzuführen. Die CM bestand aus osteogenem Medium, ergänzt mit osteogener Induktionsflüssigkeit, das 10 mM β-Glycerophosphat, 50 μg/ml L-Ascorbinsäure-2-Phosphat und 0,1 μM Dexamethason enthielt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Zusätzlich wurde 2-Methoxyestradiol (2-MeOE2) (Selleck Chemicals, Houston, TX, USA) als spezifischer HIF-1α-Inhibitor verwendet. In der 2-MeOE2(+)-Gruppe wurden hWJ-MSCs mit CM aus HUVECs kultiviert, die vor der HAP-Supplementierung für 40 Minuten mit 5 μM 2-MeOE2 vorbehandelt wurden. Als spezifischer MEK-Inhibitor wurde PD98059 verwendet. In der PD98059-Gruppe wurden hWJ-MSCs mit CM kultiviert, das 5 μM PD98059 enthielt.

Illustration der indirekten Kokultur von HAPs/hWJ-MSCs, vermittelt durch HUVECs. Abkürzungen:HAPs Hydroxyapatit-Partikel, hWJ-MSCs menschliche Nabelschnur Aus Gelee gewonnene mesenchymale Stammzellen von Wharton, HUVECs Endothelzellen der menschlichen Nabelvene

Bestimmung der Lebensfähigkeit und Anzahl von Zellen

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem MTS Assay Kit (MTS; Bestbio, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) bewertet. hWJ-MSCs wurden 24 h adhärieren gelassen und dann 24 und 72 h mit CM kultiviert. Die Absorption von Formazan wurde bei 490 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (SpectraMax M2; Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, USA) bewertet. Die Extinktion wurde auch unter Verwendung von Standardkalibrierungskurven unter den gleichen Bedingungen in Zellzahlen umgerechnet.

Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)

TRIzol-Reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) wurde verwendet, um die Gesamt-RNA aus hWJ-MSCs-Zellen zu isolieren, die für die angegebene Zeit in CM inkubiert wurden. Komplementäre DNA wurde aus 1,0 µg RNA unter Verwendung eines PrimeScript First Strand cDNA Synthesis Kits (TaKaRa, Tokio, Japan) in einem T3-Thermocycler (Mastercycler 5333; Eppendorf, Hamburg, Deutschland) transkribiert. Die Expressionsniveaus der angegebenen Gene wurden unter Verwendung des FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) Kits (Roche, Basel, Schweiz) auf einem quantitativen Echtzeit-Amplifikationssystem (7900HT Fast; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) analysiert. Die relative mRNA-Expression des Zielgens wurde auf GAPDH normalisiert und dann mit der Methode \(2^{{ - \Delta \Delta C_{t}}}\) bestimmt. Primersequenzen für die Zielgene sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Alizarin Red S (ARS)-Färbung und quantitative Analyse

hWJ-MSCs wurden in 12-Well-Platten mit osteogenem Medium für bis zu 14 Tage kultiviert, und dann wurde die Mineralisierung der extrazellulären Matrix unter Verwendung von ARS-Färbung (Leagene, Leagene Biotechnology, Peking, China) nach dem beobachtet. Kurz gesagt, die Proben wurden mit absolutem Ethylalkohol für 15 Minuten fixiert und dann in 1% (w/v) ARS (pH, 4,2) bei Raumtemperatur für 5 Minuten gefärbt. Die gefärbten Zellen wurden zweimal mit bidestilliertem Wasser gewaschen und dann fotografiert. Zur quantitativen Analyse des Mineralisierungsprozesses wurden 300 μl 10 % (w/v) Cetylpyridiniumchlorid-Monohydrat (BOMEI, BOMEI Biotechnology, Hefei, China) in jede Vertiefung gegeben und die Platten 30 Minuten lang inkubiert. Von jeder Probe wurden insgesamt 90 μl in eine 96-Well-Platte überführt und die Extinktion dann bei 405 nm in dreifacher Ausfertigung gemessen.

Färbung mit alkalischer Phosphatase (ALP) und quantitative Analyse

Nachdem die hWJ-MSCs in 12-Well-Platten mit osteogenem Medium bis zu 14 Tage lang kultiviert wurden, wurde die ALP-Färbung mit einem BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit (Beyotime) durchgeführt. Kurz gesagt, hWJ-MSCs wurden in 4% Paraformaldehyd fixiert. Anschließend wurden die Proben in einer Mischung aus Nitroblau-Tetrazolium und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat 4 h lang gefärbt und fotografiert. Um die ALP-Synthese zu quantifizieren, wurden die Zellen 30 Minuten lang in eisigem RIPA-Lysepuffer (Beyotime) lysiert. Zelllysate wurden bei 12.000 U/min bei 4 °C für 10 Minuten zentrifugiert, und die Überstände wurden einer quantitativen ALP-Analyse unter Verwendung eines ALP-Assay-Kits (Beyotime) unterzogen. Die Absorption wurde dreifach bei 405 nm gemessen und mithilfe einer Standardkurve in die ALP-Aktivität umgerechnet.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

HUVECs wurden mit 2 × 10 ⁵ . ausgesät Zellen/Well. CM wurde von HUVECs gesammelt, die 18 h lang mit HAPs kultiviert wurden (zusätzliche Datei 1), und der Überstand wurde einer ELISA-Analyse unterzogen (Abb. 1). Ein humaner HIF-1α ELISA-Kit (Anhui Joyee Biotechnics, Anhui, China) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.

Immunfluoreszenz

HUVECs wurden auf Objektträgern in 12-Well-Platten (7,6 × 10 ⁴ .) ausgesät Zellen/Well). Nach 18 h Exposition gegenüber CM wurden die Zellen in 4% Paraformaldehyd (Biosharp, Peking, China) fixiert und mit 0,1% Triton X‐100 (Beyotime) in PBS vor der Inkubation mit 1% anti-HIF-1α-Antikörper permeabilisiert [EPR16897 ](ab179483, Abcam, UK) über Nacht um 4 ℃. Anschließend wurden die Zellen mit 1% CoraLite594 – konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG(H + L) (Proteintech, USA) für 1 h im Dunkeln inkubiert. Dann wurden die Kerne mit DAPI (Beyotime, Shanghai, China) gefärbt, das den Zellen zugesetzt wurde und 30 s lang reagierte. Die Proben wurden unter Verwendung eines konfokalen Lasermikroskops (Olympus, Japan) untersucht. Die Fluoreszenzintensität wurde mit der Analysesoftware ImageJ v.1.4 (Bethesda, MD, USA) quantifiziert.

Western Blot-Analyse

hWJ-MSCs wurden in CM für 24 h (extrazelluläre signalregulierte Kinase (ERK)1/2, p-ERK1/2) oder in osteogenem Medium für 7 d (runt-related Transcription Factor (RUNX)-2, Typ 1 .) inkubiert Kollagen/Kollagen 1 (COL I)). Dann wurden die Zellen 30 Minuten lang in RIPA-Lysepuffer lysiert. Zelllysate wurden zentrifugiert und die Überstände zur Analyse bei – 20 °C gelagert. Nach 12% SDS-PAGE wurden die Proteine ​​auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran übertragen. Die verwendeten primären Antikörper waren Anti-p-ERK1/2, Anti-ERK1/2, Anti-RUNX-2, Anti-COL I und GAPDH (1:1.000, polyklonale Kaninchen-Antikörper; Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA) ). Nach Entfernen ungebundener Antikörper wurde die Membran 1 h mit sekundären Antikörpern inkubiert. Das Signal auf den Membranen wurde unter Verwendung eines Chemilumineszenz-Gel-Bildgebungssystems (LAS4000M; GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Schweden) nachgewiesen. Das Verhältnis von p-ERK zu ERK und RUNX-2/COL I zu GAPDH wurde mit der Analysesoftware ImageJ v.1.4 (Bethesda) quantifiziert.

Bewertung der Zellapoptose

hWJ-MSCs wurden mit einer Dichte von 10 ⁵ . ausgesät Zellen pro Well in 6-Well-Platten. Anhaftende Zellen wurden mit den angegebenen Konzentrationen von HIF-1&agr; für die angegebene Zeit behandelt. Die Zellen wurden dann gesammelt und mit FITC-Annexin V und PI (Fcmacs, Nanjing, China) für 15 Minuten im Dunkeln markiert. Alle Proben wurden mit einem FACScan-Durchflusszytometer (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) getestet. Die Daten wurden mit FlowJo v10 (BD Biosciences) analysiert.

Zweistufiges Zelllinienmodell

Angesichts des enormen Potenzials von HAPs und der Schwierigkeit, das Co-Kultursystem zu analysieren, war ein mathematisches Modell erforderlich, das eine quantitative Analyse ermöglicht, und eine zuverlässige Vorhersage war erforderlich, um die Rolle von HIF-1α bei der osteogenen Differenzierung von hWJ zu verstehen. MSCs.

hWJ-MSCs wurden mit 0, 300, 500, 1000, 1500, 2000, 3000 und 4000 pg/ml HIF-1α sowie osteogener Induktionsflüssigkeit kultiviert. Nach Anpassung der Daten an diese Konzentrationen verwenden wir die Konzentrationen von HIF-1α (hergestellt von HUVECs) in den Kontroll-, m-HAP-, np80- und np20-Gruppen (240, 300, 325 bzw. 375 pg/ml) zu Testen Sie die Anpassungsgleichungen mit MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA). Um das Modell zu vereinfachen, betrachteten wir ihre ähnlichen Wachstumsmuster bei den unterschiedlichen Konzentrationen von HIF-1α als identisch. Der durchschnittliche Differenzierungsgrad wurde verwendet, um die Differenzierungsgrad-Zeit-Gleichung anzupassen. Die Proliferationsrate, Apoptoserate und osteogenen Differenzierungsgrade der hWJ-MSCs in den verschiedenen Gruppen wurden zu definierten Zeitpunkten nachgewiesen.

Anhand der experimentellen Daten wurde ein vereinfachtes zweistufiges Zelllinienmodell erstellt, das einem mehrstufigen Zelllinienmodell [18, 19] ähnelte. C ₀ und C ₁ repräsentieren die Zellzahl der hWJ-MSCs bzw. Terminalzellen. C ₀ und C ₁ unterliegen:

Hier, p , beeinflusst durch HIF-1α und Zeit, repräsentiert die Replikationswahrscheinlichkeit der hWJ-MSCs. Dementsprechend d = 1 − p ist die Differenzierungsrate, die durch Anpassen der geschätzten und experimentellen Daten der Zellzahl erhalten werden kann. Der Parameter v₀ quantifiziert, wie schnell sich die Zellen in jedem Abstammungsstadium teilen (insbesondere v = ln2/c , wobei c die Dauer eines Zellzyklus ist). Die Apoptoserate der terminalen Zellen wird durch A . symbolisiert . Der Einfachheit halber haben wir vernachlässigt, dass die Apoptoserate im Laufe der Zeit leicht schwankt und daher A = 4,5 % ist eine Konstante. K bezeichnet die Umweltkapazität, da sich die Zellen nicht unbegrenzt vermehren können [20]. HIF-1α erhöht die Differenzierungsrate der hWJ-MSCs, was zu einer Differenzierungsrate nach dem Modell führt:

Hierin, H stellt die Konzentration von HIF-1α dar; d ₀ bezeichnet die Differenzierungsrate bei 0 pg/ml HIF-1α; r die Intensität der Regulierung darstellt (hierin die Intensität der Regulierung von HIF-1α auf MSCs darstellend); und m entspricht dem Hill-Koeffizienten [21], scilicet der Beziehung zwischen der MSC-Differenzierungsrate und der HIF-1α-Konzentration.

Statistische Analyse

Alle Daten, die die Anforderungen an Normalität und Homoskedastizität erfüllen, werden als mittlere ± ± Standardabweichung (SD) aus drei oder mehr unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Die Software SPSS 24.0 (SPSS Inc., Chicago, USA) wurde verwendet, um die statistischen Analysen über Einweg-ANOVA oder Zweiweg-ANONA durchzuführen. A P Wert   <0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Die statistische Analyse erfolgt mit GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Ergebnisse

Charakterisierung von HAPs

Wie in Abb. 2 gezeigt, wurden HAPs mit einer bestimmten Größe und Form hergestellt. Der Durchmesser des np20 mit nahezu kugelförmiger Form betrug im Durchschnitt 20 nm, und der np80 war stabförmig mit einer durchschnittlichen Länge von 80 nm und einer Breite von 20 nm. Die m-HAPs hatten auch eine nahezu kugelförmige Form und einen Durchmesser von ungefähr 12 μm. Alle Partikel hatten in L-DMEM eine negative Oberflächenladung. Es wurde vermutet, dass negative Werte des Zetapotentials einen signifikant günstigen Einfluss auf die Anheftung und Proliferation von Knochenzellen sowie die direkte Knochenbindung und Knochenneubildung haben [22, 23]. Partikel, die in L-DMEM beobachtet wurden, neigen in wässrigen Systemen zur Aggregation. Ihre hydrodynamische Größe wurde ebenfalls getestet, was ebenfalls ein wichtiger Faktor sein könnte, der ihr biologisches Verhalten beeinflusst.

Charakterisierung von HAPs. TEM-Aufnahmen von a np20 und b np80 und REM-Aufnahme von c m-HAP. d Charakterisierung von HAPs (n = 6). Abkürzungen:TEM Transmissionselektronenmikroskopie, REM Rasterelektronenmikroskopie, HA Hydroxylapatit, m-HAP HAP-Partikel in Mikrogröße

Indirekte Toxizität von HAPs gegenüber hWJ-MSCs

Um die indirekte Toxizität von HAPs auf hWJ-MSCs zu beurteilen, wurde die Lebensfähigkeit der Zellen über MTS-Assays gemessen. CM mit 50 µg/ml HANPs könnte die Lebensfähigkeit von hWJ-MSC nach 24 h und 72 h und insbesondere nach 24 h signifikant stimulieren. Allerdings verringerte CM mit 100 µg/ml HANPs die Lebensfähigkeit der Zellen nach 72 h um 15–20 % im Vergleich zur Kontrolle. Darüber hinaus stimulierte CM mit 25 µg/mL np20, aber nicht np80, die Lebensfähigkeit der Zellen nach 24 h. Diese Phänomene bestätigten, dass 50 µg/ml HANPs eine subzytotoxische Konzentration waren, die in allen nachfolgenden Experimenten verwendet wurde (Abb. 3).

Indirekte Toxizität von HAPs gegenüber hWJ-MSCs. Die Lebensfähigkeit von hWJ-MSCs, die indirekt mit HAPs kultiviert wurden, wurde für a . gemessen 24 und b 72 Std. *P <0,05; **P <0,01 gegenüber der Kontrolle. Die Kontrollgruppe bestand aus Zellen, die in CM ohne HAPs-Behandlung inkubiert wurden, und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde als Prozentsatz der Kontrolle normalisiert. Abkürzungen:HAPs Hydroxyapatit-Partikel, m-HAP HAP-Partikel in Mikrogröße, hWJ-MSCs menschliche Nabelschnur Aus Gelee gewonnene mesenchymale Stammzellen von Wharton

Indirekte osteoinduktive Wirkung von HAPs auf hWJ-MSCs

Um die indirekten osteoinduktiven Wirkungen von HANPs auf hWJ-MSCs zu identifizieren, wurde die Expression osteogener Gene durch quantitative RT-PCR-Analyse bewertet. Der Transkriptspiegel für Runt-related Transcription Factor 2 (RUNX-2) in den HANP-Gruppen, insbesondere np20, zeigte einen bemerkenswerten Anstieg von Tag 7 bis Tag 21 (Fig. 4a). Die Genexpression von Typ-I-Kollagen (Col I) in der np20-Gruppe zeigte eine Verbesserung von Tag 7 bis Tag 21, während die np80-Gruppe einen anhaltenden Anstieg von Tag 7 bis Tag 14 zeigte (Fig. 4b). Die mRNA von Osteocalcin (OCN) war in den HANP-Gruppen an Tag 14 eindeutig hochreguliert, was auf eine beschleunigte Osteogeneserate hinweist (Abb. 4c). Die mRNA-Spiegel der alkalischen Phosphatase (ALP) stiegen offensichtlich in den HANP-Gruppen an (Abb. 4d), was auf die osteogene Differenzierung von hWJ-MSCs hindeutet. Die m-HAP-Gruppe zeigte jedoch im Vergleich zur Kontrollgruppe begrenzte Veränderungen in Bezug auf die Konzentrationen dieser drei osteogenen Gene (Abb. 4). Darüber hinaus nahm die Expression der Pluripotenzmarker NANOG, OCT3/4 und SOX2 in den HANPs-Gruppen im Vergleich zur Kontrolle ab (Abb. 4e–g), was darauf hindeutet, dass sich die hWJ-MSCs in den HANPs-Gruppen differenziert hatten, insbesondere in die np20-Gruppe. Ähnliche Ergebnisse wurden durch Western-Blot-Analyse erhalten (Abb. 5c, d), was darauf hindeutet, dass die np-20-Gruppe die Expression von RUNX-2 und COL I in hWJ-MSCs indirekt verstärken könnte.

Indirekte Wirkungen von HAPs auf die Expression von Genen, die mit der osteogenen Differenzierung in Verbindung stehen. a RUNX-2, b Spalte I, c OCN, d ALP, e NANOG, f OCT3/4 und g SOX2-Genspiegel in hWJ-MSCs, die mit CM für die angegebene Zeit kultiviert wurden. *P <0,05; **P <0,01; ***P < 0,001 gegenüber Kontrollgruppe; ^& P <0,05; ^&& P <0,01; ^&&& P < 0,001 gegenüber der m-HAP-Gruppe; ^# P <0,05; ^## P <0,01 gegenüber der np20-Gruppe. Als Kontrollgruppe wurden in osteogenem Medium ohne HAPs-Behandlung inkubierte Zellen verwendet. Abkürzungen:HAPs Hydroxyapatit-Partikel, m-HAP HAP-Partikel in Mikrogröße, hWJ-MSCs menschliche Nabelschnur Aus Gelee gewonnene mesenchymale Stammzellen von Wharton, RUNX-2 Runt-bezogener Transkriptionsfaktor 2, Col I Kollagen Typ I, OCN Osteocalcin, ALP alkalische Phosphatase, SOX 2 SRY-bezogene HMG-Box 2

Indirekte Wirkung von HAPs auf die extrazelluläre Calciumablagerung und die ALP-Aktivität. hWJ-MSCs wurden 14 d in osteogenem Medium inkubiert. a Die extrazelluläre Calciumablagerung wurde dann mittels ARS-Färbung sichtbar gemacht; b Die ALP-Aktivität der hWJ-MSCs wurde mittels ALP-Färbung bewertet, Maßstabsbalken:200 μm. c Western-Blot-Analyse zeigte die Expression von RUNX-2 und COL I von hWJ-MSCs in osteogenem Medium am 7. Tag. d Densitometrische Messungen von RUNX-2 und COL I aus Teil (c ). Als Kontrollgruppe wurden in osteogenem Medium ohne HAPs-Behandlung inkubierte Zellen verwendet. *P <0,05; **P <0,01; ***P < 0,001 gegenüber Kontrollgruppe; ^& P <0,05; ^&&& P < 0,001 gegenüber der m-HAP-Gruppe; ^### P < 0,001 gegenüber der np20-Gruppe. Abkürzungen:HAPs Hydroxyapatit-Partikel, m-HAP HAP-Partikel in Mikrogröße, hWJ-MSCs menschliche Nabelschnur Aus Gelee gewonnene mesenchymale Stammzellen von Wharton, ALP alkalische Phosphatase

Um die indirekte osteoinduktive Wirkung von HANPs auf hWJ-MSCs visuell zu beobachten, wurden die Zellen mit dem angegebenen osteogenen Medium für 14 Tage inkubiert, gefolgt von ARS- und ALP-Färbung. Wie in Abb. 5a, b gezeigt, wurden in den HANP-Gruppen im Vergleich zu den m-HAP- und Kontrollgruppen eine erhöhte Anzahl mineralisierter Knötchen und eine höhere ALP-Aktivität der hWJ-MSCs beobachtet. Außerdem zeigte m-HAP, ähnlich wie die Kontrolle, begrenzte Wirkungen auf die osteogene Differenzierung der hWJ-MSCs.

HAPs aktivierte ERK1/2-Signalgebung in hWJ-MSCs, die indirekt mit HUVECs kokultiviert wurden

Um die Auswirkungen von HAPs auf die parakrine Funktion von HUVECs zu untersuchen, wurden Immunfluoreszenz- und ELISA-Assays verwendet, um das mögliche Protein zu identifizieren, das die osteogene Differenzierung der hWJ-MSCs fördert. Wie in Abb. 6a–c gezeigt, wurde die intrazelluläre und extrazelluläre Produktion von HIF-1α durch HANPs (insbesondere np20) signifikant erleichtert, während m-HAP einen begrenzten Einfluss auf seine Produktion hatte.

HAPs aktivierten die ERK1/2-Signalgebung in hWJ-MSCs, die indirekt mit HUVECs kokultiviert wurden. a Immunfluoreszenz von HIF-1α, durchgeführt in HUVECs, die 18 h mit/ohne HAPs behandelt wurden. b Die Fluoreszenzintensität von HIF-1α von einem Teil (a ). c Die extrazelluläre Konzentration von HIF-1α im Kulturmedium von HUVECs, die 18 h mit/ohne HAPs behandelt wurden, wurde mittels ELISA gemessen. Maßstabsbalken:20 μm. *P <0,05; **P <0,01; ***P < 0,001 gegenüber Kontrolle; ^## P <0,01; ^### P < 0,001 gegenüber der np20-Gruppe. Als Kontrollgruppe wurden Zellen ohne HAPs-Behandlung verwendet. hWJ-MSCs wurden 24 h lang mit CM behandelt. d Western-Blot-Analyse, die die Aktivierung von Schlüsselkinasen in den ERK1/2-Wegen anzeigt. e Densitometrische Messungen von p-ERK1/2 aus Teil (b ). **P <0,01; ***P < 0,001 gegenüber Kontrolle; ^## P < 0.01, ^### P < 0,001 gegenüber 2-MeOE2( −)-Gruppe. Als Kontrollgruppe wurden in CM ohne HAP-Behandlung inkubierte Zellen verwendet. Abkürzungen:HAPs Hydroxyapatit-Partikel, m-HAP HAP-Partikel in Mikrogröße, hWJ-MSCs menschliche Nabelschnur Aus Gelee gewonnene mesenchymale Stammzellen von Wharton, HUVECs menschliche Nabelvenen-Endothelzellen, ERK extrazelluläre signalregulierte Kinase, HIF-1α Hypoxie-induzierbarer Faktor 1α

Um den Differenzierungs-Signalweg der durch HIF-1α aktivierten hWJ-MSCs genauer zu verstehen, haben wir die Schlüsselregulatoren des ERK1/2-Wegs mittels Western-Blot-Analyse untersucht. Wie in Abb. 6d, e gezeigt, waren die p-ERK1/2-Spiegel in den mit HANPs kultivierten hWJ-MSCs deutlich erhöht, während die Proteinspiegel von Gesamt-ERK1/2 unverändert blieben, und dies galt insbesondere für die np20-Gruppe. m-HAP hatte jedoch eine geringe Wirkung auf die p-ERK1/2-Spiegel in den hWJ-MSCs, ähnlich wie seine Wirkung auf die HIF-1α-Produktion in HUVECs. Wichtig ist, dass die erhöhten Spiegel von p-ERK1/2 in den durch HIF-1α aktivierten hWJ-MSCs durch 2-MeOE2, einen spezifischen HIF-1α-Inhibitor, blockiert werden könnten, was darauf hinweist, dass HIF-1α stromaufwärts des ERK1/2-Signalwegs funktioniert in hWJ-MSCs.

HIF-1α förderte die osteogene Differenzierung von hWJ-MSCs über den ERK1/2-Pfad

Um zu bestimmen, ob HIF-1α für die beobachtete Stimulierung der osteogenen Differenzierung von hWJ-MSC notwendig war, wurde ein spezifischer HIF-1α-Inhibitor (2-MeOE2) auf diese Zellkulturen aufgetragen. Wie in Abb. 7 gezeigt, waren die mineralisierte Matrixablagerung und die ALP-Aktivität der mit 2-MeOE2 (+) behandelten hWJ-MSCs, die in osteogenem Medium kultiviert wurden, abgeschwächt, was darauf hinweist, dass HIF-1α für die osteogene Differenzierung des hWJ- unverzichtbar war. MSCs. Basierend auf diesen Ergebnissen untersuchten wir weiter die Rolle des ERK1/2-Signalwegs bei der osteogenen Differenzierung der durch HIF-1α aktivierten hWJ-MSCs. Die mineralisierte Matrixablagerung und ALP-Aktivität in den mit osteogenem Medium kultivierten hWJ-MSCs wurden nach der Verabreichung von PD98059, einem spezifischen MEK-Inhibitor, unterdrückt.

HIF-1α förderte die osteogene Differenzierung von hWJ-MSCs über den ERK1/2-Weg. hWJ-MSCs wurden in osteogenem Medium mit oder ohne PD98059 für 14 d inkubiert. a Die extrazelluläre Calciumablagerung wurde mittels ARS-Färbung sichtbar gemacht. b Die ALP-Aktivität von hWJ-MSCs wurde durch ALP-Färbung bestimmt. Maßstabsbalken:200 μm. c Quantitative Analyse der extrazellulären Calciummatrix. *P <0,05; **P <0,01; ***P < 0,001 gegenüber Kontrolle; ^# P <0,05; ^### P  < 0.001 versus the np20 group. Cells incubated in osteogenic medium without HAPs and PD98059 treatment were used as the control group. Abbreviations:HAPs hydroxyapatite particles, m-HAP micro-sized HAP particles, hWJ-MSCs human umbilical cord Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells, HUVECs human umbilical vein endothelial cells, ERK extracellular signal-regulated kinase, HIF-1α hypoxia-inducible factor 1α, ALP alkaline phosphatase

Two-Stage Cell-Lineage Models

To quantitatively reveal the intrinsic connection between the concentration of HIF and osteogenic differentiation of hWJ-MSCs, 0–4000 pg/mL of HIF-1α was used to treat eight groups of hWJ-MSCs. A two-stage cell-lineage mathematical model was used to analyze the proliferation, apoptosis, and osteogenic differentiation rates of these hWJ-MSCs treated with different concentrations of HIF-1α. As shown in Fig. 8a, fitting data were employed to obtain the simulated formula (\(\frac{d}{{d_{0} }} =\frac{1}{{0.14H^{2} - 0.43H + 1}}\)) and curve (blue curve), showing that the differentiation rate first increased and then decreased with the increase in HIF concentration. More specifically, the differentiation rate reached a peak at 1500 pg/mL HIF-1α.

Two-stage cell-lineage models. hWJ-MSCs were incubated in a defined concentration of HIF-1α for the indicated times. a Relative differentiation rates of hWJ-MSCs at different concentrations of HIF-1α, b relative ALP activity (differentiation degrees of hWJ-MSCs) and relative osteoblast cells on different culture days. c Three-dimensional surface of differentiation degree evolving with time and HIF-1α. Cell number with an initial seeding density of 1500 cells per well (in a 96-well plate), as well as d 0, e 375, and f 1500 pg/mL HIF-1α. Abbreviations:hWJ-MSCs human umbilical cord Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells, HIF-1α hypoxia-inducible factor 1α, ALP alkaline phosphatase

According to our study, the concentrations of HIF-1α produced by HUVECs in the control, m-HAP, np80, and np20 groups were 240, 300, 325, and 375 pg/mL, respectively. The black square represents the differentiation rate promoted by 240, 300, 325, and 375 pg/mL HIF-1α, and this matches well with the simulated curve. In addition, the differentiation degrees of the hWJ-MSCs (relative ALP activity) treated with different concentrations of HIF-1α increased similarly increased with time. Therefore, in order to simplify the model, we consider their growth patterns to be similar or even identical. We found that the increase in ALP activity from Day 0 to Day 7 was proportional to the number of osteoblasts, and osteoblast cells reached their peak at the platform period. Therefore, after fitting the ALP activity with the relative osteoblasts cell number curve (osteoblasts cell number / maximum osteoblasts cell number), the maximum of ALP activity was predicted and relative ALP activity (ALP activity/ maximum of ALP activity), representing the differentiation degree, was acquired (Fig. 8b). Combining these two studies, the three-dimensional surface of the differentiation degree evolving with time and HIF-1α was obtained (Fig. 8c).

In order to estimate the optimal culture time, it was necessary to simulate cell numbers. After elucidating the differentiation rate under different concentrations of HIF-1α, we simulated the size of each population. The simulation utilized an initial seeding density of 1500 cells per well (in a 96-well plate) using different concentrations of HIF-1α. As shown in Fig. 8d–f, the experimental data (black square) match well with the simulated total cell numbers (blue curve), which is a sum of the number of hWJ-MSCs and osteoblasts, and this supports the ability of this model to predict the number of hWJ-MSCs and osteoblasts at any time point. Moreover, the osteoblast cell number approached the platform period at 21, 18, and 15 days with 0, 375, and 1500 pg/mL HIF-1α, respectively. This model provides the optimum culture time for guiding tissue engineering, and it also provides direct evidence that HIF-1α accelerates the osteogenic differentiation of hWJ-MSCs.

Diskussion

With recent advances in nanobiomaterials, nano-based artificial bone substitutes have been an area of intense investigation. The accumulating evidence suggests that there are complex interactions between cells and nanobiomaterials due to their capacity to penetrate cell membranes and increase internal retention times [24, 25]. A previous study revealed that collagen/alginate nanofilms can adsorb onto the MSC membrane to activate intracellular signaling cascades and promote osteogenic differentiation [26]. Elegant experiments by Wu and his colleagues clearly demonstrated that TiO₂ nanotubes can improve vascularization and osteogenic differentiation by facilitating paracrine effects and cell junctions via EC-MSC interactions [27]. For the purpose of developing excellent candidates for bone tissue engineering, it is necessary to clarify the direct crosstalk between nano-based bone substitutes and cells implicated in bone repair as well as their indirect interactions. However, our current understanding of this is still limited. In the present study, we utilized an indirect co-culture model to further elucidate the biological effects of HANPs on MSCs in regard to the indirect interactions mediated by ECs.

Cytotoxicity is a primary issue for assessing the biocompatibility of any nanobiomaterial. Although our previous study found that HANPs did not directly influence the viability or apoptosis of hWJ-MSCs, they may still exert different impacts via the mediation of other cells [28]. Thus, it was necessary to evaluate the cytotoxic effects of HANPs on hWJ-MSCs mediated by HUVECs. Interestingly, after incubation in CM for 24 h and 72 h, hWJ-MSC viability was maintained and even elevated in the 0–50 µg/mL HANP groups, especially in the np20 group, indicating the existence of effector molecules in the CM. When the concentration of HANPs reached 100 µg/mL, they became cytotoxic to the hWJ-MSCs. However, 0–100 µg/mL m-HAP had no influence on hWJ-MSC viability (Fig. 3). Jianget al. have shown that engineered nanoparticles of a particular size can have distinct endocytic routes and kinetics associated with altered downstream signaling involved in regulating target cell functions [29]. In our previous study, we showed that np20 and np80 were endocytosed by HUVECs, and this was followed by morphologic changes and the appearance of large vacuoles, indicating the activated state of the HUVECs. Additionally, np20, with their faster uptake speed and increased accumulation, might result in a stronger activation of HUVECs, possibly resulting in increased hWJ-MSC viability via paracrine signaling. Conversely, few m-HAPs can be endocytosed by HUVECs, and this might account for their limited influence on the metabolism of hWJ-MSCs [9].

To further explore the potential osteoinductive effect of activated HUVECs, a subcytotoxic dose of 50 µg/mL HAPs was used in subsequent studies. The CM collected from the activated HUVECs promoted extracellular calcium deposition, ALP activity, and osteogenic proteins expression in hWJ-MSCs, as well as the mRNA expression of osteogenic genes (Figs. 4, 5). Runx2, an essential transcription factor involved in specifying the osteoblast lineage [30], showed a substantial enhancement in the np20 group, indicating a strong osteoinductive effect on hWJ-MSCs (Fig. 4a and Fig. 5c, d). The np20 group demonstrated a 1.5-fold improvement in COLI expression at Day 7 (Figs. 4b, 5c, d) and a double increase at Day 14, which implied the presence of additional differentiated osteoblasts in the HANP-treated groups (Fig. 4b) [30]. OCN is a mature stage bone marker [31], and this gene showed a significant increase in the HANP groups at Day 14 (Fig. 4c), indicating that np20 and np80 can accelerate bone maturation compared to m-HAP. ALP is an early marker of osteoblast differentiation, and it obviously increased with culture time in each group, especially the np20 group, revealing that additional transformation occurred from MSCs to osteoblasts (Fig. 4d). Pluripotency markers, NANOG, OCT3/4, and SOX2 imply the capacity for differentiation [32]. As shown in Fig. 4e–g, the decreased expression in the genes of the HANP groups implied that most of the hWJ-MSCs in HAP groups had transformed into osteoblasts.

Our data demonstrated that the endocytosis of HANPs by HUVECs was associated with an improved osteogenic differentiation of hWJ-MSCs. However, the cause of this outcome is currently unclear. In terms of the paracrine function of HUVECs, we focused on soluble differentiation-inducing proteins in the supernatant of activated HUVECs. HIF-1α signaling is essential in coupling ossification and angiogenesis during bone regeneration [33, 34]. Heikal et al. reported that injured ECs secrete more HIF-1α even under normoxia conditions [35]. It has also been shown that exposure to HANPs inhibits the angiogenic ability of HUVECs [9]. Thus, we measured the concentrations of HIF-1α in the CM, and the results showed that the HIF-1α content increased in the HANP treatment groups compared to the m-HAP and control groups (Fig. 6a). To identify the role of HIF-1α in the osteogenic differentiation of hWJ-MSCs, we used 2-MeOE2, which is a specific HIF-1α inhibitor, was used. The decreased concentration of HIF-1α paralleled the impaired mineralized matrix deposition and ALP activity in these hWJ-MSCs, indicating that HANPs can promote the HIF-1α production of HUVECs to facilitate the osteogenesis of hWJ-MSCs (Fig. 7).

To properly apply HANPs for use in bone tissue engineering, it is necessary to gain further insights into the mechanisms by which HANPs promote the osteogenic differentiation of hWJ-MSCs mediated by HUVECs. The ERK1/2 pathway is downstream of HIF-1α [36] and is fundamental to the differentiation of MSCs [37]. In this work, the concentrations of HIF-1α in the CM coincide well with the p-ERK1/2 levels in the hWJ-MSCs (Fig. 6b, c). When 2-MeOE2 was applied, the p-ERK1/2 expression in the hWJ-MSCs failed to be activated, indicating that HIF-1α functioned upstream of ERK1/2 signaling. To directly address the role of ERK1/2 signaling in the osteogenic differentiation of hWJ-MSCs, PD98059, a specific MEK inhibitor, was used. The suppression of ERK1/2 signaling resulted in the lowest osteogenic differentiation of hWJ-MSCs. One possible reason for this occurrence is that the ERK1/2 pathway plays a key role in both HIF-1α signaling and in the apoptosis and proliferation signaling pathways, which could be responsible for the observed changes in osteogenic differentiation in these cells [38, 39]. Additionally, this could also be related to the presence of vascular endothelial growth factor (VEGF). VEGF is one of the downstream effectors of HIF-1α signaling [33], and it can also promote the osteogenic differentiation of MSCs via activation of the ERK1/2 pathway [37]. Our previous study found that np20 induced the production of VEGF in HUVECs [9]; therefore, it is possible that the suppression of the ERK1/2 pathway may result in inhibition of VEGF, which would lead to the decreased osteogenic differentiation of hWJ-MSCs. According to the available experimental results, we can summarize as follows. HANPs are able to more optimally process better direct [5] and indirect osteoinductive effects than m-HAPs. Compared to autogenous bone grafts and bone allografts, there is an extensive source of HANP and without secondary damage and potential immunogenicity. However, compared to m-HAPs, HANPs can suppress the angiogenic ability of HUVECs [9] and exhibit slight cytotoxicity in both a time- and dose-dependent fashion.

Recently, growing evidence has demonstrated the importance of HIF-1α in the bone regeneration. However, few studies have been able to quantitatively predict the MSC differentiation rate under specific initial conditions, such as the HIF-1α concentration. Taking cell proliferation, apoptosis, and osteogenic differentiation into account, we present a mathematical model that combines a two-stage cell lineage with HIF-1α that is highly correlated with our experimental data. By fitting the differentiation rate of hWJ-MSCs in 0–4000 pg/mL HIF-1α, we acquired the equations for describing the differentiation rate, HIF-1α concentration, and time. As shown in Fig. 8d, this model can depict the cell number map under different HIF-1α concentrations, so that it is possible to explore the intrinsic dynamics of the two-stage system [40]. Additionally, this model mathematically validates the effect of HIF-1α on the osteogenic differentiation of hWJ-MSCs. Moreover, based on a multi-stage cell-lineage model and logistic model, our model is sufficiently stable to enable long-term predictions without falling into the trap of population unlimited explosion [41].

By using the existing experimental data, both the cell number and differentiation rate can be predicted with a defined initial cell seeding density and HIF-1α concentration. As such, the optimum incubation time is also obtained. Consequently, we can predict the optimum concentration of HIF-1α and determine the most optimal time for osteogenesis, which is important for efficient tissue engineering. A two-stage cell-lineage model is applicable for predicting the proliferation and differentiation of stem cells, which have two cell lineages. On this basis, the model founded on the initial conditions and existing experimental data can be established to identify the optimum culture conditions in vitro, which will assist in optimizing bone repair in vivo.

Schlussfolgerung

In this study, we explored the specific biological effects of HANPs on hWJ-MSCs mediated by HUVECs. Compared to m-HAPs, both np20 and np80 showed slight cytotoxicity in both a time- and dose-dependent fashion. Importantly, the size of the HANPs appeared to have no significant impact on this cytotoxicity. Our data also showed that HANPs, especially np20, were capable of facilitating HUVECs to secrete increased levels of HIF-1α, which directly correlated with the enhanced osteogenic differentiation of hWJ-MSCs via the activation of the ERK1/2 pathway (Fig. 9). More remarkably, the results from the two-stage cell-lineage model suggested that HIF-1α exerted a dose-dependent stimulatory effect on the osteogenic differentiation rate of hWJ-MSCs. Additionally, the optimum concentration of HIF-1α and incubation time were estimated based on the initial conditions using an in vitro model, which could be invaluable in the future for tissue engineering applications. Collectively, these observations provide evidence that HANPs may improve bone regeneration by modulating cell–cell interactions.

A schematic illustration of the possible mechanisms

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

The datasets used and analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

Abkürzungen

HA:

Hydroxyapatite

HANPs:

HA nanoparticles

hWJ-MSCs:

Human umbilical cord Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells

HUVECs:

Human umbilical vein endothelial cell

m-HAP:

Micro-sized HAP particles

PBS:

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

ECM:

EC medium

2-MeOE2:

2-Methoxyestradiol

ELISA:

Enzyme-linked Immunosorbent Assay

RUNX-2:

Runt-related transcription factor 2

Col I:

Type I collagen

OCN:

Osteocalcin

ALP:

Alkaline phosphatase

SOX 2:

SRY-related HMG-box 2

ERK:

Extracellular signal-related kinases

VEGF:

Vaskulöser endothelialer Wachstumsfaktor