Zusammenbau von Carbon Dots in Rahmen mit erhöhter Stabilität und antibakterieller Aktivität

Einführung

Bakterielle Infektionen stellen eine ernsthafte Bedrohung für das menschliche Leben dar, und die Entwicklung wirksamer Medikamente zur Desinfektion von Bakterien ist sehr gefragt [1]. Zur Behandlung bakterieller Infektionen wurden verschiedene Antibiotika eingesetzt, aber der übermäßige Einsatz von Antibiotika verursacht andere Probleme wie Nebenwirkungen und Arzneimittelresistenz [2]. Die Nanomaterialien einschließlich antimikrobieller Polymere [3], Metall-Nanomaterialien [4] und Kohlenstoff-Nanomaterialien [5, 6] wurden als Alternativen zu klassischen Antibiotika verwendet [7]. Sowohl arzneimittelresistente als auch toxische Probleme wirken lindernd [8]. In jüngster Zeit werden CDs [9, 10] und Nanocluster (NCs) [11] gut zur Bekämpfung bakterieller Infektionen eingesetzt, da sie biokompatibel [12], aktiv [13] und aufgrund der ultrakleinen Größe leicht durch Umwälzungen gereinigt werden können [14, 15]. Insbesondere haben Forscher herausgefunden, dass CDs eine ausgezeichnete Fähigkeit zum Abfangen freier Radikale aufweisen, die stärker sein kann als viele traditionelle Anti-Infektionsmedikamente [16,17,18]. Einige ultrakleine antimikrobielle Mittel weisen jedoch aufgrund der größeren oxidativen Oberfläche eine schlechte Stabilität auf [19]. Es ist sehr erwünscht, wirksamere antibakterielle Mittel zur Bekämpfung von bakteriellen Infektionen zur Langzeitanwendung zu entwickeln.

Um der Nachfrage nach praktischen Anwendungen gerecht zu werden, sollten die antimikrobiellen Mittel die folgenden Eigenschaften aufweisen:(a) Die ausgezeichnete Stabilität bleibt für eine bestimmte Zeit in einer Umgebungsumgebung unverändert; (b) Ausgezeichnete Biokompatibilität und geringe Toxizität:(c) hohe antibakterielle Aktivität. Die größeren Nanomaterialien sind tendenziell stabiler, könnten jedoch aufgrund der kleineren aktiven Oberfläche eine relativ schwächere antibakterielle Aktivität aufweisen. Angesichts der Schwäche kleiner und großer Nanomaterialien berichten wir über den Zusammenbau der kleinen CDs zu großen CDFs durch einfache Zugabe von Polyethylenimin (PEI) (Abb. 1). CDs wurden nicht fusioniert, sondern behielten ihre Morphologie als Bausteine. Daher zeigten die gesamten CDFs größere Grßen, zeigten jedoch eine ausgezeichnetere Stabilität, ohne die aktiven Eigenschaften von CDs zu verlieren. Darüber hinaus fanden wir, dass die CDFs sowohl gegen Gram-negative Escherichia coli (E. coli ) und Gram-positiver Staphylococcus aureus (S. aureus ) im Vergleich zu CDs, was auf ihre antibakterielle Breitbandleistung hinweist, obwohl viele CDs nur grampositive Bakterien ausrotteten [20]. Darüber hinaus förderten die CDFs die Proliferation der PC12-Zellen (eine Zelllinie, die aus einem Phäochromozytom des Nebennierenmarks der Ratte gewonnen wurde) und zeigten ein großes Potenzial für Anwendungen zur Nervenwiederherstellung [21]. Diese Arbeit legt nahe, dass der Zusammenbau kleiner CDs zu großen CDFs nicht nur die Stabilität erhöht, sondern auch die antibakterielle Aktivität verstärkt.

Schema für die Synthese von CDs und den Zusammenbau zu CDFs durch Zugabe von PEI mit erhöhter antibakterieller Aktivität

Materialien und Methoden

Materialien und Instrumente

Röntgenoberflächen-Photoelektronenspektren (XPS) wurden auf einem ESCALAB250Xi-Röntgenoberflächen-Photoelektronenspektroskopie-(XPS)-Instrument aufgezeichnet. Das Transmissionselektronenmikroskop (TEM) wurde mit einem JEM-2100-Mikroskop durchgeführt, das bei 200 kV betrieben wurde. Die Fluoreszenz der Materialien wurde mit dem Fluoreszenzspektrometer F97 erhalten. Die FDA/PI-Färbung der Bakterienzellen wurde im Tapping-Modus mit einem Leica DFC450C Mikroskop aufgenommen. Die Fluoreszenzlebensdauer wurde auf einem zeitkorrelierten Einzelphotonenzählsystem (TCSPC) unter Verwendung eines Nanolog-Spektrofluorometers (Horbia JY, Japan) gemessen. Ultraviolett-sichtbare-Spektroskopie (UV-vis)-Spektren werden vom UV-1600-Instrument erhalten. Die bakterielle Bildgebung wurde mit einem konfokalen Mikroskop (Olympus FLUOVIEW FV1000 c) beobachtet. Alle Reagenzien waren von analytischer Qualität. Das entionisierte Wasser wurde während der Experimente verwendet. Das Zellzähl-Kit-8 wurde von Beyotime Biotechnology bezogen.

Vorbereitung von CDs und CDFs

L-Cystein (1,0 g) wurde in 10,0 ml entionisiertem Wasser gelöst und gut gemischt. Dann wurde der pH-Wert der Lösung mit 1,0 M NaOH auf 9,0 eingestellt. Die Lösung wurde in einen Hydrothermalreaktor überführt und 24 h auf 160 °C erhitzt. Nachdem die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde die resultierende Lösung einen Tag lang einer Dialyse unter Verwendung eines Dialysebeutels (MW 7000 Cut-off) unterzogen. Die so erhaltenen CDs wurden für die folgenden Charakterisierungen und Experimente verwendet. Für die Herstellung von CDFs wurden 40 µl 1% PEI zu 1 ml der CDs hinzugefügt. Die Mischung wurde 1 h stehen gelassen. Das Produkt wurde durch Dialyse unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie bei der Reinigung von CDs gereinigt. Für die HR-TEM-Charakterisierung wurden die Proben auf ein kleines Volumen konzentriert, auf eine Kieselgelsäule übertragen und mit Methanol und Dichlormethan eluiert, um die weiter gereinigten Produkte zu erhalten.

Toxizitätsbewertung

PC12-Zellen wurden 12 h in 96-Well-Platten ausgesät und dann mit CDs und CDFs mit unterschiedlichen Konzentrationen inkubiert. Die Anzahl lebensfähiger Zellen wurde unter Verwendung eines Cell Counting Kit-8-Assays (CCK-8) untersucht. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (5 mg/ml in PBS) wurde in einem Kulturvolumen von 1/10 zugegeben und die Zellen wurden in den Inkubator zurückgeführt. Danach wurden die Überstände verworfen und 200 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) in jede Vertiefung gegeben. Die Kristalle wurden durch Schütteln der Platten für 10 Minuten gelöst. Die Absorption bei 490 nm wurde mit dem Microreader (Varioskan LUX Multimode Reader) gemessen. Für alle Extinktionsmessungen wurden leere Kontrollvertiefungen eingeschlossen.

Antibakterielles Experiment

E. coli und S. aureus wurden in Abwesenheit und Anwesenheit von CDs und CDFs bei 37 °C mit 250 U/min Schütteln inkubiert. Das Wachstum der Bakterienzellen in Lysogeny-Brühe (LB)-Kultur wurde mit dem Microreader bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD600) gemessen. Als Blindwertkontrolle wurde LB-Medium verwendet. Die OD600 steht für die Zelldichte, und die relative Zelllebensfähigkeit wurde basierend auf dem Vergleich zwischen den kultivierten Bakterienzellen in Gegenwart der Materialien mit der Kontrollgruppe (OD600 der Bakterienzellen in Abwesenheit der CDs oder CDFs) berechnet. Die lebenden/toten Bakterien werden nach dem FDA/PI-Färbeprotokoll bewertet [22].

Nachweis von Ros-reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)

Die intrazelluläre ROS-Produktion wurde in Bakterienzellen vor und nach der Behandlung mit CDs und CDFs für 12 h mit einer 2′, 7′-Dichlorfluorescindiacetat (DCFH-DA)-Sonde gemäß den Anweisungen gemessen. Die Fluoreszenz wurde bei einer Emissionswellenlänge von 525 nm mit Anregung bei 488 nm nachgewiesen.

Ergebnisse und Diskussionen

Charakterisierung der Materialien

Größenuntersuchungen

Abbildung 2 zeigt das SEM des Pulvers für CDFs mit relativ geringer (Abb. 2a0) und höherer Vergrößerung (Abb. 2b0) nach mehrstündiger Luftexposition. Es ist zu erkennen, dass die CDFs gut verteilt waren und eine durchschnittliche Größe von ca. 25 nm. CDs sollten basierend auf der TEM- und AFM-Studie monodisperse kleine Größen aufweisen (Zusatzdatei 1:Abbildung S1), aber diese kleinen Partikel zeigten eine Aggregationsbeobachtung durch REM nach einer gewissen Zeit an der Luft (Zusatzdatei 1:Abbildung S2 ). Andererseits behielten CDFs ihre Morphologie bei, obwohl sie der Umgebung ausgesetzt waren. Dies zeigte, dass die so erhaltenen CDFs für praktische Anwendungen vielversprechender sind. CDFs wurden weiter durch TEM charakterisiert (Abb. 2b1). Es ist ersichtlich, dass CDFs Assemblierungsstrukturen mit kleinen CDs als Bausteine ​​aufwiesen. Die Analyse mit hochauflösender Transmissionselektronenmikroskopie (HR-TEM) (Abb. 2b2) ergab, dass der Baustein der CDFs Gitterstreifen mit einem d-Abstand von 0,21 nm aufwies, entsprechend dem (100)-Ebenengitter von Graphit, das ähnlich den klassischen CDs [23,24,25]. Daher verlieren die Baugruppen-CDFs nicht die Eigenschaften von CDs, die die Vorteile sowohl der gesamten großen Rahmen als auch der kleinen inneren Bausteine ​​​​vereinen können.

SEM für CDFs mit relativ niedriger (a0 ) und höhere Vergrößerung (b0 ); TEM (b1 ) HR-TEM (b2 ) von CDFs

Zeta-Potenzial

Zeta-Potential-Untersuchungen wurden verwendet, um den Grad der elektrostatischen Abstoßung von CDs und CDFs zwischen benachbarten geladenen Partikeln im dispergierten System zu messen (Abb. 3). Es ist ersichtlich, dass der Zeta-Potential-Peak von CDs, die der Umgebung ausgesetzt waren, nicht gut gekennzeichnet war. Außerdem wurden mehrere Zetapotential-Peaks mit großen Zeta-Abweichungen erhalten (Tabelle 1), was darauf hinweist, dass die CDs ziemlich instabil und nicht wiederholbar waren. Andererseits konzentrierte sich der Peak des Zetapotentials für CDFs auf einen relativ stabilen Bereich. Wir hatten auch viel kleinere Zeta-Abweichungen basierend auf dreimaligen Messungen, was zeigte, dass CDFs stabiler waren und die dispergierten Systeme Proben mit höherer Reinheit aufwiesen.

Zetapotential von CDs (a ) und CDFs (b )

Fluoreszenzeigenschaften

Die Fluoreszenzemissionsspektren wurden verwendet, um den Montageprozess von CDs zu CDFs zu verfolgen (Abb. 4). Bei der Titration von PEI wurde die Fluoreszenzemission bei 350 nm allmählich gelöscht (Abb. 4a). Es wurde jedoch keine signifikante Verschiebung der Fluoreszenzspektren beobachtet, was zeigt, dass keine Aggregation auftrat. Die Anordnungsstruktur von CDFs verändert die Gesamtgröße von CDs, was die Fluoreszenz beeinflusst. Inzwischen markierten die benachbarten CDs die Fluoreszenz voneinander. Darüber hinaus spielt die Oberflächenchemie eine wichtige Rolle bei den Fluoreszenzeigenschaften. Die Stickstoffatome und Schwefelatome auf der Oberfläche von CDs können Energiefallen erzeugen. Die helle Fluoreszenz von CDs ist auf die Defektoberfläche mit vielen Carbonyl- und Aminogruppen zurückzuführen. Nach der Funktionalisierung von PEI wurde die Oberfläche von CDFs von den Aminogruppen dominiert, die zusammen mit den wachsenden Größen die Fluoreszenz löschten. Der Vergleich des Fluoreszenzverhaltens von CDs und CDFs wurde von TCSPC weiter untersucht, um die photogenerierten Ladungsrekombinationswege der Materialien zu verstehen (Abb. 4b). Die Emission wurde bei 430 nm überwacht. Die Fluoreszenzzerfälle erforderten eine zweikomponentige exponentielle Anpassung. Die Zeitkonstanten und relativen Amplituden sind angepasst und in Tabelle S1 zusammengefasst. Es zeigte sich, dass die Lebensdauer der dominierenden Komponente für CDs 2,45 ns betrug, während die der anderen Komponente 7,47 ns betrug. Andererseits betrug die Lebensdauer der dominanten Komponente für CDs 1,98 ns, während die andere Komponente eine Lebensdauer von 7,30 ns aufwies. Zwischen CDs und CDFs wurde keine signifikante Änderung der Lebensdauer beobachtet, was auch darauf hindeutet, dass sich die Eigenschaften von CDs während des Zusammenbaus zu CDFs nicht wesentlich geändert haben [26].

Fluoreszenzemissionsspektren a von CDs als Titration von PEI und Lebensdauer b für CDs und CDFs

Toxizität

Zur Bewertung der Sicherheit der Materialien wird die Toxizität der CDs und CDFs gegenüber PC12-Zellen untersucht. MTT-Assays wurden durchgeführt, um den Einfluss der Materialien auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu untersuchen (Abb. 5). Nach der Inkubation von PC12 mit CDs und CDFs war die Lebensfähigkeit der Zellen innerhalb von 24 h nicht wesentlich beeinträchtigt. Interessanterweise fördern beide Kohlenstoffmaterialien die Proliferation von PC12, das bei der Therapie von Nervenschädigungen eine wichtige Rolle spielt. Diese Ergebnisse weisen auf die geringe Toxizität der Materialien hin, und die Materialien sind vielversprechend für den Nervenschutz mit beteiligten PC12-Zellen [27].

Zelllebensfähigkeit von PC12 in Gegenwart von CDs (a ) und CDFs (b ). Zelllebensfähigkeit (%) = (Absorption der Versuchsgruppe – Absorption der Leergruppe)/(Absorption der Kontrollgruppe – Absorption der Leergruppe) × 100%

Antibakterielle Untersuchungen

Die antibakteriellen Aktivitäten der CDs und CDFs wurden zunächst durch Messung der Bakteriendichte in Gegenwart dieser Wirkstoffe bei 600 nm bewertet [28]. Abb. 6 zeigt eine erhebliche antibakterielle Wirkung sowohl der CDs als auch der CDFs gegen die S. aureus und E. coli Zellen. Insbesondere die Lebensfähigkeit der S. aureus Zellen war fast 0, wenn mehr als 30 µg/ml der CDFs verwendet wurden. Ebenso die E. coli Zellen wurden sowohl mit CDs als auch mit CDFs desinfiziert. CDs wiesen mehrere Ladungen auf (Abb. 3a). Auf der anderen Seite waren die CDFs mit unbedeutenden Ladungen (Abb. 3b), die die bakterielle Adhäsion bei schwacher Abstoßung unterdrücken und so leichter mit der Bakterienoberfläche interagieren könnten. Im Vergleich dazu zeigen die CDFs eine höhere antibakterielle Aktivität, basierend auf dem Phänomen, dass ein relativ größerer Anteil der Zellen abgetötet wird, wenn mehr als 6 µg/ml der Materialien verwendet werden. Die erhöhte antibakterielle Aktivität von CDFs wird möglicherweise auf den Synergieeffekt der CDs als Bausteine ​​sowie auf die stabileren Oberflächenladungen zurückgeführt. Um den antibakteriellen Mechanismus gründlich zu verstehen, wurde die ROS gemessen, die nichtfluoreszierendes DCFH zu fluoreszierendem DFC oxidieren könnte (Abb. 6C). Beide Kohlenstoffmaterialien induzierten nach der Behandlung von E keine signifikante ROS-Produktion. coli . CDFs verbesserten jedoch die intrazelluläre ROS bemerkenswert, während sie mit S interagierten. aureus . Da ROS bakterielle DNA, RNA und Proteine ​​schädigen kann, erleichterte der erhöhte Wert die Desinfektion der Bakterien. Darüber hinaus wurde die ROS mit H₂ . stimuliert O_2. Es ist erwähnenswert, dass alle ROS-Produktionen im Vergleich zu H₂ . dramatisch beworben wurden O₂ Behandlung allein, während CDFs die höchste Verbesserung zeigten. Dies zeigte die Kombination von H₂ O₂ mit diesen beiden Kohlenstoffmaterialien könnte die antibakterielle Aktivität weiter verbessern, insbesondere für die CDFs.

Antibakterielle Aktivität von CDs und CDFs gegen S. aureus (a ) und E.coli (b ), c Fluoreszenzintensität von DCF bei 525 nm, die eine lineare Beziehung zum ROS-Spiegel zeigt, bei der Behandlung von CDs und CDFs in Abwesenheit und Anwesenheit von H₂ O₂ (100 μM)

Einige CDs wurden zuvor für die Desinfektion von S gemeldet. aureus , die zum Vergleich in Tabelle 2 aufgeführt ist. Die aktuellen CDFs zeigten eine wettbewerbsfähige MIC. Anstatt nur die Lebensfähigkeit der untersuchten Zellen zu verringern, förderten CDFs die Zellproliferation von PC12, was auf ihre Vielseitigkeit bei der Behandlung bakterieller Infektionen hinweist.

Die Integrität der Bakterienmembran nach der CDs- und CDFs-Behandlung wurde durch das Lebend/Tot-Färbeexperiment untersucht (Abb. 7). Die grün fluoreszierende FDA-Färbung kann nur die lebenden Zellen zeigen, während rot fluoreszierendes PI spezifisch tote Bakterien mit gebrochenen Membranen färbt, aber die lebenden mit intakter Bakterienmembran sind ungefärbt [30, 31]. Wie in den Fluoreszenzbildern gezeigt, wurde bei den mit CDs behandelten Proben eine deutliche rote Fluoreszenz und bei den mit CDFs behandelten Proben eine viel höhere Dichte der toten Zellen festgestellt.

FDA/PI-Färbung S. aureus und E. coli in Abwesenheit und Anwesenheit von CDs und CDFs bei 30 µg/ml. Maßstabsleiste, 200 µm

Basierend auf den obigen Vergleichen schließen wir, dass CDFs vielversprechend sind, um sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterienzellen abzutöten. Daher E. coli und S. aureus vor und nach der Behandlung mit 30 µg/ml CDFs wurden durch SEM charakterisiert (Abb. 8). Wie in Abb. 8a, c gezeigt, weisen Bakterien vor der Behandlung mit CDFs eine regelmäßige Oberfläche auf. Nach der Inkubation mit CDFs ist jedoch die Morphologie der Bakterienzellen, einschließlich S. aureus (Abb. 8b) und d E. coli (Abb. 8d) drastisch verändert. Außerdem brachen die Membranen vieler Bakterienzellen auf. Auf der Oberfläche der Bakterien wurden einige kleine Materialien beobachtet, die von den angehefteten CDFs stammten. Dies weist darauf hin, dass die CDFs die Bakterienzellen durch Beschädigung der Membranen desinfizieren können [32].

SEM für S. aureus (a , b ) und E.coli vorher (a , c ) und nach (b , d ) die Behandlung mit 30 µg/ml CDFs. Maßstabsleiste:2 µm

Da sowohl CDs als auch CDFs fluoreszierend sind, wurden 6 µg/ml der Wirkstoffe im Verlauf der Desinfektion für die bakterielle Bildgebung untersucht. Die Bildgebung von S. aureus wurde untersucht und in Abb. 9 gezeigt. Interessanterweise wurde festgestellt, dass sowohl CDs als auch CDFs für die Bildgebung des S verwendet werden können. aureus . CDFs zeigen jedoch eine höhere Aufnahmeeffizienz, da sich die Bakterienzellen bei der Beobachtung aus dem Hell- und Dunkelfeld fast überlappten. Andererseits ist nur ein Teil von S. aureus Zellen wurde durch die CDs gefärbt. Außerdem waren die Bakterienzelldichten durch die Behandlung von CDFs geringer, was für desinfizierte CDFs steht S. aureus effizienter im Vergleich zu CDs bei gleichen Dosierungen. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass CDFs als alternative Farbstoffe für die Abbildung verschiedener Bakterienzellen verwendet werden können.

Bildgebung von S. aureus durch Aufnahme von CDs und CDFs nach 12 h

Schlussfolgerungen

Der Zusammenbau von CDs zu CDFs führt zu einer robusteren antibakteriellen Aktivität. Daraus wird geschlossen, dass die Anordnungsstruktur stabilere Eigenschaften ermöglicht, aber die antibakterielle Aktivität von CDs erhöht. Diese Arbeit bietet auch einen neuen Weg, kleine Nanomaterialien zu Gerüsten für praktischere Anwendungen zusammenzubauen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle Daten, die die Schlussfolgerungen dieses Artikels unterstützen, sind im Artikel enthalten.

Abkürzungen

CDs:

Karbonpunkte

CDFs:

Carbon Dots-basierte Frameworks

PEI:

Polyethylenimin

E. coli :

Escherichia coli

S. aureus :

Staphylococcus aureus

TEM:

Transmissionselektronenmikroskop

HR-TEM:

Hochauflösendes TEM

XPS:

Röntgenoberflächen-Photoelektronenspektren

MIC:

Minimale Hemmkonzentration

NCs:

Nanocluster

TCSPC:

Zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung

CCK-8:

Zellzähl-Kit-8-Assay

ROS:

Ros reaktive Sauerstoffspezies

SEM:

Rasterelektronenmikroskop

ZP:

Zeta-Potenzial