Targeting der miR-342-5p/Wnt3a-Achse stabilisiert atherosklerotische Plaques und unterdrückt Angiogenese in ApoE^−/− Mäusen

Zusammenfassung

MicroRNA-342-5p (miR-342-5p) wurde in Atherosklerose (AS) impliziert, doch ihre mechanistische Rolle bleibt unklar. In dieser Studie untersuchten wir, wie miR-342-5p den Wnt3a-Signalweg reguliert und Plaque-Vulnerabilität und Neovaskularisation in einem ApoE^−/− Mausmodell von AS beeinflusst. 24 Wochen alte männliche ApoE^−/− Mäuse erhielten 16 Wochen High-Fat-Diät zur Induktion vulnerabler Plaques. miR-342-5p und Wnt3a Expression wurden per RT-qPCR und Western Blot quantifiziert. Funktionelle Effekte von miR-342-5p Inhibition (Antagomir) und Wnt3a Überexpression (oe-Wnt3a Vektor) wurden auf Serumb lipids, entzündliche und oxidativ-stress Zytokine, Plaque-Morphologie und Mikrogefäßdichte (MVD) bewertet. Ergebnisse zeigten, dass miR-342-5p hochreguliert war, während Wnt3a und β-Catenin in AS-Aorten herunterreguliert waren, und miR-342-5p direkt die 3'-UTR von Wnt3a anvisierte. Antagonisierung von miR-342-5p oder Überexpression von Wnt3a senkte Gesamtcholesterin, Triglyceride, LDL-C und pro-inflammatorische Zytokine (IL-5, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α), erhöhte HDL-C und SOD-Aktivität, reduzierte Lipidkernbereich, erhöhte Kollagengehalt, verringerte Makrophagen-Infiltration und senkte MVD. Im Gegensatz dazu verschlimmerte miR-342-5p Überexpression all diese Parameter. Somit fördert miR-342-5p Plaque-Instabilität und Angiogenese durch Repression von Wnt3a; Wiederherstellung von Wnt3a mildert diese Effekte, was ein therapeutisches Target für AS suggeriert.

Einleitung

Atherosklerose (AS) bleibt weltweit führende Ursache kardiovaskulärer Morbidität und Mortalität. Plaque-Destabilisation – charakterisiert durch lipidreiche nekrotische Kerne, dünne faserige Kappen, Makrophagen-Infiltration und reduziertes Kollagen – führt zu Ruptur und akuten Ereignissen. Während Lipidsenkende Therapien Outcomes verbessert haben, erleben viele Patienten weiterhin kardiovaskuläre Ereignisse, was Bedarf an neuartigen molekularen Interventionen unterstreicht.

MicroRNAs (miRNAs) sind kurze nicht-kodierende RNAs, die post-transkriptionell multiple Target-Gene regulieren. miR-342-5p, lokalisiert im 14q32 miRNA-Cluster, wurde berichtet, Angiogenese via TGF-β und VEGF Wege zu beeinflussen und inflammatorische Reaktionen in vaskulären Erkrankungen zu modulieren. Ihre spezifische Rolle in AS und Interaktion mit Schlüsselsignalwegen bleiben jedoch unvollständig definiert.

Der Wnt/β-Catenin Pfad ist kritisch für vaskuläre Zell-Homöostase, beeinflussend glatte Muskelzell-Proliferation, Endothelintegrität und Plaque-Zusammensetzung. Vorarbeiten deuten an, dass miR-342-5p Wnt3a in anderen Krankheitskontexten negativ reguliert, was eine potenzielle regulatorische Achse in AS suggeriert.

Hier elucidieren wir die miR-342-5p/Wnt3a Interaktion in AS und evaluieren deren Impact auf Plaque-Stabilität und Angiogenese in ApoE^−/− Mäusen.

Materialien und Methoden

Tiere und Ethik

Männliche ApoE^−/− und C57BL/6J Mäuse (8 Wochen alt) wurden unter 12 h Licht/12 h Dunkelzyklus gehalten und mit Standardfutter oder High-Fat-Diät (20% Fett, 0,25% Cholesterin) für 16 Wochen gefüttert. Alle Verfahren folgten NIH-Richtlinien und wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Qinghai Provincial People's Hospital genehmigt (Ethiknummer 201870726).

Experimentelles Design

ApoE^−/− Mäuse wurden randomisiert in sechs Gruppen (n = 12 each): AS, NC (Saline), miR-342-5p Agomir, miR-342-5p Antagomir, oe-Wnt3a, und miR-342-5p Agomir + oe-Wnt3a. Behandlungen (40 mg/kg, Schwanzvene) wurden biweekly für 8 Wochen verabreicht. C57BL/6J Mäuse dienten als normale Kontrollen.

Biochemische Analysen

Serum Gesamtcholesterin (TC), Triglyceride (TG), LDL-C, HDL-C, Malondialdehyd (MDA) und Superoxiddismutase (SOD) wurden mit kommerziellen Kits (NanJing JianCheng Bioengineering Institute) gemessen. Zytokine (IL-5, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α) wurden per ELISA (MultiSciences) quantifiziert.

Gewebeverarbeitung

Nach 12-h Fasten wurden Mäuse euthanisiert; Aorten wurden entnommen, in RNA-freiem PBS gewaschen und für Histologie (HE, Oil Red O, Sirius Red) oder molekulare Assays (RT-qPCR, Western Blot) geteilt. Histologie-Proben wurden in Paraffin eingebettet, geschnitten (4 µm) und nach Standardprotokollen gefärbt.

Genexpressions- und Proteinanalyse

RT-qPCR quantifizierte miR-342-5p, Wnt3a, β-Catenin und Referenzgene (U6, β-Actin) mittels 2^−ΔΔCt Methode. Western Blot assessed Wnt3a, β-Catenin, CD34, α-SMA und β-Actin, mit ImageJ Densitometrie.

Immunhistochemie

Schnitte wurden für MOMA-2 (Makrophagen), α-SMA (glatte Muskelzellen) und CD34 (Endothelzellen) immungefärbt. Färbintensität wurde via Image Pro Plus 6.0 quantifiziert, und Plaque-Vulnerabilitätsindex berechnet als (Makrophagen + Lipid %) / (glatte Muskelzellen + Kollagen %). MVD wurde durch Zählen CD34⁺ Mikrogefäße/mm² bestimmt.

Luciferase Reporter Assay

Wnt3a 3'-UTR (Wildtyp und Mutant) wurde in GP-miRGLO kloniert. Maus-Aorten-Endothelzellen wurden ko-transfiziert mit Reporter und variierenden Konzentrationen miR-342-5p Agomir; Luciferase-Aktivität wurde nach 48 h gemessen.

Statistische Analyse

Daten wurden als Mittelwert ± SD präsentiert. Zweigruppen-Vergleiche nutzten ungepaarte t-Tests; Mehrfachgruppen nutzten Einfaktorielle ANOVA mit Tukey Post-hoc-Tests. Signifikanz wurde bei *p* < 0,05 angesetzt.

Ergebnisse

miR-342-5p ist hochreguliert und Wnt3a herunterreguliert in AS-Aorten

RT-qPCR zeigte signifikanten Anstieg von miR-342-5p (≈3,5-fach, *p* < 0,01) und gleichzeitigen Abfall von Wnt3a (≈0,4-fach, *p* < 0,01) in AS-Mäusen vs. Normalen. Western Blot bestätigte reduzierte Wnt3a und β-Catenin Proteinlevel. Luciferase-Assays demonstrierten, dass miR-342-5p direkt die Wnt3a 3'-UTR bindet, Reporter-Aktivität um bis zu 64% bei 100 pM reduzierend, ein Effekt der durch Mutation der Bindungsstelle aufgehoben wurde.

miR-342-5p Antagomir oder Wnt3a Überexpression verbessern Lipidprofile

miR-342-5p Antagomir und oe-Wnt3a senkten TC, TG und LDL-C markant (≈30–40% Reduktion, *p* < 0,01) und erhöhten HDL-C (≈20% Anstieg, *p* < 0,05) relativ zu AS und NC Gruppen. miR-342-5p Agomir verschlimmerte Dyslipidämie. Überexpression von Wnt3a rettete die adversen Effekte von miR-342-5p Überexpression.

Inflammatorische und oxidative Stress Marker werden durch miR-342-5p Inhibition unterdrückt

Serum IL-5, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α und MDA waren in AS-Mäusen erhöht (*p* < 0,01). miR-342-5p Antagomir oder oe-Wnt3a reduzierten diese Zytokine und MDA um ~40% und erhöhten SOD-Aktivität um ~35% (*p* < 0,01). miR-342-5p Agomir intensivierte inflammatorische und oxidative Marker weiter.

Plaque-Morphologie verbessert sich durch miR-342-5p Inhibition oder Wnt3a Überexpression

HE-Färbung zeigte, dass miR-342-5p Antagomir und oe-Wnt3a Gruppen kleinere Plaque-Flächen, dickere faserige Kappen, reduzierte Lipidkerne und erhöhten Kollagengehalt (Sirius Red) aufwiesen verglichen mit AS und NC Gruppen (*p* < 0,01). Oil Red O Quantifizierung bestätigte ~30% Abnahme des Lipidgehalts in behandelten Gruppen. Der Plaque-Vulnerabilitätsindex sank um 45% in Antagomir und oe-Wnt3a Gruppen, während miR-342-5p Agomir ihn um 60% erhöhte (*p* < 0,01).

Makrophagen-Akkumulation und Glatte-Muskelzellen-Präsenz werden moduliert

Immunhistochemie zeigte, dass miR-342-5p Antagomir und oe-Wnt3a MOMA-2⁺ Makrophagen-Prozente um ~50% reduzierten und α-SMA⁺ glatte Muskelzellen um ~30% erhöhten relativ zu AS und NC Gruppen (*p* < 0,01). Die kombinierte miR-342-5p Agomir + oe-Wnt3a Behandlung stellte Makrophagen- und glatte Muskelzellen-Level Richtung Baseline wieder her.

Angiogenese wird durch Targeting der miR-342-5p/Wnt3a Achse attenuiert

CD34 Immunfärbung und Western Blot demonstrierten, dass miR-342-5p Antagomir und oe-Wnt3a MVD um ~55% reduzierten verglichen mit AS-Mäusen (*p* < 0,01). miR-342-5p Agomir erhöhte MVD um ~70% (*p* < 0,01). Die kombinierte Behandlung moderierte angiogene Reaktionen.

Diskussion

Unsere Ergebnisse enthüllen eine bisher uncharakterisierte miR-342-5p/Wnt3a Achse, die Lipidstoffwechsel, Entzündung, oxidativen Stress, Plaque-Zusammensetzung und Neovaskularisation in Atherosklerose regiert. miR-342-5p Hochregulierung in AS-Aorten unterdrückt direkt Wnt3a, wodurch β-Catenin Signalisierung gedämpft und ein vulnerabler Plaque-Phänotyp gefördert wird. Umgekehrt stellt Inhibition von miR-342-5p oder Wiederherstellung von Wnt3a schützende Lipidprofile wieder her, reduziert pro-inflammatorische Zytokine, verstärkt antioxidative Abwehr, stabilisiert Plaque-Architektur und kurbelt pathologische Angiogenese.

Diese Ergebnisse alignieren mit Berichten über miR-342-5p Involvierung in Makrophagen-Aktivierung und Entzündung, und mit der etablierten Rolle von Wnt-Signalisierung in vaskulärer Biologie. Das therapeutische Potenzial der Modulation dieser Achse wird durch die robuste Umkehrung von AS-Merkmalen in vivo unterstrichen.

Schlussfolgerung

Diese Studie demonstriert erstmals, dass miR-342-5p Plaque-Vulnerabilität und Angiogenese durch Targeting von Wnt3a in ApoE^−/− Mäusen fördert. Pharmakologische Inhibition von miR-342-5p oder Up-Regulation von Wnt3a stabilisiert atherosklerotische Plaques und könnte eine vielversprechende Strategie für AS-Behandlung darstellen.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle während dieser Studie generierten Daten sind im Artikel und seinen Supplementarmaterialien enthalten. Weitere Anfragen können an den korrespondierenden Autor gerichtet werden.